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施用抗TNFΑ抗體的方法.pdf

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施用 TNF 抗體 方法
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摘要
申請專利號:

CN02815654.4

申請日:

20020605

公開號:

CN1638796A

公開日:

20050713

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A61K39/395,C07K16/00 主分類號: A61K39/395,C07K16/00
申請人: 艾博特生物技術有限公司
發明人: J·肯佩尼,R·維斯,S·A·菲斯科夫
地址: 百慕大哈米爾頓
優先權: 60/296,961
專利代理機構: 中國專利代理(香港)有限公司 代理人: 劉玥;徐雁漪
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法律狀態
申請(專利)號:

CN02815654.4

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了治療其中TNFα活性是有害的失調的方法,所述方法是通過每兩周皮下施用人抗體,優選重組人抗體而進行的,所述抗體特異性地結合人腫瘤壞死因子α(hTNFα)。抗體可以與氨甲蝶呤一起施用或不一起施用。這些抗體對hTNFα有高的親和力(例如Kd=10-Koff=10-3/秒或更低)和體外、體內中和hTNFα活性。本發明的抗體可以是全長抗體或其抗原結合部分。本發明也包括含有藥物組合物的和施用說明的試劑盒,和含有藥物組合物的預裝的注射器。

權利要求書

1.一種治療人類受試者中的失調的方法,其中疾病可用TNFα抗體治療,所述方法包括給人類受試者每兩周施用一種組合物來治療失調,其中所述組合物包含抗TNFα抗體或其抗原結合部分。2.權利要求1中的方法,其中施用是通過皮下注射進行的。3.權利要求1中的方法,其中所述抗TNFα抗體或其抗原結合部分是人抗TNFα抗體。4.權利要求3中的方法,其中由表面等離子共振測定,人抗體或其抗原結合部分以K為1×10M或更低,K速率常數為1×10/秒或更低從人TNFα上解離,而且在標準的體外L929檢測方法中以IC為1×10M或更低中和人TNFα細胞毒性。5.權利要求3中的方法,其中人抗體或其抗原結合部分以K速率常數為5×10/秒或更低從人TNFα上解離。6.權利要求3中的方法,其中人抗體或其抗原結合部分以K速率常數為1×10/秒或更低從人TNFα上解離。7.權利要求3中的方法,其中人抗體或其抗原結合部分,在標準體外L929檢測方法中,以IC為1×10M或更低中和人TNFα細胞毒性。8.權利要求3中的方法,其中人抗體或其抗原結合部分,在標準體外L929檢測方法中,以IC為1×10M或更低中和人TNFα細胞毒性。9.權利要求3中的方法,其中人抗體或其抗原結合部分,在標準體外L929檢測方法中,以IC為1×10M或更低中和人TNFα細胞毒性。10.權利要求3中的方法,其中人抗體或其抗原結合部分是一種重組抗體或其重組的抗原結合部分。11.一種在人受試者中抑制人TNFα活性的方法,所述人受試者患有其中TNFα活性有害的失調,所述方法包括每兩周施用一種組合物,所述組合物包含人抗TNFα抗體,其中人抗體或其抗原結合部分具有下列特征:a)由表面等離子共振測定,以K速率常數為1×10/秒或更低從人TNFα上解離;b)具有輕鏈CDR3結構域,其包含SEQ?ID?NO:3的氨基酸序列,或通過在1,4,5,7或8位進行單一丙氨酸替代,或在1,3,4,6,7,8和/或9位進行1至5個保守氨基酸替代由SEQ?ID?NO:3修飾的氨基酸序列;c)具有重鏈CDR3結構域,其包含SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列,或通過在2,3,4,5,6,8,9,10或11位進行單一丙氨酸替代,或在2,3,4,5,6,8,9,10,11和/或12位進行1至5個保守氨基酸替代由SEQ?ID?NO:4修飾的氨基酸序列。