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抑制腦腫瘤生長的方法.pdf

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抑制 腫瘤 生長 方法
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摘要
申請專利號:

CN200510004159.1

申請日:

20000126

公開號:

CN1660426A

公開日:

20050831

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A61K39/395,A61P35/00 主分類號: A61K39/395,A61P35/00
申請人: 洛杉磯兒童醫院
發明人: W·E·勞格
地址: 美國加利福尼亞州
優先權: 60/118126,09/489391
專利代理機構: 中國專利代理(香港)有限公司 代理人: 譚明勝
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法律狀態
申請(專利)號:

CN200510004159.1

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明描述了應用整合素α的方法。本發明中的整合素拮抗劑可抑制腦腫瘤組織的血管生成。他們還能抑制腦腫瘤細胞中玻連蛋白和腱生蛋白介導的黏附和遷移。他們還能進一步地誘導出直接的腦腫瘤細胞死亡。

權利要求書

1.一種抑制宿主腦腫瘤生長的方法,包括對需要這種抑制的宿主應用治療有效量的整合素拮抗劑,其中所述整合素拮抗劑選自:抗αβ抗體、抗αβ抗體、及分別抗αβ和αβ抗體的組合。2.權利要求1的方法,其中所述拮抗劑為αβ的免疫特異性單克隆抗體。3.權利要求2的方法,其中所述單克隆抗體具有名為LM-609的單克隆抗體的免疫反應特征。4.權利要求1的方法,其中所述分別抗αβ和αβ抗體的組合為αβ的免疫特異性單克隆抗體和αβ的免疫特異性單克隆抗體的組合。5.權利要求4的方法,其中所述αβ的免疫特異性單克隆抗體具有名為LM-609單克隆抗體的免疫反應特征,并且所述αβ5的免疫特異性單克隆抗體具有名為P1-F6單克隆抗體的免疫反應特征。

說明書

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本申請是2000年1月26日提交的申請號為00805997.7一案的分案 申請。

相關申請

本申請要求系列號為60/118,126的臨時申請的優先權,該臨時申請 于1999年2月1日遞交,在此引入作為參考。

技術領域

本發明總體而言涉及腫瘤生長的抑制,特別是腦腫瘤的抑制。

背景技術

本申請全文中的各參考文獻見括號中。本申請在此引入所有上述出 版物作為參考,以便更充分地描述本發明所屬領域的現狀。所有上述參 考文獻的全部文獻目錄見本申請文末,權利要求之前。

與其他實體瘤一樣,腦腫瘤需要不斷增長的血液供應以維持其持續 生長超過1-2mm3(1,2)。這要通過血管生成才能實現。血管生成是一種對 腫瘤細胞釋放的內皮生長因子的反應過程。該過程包括:在靜止的微脈 管系統中誘導內皮細胞增殖;新生內皮向腫瘤床遷移;最后成熟形成新 的毛細血管網(3)。腦腫瘤是所有人類新生物中血管生成最活躍的。在 膠質母細胞瘤和髓母細胞瘤患者組織切片進行的原位雜交或特異抗體試 驗證明,主要的血管生成因子是血管內皮生長因子(VEGF)和堿性成纖 維細胞生長因子(bFGF)(4-7)。膠質母細胞瘤和髓母細胞瘤是最常見 的惡性腦腫瘤。實際上,神經膠質瘤中的VEGF表達和微血管密度與其 惡性特征的程度及總體預后直接相關(8-9)。

新近的證據表明,血管生成受內皮細胞整合素活性的調節。整合素 是一個跨膜受體家族,可引導細胞通過與氨基酸序列Arg-Gly-Asp(RGD) (10)結合黏附到細胞外基質(ECM)蛋白上。在bFGF和VEGF的作 用下,內皮細胞中整合素αvβ3和αvβ5的表達分別上調(11-13)。膠 質母細胞瘤及其相關的血管內皮中發現有整合素αvβ3和αvβ5的表達 (14,15)。整合素介導的黏附導致細胞內信號傳播,從而促進細胞的生 存、增殖、運動及毛細血管的生成(16,17)。這些整合素與配體結合失 敗將導致內皮細胞凋亡(18,19)。基質中的糖蛋白-玻連蛋白,由惡性 膠質瘤的侵襲邊緣(the?leading?invasive?edge)產生,作為整合素αvβ3和αvβ5的配體(15,20)。同時,這些發現還說明在腫瘤細胞、腦ECM 和內皮細胞整合素之間存在一種復雜的旁分泌相互作用,以維持持續的 血管生成和惡性腦腫瘤的生長。

應用抗-αvβ3抗體LM-609或可阻斷內皮素-ECM相互作用的αvβ3和αvβ5RGD環肽拮抗劑進行的研究證明,在小雞的尿囊絨膜(CAM) 和小鼠嵌合體模型中存在抗血管生成反應(21-23)。其他作用于血管生 成通路選擇性位點的因子,如VEGF抗體或其酪氨酸激酶受體配體,也 可有效抑制血管生成(24,25)。

現有研究顯示,乳腺癌、黑色素瘤和HT29-D4結腸腺癌細胞與玻連 蛋白的黏附分別依賴αv、αvβ3和αvβ5(51-53)。由腫瘤和內皮細胞 所產生的玻連蛋白可被αvβ3和αvβ5所識別,同時也是在腫瘤侵襲及新 血管形成位點發現的一種ECM蛋白。除能通過αv連接及血管生成支持 內皮細胞生存之外,玻連蛋白的表達還能進一步加強腫瘤和表達αvβ3和αvβ5整合素的內皮細胞之間的黏附,從而促進腫瘤的侵襲性。在應 用乳腺癌SCID小鼠/人嵌合體模型進行的一項研究中,腫瘤的侵襲性在 應用抗-αvβ3抗體LM-609后明顯降低,這說明通過阻斷αvβ3可直接 影響腫瘤細胞的生物學特性。

由于具有高度的侵襲性和血管生成,腦腫瘤為進一步研究整合素在 腫瘤進展過程中的重要性提供了一種極好的模型。多項研究顯示,微血 管密度與星形細胞瘤的惡性程度及預后相關(57-59)。血管生成抑制劑 如TNP-470、血小板刺激素-1及血小板因子-4,已被用于實驗性腦腫瘤, 并顯示出對腫瘤生長的抑制作用(60-62)。然而,直至今日,尚無研究 檢測過針對整合素的拮抗作用對腦腫瘤侵襲性和血管生成的影響。因 此,有必要研究該影響并因而提供一種治療腦腫瘤的新方法。

發明內容

本發明基于以下驚人發現:針對整合素的靶向性拮抗作用,特別是 對αvβ3和αvβ5,能在體內顯著地抑制腦腫瘤的生成。腦腫瘤的微環境 對腫瘤行為及決定其對上述生物靶向治療的反應性非常關鍵。針對整合 素的拮抗作用能起到抗腫瘤生成的作用,此作用不依賴于抗血管生成作 用,可能協同性地阻止腫瘤的生長。例如,本發明的一項發現表明,針 對整合素的拮抗作用可直接誘導腦腫瘤細胞死亡。

