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用于調節平滑肌張力的基因轉移.pdf

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用于 調節 平滑肌 張力 基因 轉移
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摘要
申請專利號:

CN200410043245.9

申請日:

20040514

公開號:

CN1621094A

公開日:

20050601

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A61K48/00,C12N15/12,C12N15/00,A61P15/10,A61P13/10,A61P13/08,A61P13/02,A61P9/00,A61P1/00,A61P25/06 主分類號: A61K48/00,C12N15/12,C12N15/00,A61P15/10,A61P13/10,A61P13/08,A61P13/02,A61P9/00,A61P1/00,A61P25/06
申請人: 猶太大學阿爾伯特愛因斯坦醫學院
發明人: G·J·克里斯特,K·戴維斯,A·梅爾曼
地址: 美國紐約
優先權: 60/525,195
專利代理機構: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 代理人: 程泳
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法律狀態
申請(專利)號:

CN200410043245.9

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明提供了在被試者中調節平滑肌張力的方法,該方法包含向被試者的平滑肌細胞中引入編碼參與調節平滑肌張力的鉀通道蛋白質的DNA序列并使其在被試者足夠數目的平滑肌細胞中表達以在被試者中調節平滑肌張力。本發明提供了用于治療勃起機能障礙、膀胱機能障礙和其他平滑肌病癥的基因轉移方法。

權利要求書

1.一種在被試者中調節平滑肌張力的方法,該方法包括在被試者足夠數目的平滑肌細胞中引入并表達DNA序列以調節被試者中的平滑肌張力,該DNA序列包含可操作地與編碼調節平滑肌張力的鉀通道蛋白質的序列連接的平滑肌特異性啟動子,即平滑肌α肌動蛋白(SMAA)。2.一種在被試者中調節平滑肌張力的方法,該方法包括在被試者足夠數目的平滑肌細胞中引入并表達DNA序列以調節被試者中的平滑肌張力,該DNA序列編碼調節平滑肌張力的電壓依賴性鉀通道蛋白質。3.一種在被試者中調節平滑肌張力的方法,該方法包括在被試者足夠數目的平滑肌細胞中引入并表達DNA序列以調節被試者中的平滑肌張力,該DNA序列編碼調節平滑肌張力的非大電導的鈣敏感性鉀通道蛋白質。4.權利要求1、2或3的方法,其中該平滑肌細胞為動脈平滑肌細胞、靜脈平滑肌細胞或內臟平滑肌細胞。5.權利要求4的方法,其中該平滑肌細胞位于被試者的膀胱、血管壁、胃腸道、肺支氣管、盆內筋膜、陰莖、前列腺、輸尿管、尿道、子宮或輸精管。6.權利要求4的方法,其中該內臟平滑肌細胞為膀胱平滑肌細胞、corporal?smooth?muscle細胞、胃腸平滑肌細胞、前列腺平滑肌細胞或尿道平滑肌細胞。7.權利要求1、2或3的方法,其中該DNA序列為基因組DNA或cDNA。8.權利要求1、2或3的方法,其中該鉀通道蛋白質調節平滑肌的松弛。9.權利要求8的方法,其中該鉀通道蛋白質調節corporalsmooth?muscle的松弛。10.權利要求1的方法,其中該鉀通道蛋白質是maxi-K、K、Kv1.5或SK3。11.權利要求1的方法,其中該平滑肌細胞是corporal?smoothmuscle細胞且鉀通道蛋白質是maxi-K。12.權利要求2的方法,其中該電壓依賴性鉀通道蛋白質是Kv1.5。13.權利要求3的方法,其中該非大電導的鈣敏感性鉀通道是中等電導的鈣敏感性鉀通道。14.權利要求3的方法,其中該非大電導的鈣敏感性鉀通道是小電導的鈣敏感性鉀通道。15.權利要求14的方法,其中該小電導的鈣敏感性鉀通道是SK3。16.權利要求2或3的方法,其中該DNA序列進一步包含可操作地與編碼鉀通道蛋白質的序列連接的啟動子。17.權利要求16的方法,其中該啟動子是平滑肌特異性啟動子。18.權利要求17的方法,其中該平滑肌特異性啟動子是平滑肌α肌動蛋白(SMAA)。19.權利要求1、2或3的方法,其中該DNA序列是通過選自如下的方法引入的:滴注治療法、電穿孔、DEAE葡聚糖、陽離子脂質體融合、原生質體融合、體內電場的創建、DNA包被的微粒轟擊、重組復制缺陷型病毒的注射、同源重組、霧化、裸露DNA轉移。20.權利要求19的方法,其中該DNA序列是通過裸露DNA轉移引入的。21.權利要求1、2或3的方法,其中該DNA序列是用EYFP載體引入的。22.權利要求1、2或3的方法,其中該DNA序列是通過直接注射入平滑肌壁中而引入的。23.權利要求22的方法,其中該平滑肌是膀胱。24.權利要求1、2或3的方法,該方法進一步包括轉染離體細胞及將轉染的細胞移植入被試者中。25.權利要求1、2或3的方法,其中該被試者具有升高的平滑肌收縮性,且對平滑肌張力的調節降低了被試者中平滑肌的收縮性。26.權利要求25的方法,其中該平滑肌細胞是陰莖平滑肌細胞或膀胱平滑肌細胞。27.權利要求1、2或3的方法,其中該被試者患有選自如下的功能障礙:哮喘;前列腺良性增生(BPH);冠狀動脈疾病;勃起機能障礙;盆內筋膜、前列腺、輸尿管、尿道、泌尿道或輸精管的泌尿生殖功能障礙;胃腸動力紊亂;便秘;腹瀉;過敏性腸綜合征;偏頭痛;早產;Raynaud氏綜合征;尿失禁;膀胱機能障礙;靜脈曲張和血栓閉塞性脈管炎。28.權利要求27的方法,其中該功能障礙是勃起機能障礙。29.權利要求11的方法,其中該被試者具有勃起機能障礙。30.權利要求28或29的方法,其中該勃起機能障礙由平滑肌不完全松弛引起,該平滑肌不完全松弛歸因于神經原性功能障礙、動脈原性功能障礙和/或靜脈閉塞性功能障礙。31.權利要求27的方法,其中該功能障礙是膀胱機能障礙。32.權利要求31的方法,其中該膀胱機能障礙由膀胱過度活動導致。33.權利要求27-32中任何一項的方法,其中對該功能障礙進行治療。34.權利要求1、2或3的方法,其中該鉀通道蛋白質通常不表達于平滑肌細胞中。35.一種在被試者中治療勃起機能障礙的方法,該方法包括在被試者足夠數目的corporal?smooth?muscle細胞中引入并表達DNA序列以調節被試者中的corporal?smooth?muscle張力,從而治療被試者的勃起機能障礙,該DNA序列包含可操作地與編碼調節corporal?smoothmuscle張力的鉀通道蛋白質的序列連接的平滑肌特異性啟動子,即平滑肌α肌動蛋白(SMAA)。36.權利要求35的方法,其中該鉀通道蛋白質是maxi-K、K、Kv1.5或SK3。37.一種在被試者中治療勃起機能障礙的方法,該方法包括在被試者足夠數目的corporal?smooth?muscle細胞中引入并表達DNA序列以調節被試者中的corporal?smooth?muscle張力,從而治療被試者的勃起機能障礙,該DNA序列編碼調節corporal?smooth?muscle張力的電壓依賴性鉀通道蛋白質。38.權利要求37的方法,其中該電壓依賴性鉀通道蛋白質是Kv1.539.一種在被試者中治療勃起機能障礙的方法,該方法包括在被試者足夠數目的corporal?smooth?muscle細胞中引入并表達DNA序列以調節被試者中的corporal?smooth?muscle張力,從而治療被試者的勃起機能障礙,該DNA序列編碼調節corporal?smooth?muscle張力的非大電導的鈣敏感性鉀通道蛋白質。40.權利要求39的方法,其中該非大電導的鈣敏感性鉀通道是中等電導的鈣敏感性鉀通道。41.權利要求39的方法,其中該非大電導的鈣敏感性鉀通道是小電導的鈣敏感性鉀通道。42.權利要求41的方法,其中該小電導的鈣敏感性鉀通道是SK3。43.權利要求1的方法,其中應用可操作地與編碼鉀通道蛋白質的DNA序列連接的平滑肌特異性啟動子SMAA在被試者中調節平滑肌張力至少與應用可操作地與編碼鉀通道蛋白質的DNA序列連接的病毒啟動子是同樣有效的。44.權利要求35的方法,其中應用可操作地與編碼調節平滑肌張力的鉀通道蛋白質的DNA序列連接的平滑肌特異性啟動子SMAA在被試者中治療勃起機能障礙至少與應用可操作地與編碼鉀通道蛋白質的DNA序列連接的病毒啟動子是同樣有效的。