12.權利要求11中的方法,其中施用是皮下施用。13.權利要求11中的方法,其中人抗體或其抗原結合部分以K速率常數為5×10/秒或更低從人TNFα上解離。14.一種在人受試者中抑制人TNFα活性的方法,所述人受試者患有其中TNFα活性有害的失調,所述方法包括每兩周皮下施用一種組合物,所述組合物包含人抗TNFα抗體,其中人抗體或其抗原結合部分具有輕鏈可變區(LCVR)和重鏈可變區(HCVR),輕鏈可變區具有CDR3結構域,該結構域包含SEQ?ID?NO:3的氨基酸序列,或通過在1,4,5,7或8位進行單一丙氨酸替代由SEQ?ID?NO:3修飾的序列;重鏈可變區具有CDR3結構域,該結構域包含SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列,或通過在2,3,4,5,6,8,9,10或11位進行單一丙氨酸替代由SEQ?ID?NO:4修飾的序列。15.權利要求14中的方法,其中人抗體或其抗原結合部分的LCVR進一步具有包含SEQ?ID?NO:5的氨基酸序列的CDR2結構域,HCVR進一步具有包含SEQ?ID?NO:6的氨基酸序列的CDR2結構域。16.權利要求14中的方法,其中人抗體或其抗原結合部分的LCVR進一步具有包含SEQ?ID?NO:7的氨基酸序列的CDR1結構域,HCVR具有包含SEQ?ID?NO:8的氨基酸序列的CDR1結構域。17.一種在人受試者中抑制人TNFα活性的方法,所述人受試者患有其中TNFα活性有害的失調,所述方法包括每兩周皮下施用一種組合物,所述組合物包含人抗TNFα抗體,其中所述人抗體或其抗原結合部分具有包含SEQ?ID?NO:1的氨基酸序列的輕鏈可變區(LCVR),和包含SEQ?ID?NO:2的氨基酸序列的重鏈可變區(HCVR)。18.權利要求17中的方法,其中人抗體具有IgG1重鏈恒定區。19.權利要求17中的方法,其中人抗體具有IgG4重鏈恒定區。20.權利要求17中的方法,其中人抗體是Fab片段。21.權利要求17中的方法,其中人抗體是單鏈FV片段。22.一種在人受試者中抑制人TNFα活性的方法,其中所述人受試者患有其中TNFα活性有害的失調,所述方法包括每兩周皮下施用一種組合物,所述組合物包含人抗TNFα抗體,其中所述人抗體或其抗原結合部分具有輕鏈可變區(LCVR)或重鏈可變區(HCVR),輕鏈可變區具有CDR3結構域,該結構域包含選自SEQ?ID?NO:3、SEQID?NO:11、SEQ?ID?NO:12、SEQ?ID?NO:13、SEQ?ID?NO:14、SEQ?IDNO:15、SEQ?ID?NO:16、SEQ?ID?NO:17、SEQ?ID?NO:18、SEQ?ID?NO:19、SEQ?ID?NO:20、SEQ?ID?NO:21、SEQ?ID?NO:22、SEQ?ID?NO:23、SEQ?ID?NO:24、SEQ?ID?NO:25、SEQ?ID?NO:26的氨基酸序列;重鏈可變區具有CDR3結構域,該結構域包含選自SEQ?ID?NO:4、SEQID?NO:27、SEQ?ID?NO:28、SEQ?ID?NO:29、SEQ?ID?NO:30、SEQ?IDNO:31、SEQ?ID?NO:32、SEQ?ID?NO:33和SEQ?ID?NO:34的氨基酸序列。23.一種在人受試者中抑制人TNFα活性的方法,所述人受試者患有其中TNFα活性有害的失調,所述方法包括每兩周皮下施用一種組合物,所述組合物包含人抗TNFα抗體,其中所述人抗體是D2E7抗體或其抗原結合部分。24.一種試劑盒,它包含一種制劑,所述制劑包含:a)一種藥物組合物,其包含抗TNFα抗體和藥學上可接受的載體;b)每兩周施用一次藥物組合物以治療失調的說明,其中抗TNFα抗體或其抗原結合部分在治療失調時有效。25.權利要求24中所述的試劑盒,其中抗體包含權利要求2~22任一項中的抗體或其抗原結合部分。26.一種包含藥物組合物的預裝注射器,所述藥物組合物中包含抗TNFα抗體和藥學上可接受的載體。27.權利要求26中的注射器,其中人抗體包含權利要求2~22任一項中的抗體或其抗原結合部分。28.