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一種紫杉醇納米膠束及其應用.pdf

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一種 紫杉醇 納米 膠束 及其 應用
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摘要
申請專利號:

CN201110044677.1

申請日:

20110222

公開號:

CN102133172B

公開日:

20121114

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A61K9/00,A61K31/337,A61K47/34,A61P35/00 主分類號: A61K9/00,A61K31/337,A61K47/34,A61P35/00
申請人: 北京大學
發明人: 呂萬良,姚紅娟,居瑞軍,王小星,張燕,李若婧,于洋,張亮
地址: 100191 北京市海淀區學院路38號北京大學醫學部
優先權: 201110025488.X
專利代理機構: 北京紀凱知識產權代理有限公司 代理人: 關暢
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201110044677.1

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種紫杉醇納米膠束及其應用。一種紫杉醇納米膠束,為如下1)或2)或3)所示:1)由載體和紫杉醇制備而成;所述載體為聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯和地喹氯銨的混合物;2)由載體和紫杉醇制備而成;所述載體為聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯的混合物;3)由載體和紫杉醇制備而成;所述載體為聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。本發明的功能化紫杉醇納米膠束在口服給藥后能使紫杉醇通過胃腸道屏障,克服耐藥性乳腺癌的多藥耐藥性。本發明的功能化紫杉醇納米膠束口服劑型能避免過敏反應,可用于眾多的癌癥病人,同時適用于多藥耐藥腫瘤,比當前的靜脈注射劑型有更大的優越性。

權利要求書

1.一種紫杉醇納米膠束,由載體和紫杉醇制備而成;所述載體為聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯和地喹氯銨的混合物;所述紫杉醇和載體的投料質量比為1∶20至1∶40;所述載體中,所述聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯和地喹氯銨的投料摩爾比為1∶(0.5-3)∶(0.2-0.5)。2.根據權利要求1所述的紫杉醇納米膠束,其特征在于:所述紫杉醇和載體的投料質量比為1∶28。3.根據權利要求1所述的紫杉醇納米膠束,其特征在于:所述載體中,所述聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯和地喹氯銨的投料摩爾比為1∶1∶0.4。4.根據權利要求1或2或3所述的紫杉醇納米膠束,其特征在于:所述聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的分子式為CHNOP,分子結構式如式II所示:(式II)所述聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯的分子式為(CHO)CHO,分子結構式如式III所示:(式III)所述地喹氯銨的分子式為CHCN,分子結構式如式IV所示:(式IV)所述紫杉醇的分子式為CHNO,分子結構式如式I:(式I)。5.根據權利要求1所述的紫杉醇納米膠束,其特征在于:其制備的方法包括如下步驟:將所述紫杉醇和所述載體置于容器中,再向其中加入甲醇,使所述紫杉醇和所述載體溶解于所述甲醇中,再去除甲醇并使所述紫杉醇和所述載體的混合物在所述容器壁上形成薄膜,再向所述容器中加入pH7.0-7.5的緩沖液,水化處理,得到水化處理產物,即得到所述紫杉醇納米膠束。6.根據權利要求5所述的紫杉醇納米膠束,其特征在于:所述制備的方法中,所述水化處理的方法為將裝有所述薄膜和所述緩沖液的容器在60℃振搖30min;所述制備的方法中,所述緩沖液為HEPES緩沖液;和/或,所述HEPES緩沖液由10mM?HEPES、145mM?NaCl和水組成,水補足體積;所述HEPES緩沖液的pH值為7.4。7.根據權利要求6所述的紫杉醇納米膠束,其特征在于:所述紫杉醇納米膠束的平均粒徑為15.77±0.77nm;所述紫杉醇納米膠束的粒徑的多分散系數為0.18±0.04。8.根據權利要求6所述的紫杉醇納米膠束,其特征在于:所述紫杉醇納米膠束的Zeta電位為1.6mV;和/或,所述紫杉醇納米膠束的載藥量為2.58±0.18%;和/或,所述紫杉醇納米膠束中紫杉醇的含量為1502±17μg/ml。9.權利要求1-8中任一所述紫杉醇納米膠束在制備抑制腫瘤的產品中的應用。10.根據權利要求9所述的應用,其特征在于:所述抑制腫瘤為抑制腫瘤的增殖和/或抑制腫瘤細胞的存活;和/或,所述抑制腫瘤的增殖為抑制腫瘤細胞的增殖和/或抑制腫瘤球體積增大和/或促進腫瘤球的瓦解;和/或,所述腫瘤為乳腺癌;所述乳腺癌的細胞為人源乳腺癌MCF-7細胞或耐藥人源乳腺癌MCF-7/Adr細胞。

說明書

技術領域

本發明涉及一種紫杉醇納米膠束及其應用。

背景技術

紫杉醇(paclitaxel)是從紅豆杉屬植物中提取和純化得到的一種具有高效抗腫瘤活性的天然物質,對許多類型的癌癥具有顯著的療效,包括卵巢癌、乳腺癌和非小細胞肺癌。由于紫杉醇很小的溶解度(<1μg/ml)和很差的胃腸道屏障透過性,導致紫杉醇不能口服生物利用。目前臨床中使用的紫杉醇制劑都是靜脈注射劑。紫杉醇的市售制劑泰素(Taxol)是由聚氧乙烯蓖麻油/無水乙醇(50/50)制成的無色黏稠狀溶液。但制劑中的聚氧乙烯蓖麻油引起病人嚴重的副反應,例如過敏反應、神經毒性和腎毒性,而且還可溶解聚氯乙烯輸液器中的增塑劑,也可引起制劑稀釋時紫杉醇出現沉淀。

實際上,由于紫杉醇的低溶解度、胃腸道中P-糖蛋白的外排以及腸或肝上細胞色素P-450?3A4酶的代謝,使得紫杉醇很難跨過胃腸道屏障。研究者們采用了很多策略來提高紫杉醇的生物利用度,但是目前仍沒有理想的紫杉醇口服劑型。

紫杉醇對多種類型的腫瘤病人復發后治療上表現出明顯的多藥耐藥性,主要是由于ABC轉運蛋白家族的過度表達(尤其是P-糖蛋白),使得抗腫瘤藥物被耐藥腫瘤細胞外排后,從而降低了腫瘤細胞內的藥物濃度。

由于這些問題的存在,有必要開發一種新型紫杉醇輸送系統,以提高紫杉醇的溶解度,提高紫杉醇對胃腸道屏障的透過性以及克服紫杉醇的多藥耐藥性。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種紫杉醇納米膠束。

本發明所提供的紫杉醇納米膠束,為如下1)或2)或3)所示:

1)由載體和紫杉醇制備而成;所述載體為聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯和地喹氯銨的混合物;

2)由載體和紫杉醇制備而成;所述載體為聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯的混合物;

3)由載體和紫杉醇制備而成;所述載體為聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。

上述紫杉醇納米膠束中,

1)中,所述紫杉醇和載體的投料質量比為1∶20至1∶40,優選為1∶28;

2)中,所述紫杉醇和載體的投料質量比為1∶20至1∶40,優選為1∶28;

3)中,所述紫杉醇和載體的投料質量比為1∶40至1∶60,優選為1∶50。

上述任一所述紫杉醇納米膠束中,

1)中,所述載體中,所述聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯和地喹氯銨的投料摩爾比為1∶(0.5-3)∶(0.2-0.5),優選1∶1∶0.4。

2)中,所述載體中,所述聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯的投料摩爾比為1∶(0.5-3),優選1∶1。

上述任一所述紫杉醇納米膠束中,所述1)、2)和3)中,

所述聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的分子式為C135H268NO56P,分子結構式如式II所示:

(式II)

所述聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯的分子式為(C2H4O)23C33H54O5,分子結構式如式III所示:

(式III)

所述地喹氯銨的分子式為C30H40C12N4,分子結構式如式IV所示:

(式IV)

所述紫杉醇的分子式為C47H51NO14,分子結構式如式I:

(式I)