說明書

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發明背景

[0001]許多生理學功能障礙或病癥是由平滑肌張力失調引起的。 其中包括哮喘;前列腺良性增生(BPH);冠狀動脈疾病;勃起機能障 礙;膀胱、盆內筋膜、前列腺、輸尿管、尿道、泌尿道和輸精管的泌 尿生殖功能障礙;過敏性腸綜合征;偏頭痛;早產;Raynaud氏綜合 征;靜脈曲張;和血栓閉塞性脈管炎。

[0002]在這些功能障礙中,勃起機能障礙是常見的疾病,在美國 估計可影響1000~3000萬男性(Feldman等人,Journal?of?Clinical Epidemiology,47(5):457-67,1994;和Anonymous,International Journal?of?Impotence?Research,5(4):181-284,1993)。勃起機能障 礙的主要疾病相關性原因中有衰老、動脈粥狀硬化、慢性腎病、糖尿 病、高血壓和抗高血壓藥物治療、骨盆手術和放射治療及心理焦慮 (Feldman等人,Journal?of?Clinical?Epidemiology,47(5):457-67, 1994)。對這許多和多面性疾病狀態的血管創傷的直接治愈在不久的將 來不可能發生。

[0003]在過去的十年中發展了幾種治療形式來直接恢復減少的 勃起能力。然而,大多數目前可用的治療或者是非特異性的(如激素 治療)、具有有限的總成功率(如真空勃起設備)、侵襲性的(如體內 注射治療),或者是不可逆且昂貴的(如陰莖假器官植入手術)。盡管 有這些治療限制,但美國食品藥物管理局(U.S.Food?and?Drug Administration)(FDA)批準CAVERJECT用于勃起機能障礙的海 綿竇內治療(1995年7月6日)、批準MUSE用于治療勃起機能障礙 中的尿道內給藥(1996年11月19日)及批準VIAGRA(1998年3 月27日)和LEVITRA(2003年8月19日)用作治療勃起機能障礙 的口服治療劑,這些代表了主要的進步。勃起機能障礙問題的重要性 和對更有效治療的渴望通過開具VIAGRA的處方數目而突顯。本質 上,美國聯邦政府的這些舉動已導致對勃起機能障礙問題醫學特性的 正式認識,且此外已使其臨床治療合法化了。

[0004]研究已證明改變的corporal?smooth?muscle張力是大部分 陽萎男性中勃起機能障礙的最直接的原因,該改變的corporal?smooth muscle張力導致升高的收縮性或消弱的舒張。這些研究進一步顯示 corporal?smooth?muscle的完全舒張是恢復勃起能力的必要和充分條 件,除非存在嚴重動脈疾病或先天性結構異常,而這只在極少數患者 中出現。目前批準的治療勃起機能障礙療法的功效證實了該推測的正 確性,這些療法包含直接或間接致使平滑肌舒張的試劑,包括PGE1 (CAVERJECT、EDEX和MUSE)、Sildenafil(VIAGRA)和 Vardenafil(LEVITRA)。

[0005]corporal?smooth?muscle細胞在勃起功能中發揮的重要作 用使其成為在治療勃起機能障礙中進行分子干預的極好目標。前面的 努力已集中于向血管平滑肌細胞進行基因轉移的技術上,該技術是潛 在的幾種心血管疾病療法的基礎。其中有動脈粥狀硬化、脈管炎、氣 囊血管成形術后的再狹窄(restenosis)和肺動脈高壓。這些初始的研 究已提供了關于平滑肌細胞中基因轉移方法效率和持續性的重要信息 (Finkel等人,FASEB?Journal,9:843-51,1995;Pozeg等人, Circulation?107:2037-44,2003)。因為勃起機能障礙主要由改變的平 滑肌張力引起,所以以參與平滑肌張力改變的基因為目標的基因轉移 方法是極其想要的。用于減輕勃起機能障礙的基因轉移的成功方法是 非常需要的,這是因為它是目前采用的方法的優選的替代方法。

[0006]異常的膀胱功能是顯著影響美國數百萬男性和女性生活 質量的另一個常見問題。許多常見疾病(如BPH、糖尿病、多發性硬 化和中風)可改變正常的膀胱功能。膀胱功能中顯著困難的變化也是 逐漸衰老的結果。

[0007]改變的膀胱生理學有兩種主要的臨床表現:張力缺乏的膀 胱和過度活動的膀胱(Abrams?P等人,Neurourol.Urodyn.21(2): 167-78,2002)。張力缺乏的膀胱由于逼尿平滑肌(膀胱壁的平滑肌) 低效的收縮性而具有降低的排空其尿內容物的能力。在張力缺乏狀態 時,降低的平滑肌收縮性包含于膀胱機能障礙的病因學中。因而,對 平滑肌張力的藥理學調節不足以矯正潛在的問題是不令人驚訝的。事 實上,治療該病癥的主要方法采用了未污染間歇性插管術;這是防止 慢性泌尿道感染、腎盂腎炎和最終的腎衰竭的成功方法。這樣,對張 力缺乏的膀胱的治療減輕了疾病的癥狀,但未矯正潛在的原因。