一種治療失調的方法,其中抗TNFα抗體或其抗原結合部分在治療失調時有效,所述方法包括給人受試者皮下施用一種組合物,所述組合物包含抗TNFα抗體或其抗原結合部分以及氨甲蝶呤,用以治療失調。29.權利要求28中的方法,其中氨甲蝶呤與抗TNFα抗體或其抗原結合部分一起施用。30.權利要求28中的方法,其中氨甲蝶呤在施用抗TNFα抗體或其抗原結合部分前施用。31.權利要求28中的方法,其中氨甲蝶呤在施用抗TNFα抗體或其抗原結合部分后施用。32.權利要求28中的方法,其中抗TNFα抗體是人抗TNFα抗體或其抗原結合部分。33.權利要求28中的方法,其中由表面等離子共振測定,人抗體或其抗原結合部分以K為1×10M或更低,K速率常數為1×10/秒或更低從人TNFα上解離,而且在標準的體外L929檢測方法中以IC為1×10M或更低中和人TNFα細胞毒性。34.權利要求28中的方法,其中人抗體或其抗原結合部分以K速率常數為5×10/秒或更低從人TNFα上解離。35.權利要求28中的方法,其中人抗體或其抗原結合部分以K速率常數為1×10/秒或更低從人TNFα上解離。36.權利要求28中的方法,其中人抗體或其抗原結合部分,在標準體外L929檢測方法中,以IC為1×10M或更低中和人TNFα細胞毒性。37.權利要求28中的方法,其中人抗體或其抗原結合部分,在標準體外L929檢測方法中,以IC為1×10M或更低中和人TNFα細胞毒性。38.權利要求28中的方法,其中人抗體或其抗原結合部分,在標準體外L929檢測方法中,以IC為1×10M或更低中和人TNFα細胞毒性。39.權利要求28中的方法,其中人抗體或其抗原結合部分是一種重組抗體或其重組的抗原結合部分。40.權利要求28中的方法,其中人抗體或其抗原結合部分能夠抑制人TNFα誘導的ELAM-1在人臍帶靜脈內皮細胞上的表達。41.一種在人受試者中抑制人TNFα活性的方法,所述人受試者患有其中TNFα活性有害的失調,所述方法包括給人受試者施用氨甲蝶呤并皮下施用人抗TNFα抗體,其中所述人抗體或其抗原結合部分具有下列特性:a)由表面等離子共振測定,以K速率常數為1×10/秒或更低從人TNFα上解離;b)具有輕鏈CDR3結構域,其包含SEQ?ID?NO:3的氨基酸序列,或通過在1,4,5,7或8位進行單一丙氨酸替代,或在1,3,4,6,7,8和/或9位進行1至5個保守氨基酸替代由SEQ?ID?NO:3修飾的氨基酸序列;c)具有重鏈CDR3結構域,其包含SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列,或通過在2,3,4,5,6,8,9,10或11位進行單一丙氨酸替代,或在2,3,4,5,6,8,9,10,11和/或12位進行1至5個保守氨基酸替代由SEQ?ID?NO:4修飾的氨基酸序列。42.權利要求41中的方法,其中人抗體或其抗原結合部分以K速率常數為5×10/秒或更低從人TNFα上解離。43.權利要求41中的方法,其中人抗體或其抗原結合部分以K速率常數為1×10/秒或更低從人TNFα上解離。44.一種在人受試者中抑制人TNFα活性的方法,所述人受試者患有其中TNFα活性有害的失調,所述方法包括施用氨甲蝶呤并皮下施用人抗TNFα人抗體,其中人抗體或其抗原結合部分具有輕鏈可變區(LCVR)和重鏈可變區(HCVR),輕鏈可變區具有CDR3結構域,該結構域包含SEQ?ID?NO:3的氨基酸序列,或通過在1,4,5,7或8位進行單一丙氨酸替代由SEQ?ID?NO:3修飾的序列;重鏈可變區具有CDR3結構域,該結構域包含SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列,或通過在2,3,4,5,6,8,9,10或11位進行單一丙氨酸替代由SEQ?ID?NO:4修飾的序列。45.權利要求44中的方法,其中人抗體或其抗原結合部分的LCVR進一步具有包含SEQ?ID?NO:5的氨基酸序列的CDR2結構域,HCVR進一步具有包含SEQ?ID?NO:6的氨基酸序列的CDR2結構域。46.權利要求44中的方法,其中人抗體或其抗原結合部分的LCVR進一步具有包含SEQ?ID?NO:7的氨基酸序列的CDR1結構域,HCVR具有包含SEQ?ID?NO:8的氨基酸序列的CDR1結構域。47.