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一種以原人參三醇為有效成分的抗癌輔助藥物及應用.pdf

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一種 人參 有效成分 抗癌 輔助 藥物 應用
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摘要
申請專利號:

CN200310114430.8

申請日:

20031206

公開號:

CN1623556A

公開日:

20050608

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A61K31/7048,A61K9/00,A61P37/04 主分類號: A61K31/7048,A61K9/00,A61P37/04
申請人: 山東綠葉天然藥物研究開發有限公司
發明人: 王振華,馬成俊,何杰,茍海濤,傅風華
地址: 264003山東省煙臺市萊山區寶源路9號
優先權: CN200310114430A
專利代理機構: 代理人:
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法律狀態
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CN200310114430.8

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法律狀態類型:

摘要

本發明提供了一種以原人參三醇為有效成分,用于增強抗癌藥物療效,降低抗癌藥物毒性、預防和治療放化療引起的白細胞降低的藥物。該藥物可以以口服或注射途徑給藥,注射給藥可以為靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射或瘤體內注射。本發明還提供了原人參三醇用于增強抗癌藥物療效,降低抗癌藥物毒性、預防和治療放化療引起的白細胞降低的用途。

權利要求書

1.一種以20-S-原人參三醇為有效成分,用于增強抗癌藥物療效,降低化療藥物毒性,預防或治療放化療引起的白細胞降低及組織損傷、增強機體免疫功能的藥物。2.根據權利要求1所述的藥物,其可以和藥學上可接受的載體或輔料組成藥物組合物。3.根據權利要求1或2所述的藥物,其可以口服或注射給藥,注射給藥可以靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射或瘤體內注射。4.根據權利要求3所述的藥物,其可以以片劑、丸劑、顆粒劑、膠囊、糖漿、注射劑、霜劑、軟膏、噴霧劑、口嚼劑或貼劑等形式存在。5.根據權利要求4所述的藥物,其優選滴丸、軟膠囊、凍干粉針、靜脈注射用乳劑。6.??20-S-原人參三醇在制備增強抗癌藥物療效的藥物中的應用。7.??20-S-原人參三醇在制備降低化療藥物毒性,預防和治療放化療引起的白細胞降低及組織損傷的藥物中的應用。8.??20-S-原人參三醇在制備增強機體免疫功能作用的藥物中的應用。

說明書

?

技術領域:

本發明涉及一種用于增強抗癌藥物療效,降低抗癌藥物毒性、預防和治療放化療引起的 白細胞降低及增強機體體液免疫功能的抗癌輔助藥物,屬于癌癥治療的醫藥領域。

背景技術:

癌癥一直是人類健康的大敵,人類的科技水平發展到今天也不能完全征服癌癥,反而其 發病率呈逐年升高的趨勢,并有年輕化的趨向。在某些國家癌癥的發病率和死亡率已超過其 它疾病上升到第一位,在我國每年至少有150萬人死于癌癥。癌癥給患者的身心都造成了難 以修復和治愈的創傷。癌癥的藥物治療近年來已經取得了顯著的進展,但目前臨床應用的抗 癌藥物大多為細胞毒性藥物,在抑制腫瘤細胞增殖的同時,機體正常細胞的增殖也被抑制, 如造血干細胞等,從而導致骨髓造血機能受損,紅細胞或白細胞水平低下,往往是抑制了腫 瘤的增殖,但也破壞了患者的免疫力,最終很難取得良好的治療效果,也限制了化療藥物的 臨床應用。因此,開發高效低毒、靶向性強的抗腫瘤藥物成為抗腫瘤藥物開發的熱點。另外 一種思路就是利用其它輔助治療藥物,在降低化療藥物毒性的同時,起到增效的作用,也成 為抗腫瘤藥開發中重要的方向之一。

中醫藥在我國的應用具有幾千年的歷史,在腫瘤治療及腫瘤輔助治療中也積累的豐富的 經驗。在腫瘤的治療中,中醫多以扶正治療為主,可明顯改善患者生存質量,增強免疫功能, 減少手術、放療、化療的副反應和復發以及遠處轉移,提高患者的遠期療效和生存率。

人參屬中藥上品。具有大補元氣,復脈固脫,補脾益肺,生津、安神等功能。研究發現, 人參在腫瘤的臨床治療中,除具有一定的抑瘤作用外,主要具有減輕化療藥物的骨髓毒性, 明顯改善化療藥物導致白細胞水平降低提高機體免疫功能,改善生活質量及臨床癥狀,增加 體重,增加食欲、緩解疲勞倦怠感的自覺癥狀等功效(林麗珠等,人參注射液在中晚期惡性 腫瘤化療中的協同作用——附66例臨床分析,新中醫,1997,02;郭恒岳等,人參養榮湯對 惡性腫瘤放療致白細胞減少及自覺癥狀的有效性,日本醫學介紹,1996(5);楊娜等,人 參的抗腫瘤及對放化療遠期效應的抑制作用,齊魯腫瘤雜志,1995(4))。