上述任一所述紫杉醇納米膠束中,所述1)、2)和3)中,所述制備的方法包括如下步驟:將所述紫杉醇和所述載體置于容器中,再向其中加入甲醇,使所述紫杉醇和所述載體溶解于所述甲醇中,再去除甲醇并使所述紫杉醇和所述載體的混合物在所述容器壁上形成薄膜,再向所述容器中加入pH7.0-7.5的緩沖液,水化處理,得到水化處理產物,即得到所述紫杉醇納米膠束。

上述任一所述紫杉醇納米膠束中,所述制備的方法中,所述水化處理的方法為將裝有所述薄膜和所述緩沖液的容器在60℃振搖30min;

上述任一所述紫杉醇納米膠束中,所述制備的方法中,所述緩沖液為HEPES緩沖液;

上述任一所述紫杉醇納米膠束中,所述制備的方法中,所述HEPES緩沖液由10mMHEPES、145mM?NaCl和水組成,水補足體積;所述HEPES緩沖液的pH值為7.4。

上述任一所述紫杉醇納米膠束中,所述制備的方法中,所述水化處理后,包括將水化處理產物進行0.2μm孔徑過濾的步驟。

上述任一所述紫杉醇納米膠束中,所述3)、2)和1)所示紫杉醇納米膠束的平均粒徑分別為15.51±0.58nm,15.94±0.29nm和15.77±0.77nm;

上述任一所述紫杉醇納米膠束中,所述3)、2)和1)所示紫杉醇納米膠束的粒徑的多分散系數分別為0.14±0.04,0.19±0.08和0.18±0.04。

上述任一所述紫杉醇納米膠束中,所述3)、2)和1)所示紫杉醇納米膠束的Zeta電位分別為-5.4mV,-3.7mV和1.6mV;

上述任一所述紫杉醇納米膠束中,所述3)、2)和1)所示紫杉醇納米膠束的載藥量分別為1.57±0.15%,2.55±0.03%和2.58±0.18%;

上述任一所述紫杉醇納米膠束中,所述3)、2)和1)所示紫杉醇納米膠束中紫杉醇的含量分別為987±21μg/ml,1456±33μg/ml,1502±17μg/ml。

上述任一所述紫杉醇納米膠束在制備抑制腫瘤的產品中的應用也屬于本發明的保護范圍。

上述應用中,所述抑制腫瘤為抑制腫瘤的增殖和/或抑制腫瘤細胞的存活;

上述任一所述應用中,所述抑制腫瘤的增殖為抑制腫瘤細胞的增殖和/或抑制腫瘤球體積增大和/或促進腫瘤球的瓦解;

上述任一所述應用中,所述腫瘤為乳腺癌;所述乳腺癌的細胞為人源乳腺癌MCF-7細胞或耐藥人源乳腺癌MCF-7/Adr細胞。

本發明的功能化紫杉醇納米膠束粒徑大約15nm,明顯提高了紫杉醇的細胞內攝取,選擇性地累積進入線粒體和內質網,對MCF-7和MCF-7/Adr細胞表現出強烈的抑制效應。功能化紫杉醇納米膠束能夠穿透進入MCF-7和MCF-7/Adr腫瘤球的中心壞死區,明顯降低了腫瘤球的大小。透射電鏡結果表明,完整的功能化紫杉醇納米膠束能夠跨過Caco-2細胞單層和外翻小腸囊。口服給藥后對耐藥性乳腺癌細胞移植瘤具有明顯抗腫瘤活性。功能化紫杉醇納米膠束在口服給藥后能使紫杉醇通過胃腸道屏障,克服耐藥性乳腺癌的多藥耐藥性。本發明的功能化紫杉醇納米膠束口服劑型能避免過敏反應,可用于眾多的癌癥病人,同時適用于多藥耐藥腫瘤,比當前的靜脈注射劑型有更大的優越性。本發明功能化紫杉醇納米膠束在腫瘤治療領域將有廣闊的應用前景。

附圖說明

圖1紫杉醇納米膠束及其表征。

圖2五種不同的紫杉醇制劑對MCF-7細胞(A)和MCF-7/Adr細胞(B)的抑制效應。

圖3MCF-7細胞和MCF-7/Adr細胞的攝取。

圖4納米膠束在MCF-7細胞(A)和MCF-7/Adr細胞(B)中亞細胞器的分布。圖中,6香豆素納米膠束即指6香豆素標記的普通紫杉醇納米膠束。

圖5各種紫杉醇制劑對腫瘤球的抑制效應及穿透力研究。圖5E和F中,a為游離羅丹明123,b為羅丹明123標記的普通紫杉醇納米膠束,c為羅丹明123標記的抗耐藥紫杉醇納米膠束,d為羅丹明123標記的功能化紫杉醇納米膠束。

圖6不同的紫杉醇制劑對紫杉醇跨過Caco-2細胞單層的影響。

圖7不同的紫杉醇制劑對紫杉醇跨過外翻小腸囊的影響。

圖8功能化紫杉醇納米膠束口服給藥后對移植瘤模型的治療效果(A)和給藥期間荷瘤裸鼠的體重變化(B)。

圖9?DiR標記的功能化納米膠束在荷MCF-7/Adr移植瘤裸鼠體內的分布和腫瘤蓄積能力。

圖1-9中的標記中,未作特別說明的,紫杉醇納米膠束均指文中的普通紫杉醇納米膠束。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明,均為常規方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業途徑得到。

文中,維生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS1000)也即聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯。

泰素注射劑購自海口市制藥廠,產品批號為080204。紫杉醇干粉購自南京天尊澤眾化學試劑公司,產品批號為080315。

人源乳腺癌MCF-7細胞購自中國醫學科學院協和醫科大學藥物研究所。耐藥人源乳腺癌MCF-7/Adr細胞購自中國醫學科學院協和醫科大學血液病研究所(也叫中國醫學科學院協和醫科大學血液學研究所)。人結腸腺癌Caco-2購自中國醫學科學院協和醫科大學藥物研究所。

聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG2000-DSPE)購自日本油脂株式會社,產品目錄號為DSPE-020CN。

聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯(TPGS1000)購自美國Sigma-Aldrich公司,產品目錄號為57668。

地喹氯銨購自浙江洪波化工有限公司,產品批號為100402。

實施例1、紫杉醇納米膠束的制備

一、制備中使用的原料

1、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG2000-DSPE)的分子式為C135H268NO56P,分子量為2829,含有聚合度為45的聚乙二醇(PEG),分子結構式如式II所示:

(式II)

2、聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯(TPGS1000)的分子式為(C2H4O)23C33H54O5,分子量為1513;含有聚合度為23的聚乙二醇(PEG),結構式如式III所示:

(式III)

3、地喹氯銨的分子式為C30H40C12N4,分子量為527.57。結構式如式IV所示:

(式IV)

4、紫杉醇的分子式為C47H51NO14,分子量為853.92,化學結構式如式I:

(式I)

二、制備方法

(一)功能化紫杉醇納米膠束的制備

方法I:

將紫杉醇和載體置于茄形瓶中,再向其中加入甲醇,使紫杉醇和載體溶解于甲醇中,旋轉蒸發37℃真空干燥除去甲醇,并使所述紫杉醇和所述載體的混合物在茄形瓶底部及內壁形成一層薄薄的均勻膜。再向茄形瓶中加入pH值為7.4的HEPES緩沖液,進行水化處理(即在60℃水浴中振搖30min),得到水化處理產物(即功能化紫杉醇納米膠束溶液),冷卻至室溫,水化處理產物中過量的紫杉醇通過0.2μm的聚碳酸酯膜過濾除去,即得透明的功能化紫杉醇納米膠束。

其中,載體為聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯和地喹氯銨的混合物;聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯和地喹氯銨的投料摩爾比為1∶1∶0.4;紫杉醇和載體的投料質量比為1∶28。

每1升HEPES緩沖液按照如下方法制備:將10mmol?HEPES、145mmol?NaCl和水混合,調節pH值至7.4,用水補足體積至1L。

方法II:

操作步驟基本與方法I相同,不同的是:載體中聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯和地喹氯銨的投料摩爾比為1∶0.5∶0.2;紫杉醇和載體的投料質量比為1∶20。HEPES緩沖液的pH值至7.0。

方法III:

