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治療奶牛乳房炎的涂膜劑及其制備方法.pdf

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治療 奶牛 乳房 涂膜劑 及其 制備 方法
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摘要
申請專利號:

CN200410065838.5

申請日:

20041221

公開號:

CN1660209A

公開日:

20050831

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A61K35/78,A61K9/70,A61P15/14,A61P29/00 主分類號: A61K35/78,A61K9/70,A61P15/14,A61P29/00
申請人: 江蘇省農業科學院
發明人: 戴鼎晨,方泰惠,王曉麗,甘黎明,夏興霞,蔣兆春
地址: 210014江蘇省南京市孝陵衛鐘靈街50號
優先權: CN200410065838A
專利代理機構: 南京蘇高專利事務所 代理人: 柏尚春
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法律狀態
申請(專利)號:

CN200410065838.5

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種治療奶牛乳房炎的涂膜劑,它是以蛇床子、紫花地丁、芙蓉花、金銀花、蒲公英為有效成分,苯甲酸鈉為防腐劑,冰片為促透劑、聚乙烯醇為成膜材料、甘油為助溶劑,水、乙醇為溶劑,按比例配制,再經煎煮、除渣、過濾、煎煮濃縮、定容制成涂膜劑。本發明配方及制作方法獨特,治療效果顯著。

權利要求書

1、一種治療奶牛乳房炎的涂膜劑,其特征在于它是由下述重量體積配比的原料制成的涂膜劑:紫花地丁100~150克、金銀花150~200克、蛇床子200~300克、蒲公英100~150克、芙蓉花100~150克、苯甲酸鈉3~4克、聚乙烯醇124?30~40克、甘油50~100毫升、水550-600ml、乙醇定容至1000ml。2、根據權利要求1所述的治療奶牛乳房炎的涂膜劑,其中各有效成分的重量體積配比是:紫花地丁150g、金銀花200g、蛇床子300g、蒲公英150g、芙蓉花150g、苯甲酸鈉3g、聚乙烯醇12440g、甘油100ml、水不低于550ml、乙醇定容至1000ml。3、根據權利要求1或2所述的治療奶牛乳房炎的涂膜劑,其特征在于每1000毫升涂膜劑中含有冰片30~50克。4、如權利要求1所述的治療奶牛乳房炎的涂膜劑的制備方法,其特征在于包括以下步驟:(1)按所述成分進行稱重、配比;(2)加水文火煎煮;(3)除去藥渣;(4)靜置;(5)過濾、濃縮;(6)加入乙醇;(7)去沉淀;(8)回收乙醇;(9)復加水沉淀;(10)除去沉淀;(11)上清液煎煮濃縮;(12)加水;(13)緩慢加入聚乙烯醇124、甘油及苯甲酸鈉溶液,邊加邊攪拌;(14)加入含冰片的乙醇溶液定容至1000ml充分攪拌均勻、過濾制得。5、根據權利要求4所述的治療奶牛乳房炎的涂膜劑的制備方法,其特征在于步驟(2)中所述的煎煮為文火煎煮。

說明書

?

一、技術領域

本發明涉及一種治療奶牛乳房炎的涂膜劑及其制備方法。具體地說是以中草 藥為原料、配合防腐劑、促透劑制備的中成藥,本發明還涉及該藥物的制備方法。

二、背景技術

奶牛乳腺炎是指由于接觸傳染性病原微生物定植于奶牛的乳腺或由于奶牛 的環境、乳頭、乳房、創口或擠奶器被病原菌污染,使病原菌進入乳頭池引起乳 腺感染所引發的炎性過程。中獸醫又稱之為奶腫、乳癰等。乳腺炎可分臨床型和 隱性二種。江蘇省農業科學院畜牧獸醫研究所于2000~2002年對南京地區的奶 牛乳腺炎的發病情況進行了調查,共調查集體奶牛場的奶牛452頭和專業戶飼養 的487頭奶牛,其中臨床型乳腺炎的發病率為30.9%,隱性乳腺炎發病率為56.76% (頭陽性率)。中國農科院中獸醫研究所曾對我國22個城市的32個奶牛場的 10371頭成年奶牛的乳腺炎的發病情況進行了調查,發現臨床型乳腺炎的發病率 平均為33.41%(9.7%~55.6%),隱性乳腺炎的發病率為74.57%。相比之下,由 于發病率特高,且影響奶產量,造成的經濟損失更大。因此,預防和治療隱性奶 牛乳腺炎便顯得尤為重要。

目前,公認抗生素治療奶牛乳房炎不僅會造成藥物殘留,影響奶的收購,而 且會造成細菌耐藥性。而中草藥制劑因其無毒、無殘留,療效顯著,得到廣泛的 重視與應用。但中藥劑型多以口服散劑,乳房注射劑具多。散劑的優點是療效可 靠、使用方便,但由于藥物經胃腸吸收,進入全身血液循環,又經肝臟的“首過 效應”。真正進入乳房組織的有效物質已經很少;乳房內注射劑因直接將藥物經 乳頭注入乳內,藥物濃度高,吸收快,療效好,但缺點是可能會對乳腺組織產生 刺激性,會引發新的炎癥。總結上述中藥劑型的優缺點,江蘇省農科院獸醫研究 所項目組有關專家提出以外用透皮劑用于治療奶牛乳房炎的設想。透皮劑種類較 多,中國傳統的膏劑就是一種外用透皮劑,但應用于奶牛乳房炎治療就不甚方便, 一是不便涂貼,二是影響擠奶,三是容易脫落,難以在生產上推廣。國外近些年 來推出了一種以高分子材料為基質的外用涂膜透皮劑,優點是載藥量大,刺激性 小,因而備受醫學界工作者的推崇,該劑型在醫學上已得到廣泛應用,如治療局 部組織如甲狀腺、前列腺、乳房等部疾患非常有效。