人參皂苷是人參的主要活性成分之一,許多研究表明,人參皂苷具有抗疲勞、增強記憶 力、延緩衰老、增強免疫力、增強耐缺氧能力和抗腫瘤等作用(張春枝等,人參皂苷生理活 性的研究進展,食品與發酵工業,28(4))。人參皂苷包括三醇組皂苷和二醇組皂苷兩大類 別。其中二醇組皂苷在抗腫瘤中的作用較早地被人注意到了,如二醇組中的Rh2和Rb1等。 多項研究表明,口服二醇組皂苷后的抗腫瘤作用是通過天然二醇組皂苷在腸道菌的代謝下形 成的次級皂苷和苷元所產生的(ODANI?T?et?al,Studies?on?absorption,distribution, excretion?and?metabolism?of?ginseng?saponins.III.the?absorption,distribution, excretion?of?ginsenoside?Rb1?in?the?rats.Chem?Pharm?Bull?1983,31(3):1059-1066; AKAO?T?et?al,Metabolic?activation?of?crude?drug?components?by?intestinal?bacterial enzymes.J?Med?Pharm?Soc.WAKEN-YAKU?1992,9:1-13.(in?Japanese);KARIKURA?M?et?al, Studies?on?absorption,distribution,excretion?and?metabolism?of?ginseng?saponins.V. the?decomposition?products?of?ginsenoside?Rb2?in?the?large?intestine?of?rats.Chem Pharm?Bull?1990,38(9):2859-2861;KARIKURA?M?et?al,Studies?on?absorption,distribution, excretion?and?metabolism?of?ginseng?saponins.VII.comparison?of?the?decomposition modes?of?ginsenoside-Rb1?and-Rb2?in?the?digestive?tract?of?rats.Chem?Pharm?Bull?1991, 39(9):2357-2361)。近年來,人們也注意到三醇組皂苷中的某些組分也具有很強的抑瘤作用。 Choi等發現20-S-原人參三醇對多藥耐藥細胞具有細胞毒活性,且能逆轉多藥耐藥細胞的耐 藥性,效果優于其他人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rg1、Re以及原人參二醇(Choi?CH,Kang?G, Min?YD.Reversal?of?P-glycoprotein-mediated?multidrug?resistance?by?protopanaxatriol ginsenosides?from?Korean?red?ginseng.Planta?Med.2003;69(3):235-40.)。Popovich等 發現20(S)-原人參三醇可以抑制白血病細胞株THP-1的增殖,IC50為19μg/ml,并在此濃 度下可以誘導此細胞凋亡(Popovich?DG,Kitts?DD.Structure-function?relationship?exists for?ginsenosides?in?reducing?cell?proliferation?and?inducing?apoptosis?in?the?human leukemia(THP-1)cell?line.Arch?Biochem?Biophys.2002;406(1):1-8)。但對于原人參 三醇對腫瘤患者免疫機能以及對臨床放化療中的減毒增效作用還未見相關報道。我們按 Hasegawa所述方法利用三醇組人參皂苷經腸道菌代謝、硅膠柱層制備純化了20(S)-原人參 三醇(HASEGAWA?H.Main?Ginseng?Saponin?Metabolites?Formed?by?Intestinal?Bacteria. Planta?Medica.1996;62(5):453-457),結構式如圖1所示。并利用其對原人參三醇的抗癌 活性尤其是其對荷瘤之后的免疫增強作用及對放化療治療的減毒增效作用進行了深入研究, 結果發現,原人參三醇具有一定的抑瘤活性,同時它也能明顯提高荷瘤小鼠的免疫力,降低 放化療的毒副作用,增強放化療的療效,從而完成本發明。

??????????????????原人參三醇的結構(其中R=R1=OH,R2=Me)

發明內容:

本發明的目的是提供一種以原人參三醇為有效成分的能夠增強現有抗腫瘤藥物療效,降 低其毒性,預防和治療放化療引起的白細胞降低及增強腫瘤患者免疫功能,預防和治療放療 導致的皮膚及內臟潰瘍性損傷的抗癌輔助藥物。