因此,本發明一方面是提供一種抑制宿主腦部腫瘤生長的方法。該 方法包括,對需要上述抑制作用的宿主應用治療有效量的整合素拮抗 劑。

在本發明的一個實施方案中,整合素可為αvβ3或αvβ5。拮抗劑可 能是αv的多肽拮抗劑、抗-αvβ3的抗體、抗-αvβ5的抗體或分別抗αvβ3或αvβ5的抗體的合劑。

本發明的另一方面是提供一種宿主腦部腫瘤組織中血管生成的方 法。該方法包括,對宿主應用一種包含血管生成抑制劑量αv整合素拮抗 劑的組合物。

在本發明的一個實施方案中,整合素為αvβ3或αvβ5。拮抗劑是 αv的多肽拮抗劑、抗-αvβ3的抗體、抗-αvβ5的抗體或分別抗αvβ3或 αvβ5的抗體的合劑。

本發明的另一方面是提供一種抑制生長于宿主腦部的腦腫瘤細胞 ECM依賴性細胞黏附的方法。該方法包括,對宿主應用治療有效量的 αv整合素拮抗劑,即αvβ3或αvβ5整合素。在本發明的一個實施方案中, 拮抗劑是αv的多肽拮抗劑或分別抗αvβ3或αvβ5的抗體的合劑。

本發明的另一方面是提供一種抑制生長于宿主腦部的腦腫瘤細胞中 玻連蛋白依賴性細胞遷移的方法。該方法包括,對宿主應用治療有效量 的αv整合素拮抗劑。

在本發明的一個實施方案中,拮抗劑是αv的多肽拮抗劑或抗-αvβ3的抗體。

本發明的另一方面是提供一種在生長于宿主腦部的腫瘤細胞中誘導 凋亡的方法。該方法包括,對宿主應用治療有效量的整合素拮抗劑。

在本發明的一個實施方案中,整合素可為αvβ3或αvβ5。拮抗劑可 為αv的多肽拮抗劑。

本發明中的方法非常適合用于體內腦腫瘤治療。本發明提供了一種 治療腦腫瘤的新型治療途徑。

附圖說明

通過參考以下說明及相關的圖,本發明上文提到的與其他特征及獲 得這些特征的方法將變得十分明顯,同時也非常容易理解。這些圖例只 是描述了本發明的典型實施方案,但并不限制其范圍。具體特點及細節 如下:

圖1a和1b顯示αv拮抗劑對CAM上血管生成(a)和腫瘤生長(b) 的抑制作用。

圖2顯示腦內注射DAOY和U87MG細胞后的腫瘤大小(A)和小鼠 生存情況(B)。

圖3a和3b顯示每日用無活性(A)肽或有活性肽(B-D)治療的常 位注射腦腫瘤細胞DAOY(a)和Ug7MG(b)的組織病理學。對照動物 中可見巨大腦內腫瘤(箭頭所指)(A),而αv拮抗劑治療動物中無腫 瘤或僅在顯微鏡下可見殘余腫瘤(箭頭所指)(C和D)。

圖4顯示常位種植腦腫瘤的小鼠接受有活性或無活性肽治療后的生 存情況。

圖5顯示αv拮抗劑對常位(腦)和異位(皮下組織)種植DAOY細 胞的作用。

圖6a-6d顯示整合素的分布曲線及αv拮抗劑對腦腫瘤細胞和腦毛細 血管內皮細胞在玻連蛋白上的黏附(b)、遷移(c)及存活能力(d)的 作用。

圖7顯示環五肽對腫瘤細胞在ECM蛋白上黏附能力的影響。

圖8顯示黏附抑制作用的影響,導致腦腫瘤細胞和腦毛細血管細胞 中的細胞死亡(凋亡)。這種影響只限于ECM玻連蛋白和腱生蛋白。

圖9顯示移植到裸小鼠前腦并接受活性(抗-αv)或對照肽治療的 U87腫瘤細胞的免疫組織化學結果。

發明詳述

本發明一方面是提供一種抑制宿主腦部腫瘤生長的方法,包括對需 要上述抑制作用的宿主應用治療有效量的整合素拮抗劑。

由于腦部腫瘤的生長需要整合素與其配體的相互作用,本發明的方 法可用于治療任何生長于腦部的腫瘤。這類腫瘤的實例包括,但不僅限 于:膠質母細胞瘤、髓母細胞瘤(星形細胞瘤、其他原始的神經外胚層 和腦干惡性膠質瘤)。因本發明的目的起見,優選腫瘤生長定位于宿主 腦部的大腦內。宿主可為任何哺乳動物,包括但不僅限于:大鼠和人類。 如果生長遭到治療的損害,腫瘤生長就受到抑制。

因本發明的目的起見,整合素可為特定的同源異二聚體 (heterodimeric)跨膜受體家族中的任一成員。受體通過與氨基酸序列 Arg-Gly-Asp(RGD)結合而引導細胞黏附。受體在腫瘤細胞和正常細胞上 均可表達。在本領域中整合素的特性已有充分了解和清楚描述,描述細 節見引用參考文獻(1,2),有關內容在此引入作為參考。整合素的實例 包括但不僅限于:αv家族如αvβ3、αvβ5、αvβ1、αvβ6、αvβ8等。

整合素拮抗劑是一種通過抑制作為受體的整合素與其配體的結合, 從而阻斷或抑制整合素生理學和藥理學活性的分子。整合素的配體為各 種基質蛋白,包括但僅不限于:玻連蛋白、腱生蛋白、纖維結合素及膠 原蛋白I。在本發明的一個實施方案中,整合素的拮抗劑可為整合素αvβ3或整合素αvβ5的拮抗劑。優選的整合素拮抗劑既可是單克隆抗體, 也可以是單克隆抗體的片段,或是肽。

例如,αvβ3的拮抗劑可為能抑制αvβ3與其多個配體之一,即玻連 蛋白或腱生蛋白結合的任何因子。αvβ3拮抗劑的實例在PCT出版物 WO?96/37492和WO?97/45137中已有闡述,相關內容在此引入作為參考。

同樣,αvβ5的拮抗劑可為能抑制αvβ5與其配體,即玻連蛋白結合 的任何因子。αvβ5拮抗劑的實例在PCT出版物WO?97/06791中已有闡 述,相關內容在此引入作為參考。

在本發明的一個實施方案中,拮抗劑為αv的一種多肽拮抗劑,即 αvβ3和αvβ5的多肽拮抗劑。該多肽最好是含有Arg-Gly-Asp(RGD)的多 肽。在一個實施方案中,多肽拮抗劑為αv的RGD環五肽拮抗劑。