由于科學技術的進步,現代的經皮給藥遠遠突破了傳統界限。現代科學實驗 已證實,藥物透皮吸收過程包括釋放、穿透及吸收進入血液循環三個階段。釋放 指藥物從基質中脫離出來并擴散到皮膚或黏膜表面上,穿透指藥物通過表皮進入 真皮、皮下組織,主要對局部組織起作用,吸收指藥物通過皮膚微循環或黏膜接 觸后通過血管進入體循環而產生全身作用,其中分子量小的藥物,能向角質層中 擴散,擴散速度越往里越大;分子量較大的藥物以毛孔和汗腺吸收途徑為主。透 皮給藥制劑的優點或特點問世,概述大致有:(1)以保持血藥水平穩定在治療有 效濃度范圍內,具有更優越的效能性的;(2)可以提高藥物在體內的預見性,由 于避免了胃腸道及肝的“首過作用”,透皮給藥比口服給藥更穩定地直接進入血 流;(3)改善病者的適應性,不必頻繁給藥;(4)提高安全性,如有副作用,易 將貼劑移去,隨時終止給藥,減少了口服或注射給藥的危險性;(5)可以按貼敷 面積增大或減少藥物劑量,避免藥物的浪費;(6)經皮給藥具有最大的方便性和 簡單性,沒有其它劑型可能產生的困難和痛苦。

該劑型的優點是除具有正常療效外,還可自行成膜,不會從皮膚脫落,在使 用后3~5分鐘,藥劑中的成膜材料即可在外表面形成簿膜,保護內層中藥成分 不會散失,因藥膜緊緊吸附在乳房表皮,不會造成藥物脫落,在下次使用時,可 揭除整個藥膜,使用非常方便。鑒于此,中藥涂膜劑已在奶牛業上得到應用,如 浙江金華大康動物保健品有限公司研制的“乳康涂膜劑”已開始應用于生產。但 該制劑的組方是以傳統的蒲公英、金銀花、連翹、通草等中草藥,而江蘇省農科 院獸醫研究所推出了研制開發中藥涂膜劑研制的“復方蛇床子乳炎涂膜”是以蛇 床子、紫花地丁、芙蓉花、金銀花等為主的涂膜劑,產品性狀、生產工藝均有很 大差異。

三、發明內容

本發明目的在于提供一種具有改善病者的適應性,提高用藥安全性,使用方 便的治療奶牛乳房炎的涂膜劑。

本發明的另一目的是提供奶牛乳房炎的涂膜劑的制備方法。

本發明的解決方案是基于醫學上應用非常廣泛的藥透皮劑。經透皮實驗證 實,以中藥成分蛇床子素為測定對象,通過奶牛乳房部位皮膚為透皮材料,表明 該制劑有明顯的透皮效果。這為奶牛乳房炎透皮效果提供了依據。在奶牛乳房炎 實際治療過程中,如采用巴布劑、膏劑等透皮藥,則需要布、狗皮等墊料,而乳 牛乳房結構不適合張貼,除非添加乳罩樣設計。根據這一特點,選擇了涂膜劑型, 因為該劑型可自行成膜,保護內層藥物向皮內擴散,且可隨時揭除,隨時涂膜, 使用很方便。

本發明的治療奶牛乳房炎的涂膜劑是由下列組分制成的:(用量為重量體積 份)

紫花地丁100~150克、金銀花150~200克、蛇床子200~300克、蒲公英 100~150克、芙蓉花100~150克、苯甲酸鈉3~4克、聚乙烯醇124?30~40克、 甘油50~100毫升、水不低于550ml,乙醇定容至1000ml。

制備本發明涂膜劑的最佳重量體積配比是:

紫花地丁150g、金銀花200g、蛇床子300g、蒲公英150g、芙蓉花150g、 苯甲酸3g、冰片50g、聚乙烯醇124?40g、甘油100ml、乙醇定容至1000ml。

將上述各組分制成本發明涂膜劑的生產方法是:

(1)按質量標準中處方要求進行中藥飲片稱重、配比;(2)加水煎煮;(3) 除去藥渣;(4)靜置;(5)過濾;(6)加入乙醇使成70%含量;(7)去沉淀;(8) 回收乙醇;(9)復加水沉淀;(10)除去沉淀;(11)上清液煎煮濃縮;(12)加 乙醇使成60%含量的藥液;(13)緩慢加入聚乙烯醇甘油、苯甲酸鈉溶液,邊加 邊攪拌;(14)加入冰片的乙醇溶液定容至1000ml充分攪拌均勻制得;其中步驟 (2)中的煎煮為文火煎煮,時間大約2小時;步驟(4)中的靜置時間大約為 24小時。

本發明的一個重要特點是涂膜劑中含有蛇床子。有關實驗如下:

1、涂膜劑抑菌試驗。

用打孔器將定性濾紙打成與標準藥敏紙片一般大的圓形紙片,直徑約6mm。 將紙片于該涂片劑中浸透、涼干,參照藥敏紙片法試驗在營養瓊脂平板上做復方 蛇床子乳炎涂膜劑對無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌的抑菌試驗,同 時設青霉素鈉藥敏紙片做對照。細菌培養液分別均勻涂布于平板后,貼上藥敏紙 片,分別置37℃溫箱培養,24h~36h后觀察結果。青霉素紙片對3種細菌均有 非常敏感的抑菌作用,抑菌圈在20mm以上,屬高度敏感;涂膜劑對金黃色葡萄 球菌抑菌圈達19.8mm,按近高度敏感,對無乳鏈球菌和停乳鏈球菌抑菌圈分別 達18.3mm和16.5mm,屬中度敏感。從上述結果看,該涂膜劑對奶牛乳房炎常見 致病菌有較好的抑菌效果,雖然抑菌效果不如青霉素,主要是由于該藥劑不完全 是通過抑菌來發揮藥效,而應該是通過抗菌抗炎、提高免疫力來達到治療目的。

2、涂膜劑對小鼠的抗炎作用。

采用昆明種小鼠,雄性19~21g,用硫化鋇脫毛后,洗凈擦干,將涂膜劑按 2.25cm2面積涂布于脫毛處,待3~5分鐘成膜后,為防小鼠撕咬,用膠帶固定 4h,將二甲苯涂于小鼠左耳。1h后處死小鼠,取動物左、右耳用內徑8mm的鋼 銃銃下耳片稱重,比較腫脹度。腫脹度=左耳片重量-右耳片重量。試驗組、對 照組均為10只。