[0008]相反地,過度活動的膀胱自發地收縮;這將導致欲望性失 禁,其中個體不能控制尿的通過。過度活動的膀胱是比張力缺乏的膀 胱更難治療的臨床問題。已用于治療該病癥的藥物治療通常僅是部分 有效的,且具有顯著的副作用,該副作用限制了患者的藥物應用和繼 續用藥的積極性。目前可接受的治療選擇(如奧昔布寧和托特羅定) 主要是非特異性的,且大多數常涉及膀胱肌細胞上毒蠅堿受體通路和/ 或鈣通道的阻塞。鑒于這兩個通路在體內許多器官系統的細胞功能中 的重要性,這種非特異性的治療策略不僅是調節膀胱平滑肌張力的粗 略方法;而且由于其作用機制,它們事實上也保證具有顯著且不想要 的全身性作用。因此,非常需要有對膀胱機能障礙的改善的治療選擇。

[0009]在進行比較的陰莖生理學和膀胱生理學之間有一些生理 學相關的相似之處。例如,逼尿平滑肌張力在膀胱機能障礙中起作用, 這與勃起機能障礙中corporal?smooth?muscle張力充分表征的作用相 似。特別地,過度活動的膀胱特征在于升高的收縮性,而張力缺乏的 膀胱特征在于消弱的收縮性。治療過度活動的膀胱的藥物學療法一般 涉及頻繁的膀胱內滴注,即一種患者常發現是不方便或不想要的治療。 簡言之,頻繁進行膀胱內滴注以恢復膀胱肌細胞功能是不想要的,且 全身性藥物治療仍然缺乏可耐受的特異性。然而,逼尿平滑肌細胞在 膀胱功能中發揮的重要作用及其通過膀胱內滴注跨過尿道上皮的可接 近性使得它成為膀胱機能障礙治療中分子干預的極好目標。

[0010]因為勃起機能障礙和膀胱機能障礙主要是由改變的平滑 肌張力引起的,所以以參與平滑肌張力調節的基因為目標的基因轉移 方法是極其想要的,這是因為該方法可提供減輕膀胱機能障礙和勃起 機能障礙的新方法。類似地,以參與平滑肌張力調節的基因為目標的 基因轉移方法非常適于用作減輕其他平滑肌功能障礙的方法,該其他 平滑肌功能障礙包括但不局限于哮喘;BPH;冠狀動脈疾病(在血管 造影術中灌注);盆內筋膜、前列腺、輸尿管、尿道、泌尿道和輸精管 的泌尿生殖功能障礙;過敏性腸綜合征;偏頭痛;早產;Raynaud氏 綜合征;靜脈曲張和血栓閉塞性脈管炎。

[0011]在人平滑肌相關病癥的病因學中猜測有離子通道活性的 改變,該病癥諸如哮喘、膀胱機能障礙、勃起機能障礙和高血壓。在 所有這些組織中,肌細胞鉀(K+)通道在介導各種內源物質對平滑肌 張力的作用中起重要的作用。已經鑒定了超過30個K+通道的基因, 其中許多是在平滑肌中表達的(Lawson,K,Clinical?Science,91: 651-63,1996;Lawson,K,Pharmacol.Ther.,70(1):39-63,1996; 和Ashcroft,F.M.,ed.,Ion?Channels?and?Disease:Channelpathies, New?York:Academic?Press,2000)。在人身體(陰莖)平滑肌中至少 已鑒定了4個K+通道亞型。這包括(1)代謝門控K+通道(即KATP), (2)大電導(large-conductance)的鈣敏感性K+通道(即KCa或maxi-K 通道),(3)延遲整流通道和(4)電壓依賴性快速瞬時“A”電流通道 (Christ等人,Int.J.Impotence?Res.5:77-96,1993;J.Androl.14: 319-28,1993)。

[0012]Christ等人(美國專利No.6,271,211?B1)講授了治療由 升高的陰莖平滑肌收縮性導致的陰莖松弛的方法,該方法包含直接向 被試者的陰莖平滑肌細胞中引入編碼KATP通道亞基蛋白質Kir6.2的 DNA序列。類似地,Geliebter等人(美國專利No.6,150,338)講授 了誘導陰莖勃起的方法,該方法包含將編碼maxi-K通道蛋白質的 DNA引入到被試者的陰莖平滑肌細胞中。Christ等人(美國專利No. 6,239,117?B1)講授了治療由升高的膀胱平滑肌收縮性導致的膀胱機能 障礙的方法,該方法包含向被試者的膀胱平滑肌細胞中引入編碼 maxi-K通道蛋白質的DNA。然而,美國專利No.6,150,338、6,239,117 和6,271,211均未講授通過應用電壓依賴性鉀通道蛋白質、非大電導 (non-large?conductance)的鈣敏感性鉀通道蛋白質或可操作地與編碼 鉀通道蛋白質的DNA連接的平滑肌特異性啟動子平滑肌α肌動蛋白 (SMAA)來調節平滑肌張力。

發明概述

[0013]本發明提供了在被試者中調節平滑肌張力的方法,該方法 包含在被試者足夠數目的平滑肌細胞中引入并表達DNA序列以調節 被試者中的平滑肌張力,該DNA序列包含可操作地與編碼調節平滑 肌張力的鉀通道蛋白質的序列連接的平滑肌特異性啟動子平滑肌α肌 動蛋白(SMAA)。

[0014]本發明也提供了在被試者中調節平滑肌張力的方法,該方 法包含在被試者足夠數目的平滑肌細胞中引入并表達DNA序列以調 節被試者中的平滑肌張力,該DNA序列編碼調節平滑肌張力的電壓 依賴性鉀通道蛋白質。

[0015]本發明進一步提供了在被試者中調節平滑肌張力的方法, 該方法包含在被試者足夠數目的平滑肌細胞中引入并表達DNA序列 以調節被試者中的平滑肌張力,該DNA序列編碼調節平滑肌張力的 非大電導的鈣敏感性鉀通道蛋白質。

[0016]本發明的額外目的從隨后的描述中是顯而易見的。

附圖概述

[0017]圖1.多個鉀通道亞型的治療功效。在年老的(retired) 種畜大鼠中顯示了不同海綿體神經刺激強度時海綿體內壓力(ICP) 與血壓(BP)的比例,在該大鼠中向corporal?smooth?muscle細胞引 入了編碼鉀通道蛋白質Kv1.5或SK3的核酸。也顯示了不接受鉀通道 蛋白質基因轉移的年齡匹配對照(AMC)中的結果。在用SK3或Kv1.5 轉染的實驗動物中獲得了與陰莖勃起相當的超過0.6的ICP/BP比例 (水平的虛線),但在對照動物中未獲得。mA=毫安。