操作步驟基本與方法I相同,不同的是:載體中聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯和地喹氯銨的投料摩爾比為1∶3∶0.5;紫杉醇和載體的投料質量比為1∶40。HEPES緩沖液的pH值至7.5。

(二)抗耐藥紫杉醇納米膠束的制備

方法I:

與功能化紫杉醇納米膠束的制備的方法I中所述步驟基本相同,不同的是:

所用的載體為聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯的混合物;載體中聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯的投料摩爾比為1∶1。

方法II:

與功能化紫杉醇納米膠束的制備的方法II中所述步驟基本相同,不同的是:

所用的載體為聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯的混合物;載體中聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯的投料摩爾比為1∶0.5。

方法III:

與功能化紫杉醇納米膠束的制備的方法III中所述步驟基本相同,不同的是:

所用的載體為聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯的混合物;載體中聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯的投料摩爾比為1∶3。

(三)普通紫杉醇納米膠束的制備

方法I:

與功能化紫杉醇納米膠束的制備的方法I中所述步驟基本相同,不同的是:

所用的載體為聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺;紫杉醇和載體的投料質量比為1∶50。

方法II:

與功能化紫杉醇納米膠束的制備的方法II中所述步驟基本相同,不同的是:

所用的載體為聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺;紫杉醇和載體的投料質量比為1∶40。

方法III:

與功能化紫杉醇納米膠束的制備的方法III中所述步驟基本相同,不同的是:

所用的載體為聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺;紫杉醇和載體的投料質量比為1∶60。

三、納米膠束的表征

(一)方法:

采用Nano?Series?Zen?4003?Zeta?Sizer測定納米膠束的粒徑和Zeta電位。采用透射電鏡觀察制備的三種納米膠束的大小和形狀。

紫杉醇的體外含量用高效液相色譜法測定。用十八烷硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱(Phenomenex?4.6×250mm,5μm),乙腈-水(60∶40,v/v)為流動相,溫度為30℃,檢測波長為227nm,流速為1ml/min測定。精密量取制備的膠束溶液,用9倍體積的甲醇破壞。取出20μL進樣用HPLC法測定膠束中紫杉醇的含量。

包封率及載藥量分別按下式計算:

紫杉醇從各種劑型中的釋放速率用釋放百分數來表示,采用透析法測定。三種紫杉醇納米膠束和泰素注射劑(含有50μg紫杉醇)加入1ml蒸餾水混勻后放入透析袋(截留分子量為12000-14000)內。為了測試紫杉醇干粉懸浮液的釋放行為,5μl紫杉醇溶液(10mg紫杉醇/ml乙腈溶液))加入1ml蒸餾水混勻后放入透析袋內,紫杉醇立即沉淀。各種紫杉醇納米膠束、泰素或紫杉醇顆粒的透析袋兩端扎緊后置于150.0ml釋放介質中,在37℃、100rpm的條件下在搖床上振蕩。釋放介質分別為人工胃液(含1%胃蛋白酶,pH?1.2)、人工腸液(含1%胰蛋白酶,pH?6.8)和磷酸鹽緩沖液(含10%胎牛血清,pH?7.4)。分別于0,0.25,0.5,1,2,4,6,8,10,12,24和48h時取出0.5ml釋放介質,并每次取樣后立即補入同等體積的新鮮釋放介質。以釋放液為空白對照,HPLC測定紫杉醇含量,并用下式計算紫杉醇的釋放率∶釋放率%=(Wi/Wtotal)×100%,Wi為第i個時間點在釋放介質中測得的紫杉醇量,Wtotal為釋放實驗前加入的紫杉醇總量。

人工胃液的配制(按中華人民共和國藥典2005版配制):取鹽酸234ml,加水稀釋至1000ml,即得稀鹽酸。本液含鹽酸應為9.5%~10.5%。取上述配制的稀鹽酸16.4ml,加水約800ml及胃蛋白酶10g,攪勻后加水定容至1000ml即可。

人工腸液的配制(按中華人民共和國藥典2005版配制):取磷酸二氫鉀6.8g加水500ml,用0.4%(w/w)的NaOH溶液調節pH至6.8;另取胰酶10g加水適量使溶解,將兩液混合后,加水定容至1000ml即可。

磷酸鹽緩沖液的配制:將137mmol?NaCl,2.7mmol?KCl,8mmol?Na2HPO4,2mmolKH2PO4,100ml胎牛血清和水混合,調節pH值至7.4,用水補足體積至1L。

(二)結果:

普通紫杉醇納米膠束、抗耐藥紫杉醇納米膠束和功能化紫杉醇納米膠束的平均粒徑分別為15.51±0.58nm,15.94±0.29nm和15.77±0.77nm;其粒徑的多分散系數分別為0.14±0.04,0.19±0.08和0.18±0.04;載藥量分別為1.57±0.15%,2.55±0.03%和2.58±0.18%;其zeta電位分別為-5.4mV,-3.7mV和1.6mV。

三種納米膠束的包封率均大于70%。

圖1中,(A)三種紫杉醇納米膠束的的透射電鏡照片;(B)載體材料的濃度對紫杉醇溶解度的影響;(C)不同的紫杉醇劑型在人工胃液中的體外釋放行為;(D)不同的紫杉醇劑型在人工腸液中的體外釋放行為;(E)不同的紫杉醇劑型在含10%胎牛血清的PBS溶液中的體外釋放行為。

圖1A為三種紫杉醇納米膠束的透射電鏡結果。從圖中可以看出,三種納米膠束均為球形,粒徑均一,大約在15-20nm之間。圖1B是形成膠束載體材料的濃度對紫杉醇溶解度的影響。結果表明,隨著載體材料濃度的增加,紫杉醇的溶解度也在增加。當載體材料濃度為25mM時,紫杉醇納米膠束、抗耐藥紫杉醇納米膠束和功能化紫杉醇納米膠束中紫杉醇的溶解度分別為987±21,1456±33,1502±17μg/ml。圖1B對應的實驗條件為:對于紫杉醇納米膠束,載體材料濃度為25mM指的是聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的濃度為25mM;對于抗耐藥紫杉醇納米膠束,載體材料濃度為25mM指的是聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯的濃度均為12.5mM;對于功能化紫杉醇納米膠束,載體材料濃度為25mM指的是聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺,聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯和地喹氯銨的濃度分別為10.4mM,10.4mM和4.2mM。溶解度的測定方法為:精密量取0.2μm的聚碳酸酯膜過濾后的膠束溶液100μL,溶解于900μL甲醇中,混勻。取出20μL進樣用HPLC法測定得到膠束中紫杉醇的濃度。

圖1C、1D和1E分別代表不同紫杉醇劑型在人工胃液、人工腸液和含10%胎牛血清的PBS溶液中體外釋放行為。結果表明,在起始2h內,三種紫杉醇納米膠束在三種釋放介質中的釋放率不到20%。紫杉醇干粉懸浮液48h內在三種釋放介質中的釋放率不到25%。然而,泰素注射劑12h內在三種釋放介質中的釋放率超過80%。相對于泰素,三種紫杉醇納米膠束均有明顯的緩釋行為。在12h時,普通紫杉醇納米膠束、抗耐藥紫杉醇納米膠束和功能化紫杉醇納米膠束的釋放率分別如下:在人工胃液中,46.0±0.9%,55.0±1.0%和62.3±2.4%;在人工腸液中,29.0±1.2%,43.4±0.8%和53.9±1.9%;在含10%胎牛血清的PBS中,24.3±2.0%,46.0±0.9%和46.8±1.9%。12h以后釋放量變化不大。