結果見下表,涂膜劑對二甲苯所致的耳腫脹有明顯的抗炎作用。 組別 動物數(n) ??劑量(cm2/20g) ??耳腫脹度(Mean±SD) 涂膜組 ????10 ????2.25 ????0.0138±0.0043 對照組 ????10 ????2.25 ????0.0063±0.0061*

3、涂膜劑對小白鼠白細胞吞噬機能的影響。

采用昆明純種小白鼠,體重21-25克,全部雌性,共32只:藥物組、對照 組和空白組均10只。

白細胞吞噬試驗:用金黃色葡萄球菌(菌種為中監所1885/C56005)接種于 普通瓊脂,37℃恒溫培養18小時后,用生理鹽水稀釋成含菌量為20億/毫升的 菌懸液。給藥3天后各組小鼠均腹腔注射0.6ml菌懸液;6小時后斷尾采血涂片, 瑞氏液染色。100倍油鏡下計數100個白細胞,記錄吞噬細菌的白細胞總數。吞 噬率=(吞噬有葡萄球菌的中性粒細胞/100個中性粒細胞)×100%

結果見下表,藥物組與對照組,藥物組與空白組比較,白細胞吞噬百分率差 異均極顯著(P<0.01)。藥物組白細胞吞噬百分率比對照組高22.1-10.5=11.6 個百分點,藥物組比空白組高22.1-10.1=12個百分點。而對照組白細胞吞噬百 分率與空白組相差10.5-10.1=0.4,兩組差異不明顯(P>0.05)。 ????組??別 ????動物 ????只數 ????吞噬百分率% ????(X±Sx) ????T值 ????P值 藥物組 對照組 空白組 ????10 ????10 ????10 ????22.1±2.77 ????10.5±2.29 ????10.1±1.81 ????3.681* ????3.625* ????<0.01 ????<0.01

4、涂膜劑對健康大白兔皮膚安全性試驗。

取6只實驗健康大白兔,雌雄各半,體重2.2+0.35kg,分為二組并在背部 用脫毛劑脫出10×20cm2無毛區。脫毛后第2天,將一組兔在背部左冊涂布該涂 膜劑,右側涂布空白基質劑,待3~5分鐘成膜后,隔離飼養觀察;第二組用針劑 人為破損皮膚,按下面標準觀察并評定打分,最后統計平均刺激反應值,評價刺 激性大小。評定標準??紅斑:無紅斑0分;勉強可見1分;明顯可見2分;中度 嚴重紅斑3分;紫紅色紅斑并有焦痂4分;水腫:無水腫0分;勉強可見1 分;可見(邊緣高出皮膚)2分;皮膚隆起約1mm,輪廓清楚3分;水腫隆起 1mm以上4分。最高值為8分。結果由下表可以看出,完整皮膚組無紅斑和水腫 反應;損傷皮膚組未發現明顯的紅斑和水腫反應,個別兔在用藥初有勉強可見的 紅斑但不久消失,表明該涂膜劑無論對完整皮膚組還是破損皮膚組均無明顯的刺 激性。 皮膚處理 ??動物數 ??? 積分總和 ??? 平均反應值 ????1h?24h?48h ????1h???24h??48h 正常皮膚使用空白基質 正常皮膚使用涂膜劑 損傷皮膚使用空白基質 損傷皮膚使用涂膜劑 ????3 ????3 ????3 ????3 ????0??0???0 ????0??0???0 ????2??0???0 ????2??0???0 ????0?????0???0 ????0?????0???0 ????0.66??0???0 ????0.66??0???0

4、涂膜劑穩定性試驗。

本試驗驗證了3個批次“復方蛇床子乳炎涂膜劑”在密封、干燥、室溫條件 下保存1個月、2個月、3個月、6個月、12個月在顏色、氣味、氯原酸和蛇床 子素測定及對大白兔皮膚刺激性等方面有無變化。

(1)在不同時間段性狀及有效成分測定。

選擇3個批次的涂膜劑分別在生產后第1、2、3、6、12個月檢查、顏色、 氣味及氯原酸和蛇床子素檢測(均按質量標準要求測定),記錄結果,并作比較 分析。結果表明:在生產后1個月、2個月、3個月、6個月及12個月檢查均與 生產后第1天無明顯區別,氯原酸及蛇床子測定均符合質量標準要求(見下表)

????????????????????“涂膜劑”性狀及有效成分測定 批次 顏色 氣味 綠原酸 蛇床子素 1 2 3 6 12 1 2 3 6 12 1 2 3 6 12 1 2 3 6 12 20020403 棕 褐 棕 褐 棕 褐 棕 褐 棕 褐 香 苦 香 苦 香 苦 香 苦 香 苦 + + + + + + + + + + 20020613 棕 褐 棕 褐 棕 褐 棕 褐 棕 褐 香 苦 香 苦 香 苦 香 苦 香 苦 + + + + + + + + + + 20021103 棕 褐 棕 褐 棕 褐 棕 褐 棕 褐 香 苦 香 苦 香 苦 香 苦 香 苦 + + + + + + + + + +

注:+表示檢測呈陽性反應

(2)觀測兔皮膚刺激性試驗。

分別取生產后6個月和12個月的“復方蛇床子乳炎涂膜劑”作大白兔試驗。 經試驗,該涂膜劑不引起大白兔皮膚出現紅、腫等刺激性反應,證實保存一年后, 該藥劑仍可安全涂抹用于治療。

(3)假單胞菌(Pseudomonzs?zeruginosa)檢測。

取膽鹽乳糖培養基3份,每份100ml,2份分別加入規定量的供試液,其中 1份加入對照菌液作為陽性對照,陽性菌為本單位分離、鑒定和保存的綠膿桿菌, 第3份加入與供試液等量的稀釋液作陰性對照。培養18~24小時,觀察陰性對照 有無菌生長,其余2份培養液化線接種與溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基平板 上,培養18~24小時。當陽性對照的平板生長的菌落呈陽性菌落時,供試品的平 板無菌落或無疑似菌落生長,可判未檢出銅綠假單胞菌。經微生物學檢驗,生產 后第1、2、3、6、12個月的涂膜劑液體培養均無可疑菌落生長,表明該制劑均 未發現綠膿桿菌及金黃色葡萄球菌,由此證明該涂膜劑未受這兩種細菌的污染。