[0018]圖2.平滑肌特異性啟動子的功效。在年老的種畜大鼠中 顯示了不同海綿體神經刺激強度時海綿體內壓力(ICP)與血壓(BP) 的比例,在該大鼠中向corporal?smooth?muscle細胞引入了編碼鉀通 道蛋白質maxi-K的核酸(hSlo)與通用病毒(巨細胞病毒)啟動子 (pVAC/hSlo)或平滑肌特異性啟動子(平滑肌α肌動蛋白, SMAA/hSlo)的組合。也顯示了用含有20%蔗糖的磷酸緩沖鹽溶液 (PBS)注射的年齡匹配對照(AMC)中的結果。在兩個實驗動物組 中均獲得了與陰莖勃起相當的超過0.6的ICP/BP比例(水平的虛線), 但在對照動物中未獲得。mA=毫安。

發明詳述

[0019]本發明提供了在被試者中調節平滑肌張力的方法,該方法 包含在被試者足夠數目的平滑肌細胞中引入并表達DNA序列以調節 被試者中的平滑肌張力,該DNA序列包含可操作地與編碼調節平滑 肌張力的鉀通道蛋白質的序列連接的平滑肌特異性啟動子,即平滑肌 α肌動蛋白(SMAA)。優選的鉀通道蛋白質是大電導的鈣敏感性鉀通 道蛋白質maxi-K、代謝門控的和內向整流的鉀通道蛋白質KATP、電 壓依賴性鉀通道蛋白質Kv1.5和小電導的鈣敏感性鉀通道蛋白質 SK3。在優選的實施方案中,平滑肌是corporal?smooth?muscle細胞或 膀胱平滑肌細胞,且鉀通道蛋白質是maxi-K。優選地,在被試者中應 用可操作地與編碼鉀通道蛋白質的DNA序列連接的平滑肌特異性啟 動子SMAA調節平滑肌張力至少與應用可操作地與編碼鉀通道蛋白 質的DNA序列連接的病毒啟動子是同樣有效的。

[0020]本發明也提供了在被試者中調節平滑肌張力的方法,該方 法包含在被試者足夠數目的平滑肌細胞中引入并表達DNA序列以調 節被試者中的平滑肌張力,該DNA序列編碼調節平滑肌張力的電壓 依賴性鉀通道蛋白質。電壓依賴性鉀通道蛋白質包括Kv1.1、Kv1.3、 Kv1.5、Kv2.1、Kv3.1b、延遲整流通道(delayed?rectifierchannel)和快 速瞬時“A”電流通道(fast?transient“A”current?channeD。在一個優選 的實施方案中,電壓依賴性鉀通道蛋白質是Kv1.5。優選地,該DNA 序列進一步包含可操作地與編碼電壓依賴性鉀通道蛋白質的序列連接 的啟動子。優選地,該啟動子是平滑肌特異性啟動子。更優選地,該 平滑肌特異性啟動子是平滑肌α肌動蛋白(SMAA)。

[0021]本發明進一步提供了在被試者中調節平滑肌張力的方法, 該方法包含在被試者足夠數目的平滑肌細胞中引入并表達DNA序列 以調節被試者中的平滑肌張力,該DNA序列編碼調節平滑肌張力的 非大電導的鈣敏感性鉀通道蛋白質。如在此處所用的,“非大電導的鈣 敏感性鉀通道”指中等電導的鈣敏感性鉀通道或小電導的鈣敏感性鉀 通道。小電導的鈣敏感性鉀通道包括SK1、SK2和SK3。優選地,小 電導的鈣敏感性鉀通道是SK3。優選地,該DNA序列進一步包含可 操作地與編碼鉀通道蛋白質的序列連接的啟動子。優選地,該啟動子 是平滑肌特異性啟動子。更優選地,該平滑肌特異性啟動子是平滑肌 α肌動蛋白(SMAA)。

[0022]如在此處所用的,“調節”指對松弛的調節或對收縮的調 節。

[0023]可應用基因轉移方法的平滑肌細胞的例子包括但不局限 于膀胱、胃腸道、肺支氣管、陰莖(海綿體)、前列腺、輸尿管、尿道 (海綿體)、泌尿道和輸精管的內臟平滑肌細胞;以及盆內筋膜的平滑 肌和/或骨骼肌細胞。本發明的基因轉移方法可用于膀胱平滑肌細胞、 corporal?smooth?muscle細胞、胃腸平滑肌細胞、前列腺平滑肌細胞和 尿道平滑肌細胞。鑒于在調節平滑肌組織和其他血管組織張力的因素 中有許多總體的組織學和生理學相似性,那么相似的原則將允許將基 因轉移方法應用于膀胱、胃腸道、肺支氣管、陰莖(海綿體)、前列腺、 輸尿管、尿道(海綿體)、泌尿道和輸精管的動脈平滑肌細胞。本發明 的基因轉移方法也可應用于靜脈平滑肌細胞。

[0024]在平滑肌細胞中引入并表達的鉀通道蛋白質不必是在平 滑肌細胞中正常表達的鉀通道蛋白質。

[0025]本發明特定地提供了基因轉移的方法,其中參與調節平滑 肌張力的鉀通道蛋白質調節平滑肌的松弛。這些鉀通道蛋白質將增強 平滑肌的松弛也將降低平滑肌的張力。特別地,當在陰莖平滑肌中增 強了松弛時將更易于達到勃起。類似地,當膀胱中自發的平滑肌張力 降低時,膀胱的機能亢進將降低。在本發明的該實施方案中,基因轉 移方法特別適用于治療具有過度活動膀胱的個體而不影響膀胱排空的 能力。如在此處所用的,“過度活動的膀胱”是自發收縮從而個體不能 控制尿的通過的膀胱。該泌尿病癥更普遍地稱為欲望性失禁,且也包 括與壓迫性尿失禁組合的欲望性失禁。

[0026]在本發明一個優選的實施方案中,被試者具有升高的平滑 肌收縮,且通過基因轉移對平滑肌張力的調節導致被試者中平滑肌較 少升高的收縮性。優選地,該平滑肌細胞為陰莖平滑肌細胞或膀胱平 滑肌細胞。

[0027]本發明特定地提供了在被試者中調節陰莖平滑肌張力的 方法,該方法包含向被試者的陰莖平滑肌細胞中引入編碼參與調節平 滑肌張力的鉀通道蛋白質的DNA序列,并使其在被試者足夠數目的 陰莖平滑肌細胞中表達以在被試者中誘導勃起。在該實施方案中,本 發明的方法可用于減輕勃起機能障礙。