本發明還提供了由原人參三醇和其它抗癌藥物和藥學上可接的載體或輔料組成的藥物組 合物。

本發明還提供了由原人參三醇在制備具有增強抗癌藥物療效,降低抗癌藥物毒性,預防 和治療放化療引起的白細胞降低及增強機體免疫功能。

具體實施方式

制備例1?20(S)-原人參三醇軟膠囊的制備

稱取明膠100g,甘油30g和水130g。取明膠加入適量的水使其吸水膨脹。另將甘油及余 下的水置煮膠鍋中加熱至70~80℃,混合均勻,加入膨脹的明膠攪拌,熔融。保溫1~2小時, 靜置,使泡沫上浮,刮去上浮的泡沫,以洗凈白布過濾,加入0.0075mgr?Fe2O3粉末,混勻, 保溫待用。配成的膠液粘度一般為2.8~3.2度。

稱取原人參三醇10g溶于90g聚乙二醇中,加熱使其充分溶解,放至室溫。

壓制軟膠囊:將已制好的明膠甘油和當歸油裝入自動旋轉軋囊機中,溫度控制在40~50 ℃,壓制出每囊含100mg藥液油的軟膠囊。

制備例2?20(S)-原人參三醇注射用凍干粉針的制備

稱取1.00g?20(S)-原人參三醇,加入20ml乙醇使皂苷完全融解,再加入40ml甘油混 合均勻。將0.20g鹽酸丁卡因、0.02g的EDTA-2Na加入到40ml注射用水中,使輔料完全溶解。 并將上述水溶液加入到藥物溶液中,混合均勻。以0.01mol/L的氫氧化鈉和稀鹽酸調節pH值 為5.5±1.0。加入0.1%的針用活性炭85度保溫15分鐘,G3垂熔玻璃漏斗過濾,0.22um的 微孔濾膜過濾。濾液分裝于7ml西林瓶中,每支裝量2ml。

分裝好的注射劑半壓塞,于凍干機中凍干,壓鋁蓋成凍干粉針劑,20mg/支。

試驗例1?20(S)-原人參三醇對小鼠移植瘤生長的抑制作用

試驗材料

1.藥物及試劑:20(S)-原人參三醇凍干粉針,山東省天然藥物工程技術研究中心制劑室 提供,批號:20020625,20mg/支。20(S)-原人參三醇軟膠囊,山東省天然藥物工程技術研 究中心制劑室提供,批號:20020305,10mg/粒。環磷酰胺,上海華聯制藥有限公司生產,批 號:000205。DMEM培養基,GIBCO公司。胰蛋白酶、MTT、ConA、IL-2,SIGMA公司生產。大 鼠抗小鼠CD3、CD4、CD8單抗,FITC兔抗大鼠單抗,購自武漢生物制品研究所。

2.動物:昆明種小鼠,5~8周齡,體重18~22g,山東省天然藥物工程技術研究中心毒理室 提供,合格證號:魯動質字20010603。雌雄兼用,每批實驗采用同一性別。C57BL/6純系小 鼠,5~8周齡,體重18~22g,中國醫學科學院實驗動物研究所提供,合格證號:SCXK11-00-0006。

3.細胞株:小鼠H22肝癌和Lewis肺癌,購自中國醫學科學院北京藥物研究所。

試驗方法:

藥物配制:注射用20(S)-原人參三醇凍干粉針用生理鹽水溶成相應濃度。20(S)-原人參 三醇軟膠囊用玉米油溶成相相應應濃度。

H22肝癌接種:取于昆明鼠腹腔內接種傳代七天的上述荷瘤小鼠,消毒腹部皮膚后,抽取腹 水,加入三倍體積的注射用生理鹽水稀釋,消毒昆明鼠腋下皮膚,每只小鼠于腋下注射瘤細 胞懸液0.2ml。

Lewis肺癌接種:取已接種10天的Lewis肺癌、生長狀態良好的小鼠,脫頸處死,用酒精消 毒皮膚后,剝取腫瘤組織,加入五倍量的生理鹽水后用組織勻漿器研磨成勻漿,100目不銹 鋼網過濾。消毒每只小鼠左側腋下皮膚,接種瘤液0.2ml。

接瘤后第二天隨機分為如下5組并給藥:

溶劑對照組:給予含等量輔料的生理鹽水溶液

陽性藥對照:給予環磷酰胺20mg/kg

藥物小劑量組(i.v.):給予20(S)-原人參三醇0.5mg/kg

藥物中劑量組(i.v.):給予20(S)-原人參三醇5mg/kg

藥物高劑量組(i.v.):給予20(S)-原人參三醇50mg/kg

灌胃給藥組:給予20(S)-原人參三醇50mg/kg

連續給藥10天,停藥后24小時處死小鼠,剝取瘤組織稱重。計算抑瘤率。

4實驗結果:結果表明,20(S)-原人參三醇(PPT)靜脈注射與灌胃給藥均對小鼠H22肝癌 和Lewis肺癌的生長具有一定的抑制作用,抑瘤率具有一定的劑量依賴性,各給藥組與模型 組比較具差異顯著。結果見表1-2。