(4)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus?aureus)檢測。

取亞碲酸鈉肉湯(或營養肉湯)培養基3份,每份100ml,2份分別加入規 定量的供試液,其中1份加入對照菌液作為陽性對照,第3份加入與供試液等量 的稀釋液作為陰性對照。均培養18-24小時(必要時可延至48小時)。觀察陰性 對照有無細菌生長。取其余2份培養液劃線接種于卵黃高鹽瓊脂培養基平板或甘 露醇高鹽瓊脂培養基平板,培養24-72小時。當陽性對照菌C56005的平板呈現 陽性菌落時,供試品的平板如無菌落生長,或有菌落但不同于上表所列特征,可 判未檢出金黃色葡萄球菌。 培養基 菌落形態 卵黃高鹽瓊脂 金黃色。圓形凸起,邊緣整齊,外圍有卵磷脂分解的乳濁 圈,菌落直徑1~2mm 甘露醇高鹽瓊脂 金黃色。圓形凸起,邊緣整齊,外圍有金黃環,菌落直徑 0.7~1mm

5、測定了涂膜劑對無乳鏈球菌乳酸脫氫酶(LDH)的影響,表明該方劑組合 在達0.0625g/ml時能夠降低LDH活力。

6、涂膜劑對小鼠表皮細胞作用的超微結構觀察,該涂膜劑能破壞小鼠表皮 角質層細胞,有利于促進藥物透過皮膚。

7、涂膜劑中蛇床子素在兔血漿中的藥物代謝動力學。

試驗材料:3只新西蘭白兔,體重2kg左右,籠養,表現健康。

儀器:高效液相色譜儀Agilent1100(中國惠普),Eclipse?DB-C18柱(4.6 ×250mm,5.0um);低溫高速離心機,美國Beckman公司。

試驗方法:

(1)給藥和血樣采集:試驗白兔在給藥前用8%硫化鈉軀干部脫毛,涂抹 涂膜劑,給藥后分別于1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、10h、12h、24h、36h 耳緣靜脈取血,每次采血約0.5ml,至于含肝素的離心管中,混勻,3000r/min 離心10min,分離血漿,-20℃冰箱保存。

(2)血漿中蛇床子素濃度的測定:準確吸取0.2ml血漿樣品于1.5ml微量 離心管中,加入0.3ml乙腈,于漩渦混合器上混合2min,高速離心 10min(8000g/min),吸取上清液10μl作HPLC分析。色譜條件:流動相為甲醇- 水(70∶30),檢測波長325nm,流速為1ml/min,色譜柱為Eclipse?DB-C18柱 (4.6×250mm,5.0um),進樣10μl。

(3)實驗回收率:分別取3份空白血漿樣品,加入適量的蛇床子素標準溶 液,配制成高中低的生物樣品,按血漿處理方法處理后進樣,由標準曲線求出各 樣品的濃度,各濃度重復測定3次,取均值,將求得的濃度與已知濃度相比,計 算樣品的相對回收率。

(4)精密度實驗:以上高中低3個濃度的生物樣品同法各測定3次,并連 續測定3天,計算日內、日間變異。

(5)數據處理數據處理:血藥濃度-時間數據分別按一室、二室、三室模 型運用Marquardt法迭代擬合,通過對模型擬合的評價,利用F檢驗法及根據AIC 最小的原則選出最佳模型,計算藥代動力學參數。計算過程采用中國藥理學會編 3P87程序運行。

結果:

(1)標準曲線的制備:精確稱取蛇床子素配成質量濃度為20μg/ml的蛇床 子素溶液。分別取兔新鮮血漿1mL加入蛇床子素溶液,使其質量濃度分別為 0.05、0.1、0.5、1、2μg/ml,HPLC法測各質量濃度蛇床子素峰面積,繪制面 積-濃度標準曲線(圖1)。本方法測定蛇床子素的線性范圍為0.05~2μg/ml,直 線方程為A=19.928?C+0.1396,R2=0.9981。

回收率和精密度實驗:實驗回收率和精密度見下表:

????蛇床子素在血漿中的回收率和精密度 生物 樣品 ????濃度 ????(μ ????????g/ml) ????回收率 ????日內差 ????日間差 ????X±SD ??RSD% ????X±SD ??RSD% ??X±SD ??RSD% ? ? ? ? ??血漿 ? ? ? ? ? ????0.5 ? ? ????1 ? ? ????2 ? ? ??98.6±1.24 ? ? ??100.9±4.62 ? ? ??98.4±3.56 ? ? ????1.3 ? ? ????4.6 ? ? ????3.6 ? ????98.7± ? ????????2.36 ????97.6± ? ????????1.25 ????99.1± ? ????????2.36 ? ????2.4 ? ? ????1.3 ? ? ????2.4 ? ??97.6± ? ????2.56 ??99.2± ? ????2.04 ??98.6± ? ????1.34 ? ??2.6 ? ? ??2.0 ? ? ??1.4 ?

(2)藥代動力學結果:健康白兔經皮給藥后不同時間血漿藥物濃度的實測 值見下表,蛇床子素標準品及血漿樣品的色譜圖分別見圖2和圖3和圖4。

健康白兔經皮給藥后血漿藥物濃度(X±S,n=3) ??采血時間 ????(h) ??血藥濃度 ??(μg/ml) ??采血時間 ????(h) ????血藥濃度 ????(μg/ml) ????1 ????2 ????3 ????4 ????5 ????6 ??0.082±0.032 ??0.134±0.054 ??0.155±0.071 ??0.174±0.058 ??0.168±0.064 ??0.153±0.072 ????7 ????8 ????10 ????12 ????24 ????36 ??0.148±0.053 ??0.138±0.045 ??0.122±0.050 ??0.104±0.041 ??0.074±0.027 ??0.054±0.023

血藥濃度-時間數據采用中國藥理學會編3P87程序計算,分別按一室、二 室、三室模型運用Marquardt法迭代擬合,通過對模型擬合的評價,利用F檢驗法 及根據AIC最小的原則選出最佳模型,計算藥代動力學參數。經皮膚給藥復方蛇 床子乳炎涂膜的動力學最佳數學模型為有滯后時間的一級吸收和一級消除的二 房室模型,即血藥濃度與時間的關系可用下列方程式表示:Ct=Ae-αt+Be-β t+Ge-Kat,藥時曲線見圖5,血藥濃度的對數-時間曲線見圖6,有關動力學參數 見下表。