上述結果都是實施例1中實驗二的制備方法中方法I得到的普通紫杉醇納米膠束、抗耐藥紫杉醇納米膠束、功能化紫杉醇納米膠束的結果。

實施例1中實驗二的制備方法中方法II和III制備得到的功能化紫杉醇納米膠束的結果與方法I得到的功能化紫杉醇納米膠束的結果無顯著差異。

實施例1中實驗二的制備方法中方法II和III制備得到的抗耐藥紫杉醇納米膠束的結果與方法I得到的抗耐藥紫杉醇納米膠束的結果無顯著差異。

實施例1中實驗二的制備方法中方法II和III制備得到的普通紫杉醇納米膠束的結果與方法I得到的普通紫杉醇納米膠束的結果無顯著差異。

四、制備6-香豆素,羅丹明123和DiR標記的納米膠束的制備

6-香豆素標記的功能化納米膠束的方法:將6-香豆素(購自美國Sigma-Aldrich公司,產品目錄號為442631)和載體置于茄形瓶中,再向其中加入甲醇,使6-香豆素和載體溶解于甲醇中,旋轉蒸發37℃真空干燥除去甲醇,并使所述6-香豆素和所述載體的混合物在茄形瓶底部及內壁形成一層薄薄的均勻膜。再向茄形瓶中加入pH值為7.4的HEPES緩沖液,進行水化處理(即在60℃水浴中振搖30min),得到水化處理產物(即6-香豆素標記的功能化納米膠束溶液),冷卻至室溫,水化處理產物中過量的6-香豆素通過0.2μm的聚碳酸酯膜過濾除去,即得透明的6-香豆素標記的功能化納米膠束。其中,載體為聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯和地喹氯銨的混合物;聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯和地喹氯銨的投料摩爾比為1∶1∶0.4;6-香豆素和載體的投料質量比為1∶200。

6-香豆素標記的抗耐藥納米膠束的方法:與6-香豆素標記的功能化納米膠束的制備的方法中所述步驟基本相同,不同的是:所用的載體為聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯的混合物;載體中聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯的投料摩爾比為1∶1。

6-香豆素標記的普通納米膠束的方法:與6-香豆素標記的功能化納米膠束的制備的方法中所述步驟基本相同,不同的是:所用的載體為聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。

羅丹明123標記的功能化納米膠束的方法:將羅丹明123(購自美國Sigma-Aldrich公司,產品目錄號為R8004)和載體置于茄形瓶中,再向其中加入甲醇,使羅丹明123和載體溶解于甲醇中,旋轉蒸發37℃真空干燥除去甲醇,并使所述羅丹明123和所述載體的混合物在茄形瓶底部及內壁形成一層薄薄的均勻膜。再向茄形瓶中加入pH值為7.4的HEPES緩沖液,進行水化處理(即在60℃水浴中振搖30min),得到水化處理產物(即羅丹明123標記的功能化納米膠束溶液),冷卻至室溫,水化處理產物中過量的羅丹明123通過0.2μm的聚碳酸酯膜過濾除去,即得透明的羅丹明123標記的功能化納米膠束。其中,載體為聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯和地喹氯銨的混合物;聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯和地喹氯銨的投料摩爾比為1∶1∶0.4;羅丹明123和載體的投料質量比為1∶200。

羅丹明123標記的抗耐藥紫杉醇納米膠束的方法:與羅丹明123標記的功能化納米膠束的制備的方法中所述步驟基本相同,不同的是:所用的載體為聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯的混合物;載體中聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯的投料摩爾比為1∶1。

羅丹明123標記的普通紫杉醇納米膠束的方法:與羅丹明123標記的功能化紫杉醇納米膠束的制備的方法中所述步驟基本相同,不同的是:所用的載體為聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。

DiR標記的功能化納米膠束的方法:將DiR(購自美國Biotium公司,產品目錄號為60017)和載體置于茄形瓶中,再向其中加入甲醇,使DiR和載體溶解于甲醇中,旋轉蒸發37℃真空干燥除去甲醇,并使所述DiR和所述載體的混合物在茄形瓶底部及內壁形成一層薄薄的均勻膜。再向茄形瓶中加入pH值為7.4的HEPES緩沖液,進行水化處理(即在60℃水浴中振搖30min),得到水化處理產物(即DiR標記的功能化納米膠束溶液),冷卻至室溫,水化處理產物中過量的DiR通過0.2μm的聚碳酸酯膜過濾除去,即得透明的DiR標記的功能化納米膠束。其中,載體為聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯和地喹氯銨的混合物;聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯和地喹氯銨的投料摩爾比為1∶1∶0.4;DiR和載體的投料質量比為1∶50。

DiR標記的抗耐藥納米膠束的方法:與DiR標記的功能化紫杉醇納米膠束的制備的方法中所述步驟基本相同,不同的是:所用的載體為聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯的混合物;載體中聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯的投料摩爾比為1∶1。

DiR標記的普通納米膠束的方法:與DiR標記的功能化紫杉醇納米膠束的制備的方法中所述步驟基本相同,不同的是:所用的載體為聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。

實施例2、紫杉醇納米膠束的功能

一、本實施例中所用細胞的培養方法

人源乳腺癌MCF-7細胞使用的培養基為細胞培養基I。耐藥人源乳腺癌MCF-7/Adr細胞使用的培養基為細胞培養基II(1μM阿霉素保持耐藥性),在實驗一周前換成細胞培養基I培養。

人結腸腺癌Caco-2細胞使用的培養基為細胞培養基III。

所有細胞的培養條件為37℃、5%CO2培養箱中培養。

細胞培養基I:由RPMI-1640細胞培養基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素組成,其配比為:RPMI-1640細胞培養基∶胎牛血清∶青霉素∶鏈霉素=1ml∶0.1ml∶100U∶100μg。

細胞培養基II:由RPMI-1640細胞培養基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素和阿霉素組成,其配比為:RPMI-1640細胞培養基∶胎牛血清∶青霉素∶鏈霉素∶阿霉素=1ml∶0.1ml∶100U∶100μg∶1μmol。

細胞培養基III:由MEM細胞培養基、胎牛血清、非必須氨基酸、青霉素和鏈霉素組成,MEM細胞培養基、胎牛血清、非必須氨基酸、青霉素和鏈霉素=1ml∶0.15ml∶0.01ml∶100U∶100μg。

二、對乳腺癌細胞的抑制效應

紫杉醇干粉是原料藥,紫杉醇干粉懸浮液是紫杉醇的水溶液;游離紫杉醇指的是紫杉醇溶于二甲基亞砜中,給予細胞時,用無血清培養液稀釋100倍。

消化對數生長期的MCF-7和MCF-7/Adr細胞,用培養基洗滌2遍,以5000個/孔的量接種到96孔板上,在37℃、5%CO2培養箱中孵育24h。按下面的步驟加藥。下述內容括號中的濃度都指加到96孔板中被稀釋后的終濃度。

(a)取不加藥等量培養基,加入到96孔培養板中,作為空白對照;

(b)加入一系列濃度的游離紫杉醇(0.0001-5μM);

(c)加入一系列濃度的泰素(0.0001-5μM);

(d)加入一系列濃度的普通紫杉醇納米膠束(0.0001-5μM);

(e)加入一系列濃度的抗耐藥紫杉醇納米膠束(0.0001-5μM);

(f)加入一系列濃度的功能化紫杉醇納米膠束(0.0001-5μM);

加藥后的96孔培養板,置于37℃、5%CO2培養箱中,繼續孵育48h。細胞培養結束后,取出培養板,移去培養孔中的培養液,每孔加入10%預冷的三氯乙酸(TCA)200μL,在4℃冰箱中放置1h固定細胞。然后用蒸餾水洗滌5遍,以去除TCA,在空氣中干燥后,每孔加0.4%的SRB(購自美國Sigma-Aldrich公司,產品目錄號為S9012)100μL,室溫下放置20min,棄去各孔內液體后用1%乙酸洗滌5遍,以去除未結合的染料,空氣中干燥后每孔加入10mmol/L?Tris?base(三羥甲基胺基甲烷)200μL溶解,在平板振蕩器上振蕩30min,至染料全部溶解。在酶標儀于540nm波長處測定光密度值(0D)。用經過加藥培養以后細胞的存活百分數(Survival?rate,%)來評價各種紫杉醇納米膠束對細胞的毒性作用。細胞存活百分數按照下式計算:

抑制率=1-細胞存活率。

圖2A和2B分別代表五種不同的紫杉醇制劑對MCF-7和MCF-7/Adr細胞的抑制效應。對于MCF-7細胞,在紫杉醇濃度為0.01μM時,游離紫杉醇、泰素、普通紫杉醇納米膠束、抗耐藥紫杉醇納米膠束和功能化紫杉醇納米膠束對MCF-7細胞增殖的抑制率分別為19.65%、33.43%、34.94%、38.17%和43.33%,五種紫杉醇制劑均具有明顯的抑制效應,其中功能化紫杉醇納米膠束具有最強的抑制效應。對于耐藥的MCF-7/Adr細胞,在紫杉醇濃度為1.0μM時,游離紫杉醇、泰素、普通紫杉醇納米膠束、抗耐藥紫杉醇納米膠束和功能化紫杉醇納米膠束對MCF-7/Adr細胞增殖的抑制率分別為11.21%、42.97%、14.56%、63.89%和82.73%。游離紫杉醇和普通紫杉醇納米膠束對MCF-7/Adr細胞的增殖幾乎沒有抑制作用;而功能化紫杉醇納米膠束具有最強的抑制效應;泰素也有一定的抑制作用,但效果不如抗耐藥紫杉醇納米膠束或功能化紫杉醇納米膠束。

三、乳腺癌細胞的攝取

消化對數生長期的MCF-7或MCF-7/Adr細胞,制成細胞懸液,以4×105個cells/孔的量接種到6孔板上,在37℃、5%CO2培養箱中孵育24h;向培養板的孔中分別加入游離紫杉醇、泰素、普通紫杉醇納米膠束、抗耐藥紫杉醇納米膠束、功能化紫杉醇納米膠束,上述制劑中紫杉醇的濃度為10.0uM,每個劑型設有三個復孔;將加入不同紫杉醇劑型的培養板,置于37℃、5%CO2培養箱中,分別孵育0.5h、1h、2h、4h、6h;孵育結束后,加入預冷(4℃)的PBS溶液終止細胞攝取,然后快速清洗3遍;每孔加入600ul?0.25%胰酶,室溫消化2min,吸掉消化液;每孔加入1.5ml?PBS溶液終止消化,吹打貼壁細胞,收集細胞至1.5ml離心管中,1000rpm離心5min,棄上清;每個離心管中加入0.5ml甲醇溶液,冰水浴中探頭超聲(工作時間3s,間歇時間3s,全程時間1min,功率400W)破碎細胞。一部分10000rpm離心10min,上清液測定紫杉醇含量;一部分用BCA法測定蛋白含量。將每孔紫杉醇含量除以相應孔的總蛋白含量,用以消除每孔細胞數量所帶來的誤差。

細胞內紫杉醇的攝取量的計算公式:

采用激光共聚焦法研究乳腺癌細胞對羅丹明-123標記的納米膠束的定性攝取。將MCF-7或MCF-7/Adr細胞接種于玻底培養皿中,在37℃、5%CO2培養箱中孵育24h;加入游離羅丹明-123、羅丹明-123標記的普通紫杉醇納米膠束、羅丹明-123標記的抗耐藥紫杉醇納米膠束、羅丹明-123標記的功能化紫杉醇納米膠束(羅丹明-123濃度為10μM),置二氧化碳培養箱中,37℃培養2小時,依次用冰冷PBS漂洗三次,然后用Hoechst333342(10μM)進行細胞核染色30min,PBS漂洗三次。用激光共聚焦顯微鏡進行圖像分析。

圖3中,(A)MCF-7細胞對五種紫杉醇制劑在不同時間的攝取;(B)MCF-7/Adr細胞對五種紫杉醇制劑在不同時間的攝取;(C)激光共聚焦顯微鏡觀察MCF-7細胞在2h時對各種羅丹明-123制劑的攝取;(D)激光共聚焦顯微鏡觀察MCF-7/Adr細胞在2h時對各種羅丹明-123制劑的攝取.

圖3C和3D分別為MCF-7細胞和MCF-7/Adr細胞在2h時對游離羅丹明-123(a)、羅丹明-123標記的普通紫杉醇納米膠束(b)、羅丹明-123標記的抗耐藥紫杉醇納米膠束(c)和羅丹明-123標記的功能化紫杉醇納米膠束(d)攝取的激光共聚焦結果。其中,a1-d1:藍色指的是Hoechst?33342染色的MCF-7細胞或MCF-7/Adr細胞的細胞核;a2-d2:綠色指的是分別給予MCF-7細胞或MCF-7/Adr細胞游離羅丹明-123(a2)、羅丹明-123標記的普通紫杉醇納米膠束(b2)、羅丹明-123標記的抗耐藥紫杉醇納米膠束(c2)和羅丹明-123標記的功能化紫杉醇納米膠束(d2)后,細胞內羅丹明-123的熒光;a3-d3:1和2的疊力和圖像。

從圖3A和3B中可以看出,隨著孵育時間的延長,細胞內紫杉醇的量增加。在孵育時間為6h時,MCF-7細胞給予泰素、普通紫杉醇納米膠束、抗耐藥紫杉醇納米膠束和功能化紫杉醇納米膠束后,細胞內紫杉醇的攝取量比游離紫杉醇分別提高了4.9,7.5,12.6和13.0倍,此時游離紫杉醇組細胞內紫杉醇的攝取量為0.93μg/mg蛋白。相比之下,MCF-7/Adr細胞給予泰素、普通紫杉醇納米膠束、抗耐藥紫杉醇納米膠束和功能化紫杉醇納米膠束后,細胞內紫杉醇的攝取量比游離紫杉醇分別提高了16.9,2.9,41.2和45.1倍,此時游離紫杉醇組細胞內紫杉醇的攝取量為0.05μg/mg蛋白。MCF-7細胞和MCF-7/Adr細胞對功能化紫杉醇納米膠束的攝取量最大。

圖3C和3D表明,對于MCF-7細胞,親水的游離羅丹明-123易擴散進入MCF-7細胞,導致明顯的細胞內聚集;在三種羅丹明-123標記的納米膠束中,給予羅丹明-123標記的功能化紫杉醇納米膠束的MCF-7細胞內熒光最強。然而,對于MCF-7/Adr細胞,游離羅丹明-123的熒光強度最弱;在三種羅丹明-123標記的紫杉醇納米膠束中,給予羅丹明-123標記的功能化紫杉醇納米膠束的MCF-7/Adr細胞內熒光最強。這些結果與細胞攝取的定量結果一致。

四、納米膠束在細胞器內分布

采用激光共聚焦顯微鏡觀察6-香豆素標記的納米膠束在MCF-7或MCF-7/Adr活細胞細胞器內的分布。將MCF-7或MCF-7/Adr細胞接種于玻底培養皿中,在37℃、5%CO2培養箱中孵育24h;加入游離6-香豆素、6-香豆素標記的普通紫杉醇納米膠束、6-香豆素標記的抗耐藥紫杉醇納米膠束、6-香豆素標記的功能化紫杉醇納米膠束(6-香豆素濃度為1.0μM),置二氧化碳培養箱中,37℃培養4小時;依次用冰冷PBS漂洗三次;然后分別用溶酶體紅色熒光探針(50nM?Lyso?Tracker?Red?DND-99)染色溶酶體、線粒體體紅色熒光探針(200nM?Mito?Tracker?Deep?Red?FM)染色線粒體、內質網紅色熒光探針(1μM?ER?Tracker?Red)染色內質網和高爾基體紅色熒光探針(5μMTR?ceramide?complexed?to?BSA)染色高爾基體,PBS漂洗三次;用Hoechst333342(10μM)進行細胞核染色30min,PBS漂洗三次。用激光共聚焦顯微鏡進行圖像分析。

圖4為納米膠束在MCF-7細胞(A)和MCF-7/Adr細胞(B)中亞細胞器的分布。

說明:a-d:藍色指的是Hoechst?33342染色的MCF-7細胞或MCF-7/Adr細胞的細胞核;綠色指的是分別給予MCF-7細胞或MCF-7/Adr細胞游離6-香豆素(a1-a4)、6-香豆素納米膠束(b1-b4)、抗耐藥6-香豆素納米膠束(c1-c4)和功能化6-香豆素納米膠束(d1-d4)后,細胞內6-香豆素的熒光;a1-d1:紅色指的是溶酶體紅色熒光探針染色后的溶酶體;a2-d2:紅色指的是線粒體紅色熒光探針染色后的線粒體;a3-d3:紅色指的是內質網紅色熒光探針染色后的內質網;a4-d4:紅色指的是高爾基體紅色熒光探針染色后的高爾基體。