根據本發明的另一實施方案,拮抗劑可為αvβ3或αvβ5的免疫特異 性單克隆抗體。另外,它也可是分別抗αvβ3和αvβ5抗體的合劑。在一 個實施方案中,αvβ3的免疫特異性單克隆抗體具有被稱為LM-609的單 克隆抗體的免疫反應特征。在本發明的另一實施方案中,αvβ5的免疫 特異性單克隆抗體具有被稱為P1-F6的單克隆抗體的免疫反應特征。 LM-609和P1-F6抗體在本行業眾所周知,并可向美國加利福尼亞 Temecula的Chemicon商購。

因本發明的目的起見,拮抗劑可單獨或聯合用于本發明抑制腦內腫 瘤生長的方法中。

治療有效量是指在對宿主進行治療時,足以對宿主腦內腫瘤生長產 生可測量抑制作用的拮抗劑劑量。對腫瘤生長的抑制作用可通過在此進 行描述的染色后顯微鏡測量法、小鼠腦MRI掃描或本領域技術人員所熟 悉的3H-胸腺嘧啶摻入法進行測定。

在整合素拮抗劑可采取包含RGD的肽、抗αvβ3的單克隆抗體及其 片段、抗αvβ5的單克隆抗體及其片段或抗αvβ3和αvβ5單克隆抗體的 合劑等形式的情況下,應該意識到“治療有效量”的效力和表現都可以 是不同的。然而,如本分析方法所顯示,本領域的技術人員可以很容易 地評價本發明候選拮抗劑的效力。

拮抗劑的效力可通過多種方法進行測量,包括但不僅限于:在此進 行描述的CAM分析中的血管生成抑制、體內腦腫瘤分析及對天然配體與 整合素如αvβ3或αvβ5之間結合抑制作用的測量等分析法。

拮抗劑應用的劑量范圍取決于拮抗劑的種類及其對特定整合素的效 力。參考本發明所公開的內容,本領域技術人員無需過多實驗即可找到 特定拮抗劑的合適劑量。該劑量應該足夠大,以產生所想得到的抑制腦 內腫瘤生長的作用。該劑量也不應過大,導致引起不良反應,如腦水腫 或腦腫瘤中細胞因子迅速釋放導致kachexia,例如本發明中的一種整合 素拮抗劑以多肽形式應用時。每公斤體重劑量范圍為1-20mg,每天應用 一次或多次,應用一天或數天或長期應用。當本發明中的一種整合素拮 抗劑以單克隆抗體形式應用時,劑量范圍為1-20mg/kg,每日一次到每周 兩次長期應用。

本發明中的多肽或單克隆抗體通過注射或在一定時間內緩慢輸注進 行胃腸道外給藥。雖然組織經常通過腹膜內或皮下給藥接受治療,但是 本發明中的拮抗劑還可以通過眼內、靜脈內、肌肉內、腔內和透皮途徑 給藥,另外還可以通過peristaltic方式給藥。

組合物以一種劑量制劑可配伍的方式及治療有效量給藥。給藥的劑 量和時間取決于接受治療的對象、對象系統利用活性組分的能力以及預 期想達到的治療效果的程度。需要應用的活性組分的精確劑量依賴于醫 師的判斷,每個個體各不相同。然而,系統應用的適當劑量范圍將在此 進行公開,該劑量范圍依賴于給藥的途徑。適當的給藥方案也各不相同, 但典型的方案是先進行一次初始給藥,然后通過連續的注射或其他方式 重復給藥,每隔一小時或數小時給藥一次。

依照本發明的一個實施方案,本發明還為實施在此所闡述的治療方 法提供一種有用的藥物組合物。該組合物包含本發明中的一種拮抗劑和 一種藥劑學可接受的載體。在此所用的短語“藥劑學可接受的 (pharmaceutically?acceptable)”、“生理學上可耐受的(physiologically tolerable)”以及提到組合物、載體、稀釋物和試劑時的語法變化,都可 以互換使用,用于描述這些物質可以用于哺乳動物而不會引起不可預料 的生理學作用。

本發明的肽或抗體腸道外應用制劑包括無菌水溶液或非水溶液、懸 浮液和乳劑。非水溶劑的實例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油 及注射用有機酯如油酸乙酯。水性載體包括水、酒精/水溶液、乳劑或懸 浮液,包括鹽和緩沖介質。腸道外載體包括氯化鈉溶液、Ringer’s(林格 氏)葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格氏液或不揮發性油。靜脈內載體 包括液體和營養補充劑、電解質補充劑(如基于林格氏葡萄糖的溶液) 等。也可有防腐劑和其他添加劑,如殺菌劑、抗氧化劑、螯合劑及惰性 氣體等。

本發明的另一方面是提供一種抑制宿主腦內腫瘤組織中血管生成的 方法。該方法包括對宿主應用一種包含血管生成抑制劑量整合素抑制劑 的組合物。

如背景部分中所討論的,血管生成是在宿主原有血管的基礎上新血 管網的形成,對于腫瘤生長超過1-2mm3是必要的。對于本發明而言,如 果血管生成和由血管生成介導的疾病癥狀得到改善,血管生成將受到抑 制。

在本發明的一個實施方案中,腫瘤組織位于宿主腦部的大腦內。該 宿主可是任何哺乳動物。宿主的實例包括但不僅限于小鼠、大鼠和人類。

拮抗劑的應用劑量范圍取決于拮抗劑的形式和它對于特定整合素的 效力。參考本發明所公開的內容,本領域技術人員無需過多實驗即可確 定特定拮抗劑的合適劑量。劑量應該足夠大,以產生預期的效果,使血 管生成和由血管生成介導的疾病癥狀得到改善。該劑量也不應過大,導 致引起不良反應,如因腫瘤溶解引起細胞因子釋放或出血導致的腦水 腫。

在本發明的一個實施方案中,整合素的拮抗劑可為整合素αvβ3或 αvβ5的拮抗劑。優選整合素拮抗劑可為單克隆抗體或肽。在本發明的一 個實施方案中,拮抗劑為整合素αv的多肽拮抗劑、整合素αvβ3和αvβ5的多肽拮抗劑。其中多肽優選包含Arg-Gly-Asp(RGD)的多肽。在本 發明的一個實施方案中,多肽拮抗劑為整合素αv的RGD環五肽拮抗 劑。

依照本發明的另一實施方案,拮抗劑可為整合素αvβ3的抗體和分別 抗αvβ3和αvβ5的抗體的合劑。

治療有效量是指能在被治療組織中產生可檢測的血管生成抑制作用 的拮抗劑劑量,即血管生成抑制劑量。血管生成抑制可通過在此所述的 免疫組織化學方法或其他本領域技術人員所熟悉的方法進行原位檢測。