[0028]本發明提供了在被試者中治療勃起機能障礙的方法,該方 法包含在被試者足夠數目的corporal?smooth?muscle細胞中引入并表 達DNA序列以調節被試者中的corporal?smooth?muscle張力,從而治 療被試者的勃起機能障礙,該DNA序列包含可操作地與編碼調節 corporal?smooth?muscle張力的鉀通道蛋白質的序列連接的平滑肌特 異性啟動子,即平滑肌α肌動蛋白(SMAA)。優選地,該鉀通道蛋白 質是maxi-K、KATP、Kv1.5或SK3。更優選地,該鉀通道蛋白質是 maxi-K。優選地,在被試者中應用可操作地與編碼調節corporal smooth?mnscle張力的鉀通道蛋白質的DNA序列連接的平滑肌特異性 啟動子SMAA治療勃起機能障礙至少與應用可操作地與編碼鉀通道 蛋白質的DNA序列連接的病毒啟動子是同樣有效的。

[0029]本發明也提供了在被試者中治療勃起機能障礙的方法,該 方法包含在被試者足夠數目的corporal?smooth?muscle細胞中引入并 表達DNA序列以調節被試者中的corporal?smooth?muscle張力,從而 治療被試者的勃起機能障礙,該DNA序列編碼調節corporal?smooth muscle張力的電壓依賴性鉀通道蛋白質。優選地,電壓依賴性鉀通道 蛋白質是Kv1.5。

[0030]本發明進一步提供了在被試者中治療勃起機能障礙的方 法,該方法包含在被試者足夠數目的corporal?smooth?muscle細胞中 引入并表達DNA序列以調節被試者中的corporal?smooth?muscle張 力,從而治療被試者的勃起機能障礙,該DNA序列編碼調節corporal smooth?muscle張力的非大電導的鈣敏感性鉀通道蛋白質。該非大電導 的鈣敏感性鉀通道蛋白質可為中等電導的鈣敏感性鉀通道蛋白質或小 電導的鈣敏感性鉀通道蛋白質。優選地,該小電導的鈣敏感性鉀通道 蛋白質是SK3。

[0031]勃起機能障礙可由各種病癥引起,該病癥包括神經原性 的、動脈原性的(arteriogenic)和靜脈阻塞性(veno-occlusive)功能 障礙,以及導致平滑肌不完全松弛的其他病癥。

[0032]此外,本發明特定地提供了在被試者中調節膀胱平滑肌張 力的方法,該方法包含向被試者的膀胱平滑肌細胞中引入編碼參與調 節平滑肌張力的鉀通道蛋白質的DNA序列,并使其在波試者足夠數 目的膀胱平滑肌細胞中表達以增強被試者的膀胱松弛。在該實施方案 中,本發明的方法可用于減輕過度活動的膀胱。過度活動的膀胱可由 許多原因引起,該原因包括神經原性的、肌性的(即逼尿肌細胞本身 產生增加的收縮性的改變)或動脈原性的(即血管閉鎖不全或局部缺 血)功能障礙,以及其他可促進膀胱平滑肌調節改變的病癥(如糖尿 病神經病、多發性硬化、帕金森氏病、中風)。神經原性的膀胱機能障 礙自身表現為部分或完全的泌尿潴留或溢流性失禁。膀胱神經原性功 能障礙的例子包括低張的或松弛的膀胱及痙攣性或收縮的膀胱。這些 功能障礙可由腦、脊髓(如脊柱裂)或膀胱及其出口的局部神經供應 的異常、損傷或病程而引起。導致神經原性膀胱機能障礙的病程包括 前列腺良性增生(BPH);腦血管意外傷害;脫髓鞘或退行性疾病,如 多發性硬化和肌萎縮性側硬化;糖尿病;破裂的椎間盤;梅毒;和腦 或脊髓腫瘤。

[0033]本發明進一步提供的是基因轉移的方法,其中參與調節平 滑肌張力的鉀通道蛋白質可調節平滑肌的收縮。

[0034]此外,本發明提供了在被試者中減少平滑肌的炎癥和興奮 作用的方法,該方法包含向被試者的平滑肌細胞中引入編碼參與調節 平滑肌張力的鉀通道蛋白質的DNA序列,并使其在被試者足夠數目 的平滑肌細胞中表達以減少炎癥和興奮作用。例如,由本發明提供的 該方法可用于減少膀胱炎的癥狀,如間質膀胱炎或輻射誘導的膀胱炎。 間質膀胱炎是具有炎癥和興奮臨床表現的膀胱病癥。間質膀胱炎可由 如變態反應、自身免疫疾病或膠原疾病引起。此外,在此處提供的基 因轉移方法可用于如減少被試者輸尿管、尿道或泌尿道中平滑肌細胞 的炎癥和興奮作用,該作用可由細菌、真菌或寄生物感染引起。

[0035]在本發明的另一個實施方案中,在此處描述的基因轉移方 法可用于治療其他與平滑肌表現相關的功能障礙,包括但不局限于哮 喘;冠狀動脈疾病(在血管造影術中灌注);輸尿管、尿道、泌尿道和 輸精管的泌尿生殖功能障礙;包括便秘、腹瀉或過敏性腸綜合征的胃 腸動力系亂;偏頭痛;早產;Raynaud氏綜合征;靜脈曲張和血栓閉 塞性脈管炎。當用于治療哮喘時,本發明的基因轉移方法可應用本領 域中公知的任何方法通過氣霧劑送遞途徑給予被試者。

[0036]在本發明的方法中,被試者可為動物或人,且優選地為人。 優選地,被試者所遭受的功能障礙可由本發明的方法治療。

[0037]目標DNA序列可通過許多本領域技術人員公知的程序引 入到平滑肌細胞中,如電穿孔、DEAE葡聚糖、單陽離子脂質體融合、 多陽離子脂質體融合、原生質體融合、DNA包被的微粒轟擊、體內電 場的創建、重組復制缺陷型病毒的注射、同源重組、霧化、應用EYEP 載體和通過如膀胱內滴注的裸露DNA轉移。DNA序列可通過直接注 射入平滑肌壁的方法引入。優選的平滑肌壁是膀胱壁。此外,平滑肌 細胞可用DNA序列進行離體轉染,且轉染的細胞可移植入被試者中。 離體轉染的細胞可來自向其中移植了轉染的細胞的相同被試者。本領 域技術人員可以理解上述DNA轉移的許多方法可進行組合。該DNA 序列可為基因組DNA或cDNA。

[0038]在本發明優選的實施方案中,DNA是用哺乳動物載體通 過裸露的DNA轉移而轉移到平滑肌細胞中的。“裸露的DNA”在此處 指在非病毒載體中含有的DNA。該DNA序列可與無菌水溶液組合, 該溶液優選地與受體的血液是等滲的。這種溶液可通過將DNA懸浮 于含有生理學相容物質(如氯化鈉、甘氨酸等)的水中、維持與生理 學條件相容的緩沖的pH并使該溶液滅菌而制備的。在本發明一個優 選的實施方案中,在引入到平滑肌細胞中的制劑中,該DNA是與 20-25%的蔗糖的鹽溶液組合的。