一種在人受試者中抑制人TNFα活性的方法,所述人受試者患有其中TNFα活性有害的失調,所述方法包括施用氨甲蝶呤并皮下施用人抗TNFα抗體,其中所述人抗體或其抗原結合部分具有包含SEQ?ID?NO:1的氨基酸序列的輕鏈可變區(LCVR),和包含SEQID?NO:2的氨基酸序列的重鏈可變區(HCVR)。48.權利要求47中的方法,其中人抗體具有IgG1重鏈恒定區。49.權利要求47中的方法,其中人抗體具有IgG4重鏈恒定區。50.權利要求47中的方法,其中人抗體是Fab片段。51.權利要求47中的方法,其中人抗體是單鏈Fv片段。52.一種在人受試者中抑制人TNFα活性的方法,所述人受試者患有其中TNFα活性有害的失調,所述方法包括施用氨甲蝶呤并皮下施用人抗TNFα抗體或其抗原結構部分,其中所述人抗體或其抗原結合部分具有輕鏈可變區(LCVR)或重鏈可變區(HCVR),輕鏈可變區具有CDR3結構域,該結構域包含選自SEQ?ID?NO:3、SEQ?ID?NO:11、SEQ?ID?NO:12、SEQ?ID?NO:13、SEQ?ID?NO:14、SEQ?ID?NO:15、SEQ?ID?NO:16、SEQ?ID?NO:17、SEQ?ID?NO:18、SEQ?ID?NO:19、SEQ?ID?NO:20、SEQ?ID?NO:21、SEQ?ID?NO:22、SEQ?ID?NO:23、SEQ?ID?NO:24、SEQ?ID?NO:25、SEQ?ID?NO:26的氨基酸序列;重鏈可變區具有CDR3結構域,該結構域包含選自SEQ?ID?NO:4、SEQID?NO:27、SEQ?ID?NO:28、SEQ?ID?NO:29、SEQ?ID?NO:30、SEQ?IDNO:31、SEQ?ID?NO:32、SEQ?ID?NO:33和SEQ?ID?NO:34的氨基酸序列。53.一種在人受試者中抑制人TNFα活性的方法,所述人受試者患有其中TNFα活性有害的失調,所述方法包括施用氨甲蝶呤并皮下施用人抗TNFα抗體,其中所述人抗體是D2E7抗體或其抗原結合部分。54.一種試劑盒,它包含一種制劑,所述制劑包含:a)一種藥物組合物,其包含抗TNFα抗體或其抗原結合部分、氨甲蝶呤和藥學上可接受的載體;和b)皮下施用用于治療失調的藥物組合物的說明,所述失調中TNFα活性是有害的。55.權利要求54中的試劑盒,其中所述抗體包含權利要求32~51中任一項中的抗體或其抗原結合部分。56.一種包含藥物組合物的預裝注射器,所述藥物組合物中包含抗TNFα抗體、氨甲蝶呤和藥學上可接受的載體。57.權利要求56中的注射器,其中所述抗體包含權利要求32~52任一項中的抗體或其抗原結合部分。58.權利要求1或28中的方法,其中所述失調是敗血癥。59.權利要求1或28中的方法,其中所述抗體與細胞因子白介素6(IL-6)一起給人受試者施用,或以血清或血漿IL-6濃度在500pg/ml以上給人受試者施用。60.權利要求1或28中的方法,其中所述失調是自身免疫性疾病。61.權利要求60中的方法,其中自身免疫性疾病選自類風濕性關節炎、類風濕性脊椎炎、骨關節炎和痛風性關節炎。62.權利要求61的方法,其中自身免疫性疾病是類風濕性關節炎。63.權利要求60的方法,其中自身免疫性疾病選自變態反應、多發性硬化病、自免性糖尿病、自免性色素層炎和腎病綜合征。64.權利要求1或28的方法,其中失調是一種傳染病。65.權利要求1或28的方法,其中失調是移植排斥或移植物抗宿主病。66.權利要求1或28中的方法,其中失調是惡性腫瘤。67.權利要求1或28中的方法,其中失調是肺病。68.權利要求1或28中的方法,其中失調是腸道失調。69.權利要求1或28中的方法,其中失調是心臟失調。70.權利要求1或28中的方法,其中失調選自炎性骨病、骨吸收疾病、酒精性肝炎、病毒性肝炎、凝血障礙、燒傷、再輸注損傷、瘢痕瘤形成、瘢痕組織形成和發熱。71.一種試劑盒,其包含:a)一種藥物組合物,其包含抗TNFα抗體或其抗原結合部分,以及藥學上可接受的載體;b)一種藥物組合物,其包含氨甲蝶呤和藥學上可接受的載體;c)皮下施用抗TNFα抗體藥物組合物和在施用抗TNFα抗體藥物組合物之前、之后或同時施用氨甲蝶呤藥物組合物的說明。72.權利要求71的試劑盒,其中抗TNFα抗體或其抗原結合部分是D2E7抗體或其抗原結合部分。