????經皮膚給藥后蛇床子素在健康兔體內的藥動學參數 ????參數 ????單位 ????數值 ????A ????α ????????B ????β ????????Ka ????V/F ????T1/2α????????T1/2β????????T1/2Ka????K21????K10????K12????AUC ????CL(s) ????T(peak) ????C(max) ????μg/ml ????1/h ????μg/ml ????1/h ????1/h ????(mg/kg)/(μg/ml) ????h ????h ????h ????1/h ????1/h ????1/h ????(μg/ml)*h ????mg/kg/(μg/ml) ????h ????μg/ml ????0.131570 ????0.210589 ????0.140339 ????0.027312 ????0.645105 ????4.483949 ????3.291476 ????25.378696 ????1.074473 ????0.137760 ????0.041751 ????0.058389 ????5.341616 ????0.187209 ????3.683038 ????0.162220

該涂膜劑透皮給藥后,其成分蛇床子素能進入兔體血液循環并在血液中保持 一定濃度,這為透皮給藥治療提供了佐證。計算藥代動力學參數結果表明,經 皮膚給藥該涂膜劑的動力學最佳數學模型為有滯后時間的一級吸收和一級消除 的二房室模型動力學參數:AUC=5.342(μg/ml)*h、Tmax=3.683h,Cmax=166.2 ng/ml、T1/2α=3.291h、T1/2β=25.3781h。

8、涂膜劑經皮滲透后蛇床子素在不同組織中的分布。

方法:

(1)給藥和樣品采集:

28只大鼠,體重300g左右,籠養,表現健康。試驗大鼠在給藥前用8%硫 化鈉軀干部脫毛,涂抹自制銀花乳炎清涂膜劑,給藥后分別于1h、2h、4h、8h、 12h、24h、48h分別處死大鼠3只,取血液、皮膚、乳腺和肌肉樣品。

(2)生物樣品的處理:

血液樣品:取血液置于含肝素的離心管中,混勻,3000r/min離心10min, 分離血漿,準確吸取0.2ml血漿樣品于1.5ml微量離心管中,加入0.3ml乙腈, 于漩渦混合器上混合2min,高速離心10min(8000g/min),吸取上清液10ul作 HPLC分析。

皮膚樣品:取1g的皮膚,至于10ml的塑料管,加入2ml蒸餾水,在高速乳 勻機上打碎皮膚組織、取0.5ml的組織漿,加入0.5ml的乙腈沉淀蛋白,于漩渦 混合器上混合2min,高速離心10min(8000g/min),吸取上清液10ul作HPLC分析。

乳腺樣品:取1g的乳腺,置于10ml的塑料管,加入2ml蒸餾水,在高速乳 勻機上打碎乳腺組織、取0.5ml的組織漿,加入0.5ml的乙腈沉淀蛋白,于漩渦 混合器上混合2min,高速離心10min(8000g/min),吸取上清液10ul作HPLC分析。

肌肉組織:取1g的肌肉,置于10ml的塑料管,加入2ml蒸餾水,在高速乳 勻機上打碎肌肉組織、取0.5ml的組織漿,加入0.5ml的乙腈沉淀蛋白,于漩渦 混合器上混合2min,高速離心10min(8000g/min),吸取上清液10ul作HPLC分析。

(3)生物樣品中蛇床子素濃度的測定。?

準確吸取2.2中處理的上清液10ul進樣作HPLC分析。色譜條件:流動相為 甲醇-水(70∶30),檢測波長325nm,流速為1ml/min,色譜柱為Eclipse?DB-C18 柱(4.6×250mm,5.0um),進樣10ul。

(4)分析方法的建立

標準曲線的建立:精確稱取蛇床子素配成質量濃度為20μg/ml的蛇床子素 溶液,分別稀釋成10、2、1、0.5、0.1、0.05μg/ml的標準溶液。分別取空白 血漿、皮膚、乳腺和肌肉勻漿6份,分別加入不同濃度的蛇床子素標準液,按生 物樣品處理方法處理后進樣分析。

實驗回收率:分別取3份血漿、皮膚、乳腺和肌肉樣品,加入適量的蛇床子 素標準溶液,配制成高中低的生物樣品,按生物樣品處理方法處理后進樣,由標 準曲線求出各樣品的濃度,各濃度重復測定3次,取均值,將求得的濃度與已知 濃度相比,計算樣品的相對回收率。

精密度實驗:以上高中低3個濃度的生物樣品同法各測定3次,并連續測定3 天,計算日內、日間變異。

結果:

(1)標準曲線。

蛇床子素在生物樣品中的標準曲線見下表

????生物樣品 ????標準曲線方程 ????決定系數(R2) ????血漿 ????A=21.887C-0.7872 ????0.9999 ????皮膚 ????A=21.605C-0.6109 ????0.9999 ????乳腺 ????A=19.563C+0.3961 ????0.9999 ????肌肉 ????A=19.787C+0.8333 ????0.9999

(2)回收率和精密度實驗見下表 生物 樣品 ????濃度 ????(μ ????????g/ml) ????回收率 ????日內差 ????日間差 ????X±SD ????RSD% ????X±SD ??RSD% ????X±SD ??RSD% 血漿 ????0.5 ????1 ????2 ????0.5 ????98.6±1.24 ????100.9±4.62 ????98.4±3.56 ????97.6±5.41 ????1.3 ????4.6 ????3.6 ????5.4 ?98.7±2.36 ?97.6±1.25 ?99.1±2.36 ?98.6±3.24 ????2.4 ????1.3 ????2.4 ????3.3 ?97.6±2.56 ?99.2±2.04 ?98.6±1.34 ?96.8±2.01 ????2.6 ????2.0 ????1.4 ????2.1 皮膚 ????1 ????2 ????0.5 ????98.3±4.32 ????97.8±4.52 ????98.5±2.36 ????4.4 ????4.6 ????2.4 ?99.2±2.45 ?98.8±1.24 ?99.4±1.28 ????2.5 ????1.3 ????1.3 ?98.7±1.25 ?98.4±1.54 ?99.6±1.24 ????1.3 ????1.6 ????1.3 乳腺 ????1 ????2 ????0.5 ????97.5±4.21 ????100.7±3.56 ????96.4±2.56 ????5.6 ????3.5 ????2.7 ?98.8±2.12 ?99.1±1.02 ?98.4±1.26 ????2.1 ????1.0 ????1.3 ?98.7±2.04 ?98.2±1.06 ?98.6±1.11 ????2.1 ????1.1 ????1.1 肌肉 ????1 ????2 ????98.2±2.32 ????100.8±3.42 ????2.4 ????3.4 ?97.8±2.86 ?99.6±1.13 ????2.9 ????1.1 ?98.9±1.25 ?96.8±2.24 ????1.3 ????2.3