???????表1.20(S)-原人參三醇對小鼠H22肝癌生長的抑制作用

??????????????????????劑量????????瘤重????????????抑瘤率

組別??????????鼠數

??????????????????????(mg/kg)?????(g)?????????????(%)

模型組????????10??????——???????????????1.96±0.71

環磷酰胺組????10??????20??????????0.82±0.34**???58.3

PPT(i.v.)?????10??????50??????????1.15±0.36**???41.3

PPT(i.v.)?????10??????5???????????1.16±0.43**???40.7

PPT(i.v.)?????10??????0.5?????????1.39±0.44*????29.1

PPT(p.o.)?????10??????50??????????1.25±0.42*????36.4

與模型組比較:**,P<0.01;*,P<0.05。

表2?20(S)-原人參三醇對小鼠Lewis肺癌生長的抑制作用

???????????????????????????劑量????????瘤重?????????????抑瘤率

組別??????????鼠數

???????????????????????????(mg/kg)?????(g)??????????????(%)

模型組????????10???????????——???????????????1.53±0.26

環磷酰胺組????10???????????20??????????0.65±0.22**????57.3

PPT(i.v.)?????10???????????50??????????0.99±0.39**????35.2

PPT(i.v.)?????10???????????5???????????1.01±0.54*?????33.8

PPT(i.v.)?????10???????????0.5?????????1.21±0.29*?????20.9

PPT(p.o.)?????10???????????50??????????1.04±0.29**????32.1

與模型組比較:**,P<0.01;*,P<0.05。

試驗例2.20(S)-原人參三醇對化療藥物的增效作用

試驗材料:同試驗例1

試驗方法:

用小鼠Lewis肺癌建立小鼠體內移植性腫瘤模型,按如下組別分組及給藥:

溶劑對照組:給予等量輔料的生理鹽水溶液

陽性藥對照組:給予環磷酰胺10mg/kg

陽性藥+藥物小劑量組(i.v.):給予環磷酰胺10+PPT?0.5mg/kg

陽性藥+藥物小劑量組(i.v.):給予環磷酰胺10+PPT?5mg/kg

陽性藥+藥物大劑量組(i.v.):給予環磷酰胺10+PPT?50mg/kg

陽性藥+灌胃藥物組(p.o.):給予環磷酰胺10+PPT?50mg/kg

給藥方法如前所述。末次給藥后脫頸椎處死小鼠,取瘤并稱重,比較單純應用環磷酰胺10mg/kg 治療同與20(S)-原人參三醇各組合用治療各組之間抑瘤作用差別,觀察20(S)-原人參 三醇增效作用。

實驗結果:

結果表明,環磷酰胺10mg/kg劑量組對Lewis肺癌的抑瘤率為20.5%,而20(S)-原人參三 醇注射給藥或灌胃給藥后,抑瘤率明顯提高,各組與環磷酰胺組比較具有明顯差異。表明20 (S)-原人參三醇對化療藥具有增效作用。結果見表3。

表3環磷酰胺與20(S)-原人參三醇聯合應用對小鼠Lewis生長的抑制作用

?????????????????????????????????????瘤重??????????????抑瘤率

組別??????????????????劑量(mg/kg)

?????????????????????????????????????(g)???????????????(%)

溶劑對照組????????????等量溶劑???????1.76±0.24????????——

環磷酰胺??????????????10?????????????1.40±0.35*??????20.5

環磷酰胺+PPT(i.v.)????10+0.5?????????0.99±0.24**##????43.7

環磷酰胺+PPT(i.v.)????10+5???????????0.71±0.18**##????59.5

環磷酰胺+PPT(i.v.)????10+50??????????0.61±0.19**##????65.1

環磷酰胺+PPT(p.o.)????10+50??????????0.84±0.24**##????52.4

試驗例3?20(S)-原人參三醇對化療藥物治療的減毒試驗

試驗材料:同試驗例1。

試驗方法:用小鼠肝癌和Lewis肺癌建立小鼠體內移植性腫瘤模型,按如下組別分組及給藥:

溶劑對照組:給予等量輔料的生理鹽水溶液

陽性藥大劑量對照組:給予環磷酰胺20mg/kg

陽性藥大劑量+PPT(i.v.):給予環磷酰胺20+PPT?0.5mg/kg

陽性藥大劑量+PPT(i.v.):給予環磷酰胺20+PPT?5mg/kg

陽性藥大劑量+PPT(i.v.):給予環磷酰胺20+PPT?50mg/kg

陽性藥大劑量+PPT(p.o.):給予環磷酰胺20+PPT?50mg/kg

給藥方法如前所述。比較單純應用環磷酰胺20mg/kg治療同與20(S)-原人參三醇各劑量組 聯合應用治療各組之間動物體重差異、胸腺指數和脾指數差異,用血細胞讀數儀計數外周血 白細胞,觀察各組間白細胞數目差異。