圖4A和4B分別為MCF-7細胞和MCF-7/Adr細胞給予游離6-香豆素和6-香豆素納米膠束后的激光共聚焦結果。溶酶體、線粒體、內質網和高爾基體經細胞器特異性性染料標記為紅色,游離6-香豆素和三種6-香豆素納米膠束呈綠色,各種細胞器和納米膠束共定位時呈現黃色,不共定位時呈現紅色。從結果可以看出,MCF-7和MCF-7/Adr細胞給予游離6-香豆素后,6-香豆素的綠色熒光和各種細胞器的紅色熒光完全分離不重合,表明游離6-香豆素沒有分布在溶酶體、線粒體、內質網和高爾基體(圖4A,a1-a4;圖4B,a1-a4);6-香豆素標記的三種納米膠束也沒有分布在溶酶體(圖4A,b1-d1;圖4B,b1-d1),但是選擇性地累積進入內質網(圖4A,b3-d3;圖4B,b3-d3)和高爾基體圖4A,b4-d4;圖4B,b4-d4);相比之下,唯有功能化的6-香豆素納米膠束特異性地累積進入線粒體(圖4A,d2;圖4B,d2)。

五、對乳腺癌腫瘤球的抑制效應

(一)方法

腫瘤球的建立:配制濃度為20g/L的瓊脂糖凝膠水溶液。將一定量的瓊脂糖溶于一定量的無血清RPMI?1640培養液中,在80℃的水浴中靜置30min;采用懸滴法(hanging-drop方法)來制備相似大小和細胞數的多細胞腫瘤球;48-well培養板每孔中加入200μl瓊脂糖凝膠水溶液,冷卻凝固后,加入900ul培養基(即上述細胞培養基I);蓋子上每孔滴加20ul的細胞懸液(含有500個細胞),蓋上蓋子,置于37℃、5%CO2培養箱中,繼續孵育72h。轉移到48-well培養板孔中,培養兩天。

抑制腫瘤球生長實驗:向含腫瘤球的48-well培養板的孔中分別加入無血清RPMI1640培養液、游離紫杉醇、泰素、普通紫杉醇納米膠束、抗耐藥紫杉醇納米膠束、功能化紫杉醇納米膠束,上述制劑中紫杉醇在孔中的濃度為5uM。加藥后的48孔培養板,置于37℃、5%CO2培養箱中,繼續孵育;觀測腫瘤球在上述條件下的生長情況。記錄每天腫瘤球的最長和最短球徑,記錄的天數為給藥后的第1、2、3、4、5天;計算抑制腫瘤球生長的公式:V=(∏×dmax×dmin)/6,其中,dmax為大直徑;dmin為小直徑;腫瘤球抑制率%=[(Vdayi/Vday0)-1]×100%,其中Vdayi代表加藥后孵育的第i天腫瘤球的體積;Vday0代表加藥前腫瘤球的體積。

腫瘤球體積變化率的計算公式:腫瘤球體積變化率=(Vdayi/Vday0)×100%

腫瘤球的電鏡照片:向含腫瘤球的48-well培養板的孔中分別加入無血清RPMI1640培養液、游離紫杉醇、泰素、普通紫杉醇納米膠束、抗耐藥紫杉醇納米膠束、功能化紫杉醇納米膠束,上述制劑中紫杉醇在孔中的濃度為5uM。加藥后的48孔培養板,置于37℃、5%CO2培養箱中,繼續孵育。腫瘤球與各種紫杉醇制劑孵育后第三天,取出孵育的腫球,將其用2.5%的戊二醛溶液固定60min,再用0.1M的磷酸鹽緩沖液漂洗3次,然后脫水和固定。最后,用掃描電鏡觀測腫球,并拍攝照片。

激光共聚焦觀察膠束穿透腫瘤球的能力:向含腫瘤球的48-well培養板孔中分別加入游離羅丹明-123、羅丹明-123標記的普通紫杉醇納米膠束、羅丹明-123標記的抗耐藥紫杉醇納米膠束、羅丹明-123標記的功能化紫杉醇納米膠束,上述制劑中羅丹明-123的濃度為10uM。加藥后的48孔培養板,置于37℃、5%CO2培養箱中,繼續培養12h;將腫瘤球轉移到玻底皿中,每組5個腫瘤球,用新鮮培養液洗滌三次,每皿再加入100ul新鮮培養液;對于每個腫瘤球,從腫瘤球頂部到中央以10μm的間隔進行光切,研究不同層面的羅丹明-123熒光強度。

(二)結果

結果如圖5所示。

(A)五種不同的紫杉醇制劑對MCF-7腫瘤球的抑制效應;(B)五種不同的紫杉醇制劑對MCF-7/Adr腫瘤球的抑制效應;(C)給予MCF-7腫瘤球五種紫杉醇制劑后第三天的掃描電鏡照片;(D)給予MCF-7/Adr腫瘤球五種紫杉醇制劑后第三天的掃描電鏡照片;(E)給予MCF-7腫瘤球各種羅丹明-123制劑后12h的激光共聚焦層切照片;(F)給予MCF-7/Adr腫瘤球各種羅丹明-123制劑后12h的激光共聚焦層切照片。

圖5A和5B中,給予游離紫杉醇、泰素、普通紫杉醇納米膠束、抗耐藥紫杉醇納米膠束和功能化紫杉醇納米膠束后,MCF-7腫瘤球在第5天的腫瘤球體積變化率分別為85.9±3.1%,61.9±3.0%,34.5±0.6%,25.4±2.9%和14.2±0.2%(腫瘤球體積變化率越低表明藥物效果越好;在用藥期間,腫瘤變小了,文中數據代表腫瘤球體積變為用藥開始時的百分之多少)。對于耐藥的MCF-7/Adr腫瘤球,給予游離紫杉醇、泰素、普通紫杉醇納米膠束、抗耐藥紫杉醇納米膠束和功能化紫杉醇納米膠束后,MCF-7腫瘤球在第5天的腫瘤球體積變化率分別為188.7±9.0%,74.0±5.3%,73.4±4.0%,43.7±10.7%和23.3±1.0%。在所有含紫杉醇的制劑中,功能化紫杉醇納米膠束具有最強的抑制體外MCF-7和MCF-7/Adr腫瘤球生長作用。

圖5C和5D中,給予游離紫杉醇,MCF-7腫瘤球的表面細胞死亡,出現凹孔(圖5C?b1,b2,圖5C?a1,a2),而MCF-7/Adr腫瘤球幾乎沒有變化(圖5D?b1,b2);給予泰素,MCF-7腫瘤球或MCF-7/Adr腫瘤球的表面出現更多凹孔(圖5C?c1,c2;圖5D?c1,c2);給予普通紫杉醇納米膠束,MCF-7腫瘤球和MCF-7/Adr腫瘤球嚴重受損,腫瘤球表面更多細胞死亡(圖5C?d1,d2;圖5D?d1,d2);給予抗耐藥紫杉醇納米膠束,MCF-7腫瘤球和MCF-7/Adr腫瘤球部分倒塌(圖5C?e1,e2;圖5D?e1,e2);給予功能化紫杉醇納米膠束,MCF-7腫瘤球和MCF-7/Adr腫瘤球失去三維結構而瓦解(圖5C?f1,f2;圖5D?f1,f2)。圖5C和5D中,a為給予無血清RPMI?1640培養液,b為給予游離紫杉醇,c為給予泰素,d為給予普通紫杉醇納米膠束,e為給予抗耐藥紫杉醇納米膠束,f表示給予功能化紫杉醇納米膠束,1表示放大×300倍,2表示放大×5000倍。

圖5E和5F,對于MCF-7腫瘤球,游離羅丹明-123、羅丹明-123標記的普通紫杉醇納米膠束、羅丹明-123標記的抗耐藥羅丹明-123納米膠束分別可以穿透到距離腫瘤球頂部30um、50um和70um的深度;羅丹明-123標記的功能化紫杉醇納米膠束可以穿透到腫瘤球的正中心(距離腫瘤球頂部80um)。對于MCF-7/Adr腫瘤球,游離羅丹明-123和羅丹明-123標記的普通紫杉醇納米膠束的穿透力也很弱,只是在腫瘤球邊緣看到微弱的羅丹明-123熒光;羅丹明-123標記的抗耐藥羅丹明-123納米膠束和功羅丹明-123標記的功能化紫杉醇納米膠束分別可以穿透到距離腫瘤球頂部50um和70um的深度。