(3)局部透皮給藥實驗見下表(X±S,n=3) ????時間 ????(h) ????????????????????????藥物濃度(μg/ml或μg/g) ????血漿 ????皮膚 ????乳腺 ????肌肉 ????1 ??0.062±0.028 ??10.991± ????3.788 ?2.867±0.878 ?1.424±0.652 ????2 ??0.094±0.031 ??24.890± ????7.016 ?4.137±1.349 ?1.570±0.626

????4 ??0.142±0.042 ??11.923± ????4.245 ?3.379±1.129 ?1.880±0.725 ????8 ??0.106±0.049 ??15.359± ????6.513 ?5.791±2.284 ?1.981±0.539 ????12 ??0.087±0.036 ??17.540± ????6.495 ?11.018± ??4.698 ?3.452±1.181 ????24 ??0.074±0.028 ??5.292±1.276 ?4.745±1.407 ?1.944±0.844 ????48 ??0.053±0.014 ??1.662±0.605 ?0.890±0.247 ?0.597±0.132

空白樣品和蛇床子素標準品及生物樣品樣品的色譜圖分別見圖7、8、9。

本發明的另一重要特點是涂膜劑中還含有冰片。

1、不同促透劑組合(5%冰片、5%氮酮、5%冰片+5%氮酮及空白對照)對復方蛇 床子乳炎涂膜劑中蛇床子素經大鼠皮膚滲透的促透作用。

用高效液相色譜法以甲醇-水(70∶30)作為流動相,測定4中不同配方促 透劑經皮給藥后,蛇床子素在皮膚和肌肉中的含量。作比較分析,評價4種促透 組合作用。結果表明,5%的冰片促進蛇床子素透皮效果最好。

2、含5%冰片復方蛇床子乳炎涂膜劑中蛇床子經皮滲透后在大白鼠皮膚,肌 肉,乳腺及血液等組織的濃度變化。

用高效液相色譜法,以甲醇-水(70∶30)作為流動相,測定不同時間皮膚, 肌肉,乳腺及血液中的射床子素含量。同時口服同樣劑量蛇床子含量的藥物,并 測定上述四種組織中蛇床子素的含量,作比較分析。結果表明,蛇床子血液濃度: 口服給藥4h可達最高峰Cmax=3.482μg/ml,而透皮給藥4h只達0.142μg/ml; 皮膚中含量:口服給藥在皮膚中蛇床子檢測不到,而透皮給藥后2h可達24.89 μg/g;肌肉含量:透皮給藥12h,肌肉中蛇床子素含量最高為3.452μg/ml,而 口服給藥后峰值在4h,為0.442μg/g。乳腺含量:透皮給藥后12h濃度最高為 11.018μg/g,而口服給藥最高含量為0.327μg/g。因此可得出:(1)口服給藥 后蛇床子在組織中的濃度分布大小為:血液>肌肉>乳腺>皮膚;(2)透皮給藥后 蛇床子在組織中的濃度分布大小為:皮膚>乳腺>肌肉>血液;(3)透皮給藥后蛇 床子在皮膚,肌肉,乳腺及血液中的含量遠比口服給藥高。

3、含5%冰片復方蛇床子乳炎涂膜劑中蛇床子素在兔體內的藥物代謝動力學

實驗兔經透皮給藥后,用高效液相色譜法以甲醇-水(80∶20)作為流動相, 測定血液中蛇床子素的含量。采用3P87程序計算藥物代謝動力參數。結果表明, 蛇床子素經透皮給藥后藥代動力學符合二房室開放模型,T1/2α=3.291h,T1/2β =25.378h,K21=0.1377.min-1,AUC=5.342(μg/ml)*h.Tmax=3.683h,Cmax =166.2μg/ml。復方蛇床子涂抹劑中蛇床子素能夠透過皮膚進入血液,并維持一 定的血藥濃度。

4、含5%冰片復方蛇床子乳炎涂膜劑經奶牛乳房皮膚的體外透皮效果。

將制備的復方蛇床子乳炎涂膜劑置于牛皮表皮上方透皮裝置的給藥室,用 HPLC法測定涂抹劑中的蛇床子素的透皮效果。試驗結果表明蛇床子素的經皮滲 透近似于零級動力學特征,表明該透皮劑對牛皮乳房皮膚具有明顯的透皮效果。

5、含5%冰片復方蛇床子乳炎涂膜劑中蛇床子素經牛皮透皮效果觀察方法:

含5%的冰片透皮劑由江蘇省農業科學院獸醫研究所和南京中醫藥大學藥學 院、聯合研制。按方劑組成除其它藥物成分不變外,蛇床子素按原藥含1%的比 例加入蛇床子素標準品(購自中國藥物監察所),使每克透皮劑中含有1.6mg蛇 床子素。紫外掃描:確定蛇床子素最大吸收峰為325nm。

(1)標準曲線的建立。

取4mg/ml蛇床子溶液1ml,以40%乙醇定容至100ml,配成40ug/ml蛇床子 素溶液,再5倍稀釋;分別配成8μg/ml、1.6ug/ml、0.32ug/ml的蛇床子溶液。 色譜條件:流動相為甲醇∶水=70∶30。檢測波長325nm,流速為1ml/min。檢 測時間為20min。將各濃度蛇床子素、溶液進樣5ul,按上述色譜分離條件測定, 得回歸方程為Y=4.9621X+6.6569(r=0.99806)結果表明,蛇床子素在0.32~40μg 范圍內呈良好線性關系。