[0039]當將DNA轉移到膀胱的平滑肌細胞中時,它可通過經由 尿道的膀胱內滴注引入到膀胱中,這是治療膀胱腫瘤的充分確立的療 法。然后該DNA溶液可由患者在膀胱中自主地保留規定的時間段。 在另一個實施方案中,該DNA可通過滴注法或注射轉移引入到盆內 筋膜、前列腺、輸尿管、尿道、上部泌尿道或輸精管中,并將輸尿管、 尿道或上部泌尿道阻塞從而使該DNA溶液與內上皮層接觸規定的時 間段。用于表達的DNA序列也可整合入陽離子脂質體中并直接注射 入被試者的平滑肌細胞中。

[0040]本方法可應用病毒和/或非病毒重組載體。基于病毒的載 體包含:(1)病毒基因組或至少相應于其部分的核酸,該部分能夠指 導DNA序列的表達;和(2)編碼參與調節平滑肌張力的鉀通道蛋白 質的DNA序列,該DNA序列可操作地與病毒核酸連接并能夠表達為 目標細胞中的功能基因產物。本發明的重組病毒載體可源自本領域中 技術人員公知的各種病毒核酸,如腺病毒(adenovirus)、腺伴隨病毒 (adeno-associated?virus)、單純皰疹病毒(herpes?simplex?virus) (HSV)、慢病毒屬(lentivirus)、Semiliki?Forest病毒、痘苗病毒 (vaccinia?virus)和其他病毒(包括RNA和DNA病毒)的基因組。

[0041]本發明的重組載體也可含有編碼適當的調節元件的核苷 酸序列,從而可影響適當宿主細胞中載體構建體的表達。如在此處所 用的,“表達”指載體將插入的DNA序列轉錄為mRNA的能力,從而 可發生由插入的核酸編碼的蛋白質的合成。本領域的技術人員可理解 如下幾點:(1)許多增強子和啟動子適用于本發明的構建體;和(2) 當將重組載體構建體引入到宿主細胞中時,該構建體將含有編碼參與 調節平滑肌張力的鉀通道蛋白質的DNA序列的正確轉錄和加工所必 需的起始、終止和控制序列。

[0042]由本發明提供的用于在平滑肌細胞中表達編碼參與調節 平滑肌張力的鉀通道蛋白質的DNA序列的非病毒載體包含本領域技 術人員公知的任何下述載體中的全部或部分:pCMVβ(Invitrogen)、 pcDNA3(Invitrogen)、pET-3d(Novagen)、pProEx-1(Life Technologies)、pFastBac1(Life?Technologies)、pSFV(Life Technologies)、pcDNA2(Invitrogen)、pSL301(Invitrogen)、pSE280 (Invitrogen)、pSE380(Invitrogen)、pSE420(Invitrogen)、pTrcHis A、B、C(Invitrogen)、pRSET?A、B、C(Invitrogen)、pYES2 (Invitrogen)、pAC360(Invitrogen)、pVL1392和pVl1392 (Invitrogen)、pCDM8(Invitrogen)、pcDNAI(Invitrogen)、 pcDNAI(amp)(Invitrogen)、pZeoSV(Invitrogen)、pRc/CMV (Invitrogen)、pRc/RSV(Invitrogen)、pREP4(Invitrogen)、pREP7 (Invitrogen)、pREP8(Invitrogen)、pREP9(Invitrogen)、pREP10 (Invitrogen)、pCEP4(Invitrogen)、pEBVHis(Invitrogen)、λPop6、 EYFP(Clontech)和pBF。其他載體對于本領域技術人員也是顯而易 見的。

[0043]適用于本發明的啟動子包括但不局限于組成型啟動子、組 織特異性啟動子和誘導型啟動子。在本發明的一個實施方案中,編碼 參與調節平滑肌張力的鉀通道蛋白質的DNA序列的表達是由向其中 引入了該DNA序列的特定載體控制和影響的。對一些真核載體已進行 了加工,從而它們能夠在宿主細胞中高水平表達插入的核酸。這種載 體利用許多有力的啟動子之一來指導高水平的表達。真核載體應用病 毒基因的啟動子-增強子序列,尤其是腫瘤病毒的。本發明的特定實施 方案提供了通過應用誘導型啟動子對編碼蛋白質的DNA序列表達的 調節。誘導型啟動子的非限制性例子包括金屬硫蛋白啟動子和小鼠乳 癌病毒(mammary?tumor?virus)啟動子。依賴于載體,平滑肌細胞 中DNA序列的表達可通過在細胞生長周期的某些點上添加特定的化 合物而誘導。可有效用于本發明的重組載體中的啟動子和增強子的其 他例子包括但不局限于CMV(巨細胞病毒)、SV40(猿猴病毒40)、 HSV(單純皰疹病毒)、EBV(EB病毒)、反轉錄病毒、腺病毒啟動 子和增強子,且優選地為平滑肌特異性啟動子和增強子。平滑肌特異 性啟動子的一個例子是SM22α。優選的平滑肌特異性啟動子是平滑肌 α肌動蛋白(SMAA)。

[0044]本發明進一步提供了表達外源DNA序列的平滑肌細胞, 該外源DNA序列編碼參與調節平滑肌張力的鉀通道蛋白質。如在此 處所用的,“外源”指引入到生物或細胞中的任何DNA。含有外源DNA 序列的重組載體向平滑肌細胞中的引入可通過本領域技術人員公知的 方法來實現,如電穿孔、DEAE葡聚糖、陽離子脂質體融合、原生質 體融合、DNA包被的微粒轟擊、重組復制缺陷型病毒的注射、同源重 組和通過如膀胱內滴注的裸露DNA轉移。

[0045]在此處描述的DNA轉移方法的任何一個均可進行組合。 此外,在此處描述的方法可與其他策略進行組合以增加治療功效同時 降低劑量需要和減少副作用。例如,勃起機能障礙可用在此處公開的 編碼鉀通道蛋白質的DNA轉移方法與應用如VIAGRA的口服療法組 合進行治療。

[0046]本發明在下面實驗細節部分的實施例中進行描述。該部分 是為了有助于對本發明的理解,而不應該理解為以任何方式限制如在 其后伴隨的權利要求中限定的本發明。

實驗細節

應用不同鉀通道亞型和平滑肌特異性啟動子的勃起機能障礙基因 轉移

[0047]不同鉀通道亞型恢復勃起能力的功效是在年老的種畜大 鼠中證明的,該大鼠用電壓依賴性鉀通道蛋白質Kv1.5、小電導的鈣 敏感性鉀通道蛋白質SK3和大電導的鈣敏感性鉀通道蛋白質maxi-K 與平滑肌特異性啟動子組合轉染的。