試驗結果:在小鼠Lewis肺癌移植性腫瘤模型中,環磷酰胺20mg/kg劑量組在抑瘤的同時可 見體重、免疫器官及白細胞均明顯低于對照組。與20(S)-原人參三醇合用后可明顯改善此 狀態,20(S)-原人參三醇可以對抗環磷酰胺所致小鼠體重降低、白細胞下降及免疫器官的 萎縮,提高小鼠胸腺及脾臟重量(見表6)。表明20(S)-原人參三醇可明顯降低環磷酰胺的 毒副作用。結果見表4。

表4?20(S)-原人參三醇對環磷酰胺在治療小鼠Lewis肺癌中的減毒作用

???????????????劑量??????????體重???????????????????????????????????????????WBC

級別??????????????????????????????????????胸腺指數??????????脾指數

???????????????(mg/kg)???????(g)????????????????????????????????????????????(×109)

溶劑對照組?????等量溶劑????25.1±1.7??????0.516±0.083??????1.43±0.29??????8.17±0.97

環磷酰胺(CTX)??20??????????22.6±2.0**???0.226±0.067**???0.94±0.15**???2.94±0.87**

CTX+PPT(i.v.)??20+0.5??????23.6±1.3*????0.306±0.060**#??1.17±0.25*#???3.82±0.86**#

CTX+PPT(i.v.)??20+5????????24.3±1.3#????0.401±0.071**##?1.26±0.24##???4.69±1.03**##

CTX+PPT(i.v.)??20+50???????24.6±1.2#????0.413±0.058**##?1.29±0.24##???4.84±1.23**##

CTX+PPT(p.o.)??20+50???????24.8±1.5#????0.366±0.053**##?1.19±0.28#????4.07±0.78**##

與溶劑對照組比較:**,P<0.01;*,P<0.05。與環磷酰胺組比較:##,P<0.01;#,P<0.05。

試驗例4?20(S)-原人參三醇對放療的減毒增效作用

試驗材料:同試驗例1。

試驗方法:用Lewis建立小鼠移植性腫瘤模型,按如下組別分組給藥:

溶劑對照組:等量溶劑對照

60Co組:等量溶劑對照+60Co照射

60Co+20(S)-原人參三醇大劑量組(i.v.):PPT?50mg/kg+60Co照射

60Co+20(S)-原人參三醇中劑量組(i.v.):PPT?5mg/kg+60Co照射

60Co+20(S)-原人參三醇小劑量組(i.v.):PPT?0.5mg/kg+60Co照射

60Co+20(S)-原人參三醇大劑量組(p.o.):PPT?50mg/kg+60Co照射

于接種腫瘤后第二天各組給予相應藥物,于接種腫瘤后3天,除荷瘤對照組外,其余4組均一 次性給予500Rad?60Co照射。于末次給藥24h后,各組動物眼眶后靜脈叢取血,測定紅細胞 (RBC)、血紅蛋白(HGB)、白細胞(WBC)量,剝離腫瘤組織稱重并計算抑瘤率。

試驗結果:結果表明,荷瘤小鼠經60Co射線照射后,腫瘤的生長被明顯抑制,但同時照射又 導致小鼠紅細胞、血紅蛋白和外周血白細胞下降,說明照射導致骨髓損傷,20(S)-原人參 三醇不同劑量組靜注或口服均可改善小鼠放療后的損傷。表明20(S)-原人參三醇對腫瘤的 放療具有減毒增效作用。結果見表5。

?????????????????????表5.20(S)-原人參三醇對60Co照射后的減毒增效作用

??????????????????劑量

???????????????????????????RBC???????????????HGB??????????????WBC??????????????瘤重?????????????抑瘤率

組別?????????????(mg/k

???????????????????????????(×109/L)????????(g/L)????????????(×109/L)???????(g)??????????????(%)

?????????????????g)

溶劑對照組???????——?????????6.65±0.44???????112.7±8.7???????6.95±1.40???????1.73±0.25

60Co照射組???????——????????4.17±0.89**?????84.0±10.2**????2.76±0.76**????0.91±0.18**???????47.7

60Co+PPT(i.v.)???50??????5.59±0.78**##???105.7±15.3##???4.81±1.32**##???0.59±0.14**##??????57.6

60Co+PPT(i.v.)???5???????5.28±0.90**#????104.8±15.3##???4.67±1.21**##???0.64±0.17**##??????63.1