(2)精密度試驗:取標準品溶度8μg/ml,連續進樣6次進樣量為5μg,按 上述色譜條件分離測定,RSD=0.31%。

(3)經皮滲透試驗:取泌乳期淘汰的奶牛乳房部位皮膚;剪脫牛毛,小心 剝離皮下脂肪組織,置生理鹽水中浸泡,置于4℃冰箱保存。將處理好的奶牛乳 房部皮膚,平展于改良的Franz擴散池裝置中,固定,皮膚呈圓形,半徑0.8cm, 面積2cm2,給藥室給予0.70g透皮劑,下層接受液為15.5ml40%乙醇溶液。磁力 攪拌器攪拌,整個裝置放于39℃恒溫水浴中,藥物從給藥室滲透到接受池,每 小時取接收液3ml,同時向裝置中補充3ml40%乙醇溶液。液相進樣5μl,測定蛇 床子素的含量。

結果:

(1)2小時蛇床子素累計透過量。

不同取樣點的累積經皮滲透量M按下式計算:M=(CnV+∑Ci?Vi) 式中,M:累積透皮滲透量;Cn:各取樣點時取樣液的濃度。V:接收池體積;Ci: 各取樣點取樣液的濃度;Vi:取樣體積。透皮試驗進行了二次重復試驗(結果見 表)。從下表結果可以看出二組結果基本相似。累計12h總透過量分別

??444.32μg和404.93μg,平均總透過量為424.6μg。 組 別 ????不同取樣時間蛇床子素累積通透量(μg) 平 均 1h ?2h ?3h?? ?4h?? ?5h ?6h ?7h ?8h ?9h ?10h ?11h ?12h ?424 ?.6 ?1 ?43. ?4 84. 8 136 .9 ?182 ?.6 ?221 ?.3 ?260 ?.9 ?294 ?.7 ?321 ?.0 ?368 ?.6 ?393 ?.6 ?419 ?.2 ?444 ?.3 ?2 ?40. ?3 88. 6 739 .8 ?189 ?.9 ?241 ?.9 ?279 ?.7 ?290 ?.3 ?345 ?.3 ?363 ?.4 ?382 ?.0 ?392 ?.9 ?404 ?.9

(2)12h蛇床子素透過率

蛇床子素平均總透過量為424.6ug,給藥室0.7克透皮劑中蛇床子素總含量 1120ug,由此得出第1組透過率為39.67%,第2組透過率為36.15%,總平均透 過率為37.9%。

透皮試驗結果表明,本透皮劑具有一定的透皮效果,12h平均累積透過量 424.6ug,透過率達37.9%。本次結果是二次重復透皮試驗的結果。從重復試驗 結果看,二次透總量分別為444.3ug和404.9ug,誤差相差不大。我們認為,累 積透過率在36.15%~39.67%之間。如果以蛇床子素作為有效物質來衡量治療量, 奶牛每天使用透皮劑2次,共50克,按蛇床子素37.9%的透過量計算,應該有 18克之多的生藥進入奶牛乳房組織。如奶牛改用口服50克生藥,那么按1%的比 例計算乳房部位生藥濃度(實際遠不足此數)不足0.5克,相比之下,乳房外用 透皮劑在藥物利用率上應該是非常合理的,加之使用方便,應該具有很好的實際 應用價值,應加以臨床試驗以驗證這一推論。

本發明的涂膜劑臨床使用結果表明,有以下優點:

1、本發明對奶牛無毒無害。

2、本發明使用方便,符合國家獸藥規定。

3、本發明從治療過程看,需要一定的療程,對臨床型和隱性乳房炎均有不 同,應區別對待。另外,個別特別嚴重的超急性病例還是配合抗生素治療為宜, 在防止抗生素殘留的同時,不要完全拒絕西藥。

為表明本發明的涂膜劑對奶牛乳房炎治療效果,本發明經103例臨床應用, 對臨床型乳房炎治療總治愈率達85%,總有效率為91.6%;對隱性乳房炎治療總 治愈率83.6%,總有效率92.7%。“復方蛇床子乳炎涂膜”分別在南京棲霞、朝陽、 攝山、燕子磯等奶牛小區進行了推廣試驗,從推廣應用的情況看,該制劑具有使 用方便,療效可靠等優點,值得進一步擴大應用。

在南京市棲霞區攝山、朝陽奶牛小區選擇臨床型病例患病奶牛,共48頭。 患病牛乳房腫大,觸之熱痛,不愿意行動或臥地,乳汁變深或乳汁變稀薄,混有 絮狀物或粒狀物。重癥時可呈淡黃色水樣或帶紅色水樣粘性液。同時出現不同程 度的全身癥狀,如食欲減退或消失,有的牛體溫上升達41~42℃,呼吸和心博加 快,精神萎頓,有時體溫可持續數天而不退。用上海乳房炎診斷試劑SMT檢測陽 性程度在“++”以上為隱性乳房炎病例。共有55頭。

使用方法:對48頭臨床型乳房炎病牛的患病乳區,先擠干奶,在將乳房洗 凈擦干,然后用本品25ml均勻涂抹在患病乳區上,待3~5分鐘便可成膜,保持 至下次擠奶或第二次用藥前將膜撕下。急性乳房炎(重癥病例):每天2次(早 晚各一次),連用3~4天。輕癥病例及隱性乳房炎:每天2~3次,連用6~8 天。使用時應注意:(1)此為外用藥,不可內服。(2)乳房壞疽、損傷性乳房 出血忌用。(3)如有嚴重性的全身癥狀,應配合其它藥物進行綜合對癥治療。(4) 對急性病例,發病初期,只能冷敷。對慢性病例,在使用本品前進行熱敷,可增 強本品療效。(5)本品使用前一定要將乳房洗凈擦干,否則將影響本劑成膜和藥 物透皮,并最終影響療效。