依照本發明的一個實施方案,本發明還為在此所述的治療方法提供 一種有用的藥物組合物。該組合物包含本發明的一種拮抗劑和藥劑學可 接受的載體。

本發明在另一方面提供了一種抑制宿主腦內腦腫瘤細胞間ECM依 賴性細胞黏附的方法,包括對宿主應用治療有效量的整合素αvβ3和αvβ5拮抗劑。

對于本發明而言,ECM依賴性細胞黏附包括任何依賴ECM及由整 合素αv介導的細胞黏附。這種黏附的實例包括但不僅限于:玻連蛋白依 賴性細胞黏附和腱生蛋白依賴性細胞黏附。本發明的一個發現是人腦腫 瘤可產生玻連蛋白和腱生蛋白,這些ECM通過與整合素相互作用,在腫 瘤細胞的黏附和遷移中起到重要作用。對于本發明而言,如果腫瘤細胞 對ECM的黏附降低就表示達到了抑制作用。

在此所用短語“治療有效量”是指足以使ECM介導的腫瘤細胞黏附 降低的拮抗劑劑量。細胞黏附可通過在此所述的方法和本領域所熟悉的 方法進行檢測。

依照本發明的一個實施方案,拮抗劑可為整合素αv的多肽拮抗劑或 分別抗αvβ3和αvβ5的抗體的合劑。例如,拮抗劑可為整合素αv的RGD 環五肽拮抗劑或被稱作LM-609和P1-F6的單克隆抗體的合劑。

本發明在另一方面提供了一種抑制宿主腦內腦腫瘤細胞玻連蛋白依 賴性細胞遷移的方法,包括對宿主應用治療有效量的αvβ3拮抗劑。

對于本發明而言,如果腫瘤細胞遷移減少就表示達到了抑制作用。

在此所用短語“治療有效量”是指足以使細胞玻連蛋白依賴性腫瘤 細胞遷移減少的拮抗劑劑量。細胞遷移可通過在此所述的方法和本領域 所熟悉的方法進行檢測。

依照本發明的一個實施方案,拮抗劑可為整合素αv的多肽拮抗劑或 具有抗αvβ3免疫反應的單克隆抗體。例如,拮抗劑可為整合素αv的 RGD環五肽拮抗劑或被稱為LM-609的單克隆抗體。

本發明還提供了一種誘導宿主腦內腫瘤細胞凋亡的方法。該方法包 括對宿主應用治療有效量的整合素拮抗劑。

對于本發明而言,如果應用拮抗劑后腦內觀察到的腦腫瘤細胞凋亡 數增多就表示誘導出了腦腫瘤細胞的凋亡。治療有效量是指在接受治療 的宿主腦內足以產生可檢測的腫瘤細胞凋亡的拮抗劑劑量。腦內腫瘤細 胞凋亡可通過在此所述的方法或本領域所熟悉的方法進行檢測。

依照本發明的一個實施方案,整合素可為αv、αvβ3或αvβ5。拮抗 劑可為αv的多肽拮抗劑。

???????????????????????? 實例

????????????????????? 材料和方法

材料:由德國達姆施塔特市Merck?KgaA公司A.Jonczyk博士提供 的活性環RGD五肽EMD?121974,環(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)及 無活性對照肽cRAD(EMD?135981)。單克隆抗體LM609和P1F6已有敘 述(13)。腦腫瘤細胞系DAOY和U87MG購自ATCC?Rockville博士。 人腦毛細血管內皮細胞基本培養液由美國洛杉磯兒童醫院的M.Stins博 士提供(49)。人玻連蛋白購自美國威斯康星州麥迪遜市Promega公司。

FACS分析:采用FACScan細胞計數儀(Becton-Dickinson,San Jose)。條件如前人所述(43)。一抗為1∶100的LM609和P1F6,二抗 為1∶250的FITC標記羊抗鼠IgG。按照廠家(美國加利福尼亞州Palo?Alto 的Clontech公司,Apo?Alert膜聯蛋白V-FITC細胞凋亡試劑盒)的說明 書來確定凋亡。

黏附:試驗條件如前人所述(15)。用非組織培養液處理過的板孔 與玻連蛋白在4℃下一起孵育過夜(1-20μg/ml?PBS),用熱變性的1% 的BSA?PBS溶液沖洗和封閉30分鐘,之后用PBS沖洗。與試驗物質(20 μg/ml)在黏附緩沖液中37℃下預先孵育了30分鐘的對照和試驗細胞被 加入到板孔中(5×104個細胞/孔),37℃下孵育1小時。用黏附緩沖液 輕柔沖洗板孔后,黏附的細胞被固定并染成紫色,染料溶解于甲醇,OD 為600°A。

遷移:Transwell聚碳酸酯濾器(8μm孔徑)與玻連蛋白PBS溶液 (頂部為1μg/ml,底部為10μg/ml)在37℃下孵育30分鐘,用1%熱 變性的BAS封閉30分鐘并用PBS沖洗。試驗細胞(5×105/孔)被加入 包含試驗指示物質(20μg/ml)的黏附緩沖液中,與含有黏附緩沖液的 底層小室在37℃下孵育4小時。用棉簽移走上層小室的細胞,濾器底部 的細胞被固定并染成紫色,通過計數確定遷移細胞的數量。

凋亡:黏附條件如上所述,除此之外,12孔板用玻連蛋白覆蓋,5 ×105個細胞/孔加入黏附緩沖液中。37℃下孵育30分鐘后,移去黏附緩 沖液,加入含20μg/ml活性cRAD肽的緩沖液并進一步孵育4小時。附 著細胞進行胰蛋白酶化處理,與上清液中的游離細胞一起用Apo?Alert膜 聯蛋白V-FITC細胞凋亡試劑盒進行凋亡細胞檢測。

CAM分析:雞卵提供者與制劑前人已有描述(23)。腫瘤細胞懸于 50μl?PBS中,DAOY細胞系濃度為4×106個細胞/卵,U87MG細胞系濃 度為3.5×106個細胞/卵。細胞在7天內生長成腫瘤,在無菌條件下收獲, 修整為相似大小,接種到10天大小胚胎的CAM上。接下來向CAM的 靜脈中注射活性或非活性肽(10μg/卵)。生長7天后對腫瘤進行原位 攝像,然后收獲、稱重并用4%的緩沖福爾馬林固定后石蠟包埋。連續切 片,切片用蘇木精和伊紅進行染色。

腦腫瘤模型:我們以前曾對模型的細節進行過闡述(31)。在所提 到的坐標處進行腫瘤細胞(106/10μl)腦內注射。在種植U87MG?3天后 及種植DAOY?10天后開始用活性cRGD或無活性cRAD肽(100μg/50 μl/小鼠)進行腹膜內治療,以后每日重復治療,直至出現惡液質和/或 垂死狀態。隨后用CO2麻醉處死動物,切除腦組織并用液氮進行速凍, 或用緩沖福爾馬林進行固定,石蠟包埋后切片進行蘇木精-伊紅染色。