說明書

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背景技術

腫瘤壞死因子(TNFα)是一種由多種細胞(包括單核細胞和巨噬 細胞)產生的細胞因子,最初是根據其誘導某些鼠腫瘤壞死的能力而 鑒定出的(參見Old,L.(1985)Science?230:630-632)。隨后,確定了一 種與惡病相關的,命名為惡液質素(cachectin)的細胞因子和TNFα是 同一分子。TNFα參與介導休克(參見Beutler,B.和Cerami,A.(1998) Annu.Rev.Biochem.57:505-518;Beutler,B.和Cerami,A.(1998)Annu. Rev.Immunol.7:625-655)。此外,TNFα與其它多種人類疾病和失調 的病理生理學有關,包括膿血癥、感染、自身免疫病、移植排斥和移 植物抗宿主疾病(參見Vasilli,P.(1992)Annu.Rev.Immunol.10:411- 452;Tracey,K.J.和Cerami,A.(1994)Annu.Rev.Med.45:491-503)。

鑒于人TNFα(hTNFα)在多種人類失調中所扮演的有害角色,治 療策略被設計為抑制或中和hTNFα的活性。尤其是,能夠結合并中 和hTNFα的抗體已被作為一種抑制hTNFα活性的手段(means)。某 些最早的這類抗體是鼠的單克隆抗體(mAbs),由用hTNFα免疫的鼠 淋巴細胞制備的雜交瘤分泌(參見Hahn?T.等,(1985)Pro?Natl?Acad?Sci USA?82:3814-3818;Liang,C-M等(1986)Biochem.Biophys.Res. Commun.137:847-854;Hirai,M等(1987)J.Immunol.Methods?96:57-62; Fendly,B.M.等,(1987)Hybridoma?6:359-370;Mller,A.等 (1990)Cytokine?2:162-169;Moeller等的美國專利No.5231024; Wallach,D.的歐洲專利出版物No.186833B1;Old等的歐洲專利申請 No.218868A1;由Moeller?A.等的歐洲專利出版物No.260610B1)。這 些鼠抗hTNFα抗體通常顯示較高的與hTNFα的親和力(如:Kd≤10- 9M)并能中和hTNFα活性,但體內應用這些抗體可能受制于施用這 些鼠抗人抗體相關的問題,如:血清半衰期短、不能觸發某些人體效 應器功能以及人體內誘發不期望的對鼠抗體的免疫應答(“人抗鼠抗 體”(HAMA)的反應)。

為了解決人體內使用完全的(full)鼠抗體所帶來的問題,用基因工 程的方法將鼠抗hTNFα抗體改造得更為“人化”。比如,已經制備 了嵌合抗體,其中抗體鏈的可變區是鼠源性的,而恒定區則是人源性 的(Knight,D.M.等(1993)Mol.Immunol.30:1443-1453;Daddona,P.E. 等的PCT出版物No.WO92/16553)。此外,也制備了人源化抗體,其 中抗體可變區的超變區是鼠源性的,但可變區的其余部分和抗體恒定 區是人源性(Adair,J.R.等的PCT出版物No.WO92/11383)。然而,因 為這些嵌合和人源化抗體仍保留一些鼠序列,它們仍可能誘發不期望 的免疫反應,即人抗嵌合抗體(HACA)反應,尤其是長期施用時,如 治療類風濕性關節炎(rheumatoid?arthritis)等慢性適應癥時(參見 Elliott,M.J.等(1994)Lancet?344:1125-1127;Elliot,M.J.等(1994)Lancet 344:1105-1110)。