六、紫杉醇納米膠束透過Caco-2細胞單層機理

Caco-2細胞單層做為胃腸道屏障的體外模型,來評價各種紫杉醇劑型的吸收特性。消化對數生長期的Caco-2細胞,制成細胞懸液3.0×105個cells/ml,向細胞板的頂端加入0.5ml已充分混合的細胞懸液,底端加入1.5ml細胞培養液,將Transwell放入37℃、5%CO2培養箱中培養。前兩周隔天換液(頂端0.5ml和底端1.5ml),此后每天換液。經過21天培養,細胞單層用于實驗。

實驗前,Caco-2細胞單層用Hank’s平衡鹽溶液在37℃洗滌兩次。測定細胞單層的跨膜電阻值,只有電阻值大于800Ωcm2的細胞單層用于實驗。實驗過程中,于設定的時間點測定電阻值。

為了評估各種紫杉醇制劑對紫杉醇跨過Caco-2細胞單層的轉運,向底端加入1.5ml?Hank’s平衡鹽溶液,向頂端分別加入0.5ml的游離紫杉醇、泰素、普通紫杉醇納米膠束、抗耐藥紫杉醇納米膠束和功能化紫杉醇納米膠束制劑,其中紫杉醇在細胞板的頂端中的濃度為5.0uM,置于37℃培養箱中孵育。分別于15、30、60、90、120、150和180min時從底端取出0.5ml樣品,并每次取樣后立即補入同等體積的新鮮Hank’s平衡鹽溶液。透過樣品2.5ml,加入2.5ml甲醇,渦旋1min,10000rpm離心5min,取上清,50℃水浴下氮氣吹干,殘渣以200μl甲醇復溶,渦旋1min,10000rpm離心5min,上清液進樣HPLC測定紫杉醇含量。表觀透過系數按下式計算:Papp=dQ/dt×1/(AC0),其中dQ/dt為透過速率,C0為紫杉醇制劑在頂端的初始濃度,A為聚碳酯膜的表面積。

紫杉醇累積透過量的計算公式:

Q = V e × Σ i = 1 n - 1 C i + V 0 × C n ]]>

其中,Ve為置換體積;Ci為第i次置換取樣時細胞板底端的溶液中紫杉醇的濃度;V0為細胞板底端加入的Hank’s平衡鹽溶液體積;n為置換次數。

在各種內吞抑制劑存在下進行轉運實驗,研究普通紫杉醇納米膠束、抗耐藥紫杉醇納米膠束和功能化紫杉醇納米膠束的跨膜轉運機理。為了抑制能量介導的內吞,細胞單層首先在4℃孵育1h,然后分別加入各種紫杉醇納米膠束(紫杉醇在細胞板的頂端中的濃度為5μM),繼續在4℃孵育2h;為了抑制小窩介導的內吞,細胞單層首先與1μg/ml菲律平III(購自美國Sigma-Aldrich公司,產品目錄號為F4767)在37℃孵育1h,然后分別加入各種紫杉醇納米膠束(1μg/ml菲律平III,紫杉醇濃度為5μM)繼續在37℃孵育2h;為了抑制網格蛋白介導的內吞,細胞單層首先與10μg/ml氯丙嗪(購自美國Sigma-Aldrich公司,產品目錄號為C8138)在37℃孵育1h,然后分別加入各種紫杉醇納米膠束(10μg/ml氯丙嗪,紫杉醇濃度為5μM)繼續在37℃孵育2h;為了抑制膽固醇依賴的內吞,細胞單層首先與10mM甲基-β-環糊精(購自美國Sigma-Aldrich公司,產品目錄號為C4555)和1μg/ml洛伐他汀在37℃孵育1h,然后分別加入各種紫杉醇納米膠束(10mM甲基-β-環糊精,1μg/ml洛伐他汀,紫杉醇濃度為5μM)繼續在37℃孵育2h。

為了直接觀察是否完整的功能化納米膠束跨過細胞單層,細胞單層分別與Hank’s平衡鹽溶液(作為對照)或功能化納米膠束在37℃孵育2h。收集底端的透過液,醋酸鈾負染,透射電鏡觀察透過液的大小和形狀。

結果如圖6所示,(A)不同紫杉醇制劑跨過Caco-2細胞單層的紫杉醇累積透過量;(B)給予Caco-2細胞單層功能化紫杉醇納米膠束或空白Hank’s平衡鹽溶液2h后頂端和底端介質的透射電鏡照片;(C)各種內吞抑制劑存在下三種紫杉醇納米膠束跨Caco-2細胞單層的表觀透過系數變化率。

從圖6A中可以看出,三種紫杉醇納米膠束的累積透過量明顯提高,而游離紫杉醇的透過量微乎其微。120min時,泰素、普通紫杉醇納米膠束、抗耐藥紫杉醇納米膠束和功能化紫杉醇納米膠束的表觀透過系數值分別是游離紫杉醇的4.9,17.3,18.1和36.4倍;120min時,游離紫杉醇的表觀透過系數值為0.37cm/s。

從圖6B中可以看出,給予空白Hank’s平衡鹽溶液,在Caco-2細胞單層的頂端和底端僅觀察到少量蛋白碎片。在頂端給予功能化紫杉醇納米膠束后,在底端可以觀察到直徑為15-20nm的球形顆粒,而且底端和頂端觀察到的顆粒粒徑相同。結果表明,功能化紫杉醇納米膠束經過完整的胞吞和胞吐過程而跨過Caco-2細胞單層。

從圖6C中可以看出,轉運過程中,加入各種內吞抑制劑后,顯示出了明顯的抑制效應。不加入任何內吞抑制劑的條件下,普通紫杉醇納米膠束、抗耐藥紫杉醇納米膠束和功能化紫杉醇納米膠束相應的表觀透過系數分別為6.5±1.4、6.8±1.8和13.6±0.3。加入不同的內吞抑制劑后,普通紫杉醇納米膠束、抗耐藥紫杉醇納米膠束和功能化紫杉醇納米膠束相應的表觀透過系數變化率如下:4℃條件下,22.9±3.4%,28.5±2.6%和15.7±5.0%;在小窩介導的內吞抑制劑條件下,49.1±10.1%,66.5±5.0%和40.4±5.9%;在網格蛋白介導的內吞抑制劑條件下,73.2±10.7%,73.7±9.7%和62.4±9.6%;在消除膽固醇條件下,34.3±5.7%,61.7±2.9%和36.2±4.0%。

紫杉醇透過系數變化率的公式(即圖6C的縱坐標的計算公式):

七、紫杉醇納米膠束透過外翻小腸囊

健康雄性SD大鼠(起始體重約230-250g),購自于北京大學醫學部實驗動物中心。所有動物實驗均按照國際動物實驗的指導標準進行。外翻小腸囊實驗用于評價各種紫杉醇制劑跨過小腸的轉運情況。實驗前將大鼠禁食12-16h,不禁水,用20%的烏拉坦腹腔注射麻醉。沿腹中線打開腹腔,剪下實驗的腸段,去除腸系膜,在37℃的通氧氣TC199培養液中沖洗干凈,一端用棉線扎緊,用細玻璃棒輕柔地將腸管翻轉使黏膜面朝外。8cm長的腸段一段用棉線扎緊,用注射器向腸內注滿TC199培養液,另一端扎緊個取樣針,然后將其放入三頸燒瓶中,取樣針端液面高于體系液面,在燒瓶中通入氣體(95%O2及5%CO2),整個裝置放入37℃恒溫水浴中,10min預培養后,分別加入游離紫杉醇、泰素、普通紫杉醇納米膠束、抗耐藥紫杉醇納米膠束或功能化紫杉醇納米膠束(紫杉醇在腸囊外液體中的終濃度為5.0μM),振蕩。分別于15、30、60、90、120、150和180min時從腸內取出0.5ml樣品,并每次取樣后立即補入同等體積的新鮮TC199培養液。透過樣品2.5ml,加入2.5ml甲醇,渦旋1min,10000rpm離心5min,取上清,50℃水浴下氮氣吹干,殘渣以200ul甲醇復溶,渦旋1min,10000rpm離心5min,上清液進樣HPLC測定紫杉醇含量。表觀透過系數按下式計算:Papp=dQ/dt×1/(AC0),其中dQ/dt為透過速率,C0為紫杉醇制劑在黏膜側的初始濃度,A為小腸的面積。