皮下腫瘤生長:皮下腫瘤生長是在腦內注射后立即在小鼠右肩墊下 方的皮下注射腫瘤細胞(106/小鼠)。

動物試驗:動物試驗依照NIH指導方針進行,并得到了地方動物保 護委員會的許可。

??????????????????????????? 試驗

?????????????????????? CAM上的血管生成

為了評估αv拮抗作用對腦腫瘤相關血管生成的影響,在小雞的尿囊 絨膜(CAMs)接種DAOY和U87MG人腦腫瘤細胞。在腫瘤被切除和重 新種植到新鮮CAMs上之前,允許腫瘤生長7天。移植后24小時,向 CAM靜脈中注射活性cRGD肽和對照肽(cRAD)。腫瘤繼續生長6天 后進行稱重及血管生成分析。通過立體顯微鏡檢查,接受對照肽的腫瘤 顯示有廣泛的血管生成,而用αv拮抗劑治療的腫瘤顯示明顯的血管生成 抑制(圖1a)。腫瘤生長也受到αv拮抗劑的抑制。與對照腫瘤相比,對 照腫瘤重量增加80%,而αv拮抗劑治療的腫瘤重量減少30%(圖1b)。 這些數據顯示,αv拮抗劑對腫瘤生長的抑制是腫瘤相關血管生成受到干 擾所致。

圖1a和圖1b顯示αv拮抗劑對血管生成(a)和在CAM上腫瘤生長 的抑制。將生長在CAMs上的腫瘤收獲并修整成相同大小后置于10天大 小雞蛋的新鮮CAMs上。接下來,向小雞靜脈中注射100μg活性αv拮 抗劑或對照肽,繼續生長6天。接受對照肽的雞蛋表現出顯著的血管生 成(a)(DAOY=A,U87MG=C),而接受活性肽的雞蛋中觀察到顯 著的新血管生成抑制(DAOY=B,U87MG=D)。在試驗開始和結束時, 對位于CAM上的腫瘤進行稱重(b)。兩種腫瘤用對照肽進行治療的, 重量均增加了80%(左,n=8),而用活性肽治療的重量僅增加了30%(右, n=8)。

???????????????? 原位(orthotopic)腫瘤模型

DAOY和U87MG細胞(106/小鼠)在立體定向下注射到nu/nu小鼠 的右額葉皮質中,以期建立能概括腦微環境的系統。該方法可建立一個 高重現性的人腦腫瘤生成模型并能檢測腫瘤的生長和使用αv拮抗劑前 的小鼠生存情況(圖2a和2b)。圖2顯示在腦內注射DAOY和U87MG 細胞后,腫瘤的大小(A)和小鼠的生存情況(B)。U87MG細胞生長 迅速,6周內達到6mm左右的狀態,而DAOY細胞生長較為緩慢,9周 內達到5.5mm直徑(A)。所有動物在9周前死亡(B)。每個時間點的 n=5或6。

為了檢測此模型中cRGD肽的作用,腫瘤首先生長7天(DAOY)或 3天(U87MG)后,每日腹腔注射αv拮抗劑(100μg/小鼠)或無活性對 照肽3周。在處死動物的時候(腫瘤共生長4周),對照小鼠中有非常 明顯的腦腫瘤生長,平均大小為3mm(DAOY)和5.5mm(U87MG)。 治療組小鼠無腫瘤生長或僅在顯微鏡下發現腦室或硬腦膜表面有極少量 腫瘤細胞殘留(圖3a和3b)。圖3a和3b顯示原位(orthotopically)注 射的腦腫瘤細胞DAOY(a)和U87MG(b)每天用無活性(A)或活性 肽(B-D)治療的組織病理學表現。對照動物(A)中可見巨大腦內腫瘤 (箭頭所指),而αv拮抗劑治療的動物(C-D)中無腫瘤(B)或僅有 顯微鏡下殘留腫瘤(箭頭所指)。

治療小鼠體重還保持基線水平21g,而DAOY和U87MG對照小鼠體 重分別為16g和15g,比基線水平下降了5-6g(見表1)。對照組發生神 經病學癥狀的平均時間為:U87MG組小鼠2.5周,DAOY組小鼠4.5周, 而治療組小鼠在任何時間均未表現出神經病學癥狀。

表1 ???????細胞系 ???????????腫瘤大小(mm) ???小鼠腫瘤(g) ????????腦 ????皮下組織 ??DAOY 對照肽 ????3.0±0.71 ????18±1.41 ????16±1.3 活性肽 ????NM ????17±0.84 ????21±0.89 ??U87MG 對照肽 ????5.5±0.55 ????20±1.0 ????15±0.45 活性肽 ????NM ????19±0.77 ????20±0.71

NM=不可測量

另外還對小鼠進行了生存測試。測試在因小鼠處于垂死狀態而需要 進行處死時進行。所有對照組的動物都在腫瘤生長6周之前處死,兩對 照組中大多數(>50%)在3-4周內處死(圖4)。圖4顯示原位 (orthotopical)種植腦腫瘤的小鼠,U87MG組從第三天開始,DAOY組 從第七天開始,接受活性或非活性肽腹腔注射治療(100μg/小鼠/天)后 的生存情況。DAOY對照組和U87MG對照組的樣本數(n)均為16只 小鼠,DAOY治療組為32只小鼠,U87MG治療組為24只小鼠。圖4顯 示,治療組動物中無一需要處死,目前,自注射腫瘤細胞以來,DAOY 治療組小鼠已存活了24周,U87MG治療組小鼠已存活了15周。治療組 動物無一發生任何神經病學癥狀,所有動物仍繼續癥狀生長。

????????????????????? 異位腫瘤模型

為闡明微環境對受αv拮抗作用控制的腫瘤生長的影響,我們在治療 開始前在小鼠皮下注射相同的人腦腫瘤細胞(106細胞/裸小鼠),注射 腫瘤細胞后第三天(U87MG)和第七天(DAOY)開始用活性和對照肽 進行治療(100μg/小鼠/天,腹腔注射)。在這些條件下,腫瘤生長未被 活性肽抑制,6周后治療組和非治療組在肉眼和顯微鏡水平表現相同,均 出現廣泛的血管生成(數據未顯示)。這說明被檢測的腦腫瘤細胞的固 有特性不足以使其對cRGD肽拮抗劑敏感,必須在獨特的腦微環境下才 能起到抑制作用。