一種針對鼠單抗或其衍生物(如嵌合或人源化抗體)的優選的hTNF α抑制劑應當是完全的人抗hTNFα抗體,因為這類藥劑即使是長期 使用也不會誘發HAMA反應。應用人雜交瘤技術已經制備了人抗 hTNFα的單克隆自身抗體(Boyle,P等(1993)Cell.Immunol.152:556- 568;Boyle,P.等(1993)Cell.Immunol.152:569-581;Boyle等的歐洲專 利申請出版物No.614984A2)。然而,據報道這些雜交瘤來源的單克 隆自身抗體對hTNFα有親和力,但親和力太低以至于用常規方法測 不出來,也不能夠結合可溶性的hTNFα,也不能夠中和hTNFα誘 導的細胞毒性(參見Boyle等;同上)。而且,人雜交瘤技術的成功 依賴于人周血中天然存在的產生特異性抗hTNFα自身抗體的淋巴細 胞。某些研究檢測了人體中的抗hTNFα的血清自身抗體(Fomsgaard,A 等(1989)Scand.J.Immunol.30:219-223;Bendtzen,K等(1990)Prog. Leukocyte?Biol?10B:447-452),而其它的研究沒有進行檢測(Leusch, H-G等(1991)J.Immunol.Methods?139:145-147)。

除天然存在的人抗hTNFα外可選擇重組hTNFα抗體。與hTNF α以相對低的親和力(如Kd約10-7M)和快的解離速率(如Koff約10-2/秒) 結合的重組人抗體已有報道(Griffiths,A.D.等(1993)EMBO?J.12:725- 734)。然而,由于它們的相對快速的解離動力學,這些抗體不適于治 療用。此外,已報道一種重組人抗hTNFα不能中和hTNFα活性, 反而強化hTNFα與細胞表面的結合,加速其內吞(Lidbury,A等(1994) Biotechnol.Ther.5:27-45;Aston,R等的PCT出版物No. WO92/03145)。

也有報道描述了重組人抗體,能夠以高的親和力以及慢的解離速 率結合可溶的hTNFα,這種抗體能夠中和hTNFα活性,包括hTNF α誘導的細胞毒性(體內和體外)和hTNFα誘導的細胞活化(參見美國 專利No.6090382)。施用抗體的典型方案為每周靜脈用藥。每周施用 抗體和/或任何藥物是昂貴的、繁瑣的,而且由于頻繁施用而導致副 反應次數的增加。另外,靜脈施用通常需要受過醫學訓練的人來操作, 這也是一種限制。

發明概述?

本發明提供一種治療TNFα相關失調的每兩周進行一次的用藥方 法,優選地通過皮下用藥。每兩周用藥一次與每周用藥一次相比有許 多優點,包括但不限于,較少的注射總數,較少的注射部位反應(如 局部疼痛與腫脹),患者接受程度提高(歸因于注射頻率降低),對患者 和衛生保健機構(health?care?provider)而言較低的花費。皮下用藥本身 也有優點,即患者可自己施用治療劑,如人TNFα抗體,這方便了 患者和衛生保健機構。

本發明提供了治療其中TNFα活性有害的失調的方法。該方法包 括給受試者每兩周皮下注射抗體一次。優選的抗體是能夠特異性結合 人TNFα的重組人抗體。本發明進一步提供了治療其中TNFα活性 有害的失調的方法。這些方法包括利用聯合治療方法,其中人抗體與 其它治療藥劑一同給受試者施用,所述其它治療藥劑如一種或多種可 與其它靶物質結合的抗體(如結合其它細胞因子或細胞表面分子的抗 體),一種或多種細胞因子,可溶性TNFα受體(見例如PCT出版物 No.WO94/06476)和/或一種或多種能夠抑制TNFα產生或抑制其活性 的化學藥劑(諸如PCT出版物No.WO93/19751中所述的 cyclohexaneylidene衍生物),優選藥劑是氨甲蝶呤。抗體優選能夠特 異性結合人TNFα的重組人抗體。本發明抗體的特征是以高親和力 和低解離動力學與hTNFα結合,而且能夠中和hTNFα活性,包括 hTNFα誘導的細胞毒性(體內和體外)和hTNFα誘導的細胞活化。這 些抗體可以是全長的(如IgG1或IgG4抗體),也可僅包含抗原結合部 分(如Fab,F(ab’)2,scFv片段或單結構域)。本發明最優選的重組抗體 命名為D2E7,其輕鏈CDR3結構域包含SEQ?ID?NO:3的氨基酸序列, 重鏈CDR3結構域包含SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列(在附錄B中列 出)。優選地,D2E7抗體輕鏈可變區(LCVR)包含SEQ?ID?NO:1的氨 基酸序列,重鏈可變區(HCVR)包含SEQ?ID?NO:2的氨基酸序列。這 些抗體在美國專利No.6090382中有描述,其全文在此引入作為參考。