60Co+PPT(i.v.)???0.5?????5.01±0.71**#????94.9±10.2*#????3.88±1.03**#????0.73±0.17**#??????66.1

60Co+PPT(p.o.)???50??????5.27±1.15**#????97.9±15.0*#????4.72±1.42**##???0.65±0.21**#???????62.6

與溶劑對照組比較:*,P<0.05;**,P<0.01。與60Co照射組比較:##,P<0.01,#,P<0.05。

試驗例5?20(S)-原人參三醇對荷瘤小鼠毒副作用

試驗材料:同試驗例1。

試驗方法:在進行20(S)-原人參三醇對小鼠Lewis肺癌抑瘤率實驗的過程中,每天稱量 體重,觀察荷瘤鼠一般狀態和體重變化,于處死小鼠前自眼眶采血,計數外周血白細胞數目, 取瘤同時解剖分離胸腺、脾臟及靶器官,稱重并計算臟器指數。

試驗結果:小鼠給予環磷酰胺后,毛色暗淡,被毛脫落嚴重,精神萎靡,體重較對照組比較 明顯降低,胸腺指數與脾指數也明顯低于對照組。20(S)-原人參三醇各給藥組荷瘤小鼠的 體重及外周血白細胞與溶劑對照比較差別不明顯,給予20(S)-原人參三醇小鼠的胸腺指數 還有一定升高趨勢(無統計學差異)。結果見表7。

???????表6?20(S)-原人參三醇對Lewis肺癌荷瘤小鼠的毒副作用

?????????????劑量????????體重??????????????????????????????????????????????WBC

組別

?????????????????????????????????????????胸腺指數??????????脾指數

?????????????(mg/kg)?????(g)

???????????????????????????????????????????????????????????????????????????(×109)

溶劑對照組???等量溶劑????25.6±1.37??????0.488±0.073??????1.43±0.29??????7.64±2.72

環磷酰胺?????20??????????22.3±2.48**???0.231±0.068**???0.94±0.15**???4.18±1.69**

PPT(i.v.)????0.5?????????25.9±2.47??????0.499±0.089??????1.38±0.31??????7.52±1.98

PPT(i.v.)????5???????????26.5±3.01??????0.512±0.083??????1.42±0.47??????7.77±2.05

PPT(i.v.)????50??????????25.8±2.47??????0.501±0.091??????1.45±0.39??????7.58±2.13

PPT(p.o.)????50??????????26.3±3.21??????0.517±0.078??????1.46±0.54??????7.90±2.47

與溶劑對照組比較:**,P<0.01。

試驗例6?20(S)-原人參三醇對小鼠脾淋巴細胞轉化功能的影響

試驗材料:同試驗例1。

試驗方法:Lewis肺癌荷瘤小鼠,荷瘤給藥方法同試驗例1,末次給藥后,無菌條件下取出荷 瘤小鼠脾臟,玻璃組織勻漿器研磨,200目不銹鋼篩網過濾,0.83%氯化銨裂解紅細胞,DMEM 培養基洗三次后,調整脾細胞濃度至1×107個/ml。取96孔平底培養板,每只鼠設:

(1)對照孔,3復孔,每孔加100μl?DMEM培養液

(2)ConA刺激孔,3復孔,每孔加10μl?ConA(10μg/ml)

然后每孔加100μl脾細胞懸液,在37℃、5%CO2、飽合濕度的培養箱中培養72小時,終止 培養前4小時,每孔加入5mg/ml?MTT溶液10μl。終止培養后,小心吸棄孔內上清液,每孔 加入150μl?DMSO,振蕩10分鐘,使結晶充分溶解。用BioRad?550酶標儀在570nm波長、630nm 參考波長下測定吸光度,計算刺激指數(SI)。

試驗結果:實驗結果表明(見表8),Lewis肺癌荷瘤小鼠注射或灌胃給予不同劑量20(S)- 原人參三醇10天后,ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞增殖反應能力明顯升高,且呈劑量依賴性。 高劑量組與溶劑對照組比較均有極顯著性差異。結果見表7。

試驗例7?20(S)-原人參三醇對荷瘤小鼠單核-巨噬細胞系統功能的影響

吞噬顆粒狀異物是網狀內皮系統的重要功能。現已明確,網狀內皮系統即單核-巨噬細胞系統。 動物試驗結果早已發現,單核-巨噬細胞系統活躍的小鼠,惡性腫瘤的發生率低。機體單核- 巨噬細胞系統功能的增強或減弱,將影響其抵御外界病因侵襲的能力。因而,測定體內該系 統的功能,有助于觀察其健康狀況,也可用于判斷某些生物反應調節劑類抗腫瘤藥物的作用 強度。