為進一步研究這一發現,我們于治療開始前同時在腦內和皮下注射 DAOY和U87MG細胞,肽治療與原位模型中所述相同。圖5顯示αv拮抗劑對原位(腦)和異位(皮下)種植DAOY細胞的影響。腫瘤細胞 (106)被注射到腦內和皮下,并在第七天開始用非活性(a)或活性(b) 肽進行治療。4周時進行攝影。接受非活性(a)或活性(b)肽的動物皮 下腫瘤的大小(A)和血管化程度(B)相似。在兩種情況下,皮下腫瘤 生長至下面的肌肉層(箭頭所指)(C)。相反,對照組發生巨大腦腫瘤 (箭頭所指),而接受活性肽治療的小鼠無腦腫瘤或僅有鏡下殘余腫瘤 (D)。因此,圖5顯示對照組和治療組的皮下腫瘤均生長至平均18mm3大小,并有明顯的廣泛血管生成(圖5)。對照組小鼠還發生巨大腦腫瘤, 大小與先前在原位腫瘤模型中所觀察到的相似,并有神經病學損害的臨 床證據(表1)。相反,接受活性肽治療的小鼠存活,并無神經病學癥狀, 尸檢無腦內腫瘤生長或僅有顯微鏡下腫瘤細胞簇(圖5)。但是,該組小 鼠的皮下腫瘤侵襲生長,需在10周時處死。這證明了生長于腦內的腫瘤 對環RGD肽治療有反應,而生長于皮下的同類腫瘤則無。

?????????????????????? 整合素的表達

玻連蛋白是一種基質蛋白,可影響腦內和皮下區域中的多種生物學 反應,富含于神經系統外組織中,但在膠質和神經元組織中很少產生 (15,20)。但是,惡性膠質瘤細胞可合成玻連蛋白,這對其附著和播散 都是非常重要的(15)。換句話說,玻連蛋白可促進內皮細胞的黏附和 向腫瘤床遷移,因此可增強血管的生成。由于細胞對玻連蛋白的附著是 由整合素αvβ3和αvβ5介導的,我們進行了FACS分析來確定人DAOY 髓母細胞瘤、UU87MG膠質母細胞瘤和原代培養的人腦內皮細胞是否表 達整合素αvβ3和αvβ5(圖6a)。

圖6a-6d顯示整合素的概況(a)、αv拮抗劑對腦腫瘤和腦毛細血管 內皮細胞與玻連蛋白黏附的影響(b)、對腦腫瘤和腦毛細血管內皮細胞 在玻連蛋白中遷移的影響(c)及對腦腫瘤和腦毛細血管內皮細胞在玻連 蛋白中生存力的影響(d)。DAOY和U87MG腫瘤細胞及腦毛細血管內 皮細胞均表達整合素αvβ3和αvβ5(a)。與玻連蛋白的黏附明顯受到 活性肽的抑制,活性肽與αvβ3和αvβ5的抗體合用時也是如此,但是對 照肽或αvβ3和αvβ5的特異性抗體單獨使用時均無明顯作用。細胞在玻 連蛋白梯度中的遷移被αvβ3抗體和αv拮抗劑完全破壞,而對照肽和αvβ5抗體對其無抑制作用。用以下方法進行細胞生存力檢測:令細胞與玻 連蛋白附著1小時后,分別使其暴露于對照肽或αv拮抗劑(20μg/ml) (d)4小時,將附著細胞和漂浮細胞混合,用FITC標記的抗膜聯蛋白V 和碘化丙錠通過FACS進行凋亡檢測。在暴露于對照肽(d,左)的培養 物中很少觀察到細胞凋亡,而腦毛細血管內皮細胞和DAOY細胞均顯示 有大量的凋亡細胞(d,右)。

圖6a-6d顯示U87MG細胞中αvβ3的表達水平高于DAOY細胞,但 是后者的αvβ5表達水平較高。生長于含VEGF培養基中的HBEC細胞 表達高水平的αvβ5,而在短期培養中,50%的細胞表達αvβ3。在包被 玻連蛋白的培養板上培養2天后,這些細胞也進行FACS分析。在這些 情況下,αvβ3和αvβ5的表達無改變(數據未顯示)。

??????????????????????? 玻連蛋白黏附

為了確定αvβ3和αvβ5是否能調節DAOY、U87MG和HBEC對玻 連蛋白的黏附,細胞被置于玻連蛋白包被的板孔中,在有或沒有αvβ3和αvβ5阻斷受體(LM-609和P1-F6)或cRGD肽存在的情況下進行黏 附。P1-F6最小限度地抑制DAOY細胞的附著,LM-609對任何細胞的附 著均無影響。當P1-F6和LM-609共孵育或cRGD肽單獨孵育時,所有細 胞的黏附都受到顯著的抑制(圖6)。這些數據說明,單獨阻斷任何一種 整合素都是不夠的,要明顯抑制玻連蛋白依賴的細胞黏附,就必須進行 αvβ3和αvβ5雙重阻斷。

??????????????????????? 玻連蛋白遷移

為了了解αvβ3和αvβ5是否能調節不依賴于黏附的在玻連蛋白上 的遷移,我們在存在阻斷抗體或cRGD的情況下,在Boyden小室中玻連 蛋白包被的膜上對相同的細胞進行了檢測。P1-F6不影響遷移,LM-609 和cRGD明顯抑制所有三種細胞的遷移(圖6c)。因為LM-609在缺乏 P1-F6的情況下不能阻斷黏附,所以這種抗遷移作用一定是通過其他不依 賴于對黏附反應能力的通路進行的。另外,LM-609與cRGD同樣能阻斷 遷移,說明αvβ3介導的細胞信號傳遞是受試的腦腫瘤和腫瘤內皮細胞 遷移測定中的關鍵組成部分。

??????????????????????????? 凋亡

高級別的星形細胞瘤在最前方的侵襲邊緣產生玻連蛋白,說明這種 蛋白質在腦腫瘤細胞的附著、遷移甚至是生存中起到重要的作用(15)。 我們之前已經展示了,腦腫瘤或毛細血管細胞與cRGD肽或抗αvβ3和 αvβ5抗體預先共孵育,可阻止細胞與玻連蛋白的黏附。在同樣的對與 基質蛋白質的整合素依賴性附著的抑制作用得到證明之后,內皮和黑色 素瘤細胞凋亡也已經得到證明(26-28)。為了確定αv拮抗劑是否能在 這些細胞從玻連蛋白上解附著之后誘導其凋亡。DAOY細胞和原代HBEC 細胞被種植于玻連蛋白包被板孔(1μg/ml)上的黏附緩沖液中,在37 ℃下附著30分鐘。隨后緩沖液置換為含cRGD或cRAD肽(對照)、濃 度為20μg/ml的緩沖液,然后孵育4小時。附著細胞在胰蛋白酶化后于 漂浮細胞混合,用抗膜聯蛋白V-FITC抗體和碘化丙錠(Clontech?Apo?alert 膜聯蛋白V-FITC凋亡檢測試劑盒)通過FACS確定凋亡細胞數。暴露于 對照肽cRAD的細胞凋亡很少,cRGD處理過的DAOY盒HBEC細胞都 有顯著的凋亡(圖6d)。這些數據說明cRGD肽不僅能將細胞從玻連蛋 白上解附著,還可以誘導其進一步凋亡。