在一個實施方案中,本發明提供了治療其中TNFα活性有害的失 調的方法。這些方法包括每兩周皮下施用一次抗TNFα抗體,抑制 人TNFα活性而治療失調。失調可以是例如膿血癥、自身免疫性疾 病(如類風濕性關節炎、變態反應、多發性硬化、自身免疫性糖尿病、 自身免疫性色素層炎以及腎病綜合征)、感染性疾病、惡性腫瘤、移 植排斥或移植物抗宿主疾病、肺失調、骨失調、腸道失調或心臟失調。

在另一實施方案中,本發明提供了治療其中TNFα活性有害的失 調的方法。這些方法包括通過皮下施用抗TNFα抗體和氨甲蝶呤, 抑制人TNFα活性,從而治療失調。在一方面中,氨甲蝶呤與抗TNF α抗體一同施用。在另一方面中,在施用抗TNFα抗體之前施用氨 甲蝶呤。在另一方面中,在施用抗TNFα抗體之后施用氨甲蝶呤。

在一優選實施方案中,用于治療其中TNFα活性有害的失調的抗 TNFα抗體是人抗TNFα抗體。更優選的是,通過每兩周皮下施用分 離的人抗體或抗體的抗原結合部分來進行治療。優選地,抗體或其抗 原結合部分以Kd為1×10-8M或更小,Koff速率常數為1×10-3/秒或更 小從人TNFα解離,這兩者都是由表面等離子共振(surface?plasmon resonance)測定;而且按照標準的體外L929檢測方法以IC50為1×10- 7M或更低中和人TNFα細胞毒性。更優選地,分離的人抗體或其抗 原結合部分以Koff為5×10-4/秒或更小,更優選地以Koff為1×10-4/秒 或更小,從人TNFα解離。更優選地,分離的人抗體或其抗原結合 部分,按照標準的體外L929檢測方法檢測,以IC50為1×10-8M或更 低,進一步優選以IC50為1×10-9M或更低,更進一步優選以IC50為 1×10-10M或更低,中和人TNFα細胞毒性。

再另一實施方案中,本發明提供了通過給受試者每兩周皮下施用 人抗體或其抗原結合部分來治療其中TNFα活性有害的失調的方法。 所述抗體或其抗原結合部分優選具有下列特征:

a)由表面等離子共振測定,以Koff為1×10-3/秒或更小從人TNF α解離;

b)具有輕鏈CDR3結構域,其包含SEQ?ID?NO:3的氨基酸序列, 或通過在1,4,5,7或8位進行單一丙氨酸替代,或在1,3,4,6, 7,8和/或9位進行1至5個保守氨基酸替代由SEQ?ID?NO:3修飾的 氨基酸序列;

c)具有重鏈CDR3結構域,其包含SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列, 或通過在2,3,4,5,6,8,9,10或11位進行單一丙氨酸替代, 或在2,3,4,5,6,8,9,10,11和/或12位進行1至5個保守氨 基酸替代由SEQ?ID?NO:4修飾的氨基酸序列;

更優選地,抗體或其抗原結合部分以Koff值為5×10-4/秒或更小 從人TNFα解離。進一步優選地,抗體或抗體的抗原結合部分以Koff值為1×10-4/秒或更小從人TNFα解離。

在另一實施方案中,本發明提供了治療其中TNFα活性有害的失 調的方法。這些方法包括每兩周給受試者皮下施用人抗體或其抗原結 合部分。抗體或其抗原結合部分優選包含LCVR區和HCVR區,所 述LCVR區具有CDR3結構域,其包含SEQ?ID?NO:3的氨基酸序列, 或通過在1,4,5,7或8位進行單一丙氨酸替代由SEQ?ID?NO:3修 飾的氨基酸序列;所述HCVR區具有CDR3結構域,其包含SEQ?ID?NO: 4的氨基酸序列,或通過在2,3,4,5,6,8,9,10或11位進行 單一丙氨酸替代由SEQ?ID?NO:4修飾的氨基酸序列。進一步優選地, LCVR區還具有CD2結構域,該結構域包含SEQ?ID?NO:5的氨基酸 序列,而HCVR還具有CD2結構域,該結構域包含SEQ?ID?NO:6的 氨基酸序列。再進一步優選地,LCVR區還具有CDR1結構域,該結 構域包含SEQ?ID?NO:7的氨基酸序列,而HCVR具有CDR1結構域, 該結構域包含SEQ?ID?NO:8的氨基酸序列。