[0048]之所以選擇大鼠用于基因轉移研究,是因為大鼠陰莖在功 能上、組織學上和藥理學上顯示與人類陰莖相似(Lesson等人, Investigative?Urology,3(2):144-45,1965)。在許多公知的模型中, 大鼠對于研究陰莖勃起(Lesson等人,Investigative?Urology,3(2): 144-45,1965;Quinlan等人,J.Urol.,141(3):656-61,1989;Chen 等人,J.Urol.,147:1124-28,1992;Martinez-Pineiro等人,European Urology,25:62-70,1994)以及神經原性和糖尿病性陽萎(Rehman 等人,Am.J.Physiol.,41:H1960-71,1997)是極好的。

[0049]下面描述的研究應用由海綿體神經(CN)的電刺激引起 的體內壓力(ICP)作為勃起能力的量度。CN刺激模型的有效性已在 如下研究中得到證明,該研究顯示轉染maxi-K后用電CN刺激或對 腦的視前內側區的電刺激獲得了相似的結果(Sato等人,J.Urol.,163 (4):增刊,第198頁,2000),或者在對化學藥品(脫水嗎啡)引起 的覺醒的動物中ICP的變化的反應中得到證明(Sato等人,J.Urol., 165(5):增刊,第220頁,2001)。

1.一般實驗程序

[0050]應用年老的種畜Sprague-Dawley大鼠(體重500-700g)。 所有大鼠均隨意飼喂Purina實驗室鼠類食品,并以07:00-19:00的光 照周期在單獨的棚舍中飼養。

[0051]如下所述將編碼鉀通道蛋白質的DNA注射入麻醉的大鼠 海綿體中。注射后1周,將大鼠再次麻醉,并進行實驗規程以調查是 否可獲得與陰莖勃起相當的海綿體內壓力(ICP)的變化。

[0052]大鼠是通過腹膜內注射戊巴比妥鈉(Anpro Pharmaceuticals)而麻醉的。如果需要可通過隨后每45-60分鐘注射 戊巴比妥(5-10mg/kg)而在實驗過程中(2-3小時)維持麻醉。

[0053]實驗規程的手術準備和壓力監控插管的放置:麻醉的動物 是以仰臥姿式放置的。通過中線腹部切口暴露膀胱和前列腺。在左側 的頸動脈中插入動脈線以連續地監控血壓(BP)。將右側外頸靜脈線 用于靜脈內流體轉輸或血液采樣。海綿體神經位于前列腺的后側面, 源自由胃下區和骨盆神經結合形成的骨盆神經節。將神經刺激探針置 于海綿體神經周圍以進行電流刺激。兩個原體(corpora)通過兩側的腹 股溝陰囊切口和陰莖顯露法而暴露。為了監控體內壓力(ICP),將充 滿250U/ml肝素溶液的23-規格套管與PE-50管(Intramedic,Becton Dickinson)連接并插入到右側海綿體中。

[0054]兩個壓力線BP和ICP均與壓力傳導器連接,該傳導器依 次通過傳導器放大器(ETH?400?CB?Sciences,Inc.)與數據獲取板 (MacLab/8e,ADI?Instruments,MA)連接。對壓力測量的實時顯 示和記錄是在Macintosh計算機上進行的(MacLab軟件v3.4)。壓力 傳導器和數據獲取板是用厘米H2O柱校正的。

[0055]對海綿體神經進行的神經刺激和體內壓力的記錄:對海綿 體的直接電刺激是用不銹鋼雙極鉤形電極進行的。每一個探針直徑均 為0.2mm;兩個電極間隔1mm。單相矩形脈沖是由信號生成器(定 制的,具有內置的恒流放大器)釋放的。刺激參數如下:頻率,20Hz; 脈沖寬度,0.22msec;持續時間,1分鐘。目前的規程涉及以如下間 隔增加的電流的應用:0.5、1、2、4和6mA。體內壓力和全身血壓中 的變化是在每一個神經刺激水平上記錄的。

[0056]對每一個神經刺激水平的統計學比較進行One?Way ANOVA,并將Fisher’s?Protected?Least?Significant?Difference?test用 于Post-hoc逐對比較。在P<0.05時,所有差異均認為是顯著的。數 據表示為平均數(±S.E.M)。

[0057]通過將體內壓力的變化表示為全身平均血壓的函數(表示 為ICP/BP),然后將該比例作為神經刺激大小的函數進行繪圖來生成 刺激-反應曲線以闡明神經刺激對體內壓力的作用。所有數據均用 Macintosh計算機的Sigma?Plot軟件進行繪圖(Sigma?Plot,Jandel Scientific,San?Rafael,CA)。

2.利用Kv1.5和SK3鉀通道亞型的實驗

[0058]Kv1.5是在許多可興奮細胞中發現的電壓敏感性K通道超 家族成員之一的電壓依賴性鉀通道(Hille,Ion?Channels?of?Excitable Membranes,Sinauer?Associates,Inc,Sunderland,MA,2002)。Kv1.5 已顯示存在于大鼠身體組織中(Archer,Vascul.Pharmacol.38:61-71, 2002)。鉀通道SK3是在可興奮細胞中發現的小電導的鈣敏感性鉀通 道家族的一個同種型(Hille,見上文;Herrera?&?Nelson,J.Physiol. 541(Pt?2):483-92,2002),該可興奮細胞包括平滑肌(Ro等人, Am?J?Physiol?Gastrointest?Liver?Physiol?281(4):G964-73,2001)。SK3 未顯示存在于大鼠或人身體組織中。

[0059]材料與方法:克隆入質粒pBF中的編碼大鼠SK3的DNA 從Dr.John?Adelman獲得(Kohler?M.等人,Science?273(5282): 1709-14,1996)。編碼人Kv1.5的DNA是由本發明者克隆的。將克隆 的編碼Kv1.5的DNA插入到pVAX表達載體(Invitrogen)中,該載 體為3.0-kb的質粒載體。pVAX1是通過對pcDNA3.1進行修飾以使其 應用卡那霉素代替氨芐青霉素進行選擇而構建的,從而避免了當注射 入人體中時對青霉素敏感性的潛在缺陷。也去除了對于在大腸桿菌(E. coli)中復制或重組蛋白質表達非必需的序列。基因Kv1.5是應用特定 引物通過PCR分離的。它首先克隆入pCR2.1-TOPO中以進行測序, 然后用HindIII?X?BamH?I限制位點亞克隆入pVAX(Invitrogen)中, 對該pVAX用堿性磷酸酶進行處理以減少背景。將100μg?pVAX/Kv1.5 (n=5)或pBF/SK3(n=6)注射入麻醉的大鼠的海綿體中。注射后1 周,在所有大鼠上進行尿道海綿體測量法(cavernosometry)。將在處 理的大鼠中獲得的反應與僅用載體(即具有20%蔗糖的磷酸緩沖鹽溶 液)注射的年齡匹配對照(AMC)大鼠中獲得的反應進行比較。