向小鼠血流內注射一定量的炭顆粒懸液,觀察炭顆粒清除的速率即可反應小鼠網狀內皮系統 吞噬功能的強弱。

試驗材料:小鼠及瘤株同試驗例1。

試驗方法:印度墨汁,超聲處理20min,加入2倍體積蒸餾水。

每只小鼠尾靜脈注射配好的印度墨汁0.1ml/10g體重,注畢即刻計時。在注射墨汁后3min 和13min,分別以預先用肝素處理的20μl毛細采血管自眼內眥取血20μl,將所取血液加 入到含1.5ml?0.1%NaCO3的離心管中,搖動混勻。于721分光光度計上測定600nm時的吸 光度,用0.1%NaCO3作空白對照。小鼠解剖取肝和脾,稱體重和肝、脾重。按下式計算每分 鐘炭粒的清除速度的K值。

K = lgOD 1 - lgOD 2 t 2 - t 1 ]]>

根據K值計算小鼠炭廓清的吞噬指數:

試驗結果:結果表明,Lewis肺癌荷瘤小鼠注射或灌胃給予不同劑量20(S)-原人參三醇10 天后,小鼠的炭末廓清指數明顯提高,且呈劑量依賴性。各劑量組與溶劑對照組比較均有顯 著性差異。而陽性對照組(環磷酰胺組)明顯低于溶劑對照組。表明20(S)-原人參三醇可 以增強荷瘤小鼠網狀內皮吞噬系統功能。結果見表7。

試驗例8?20(S)-原人參三醇對荷瘤小鼠IL-2水平的影響

研究表明惡性腫瘤病人產生IL-2水平明顯低下,且與腫瘤的生長有一定關系,腫瘤體積 越大,IL-2水平越低,手術切除腫瘤后IL-2可以恢復到較高水平。IL-2是T細胞自分泌或 旁分泌的生長因子,可以促進T細胞增殖,刺激NK細胞生長,并增強其殺傷活性,還可誘導 CTL、LAK等多種殺傷細胞的分化和效應能力,并能誘導殺傷細胞分泌IFN-γ、TNF-α等細胞 因子,其還可以促進B細胞的分化、增殖和產生抗體,以及刺激淋巴因子細胞毒性T細胞的 生成。基于IL-2的重要生物學活性,藥物對IL-2水平的影響已經被作為評價抗腫瘤藥物功 能一個重要的免疫學指標。

利用IL-2依賴性細胞株CTLL-2細胞測定20(S)-原人參三醇對荷瘤小鼠IL-2水平的影響。

試驗材料:

(1)小鼠脾細胞IL-2的誘生:無菌制脾細胞懸液方法同試驗例6,DMEM培養基沖洗一次 后調整細胞濃度為0.5×107細胞/ml細胞懸液,加入終濃度的ConA?10μg/ml,3000rpm/min 離心10分鐘,取上清待測。

(2)IL-2活性的測定:IL-2標準品用DMEM倍比稀釋,每濃度設3復孔加入96孔培養板, 100μl/孔。待測樣品同樣設3復孔加入96孔培養板中。另于每孔中加入5×106個/ml的 CTLL2細胞懸液,置37℃,5%CO2飽和濕度培養22小時。每孔加入MTT(5mg/ml)10μl,繼續 培養4h,棄上清,DMSO?150μl,充分振蕩使結晶溶解,BioRad?550酶標儀于570nm測定OD570, 根據標準曲線計算IL-2濃度。

試驗結果:結果表明,Lewis肺癌荷瘤小鼠注射或灌胃給予不同劑量20(S)-原人參三醇10 天后,小鼠脾細胞產生IL-2水平明顯高于溶劑對照組,且呈劑量依賴性。各劑量組與溶劑對 照組比較均有顯著性差異。表明20(S)-原人參三醇可以提高荷瘤小鼠IL-2水平。結果見 表7。

試驗例7?20(S)-原人參三醇對荷瘤小鼠血清溶血素水平的影響

血清溶血素水平是反應患者體液免疫功能的一個重要指標。

試驗材料:同試驗例1。

試驗方法:荷瘤鼠分組給藥方法同試驗例1。給藥第6天用處理好的綿羊紅細胞對小鼠進行免 疫。取脫纖維的綿羊紅細胞,用生理鹽水洗滌3次,每次離心2000轉/分,10min,將壓積綿 羊紅細胞(SRBC)用生理鹽水配成2%(V/V)的細胞懸液,每只鼠腹腔注射0.2ml進行免疫。 5天后,摘除眼球取血于離心管中,放置約1h,將凝固血與管壁剝離,使血清充分析出,2000 轉/分,10min,收集血清。用生理鹽水將血清稀釋200倍。