???????? 五肽對腦腫瘤細胞與不同ECM底物黏附的影響

圖7顯示環五肽對腫瘤細胞與ECM蛋白質黏附的影響。非組織培養 盤與玻連蛋白、腱生蛋白、纖維結合素或膠原蛋白I(10μg/ml)在37 ℃下共孵育1小時,然后用PBS沖洗。沖洗之后,注入培養板中,5×105個細胞/孔,在37℃下孵育16小時。沖洗該培養物,并加入含20μg/ml 環五肽或對照肽的黏附緩沖液,再孵育2-24小時。再用黏附緩沖液沖洗 該培養物兩次,并用水晶紫染色進行OD600檢測。黏附細胞越多,OD 值越高。數據代表孵育8小時后的黏附細胞。U87=膠質母細胞瘤,DAOY =髓母細胞瘤。

如圖7中所說明,從玻連蛋白和腱生蛋白上解附著的細胞,其黏附 由αv整合素介導,而從膠原蛋白和纖維結合素上解附著的則不是,他們 與非αv整合素相互作用。在腦毛細血管細胞中也獲得相似數據(未顯 示)。

???????????????? 細胞解附著對細胞生存的影響

圖8顯示生長于ECM上并暴露于五肽的腦腫瘤和毛細血管細胞的凋 亡。除了解附著細胞和黏附細胞在胰蛋白酶化后混合外,測試條件如圖 7。沖洗這些細胞,懸于50μl?PBS中,在有蓋玻片的載玻片中離心 (cytospin)。用4%低聚甲醛固定后,用Boehringer凋亡試劑盒對細胞 進行凋亡染色。結果表示凋亡細胞在細胞總數中所占比例。試驗在與肽 共孵育24小時之后進行。

細胞解附著對細胞存活的影響見圖8。如圖所示,暴露于活性肽達 24小時并在玻連蛋白或腱生蛋白上生長的細胞與對照組細胞相比,死細 胞數增多。相反,五肽不會改變在膠原蛋白I或纖維結合素上生長的細 胞的存活情況。所有種類的腫瘤細胞和腦毛細血管細胞均可見細胞生存 減少。相似數據在細胞進行表達于細胞表面的細胞死亡早期標記染色時 獲得(Annexin-V,數據未顯示)。

???????????????? 人腦腫瘤中ECM蛋白質的產生

如上所述,腦腫瘤能在人體中產生玻連蛋白和腱生蛋白,據猜想這 些底物可改善腫瘤細胞的生存并增強其侵襲性。我們在我們的腦腫瘤模 型中檢測這些蛋白質的生成。

圖9顯示U87腦腫瘤移植到裸小鼠前腦中并用活性(抗αv抗體)或 對照肽進行治療后的免疫組織化學表現。小鼠接受腫瘤細胞注射(106細胞/小鼠),并在注射后第七天開始用活性或非活性肽(100μg/小鼠/ 天)治療。治療2周后切除腫瘤,用緩沖福爾馬林固定,石蠟包埋,進 行5μm切片。用大鼠抗小鼠單克隆抗體(Phamingen)、鼠抗人玻連蛋 白單克隆抗體(Sigma)、鼠抗人腱生蛋白抗體(Neo-Marker)對切片進 行CD31(毛細血管細胞標記)表達檢測,并用Boehringer凋亡試劑盒進 行死細胞檢測。CD31=毛細血管標記,VN=玻連蛋白,TN=腱生蛋白, APO=凋亡。

如圖9所示,腦腫瘤確實產生玻連蛋白和腱生蛋白,且其在腫瘤細 胞中的來源用人蛋白質特異抗體得到了證實。活性五肽的應用對這些蛋 白質的合成物影響。另外,我們還能證明腦腫瘤細胞在組織培養中產生 這些蛋白質(數據未顯示)。因而,我們的小鼠模型可以模擬人腦腫瘤 的情況。

五肽的抗血管生成作用見圖9頂部,我們對組織切片進行了名為 CD31的毛細血管細胞特異標記染色。用對照肽治療的腫瘤有許多此標記 染色陽性的血管,而在用活性五肽治療的腫瘤中很少看到這種血管 (p<0.05),說明存在毛細血管生長抑制。圖9底部顯示凋亡(死亡) 細胞染色。方法如圖8中所述。用活性五肽治療的腫瘤與用對照肽治療 的腫瘤相比,死細胞明顯增多(p<0.02)。對膠質母細胞瘤U87進行攝 影,髓母細胞瘤DAOY中也有相似數據獲得(未顯示)。

???????????? 細胞死亡與腫瘤細胞凋亡之間的聯系

為了證明這種細胞死亡的增加時由于直接腫瘤細胞凋亡而不是對毛 細血管生長抑制的結果,我們在小鼠腦內種植了黑色素瘤細胞,該細胞 表達(M21Lαv陽性)或不表達(M21Lαv陰性)αv整合素。如果接受 αv陽性細胞種植并用活性五肽治療的小鼠生存期長于用對照肽治療的 小鼠,則直接腫瘤細胞凋亡應該是其原因。

表2顯示負荷αvβ3陰性和陽性腫瘤的小鼠用RGDfV治療的存活情 況。腫瘤細胞(106)被注射到6周齡裸小鼠的前腦中,并在第三天開始 用活性或非活性肽(100μg/小鼠/天)進行治療。當出現惡液質時處死小 鼠,通過尸體解剖證明腫瘤的存在。

表2 ???????細胞系 ???????????????存活期(天) ????RGDfV(活性) ????RADfV(對照) ????M21Lαv陰性 ????15.7±3.8 ????15.3±3.3 ????M21Lαv陽性 ????36.5±2.9 ????17.3±1.9

如表2所示,接受αv陰性黑色素瘤細胞種植的小鼠存活15天,與 所接受的治療無關。相反,負荷αv陽性腫瘤小鼠的存活期在接受活性五 肽治療時增加到36天,而接受對照肽治療的小鼠存活17天。這說明直 接腫瘤細胞凋亡應該是腫瘤細胞死亡的原因。

總之,以上討論的數據支持環五肽誘導直接腫瘤細胞死亡的假設。

??????????????????????????? 討論

腦腫瘤具有高度的血管生成,同時其持續生長依賴于新血管的生 成。因此,抗血管生成可能是針對這些惡性腫瘤的重要治療策略。由于 在血管生成過程中,整合素αvβ3和αvβ5在血管內皮上的表達被激活, 因此它們是候選的抗血管生成靶點(12,13)。它們在血管生成中的作用 已被以往的研究所證明,這些研究顯示在CAM中由bFGF和TNF-α誘 導的血管生成可被αvβ3阻斷抗體LM-609或αvβ3和αvβ5的拮抗劑環 五肽所抑制(21,23)。在任一情況下,抗血管生成作用被認為是通過 阻止必要的αv-基質蛋白質結合的相互作用,進而誘導內皮細胞凋亡實現 的(28-30)。在本研究中,我們采用類似于特異RGD環肽的αvβ3和 αvβ5的拮抗劑(EMD121974),證明其對兩個人腦腫瘤細胞系DAOY和 U87MG在CAM中誘導的血管生成的抑制能力。cRGD治療不僅能抑制 CAM的血管生成,還能進一步導致腫瘤壞死和腫瘤萎縮。