[0060]結果:實驗結果在圖1中顯示。如圖所示,在應用Kv1.5 或SK3通道亞型的基因轉移實驗中海綿體神經刺激的海綿體內壓力 (ICP)反應在大多數神經刺激水平上顯著地大于年齡匹配對照 (AMC)中的(即≥1.0mA)。應用Kv1.5或SK3通道亞型的基因轉移 產生了與陰莖平滑肌足夠的松弛相當的海綿體內壓力(ICP)對血壓 (BP)的比例,從而確保足以進行交媾(性交)的陰莖勃起。>0.6的 ICP/BP比例(圖1中水平的虛線)足以確保勃起(Melman等人,J.Urol. 170(1):285-90,2003年7月)。

3.應用maxi-K鉀通道與平滑肌特異性啟動子的實驗

[0061]材料與方法:該實驗是為了當maxi-K與高效病毒啟動子 或平滑肌特異性啟動子偶聯時對鉀通道蛋白質maxi-K在恢復勃起能 力中的功效進行比較而進行的。用于這些實驗中的平滑肌特異性啟動 子是平滑肌α肌動蛋白(SMAA)(Cogan等人,J.Biol.Chem.270: 11310-21,1995)。所用的一般病毒啟動子為巨細胞病毒(CMV)。 pCMVβ和pcDNA3質粒購自Invitrogen(San?Diego,CA)。人hSlo (maxi-K的α-或孔形成性亞基)的cDNA從Dr.Salkoff獲得 (Washington?University?School?of?Medicine,St.Louis,MO) (McCobb等人,American?Journal?of?Physiology,269:H767-H777, 1995)。hSlo?cDNA的核苷酸序列也可從GenBank?Accession?No. U23767獲得。將人maxi-K通道cDNA(長度約3,900核苷酸,或3.9 kb)(McCobb等人,American?Journal?of?Physiology,269:H767-H777, 1995)插入到pcDNA3載體的Xho?I-Xba?I克隆位點,在該位點表達 是由巨細胞病毒CMVβ啟動子(Invitrogen)驅動的。在載體 SMAA/EYFP(來自John?Szucsik,Medical?Center?of?Cincinnati,美 國)中,將EYFP去除并將hSlo插入到其位置以得到質粒SMAA/hslo。 pSMAA/EYFP本身是通過將SMAA啟動子序列插入到商業上從 Clontech購得的EYFP載體中而源自pSMP8的(由Cogan等人,J.Biol. Chem.270:11310-21,1999描述)。質粒SMAA/hslo從SMAA啟動 子表達hslo且具有與在pVAX中發現的相同的卡那霉素抗性基因。將 100μg?pVAX/hslo(n=7)或SMAA/hslo(n=5)注射入麻醉的大鼠的 海綿體中。同樣在體外用不同的細胞類型進行了實驗以證明 SMAA/hslo的特異性。

[0062]結果:SMAA/hSlo特異性地在體外培養的人corporal smooth?muscle細胞中表達,但不在非平滑肌細胞類型即常用的細胞表 達系統人胚腎(HEK)細胞中表達。這些數據證明了人平滑肌細胞中 SMAA/hSlo表達的選擇性。

[0063]如圖2所示,體內用兩類啟動子向海綿體中的基因轉移均 產生了與勃起相當的ICP/BP比例;即ICP/BP比例>0.6。因而,在兩 種情況下該變化不僅是統計學顯著的,而且它們是生理學相關的。平 滑肌特異性載體的應用可產生與應用高效病毒啟動子等價的作用。

4.一般討論

[0064]本發明提供的基因轉移方法是利用如下事實設計的,即收 縮和松弛刺激之間的平衡中相對微小的改變可導致平滑肌張力和功能 中的巨大變化(Christ等人,British?Journal?of?Pharmacology,101(2): 375-81,1990;Azadzoi等人,J.Urol.,148(5):1587-91,1992; Lerner等人J.Urol.,149(5.2):1246-55,1993;Taub等人,J.Urol., 42:698,1993;和Christ,G.J.,Urological?Clinics?op?North?America, 22(4):727-45,1995)。基因轉移的目的是在外源基因表達后恢復收 縮和松弛刺激之間的正常平衡,該外源基因編碼平滑肌中生理學相關 的鉀通道蛋白質。根據人類中勃起和膀胱機能障礙的多因素特性,事 實上在恢復勃起能力或膀胱功能中多種不同的遺傳治療策略均將是有 效的。轉染的鉀通道蛋白質的表達如檢驗所示可維持6個月長的時期 (Melman等人,J.Urol.170(1):285-90,2003年7月)。因而,患 者在該時間段內在不存在任何其他外源操作時可獲得“正常的”勃起或 “正常的”膀胱功能。這很明顯的是比所有其他目前可用的策略更大的 進步。事實上,尿殖器官的可接近性和平滑肌張力中微小的改變可引 起許多方面的人類尿殖疾病的事實均提供了應用基因轉移治療尿殖病 癥的清楚的優點。

[0065]研究已顯示來自主要鉀通道家族的鉀通道亞型在增強陰 莖平滑肌的松弛中是有效的。特定地,檢驗的鉀通道是小電導的鈣敏 感性SK3(圖1)、大電導的鈣敏感性maxi-K(美國專利No.6,150,338)、 電壓依賴性Kv1.5(圖1)和內向整流KATP(美國專利No.6,271,211?B1) 鉀通道。總之,前述數據與如下推測一致,即在單獨體內注射編碼鉀 通道蛋白質的DNA后,在corporal?smooth?muscle細胞的一些部分由 于更大數目K+通道的存在而可導致增加的鉀通道活性。反過來,這將 導致對于任何給定水平的內源或外源刺激的更大的超極化,并可能改 變細胞內的鈣轉移/穩態,從而促進更大的corporal?smooth?muscle松 弛。可以合理地認為,應用人K+通道cDNA對平滑肌細胞的相對穩定 的轉染代表了在治療平滑肌病癥中對平滑肌張力的分子操作的重要和 生理學相關的策略,該病癥如勃起機能障礙和膀胱機能障礙。

[0066]本申請也證明應用平滑肌特異性啟動子的鉀通道蛋白質 基因轉移能夠以基本上與用更普遍的病毒啟動子觀察到的相同的方式 恢復勃起能力。然而,與非組織特異性的啟動子相反,含有平滑肌特 異性啟動子的載體的應用可對平滑肌病癥治療的基因轉移方法賦予額 外的安全優點,這對于人的治療顯然是有利的。

[0067]在上文中引用的所有出版物和參考文獻均在此處整體引 入到本說明書中作為參考。

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