于試管中加入稀釋小鼠血清1ml,加入處理好的綿羊紅細胞0.5ml,移至冰浴內,再加入生理 鹽水稀釋豚鼠補體血清(1∶10,V∶V)1ml,空白對照管則以1ml生理鹽水代替小鼠血清。 混勻后置試管于37℃水浴10分鐘。按時取出冰浴終止反應。冷卻后離心2000rpm×10min。 取離心后上清1ml加都氏液(碳酸氫鈉1.4g,氰化鉀.05g,高鐵氰化鉀0.2g,蒸餾水1000ml) 3ml,搖勻靜置10min,540nm測定光吸收。先測出綿羊紅細胞半數溶血時的吸收度值[即試 管內只加0.25ml?SRBC液(5億)和都氏液3.75ml]。試驗樣品半數溶血值HC50按下式算 出:

試驗結果:結果表明,Lewis肺癌荷瘤小鼠注射或灌胃給予不同劑量20(S)-原人參三醇 10天后,小鼠的血清溶血素水平明顯升高,各劑量組與溶劑對照組比較均有顯著性差異。表 明20(S)-原人參三醇可以增加荷瘤小鼠血清溶血素水平。結果見表7。

?7.3?20(S)-原人參三醇對荷瘤小鼠T淋巴細胞亞群的影響

?Lewis肺癌荷瘤小鼠分組給藥按試驗例1中方法進行。處死前眼眶采血。用淋巴細胞分離液 分離淋巴細胞,然后調整細胞濃度為1×107個/ml。取50μl加入試管中,加100μl大鼠 抗小鼠CD3或CD4或CD8單克隆抗體,4℃孵育30min,用Hanks液洗3遍,每管加入100 μl異硫氰酸熒光素(FITC)標記的兔抗大鼠單抗,再放入4℃孵育30min,用Hanks液洗 3遍,取10μl細胞懸液滴片,在熒光顯微鏡(激發光490nm,屏障濾板透光范圍520nm~ 530nm)下觀察計數。每個樣品共計數200個細胞,其中陽性熒光細胞數換算成陽性百分率(%)。 試驗結果:熒光顯微鏡計數CD3、CD4和CD8陽性細胞并計算陽性細胞百分率。統計結果表明, 20(S)-原人參三醇連續給藥10天后,可明顯提高CD3和CD4陽性細胞百分率,各給藥組與 對照組比較有顯著性差異,給藥后CD4/CD8比值也明顯升高。結果見表8。

表7?20(S)-原人參三醇對荷瘤小鼠脾淋巴細胞轉化、炭廓清指數、IL-2水平和血清溶血 素水平的影響

????????????????劑量??????????????????????????????????????????????IL-2 ???????組別?????????????????????SI?????????????????炭廓清指數?????????????????????????HC50

????????????????(mg/kg)??????????????????????????????????????????(u/ml)

???模型組???????等量溶劑????1.084±0.146???????8.88±0.56???????2.36±0.17??????148.4±21.8

???環磷酰胺組???20??????????1.123±0.125???????7.53±1.72*?????2.46±0.14??????114.9±26.4**

???PPT(i.v.)????0.5?????????1.227±0.157*?????11.17±1.27**???2.60±0.21*????168.0±19.4*

???PPT(i.v.)????5???????????1.322±0.152**????10.91±2.24*????2.74±0.22**???181.6±16.7**

???PPT(i.v.)????50??????????1.419±0.153**????9.85±1.24*?????2.85±0.27**???182.4±22.8**

???PPT(p.o.)????50??????????1.301±0.149**????10.69±2.04*????2.64±0.28*????174.0±22.6*

???與溶劑對照組比較:**,P<0.01;*,P<0.05。

???????????????表8?20(S)-原人參三醇對荷瘤小鼠T淋巴細胞亞群的影響

?????????????劑量

組別?????????????????????CD3????????????CD4(%)????????CD8??????????DCD4/CD8

?????????????(mg/kg)

溶劑對照?????等量溶劑????45.9±3.2??????30.0±2.8??????27.4±3.6????1.11±0.19

環磷酰胺?????20??????????45.4±3.0??????26.9±6.0??????25.1±3.1????1.08±0.24

PPT(i.v.)????0.5?????????51.7±7.2*????34.7±6.3*???24.3±3.3????1.46±0.36*

PPT(i.v.)????5???????????53.7±6.7**???36.7±4.9**???24.7±2.9????1.49±0.16**

PPT(i.v.)????50??????????57.4±5.2**???39.0±6.6**???25.2±3.3????1.56±0.25**

PPT(p.o.)????50??????????54.1±6.9**???35.3±7.2*????24.4±2.9????1.46±0.32**

與溶劑對照組比較:**,P<0.01?;*,P<0.05。

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