效果評價標準:對奶牛乳房炎治療效果評價:臨床型乳房炎:(1)痊愈:凡 治療后病牛乳房紅腫消退,乳汁恢復正常,產奶量恢復病前水平,精神食欲等恢 復正常。(2)有效或好轉:乳房紅、腫、熱、痛基本消失,乳汁尚有少量凝塊, 產奶量回升;(3)無效:病牛乳房癥狀無好轉、或轉為慢性炎癥,乳腺失去泌乳 能力或瞎奶頭。隱性乳房炎治療效果評價:經治療后,用SMT檢測,凡從“+++” (強陽性)轉為“-”、“+“(陰性或可疑判為治愈;“+++”→“+”亦為好轉; 凡“+++”“++”在治療后不變的為無效。體細胞測定:根據乳汁體細胞數的大小 確定有無好轉,牛奶對體細胞的要求不得超過100萬/毫升。

臨床型乳房炎治療效果:在對重癥病例治療過程中,治愈率只有 73.33%(12/15),而對輕癥病例治愈率可達87.8%(29/33),總治愈率和總有效率 分別達85%(41/48)和91.6%(44/48);與此相對比,青霉素肌肉注射作對照, 對重癥病例和輕癥病例治愈率可分別達80%(8/10)和83.3%(10/12),總治愈 率和總有效率分別達81.8%(18/22)和90.9%(20/22)。

“復方蛇床子乳炎涂膜劑”對臨床型乳房炎臨床治療結果

從表結果中可以看出“復方蛇床子乳炎涂膜劑”對臨床乳房炎具有顯著的治 療效果,與青霉素治療對照相比,療效略高些,差異不顯著。但中藥涂膜劑不存 在抗生素殘留問題。因而不影響牛奶收購。該結果也提示我們,對嚴重的臨床型 病例可配合使用青霉素等抗生素,只是病牛所產奶不能混放。絕對排除抗生素也 是不合理的。

隱性乳房炎臨床治療效果:?

分別測定了治療當日、治療第5天和治療第8天的測定結果。治療5天后, 治愈率達67.3%(37/55),有效率達85.6%(47/55);至治療8天后治愈率和有 效率分別達83.6%(37/55)和92.7%(47/55)。對照組未見一頭好轉。詳見表。

“復方蛇床子乳炎涂膜劑”對隱性乳房炎臨床治療結果

從表可以看出,“復方蛇床子乳炎涂膜劑”對隱性乳房炎也有較好的治療效 果,治療8天后,總治愈率達到了83.6%(46/55),總有效率為92.7%(51/55)。 根據該結果,在使用“復方蛇床子乳炎涂膜劑”治療隱性乳房炎時,宜治療6~8 天,可獲滿意療效。

治療前后體細胞測定結果。

從表可以看出,用復方蛇床子乳炎涂膜劑治療后,奶牛乳汁中的體細胞數大 大減少,低于100萬/毫升,達到對生鮮奶的要求。

復方蛇床子乳炎涂膜劑治療前后奶牛體細胞數數測定結果 組別 ????體細胞數(105個/毫升) 試驗前 試驗后10天 試驗后15天 試驗組 44.24±10.12 ?21.54±5.08 ?9.29±1.96** 陽性對照組 40.2±4.69 ?37.89±4.48 ?37.76±3.98 陰性對照組 7.38±1.31 ?7.56±1.24 ?6.80±0.89

**P<0.01

對臨床型乳房炎總治愈率和總有效率分別達85%和91.6%,對隱性乳房炎總 治愈率達到了83.6%(46/55),總有效率為92.7%(51/55)。為奶牛乳房炎的治 療提供了一種新的制劑,在治療手段上也開辟了一條新的途徑。

四、附圖說明

圖1蛇床子素標準曲線圖。

圖2蛇床子素標準品色譜圖。

圖3空白血漿樣品色譜圖。

圖4給藥后血漿樣品色譜圖。

圖5經皮膚給藥后蛇床子素在健康兔體內的藥時曲線。

圖6經皮膚給藥后蛇床子素在健康兔體內的血藥濃度的對數-時間曲線。

圖7空白樣品色譜圖。

圖8蛇床子素標準品色譜圖。

圖9生物樣品色譜圖。

五、具體實施方式

實施例1:

按下述配比稱取原料:

紫花地丁150g、金銀花200g、蛇床子300g、蒲公英150g、芙蓉花150g、 冰片50g、苯甲酸鈉3g、聚乙烯醇124?40g、甘油100ml、水600ml、乙醇加 至1000ml。上述藥物共制成涂膜劑,全量1000ml,分裝成25ml/袋,40袋。

生產方法如下:

按質量標準中處方要求中藥飲片稱重、配比;加水文火煎煮2h;除去藥渣; 靜置24h;濾過;加入乙醇使成70%含量;去沉淀;回收乙醇;復加水沉淀;除 去沉淀;上清液煎煮濃縮;加乙醇使成60%含量的藥液;緩慢加入聚乙烯醇甘油 及0.3%苯甲酸鈉溶液,邊加邊攪拌;加入5%冰片的乙醇溶液;至1000ml;充分 攪拌均勻;過濾、于潔凈室分裝。

涂膜劑使用說明:

[組成]??紫花地丁、蛇床子、芙蓉花、金銀花、蒲公英。

[性狀]??本品為外用涂膜劑,棕色粘液。

[功效]??清熱解毒,活血化瘀,消腫散結,?抗菌消炎。

[主治]??用于治療奶牛乳房炎癥,在乳區腫脹、發熱,乳汁檢測有絮狀凝及泌乳 量減少時使用。

[用法]??患牛每次擠奶后,洗凈乳房,在患部乳區均勻涂抹,待3~5分鐘形成 膜后,至第二次擠奶時揭除藥膜,進行第二次涂膜。切記口服!

[用量]??每次一小包(25毫升),均勻涂抹,每天2~3次,急性病例連用3~4 天,慢性、隱性病例連用6~8天。

[儲存]??存于密封、干燥、陰涼處。

[包裝]??每箱100包,每包25毫升,每毫升含生藥1克。

實施例2:

按下述配比稱取原料:

紫花地丁100g、金銀花150g、蛇床子200g、蒲公英100g、芙蓉花100g、 冰片30g、苯甲酸鈉4g、聚乙烯醇124?30g、甘油50ml、水550ml、乙醇加 至1000ml。

上述藥物共制成涂膜劑,全量1000ml,分裝成25ml/袋,40袋。

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