為了直接觀察是否完整的功能化紫杉醇納米膠束跨過外翻小腸囊,充滿TC199培養液的外翻小腸囊分別與TC199培養液(作為對照)或功能化紫杉醇納米膠束在37℃孵育2h。收集漿膜側的液體,醋酸鈾負染,透射電鏡觀察透過液的大小和形狀。

紫杉醇累積透過量的計算公式:

Q = V e × Σ i = 1 n - 1 C i + V 0 × C n ]]>

其中,Ve為置換體積;Ci為第i次置換取樣時小腸囊內溶液中紫杉醇的濃度;V0為小腸囊內加入的空白TC199培養液的體積;n為置換次數。

圖7中,(A)不同紫杉醇制劑跨過外翻小腸囊的紫杉醇累積透過量;(B)給予外翻小腸囊功能化紫杉醇納米膠束或空白TC199培養液2h后黏膜側和漿膜側介質的透射電鏡照片。

從圖7A中可以看出,除游離紫杉醇外,泰素和三種紫杉醇納米膠束的累積透過量隨孵育時間的延長而明顯提高。120min時,泰素、普通紫杉醇納米膠束、抗耐藥紫杉醇納米膠束和功能化紫杉醇納米膠束的紫杉醇表觀透過系數值分別是游離紫杉醇的4.5,27.5,34.2和52.9倍。120min時,游離紫杉醇組的紫杉醇表觀透過系數值為0.50cm/s。

從圖7B中可以看出,與Caco-2細胞單層的結果相同,在黏膜側給予功能化紫杉醇納米膠束后,在漿膜側可以觀察到直徑為15-20nm的球形顆粒,而且漿膜側和黏膜側觀察到的顆粒粒徑相同。結果表明,功能化紫杉醇納米膠束可以完整地跨過外翻小腸囊。

八、體內抗耐藥性乳腺癌移植瘤效應

雌性BALB/c裸鼠(體重16-18g)購自北京大學醫學部實驗動物中心,動物在無菌條件下飼養,無菌條件下操作。將1.0×107個MCF-7/Adr細胞混懸于200μl無血清培養基中,皮下注射到裸鼠腋下。每天觀察裸鼠的腋下腫瘤生長情況,并且記錄腫瘤的體積。大概接種腫瘤細胞第19天后,腫瘤體積達到150~180mm3,可以給藥治療。將接種后的裸鼠隨機分成5組,每組6只。在給裸鼠接種MCF-7/Adr細胞后的第20、22、24、26、28和30天,分別給予生理鹽水、尾靜脈注射泰素、口服泰素、尾靜脈注射功能化紫杉醇納米膠束或口服功能化紫杉醇納米膠束。紫杉醇劑量為10mg/kg。每天測量腫瘤的大小和裸鼠體重。腫瘤體積(V)用下面公式計算:V=長×寬2/2(mm3)。各處理組的荷瘤裸鼠在腫瘤接種后第35天處死,測量腫瘤的長和寬,采用下式計算給藥后的腫瘤抑制率:腫瘤抑制率(%)=100%-(給藥組腫瘤體積/空白組腫瘤體積)×100%。裸鼠體重的變化來評價各個給藥組的毒性。

在裸鼠體內建立MCF-7/Adr移植瘤模型,功能化紫杉醇納米膠束口服給藥后對移植瘤模型的治療效果如圖8A所示。從圖中可以看出,泰素對耐藥性乳腺癌具有很小的抑制效應,第35天泰素尾靜脈注射組和口服組腫瘤的體積抑制率分別為25.7%和13.7%。相比之下,功能化紫杉醇納米膠束對耐藥性乳腺癌具有明顯的腫瘤抑制活性,第35天功能化紫杉醇納米膠束尾靜脈注射組和口服組腫瘤的體積抑制率分別為83.7%和75.2%。

給藥期間荷瘤裸鼠的體重變化如圖8B所示。泰素尾靜脈注射組和口服組裸鼠的體重明顯低于功能化紫杉醇納米膠束尾靜脈組和口服組,說明功能化紫杉醇納米膠束能一定程度地降低化療藥物的毒性。功能化紫杉醇納米膠束口服組裸鼠的體重并沒有顯著下降,說明該膠束在裸鼠體內毒性較低。

九、荷瘤裸鼠的活體成像

采用活體成像來觀察DiR標記的功能化紫杉醇納米膠束在荷MCF-7/Adr移植瘤裸鼠體內的分布和腫瘤蓄積能力。將1.0×107個MCF-7/Adr細胞混懸于200μl無血清培養基中,皮下注射到裸鼠腋下。當腫瘤體積達到500mm3,分別給予生理鹽水、尾靜脈注射游離DiR,尾靜脈注射DiR標記的功能化紫杉醇納米膠束,口服游離DiR,口服DiR標記的功能化紫杉醇納米膠束。DiR劑量為2.0mg/kg。照射前2分鐘腹腔注射戊巴比妥(劑量60mg/kg)以進行麻醉,分別在給藥后0.5h,1h,3h,6h,12h和24h,采用Kadak多光譜活體成像系統照相。24h后,脫臼處死,立即解剖出心、肝、脾、肺、腎、腸和腫瘤,對不同組織進行成像。

圖9中,(A)尾靜脈注射DiR標記的功能化納米膠束后裸鼠體內的熒光分布;(B)尾靜脈注射DiR標記的功能化納米膠束24后腫瘤和組織的體外成像;(C)口服DiR標記的功能化納米膠束后裸鼠體內的熒光分布;(D)口服DiR標記的功能化納米膠束24后腫瘤和組織的體外成像。

DiR標記的功能化紫杉醇納米膠束在荷MCF-7/Adr移植瘤裸鼠體內的分布和腫瘤蓄積能力如圖9所示。尾靜脈注射和口服給予DiR標記的功能化紫杉醇納米膠束(圖9A和圖9C)后0.5h時,可以在裸鼠體內觀察到強烈的DiR熒光信號,而且在腫瘤組織的熒光信號可以持續到24h。相反,尾靜脈注射和口服給予游離DiR染料(圖9A和圖9C),腫瘤組織沒有明顯的熒光信號。給藥24h后,解剖出心、肝、脾、肺、腎、腸和腫瘤組織的體外成像結果見圖9B和圖9D。結果表明,無論是靜脈還是口服給予DiR標記的功能化納米膠束,在腫瘤組織均觀察到最強的熒光信號。

本實施例中上述各實驗結果都是實施例1中實驗二的制備方法中方法I得到的普通紫杉醇納米膠束、抗耐藥紫杉醇納米膠束、功能化紫杉醇納米膠束的結果。

用實施例1中實驗二的制備方法中方法II和III制備得到的功能化紫杉醇納米膠束分別進行本實施例中上述各實驗,實施例1中實驗二的制備方法中方法II和III制備得到的功能化紫杉醇納米膠束的結果與方法I得到的功能化紫杉醇納米膠束的結果無顯著差異。

用實施例1中實驗二的制備方法中方法II和III制備得到的抗耐藥紫杉醇納米膠束分別進行本實施例中上述各實驗,實施例1中實驗二的制備方法中方法II和III制備得到的抗耐藥紫杉醇納米膠束的結果與方法I得到的抗耐藥紫杉醇納米膠束的結果無顯著差異。

用實施例1中實驗二的制備方法中方法II和III制備得到的普通紫杉醇納米膠束分別進行本實施例中上述各實驗,實施例1中實驗二的制備方法中方法II和III制備得到的普通紫杉醇納米膠束的結果與方法I得到的普通紫杉醇納米膠束的結果無顯著差異。

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