為了證明是否能在一個反映腦部微環境的模型中得到相似的反應, 腦腫瘤細胞通過立體定位注射到裸小鼠前腦中。由于在CAM分析中對肽 的反應性及其以往體內試驗所證明的廣泛侵襲性和血管生成,U87MG膠 質瘤和DAOY髓母細胞瘤細胞被選用于研究(31,32)。在此原位模型 中,cRGD再次顯著地抑制了U87MG和DAOY腦腫瘤的生長。對照小 鼠屈服于腫瘤的進展并發現有平均體積大于3mm3的高侵襲性腫瘤。用 cRGD治療的小鼠存活且無發病的證據,除了沿著種植位點有殘余的細 胞或在腦室和硬腦膜表面有小的細胞簇外,未能檢測到有活力的腫瘤。 所有聚集在治療組的殘余腫瘤均小于1mm3,因此并未獲得宿主血管生 成反應。可供選擇的血管生成抑制劑,如血小板反應素-1、TNP-470及 血小板因子4,也顯示出對實驗性腦腫瘤生長的抑制作用,但是這些抑制 作用中大多數在皮下移植瘤中受限,或者需要通過立體定位注射直接將 藥物輸送到腫瘤床(32-34)。在SCID小鼠/大鼠Leydig細胞皮下腫瘤模 型中,在腹腔內應用αvβ3的肽拮抗劑后,顯示出可抑制腫瘤80%的生 長(35)。血管他汀,一種抗血管生成劑,通過一種不明的作用機制, 也顯示出對腦內C6和9L大鼠膠質瘤移植物有相當強的抑制作用(36)。 與我們的研究不同的是,在腫瘤細胞種植后立即開始用血管他汀(1mg/ 小鼠/天)或肽類似物拮抗劑(2mg/小鼠/天)進行治療。我們的研究顯示, 已成活的腫瘤移植物幾乎被全部消除,同時也是第一次顯示通過整合素 拮抗機制對腦腫瘤生長和血管生成的抑制作用。

有趣的是,在我們的研究中,同時在皮下生長的DAOY和U87MG 腫瘤顯示對cRGD治療無反應或反應很低。這一現象強調了細胞外環境 在調節宿主-腫瘤-細胞整合素反應中的重要性。血管他汀顯示對s.c.和i.c. 注射的腦腫瘤細胞同樣有抑制作用,說明這種化合物是通過與RGD肽不 同的機制抑制血管生成(36)。cRGD對腫瘤生長抑制作用差異的一種 可能解釋是皮下的內皮細胞可能與CNS微血管系統中的內皮細胞具有本 質性差異,前者的血管生成對整合素拮抗機制的敏感性較差。最近的發 現支持這一假設,在αv高表達的小鼠中,只有腦和腸的毛細血管細胞異 常,而其他循環系統均正常(37)。換句話說,作為內皮細胞整合素配 體的基質蛋白質可被腫瘤細胞優先表達,但是要依賴于是原位腫瘤還是 異位腫瘤。例如,皮下種植的人膠質母細胞瘤細胞未發現產生玻連蛋白, 但是將其置于腦微環境,則可誘導玻連蛋白基因的表達(15)。當受到 膠質瘤細胞侵襲時,正常腦組織似乎可改變ECM蛋白質的表達(38)。 不象神經系統外位點,玻連蛋白正常存在于腦組織中,這種蛋白質在CNS 中的微小變化可深刻影響細胞反應。研究顯示內皮細胞的移動力依賴于 玻連蛋白的濃度和細胞-基質接觸點之間的距離,后者允許細胞的移動 (39,40)。

在我們的研究中,肽的抗腫瘤生成作用通常高于其他抗血管生成 劑。由于許多腫瘤也表達αvβ3和αvβ5整合素(包括U87MG和 DAOY),整合素拮抗劑的作用不會限于宿主內皮,盡管特異整合素在 腫瘤細胞反應中的重要性尚不清楚(41)。先前的研究已經顯示,膠質 瘤、乳腺癌、黑色素瘤和HT29-D4結腸腺癌細胞與玻連蛋白的附著依賴 于αv整合素(42-45)。玻連蛋白由腫瘤和基底細胞產生,在腫瘤侵襲 和新血管生成的部位含量豐富,包括惡性腦腫瘤(46,47)。因此,玻連 蛋白除了支持內皮細胞生存之外,對增強表達αvβ3和αvβ5的腫瘤細胞 的黏附和侵襲也很關鍵。在SCID小鼠/人乳腺癌嵌合模型中,應用抗αvβ3抗體LM-609后腫瘤的侵襲明顯降低,說明αvβ3阻斷劑對腫瘤有非 血管生成依賴的直接抑制作用。

為了闡明這個問題,我們利用DAOY、Ug7MG和分離的原代人腦內 皮細胞(HBEC),在存在αv拮抗劑的情況下,檢測了在玻連蛋白上的 細胞黏附和遷移(49)。抗αvβ3抗體LM-609抑制U87MG、DAOY和 HBEC在玻連蛋白上的遷移,與抗αvβ5抗體P1-F6合用抑制這些細胞對 玻連蛋白的黏附。cRGD單獨使用可顯著抑制所有三類細胞對玻連蛋白 的黏附及在玻連蛋白上的遷移。在相似的研究中,黑色素瘤細胞侵襲被 玻連蛋白所增強,被RGD肽所阻斷(50)。最后,cRGD治療不僅導致 HBEC細胞中凋亡增加,而且在DAOY和U87MG腫瘤細胞中也是如此。 這些結果提示,除了抗血管生成功能以外,cRGD可直接抑制腫瘤缺陷 和增殖。

我們的資料進一步顯示,環五肽可抑制腦腫瘤細胞與不同ECM底物 如玻連蛋白或腱生蛋白的黏附。這種對黏附的抑制作用可在腦腫瘤細胞 和腦毛細血管細胞中導致細胞死亡(凋亡)。這種作用局限于ECM玻連 蛋白和腱生蛋白。我們還證明細胞死亡的增加是由于直接細胞凋亡而不 是由于抑制毛細血管生長的結果。換句話說,本發明的發現之一是環五 肽誘導直接腫瘤細胞死亡。

總之,該研究證明針對整合素尤其是αvβ3和αvβ5的靶向拮抗作 用,能基本抑制體內腦腫瘤生成,因此提供了一種治療腦腫瘤的重要新 方法。我們的結果還提示,微環境對腫瘤行為和決定其對此類直接生物 治療的反應性非常關鍵。最后我們顯示整合素拮抗作用能起到非抗血管 生成依賴的抗腫瘤生成作用,可增強阻礙腫瘤生長的作用。

上述的內容旨在說明而非限定本發明的范圍。實際上,鑒于本文的 教導本領域技術人員無需過多實驗即可設想和提出其它實施方案。

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