在另一實施方案中,本發明提供了通過每兩周給受試者皮下施用 分離的人抗體或其抗原結合部分來治療其中TNFα活性有害的失調 的方法。所述抗體或抗體的抗原結合部分優選包含LCVR區和HCVR 區,所述LCVR區包含SEQ?ID?NO:1的氨基酸序列;而所述HCVR 區包含SEQ?ID?NO:2的氨基酸序列。在某些實施方案中,抗體具有 IgG1重鏈的恒定區或IgG4重鏈的恒定區。在另一實施方案中,抗體 是Fab片段、F(ab’)2片段或單鏈Fv片段。

在另一實施方案中,本發明提供了用于治療失調的方法,該方法 通過每兩周給受試者皮下施用一種或多種抗TNFα抗體或其抗原結 合部分而使受試者獲益。所述抗體或其抗原結合部分優選包含LCVR 區或連同HCVR區,所述LCVR區具有CDR3結構域,其包含選自 SEQ?ID?NO:3,SEQ?ID?NO:11,SEQ?ID?NO:12,SEQ?ID?NO:13,SEQ ID?NO:14,SEQ?ID?NO:15,SEQ?ID?NO:16,SEQ?ID?NO:17,SEQ?ID NO:18,SEQ?ID?NO:19,SEQ?ID?NO:20,SEQ?ID?NO:21,SEQ?ID?NO: 22,SEQ?ID?NO:23,SEQ?ID?NO:24,SEQ?ID?NO:25,SEQ?ID?NO:26 的氨基酸序列;而所述HCVR區具有CDR3結構域,其包含選自SEQ ID?NO:4,SEQ?ID?NO:27,SEQ?ID?NO:28,SEQ?ID?NO:29,SEQ?ID NO:30,SEQ?ID?NO:31,SEQ?ID?NO:32,SEQ?ID?NO:33,SEQ?ID?NO: 34和SEQ?ID?NO:35的氨基酸序列。

本發明的另一個方面涉及包含藥物制劑的試劑盒,所述藥物制劑 包含藥物組合物。該試劑盒包含抗TNFα抗體和藥學上可接受的載 體。試劑盒內附有每兩周皮下施用治療失調的藥物組合物的說明,其 中施用抗TNFα可使患者獲益。在另一個方面中,本發明涉及包含 藥物制劑的試劑盒,所述藥物制劑包含藥物組合物,所述試劑盒進一 步包含抗TNFα抗體、氨甲蝶呤以及藥學上可接受的載體。試劑盒 內附有皮下施用治療失調的藥物組合物的說明,其中施用抗TNFα 抗體可使患者獲益。

本發明的另一方面提供了一種含有藥物組合物的預裝的注射器, 所述藥物組合物包含抗TNFα抗體和藥學上可接受的載體。在另一 方面中,本發明提供了一種含有藥物組合物的預裝的注射器,所述藥 物組合物包含抗TNFα抗體、氨甲蝶呤和藥學上可接受的載體。

附圖簡述

圖1A和1B顯示了患類風濕性關節炎(RA)患者在每周皮下施用 一次D2E7抗體,共施用12周后的美國風濕病學會20(ACR20)和 ACR50反應結果(圖1A),或在隔周皮下施用一次D2E7抗體和氨甲 蝶呤,共施用24周后的美國風濕病學會20(ACR20)和ACR50反應結 果(圖1B)。這些資料表明隔周施用與每周施用一樣有效。

圖2顯示了患類風濕性關節炎患者在隔周皮下施用一次D2E7抗 體和氨甲蝶呤,施用24周后的ACR20、ACR50和ACR70反應結果。

圖3顯示了患類風濕性關節炎患者在隔周皮下施用一次D2E7抗 體和氨甲蝶呤,施用24周后的疼痛關節計數(3A)和腫脹關節計數(3B) 隨時間的結果。

圖4顯示了患類風濕性關節炎患者在隔周皮下施用一次D2E7抗 體和氨甲蝶呤,施用24周后的體檢結果簡表(SF-36)。RP,身體 狀況(role?physical);PF,身體功能;BP,身體疼痛;GH,總體健康狀 態;V,活力;SF,社會功能;RE,情緒狀況;和ME,精神健康。

圖5顯示了患類風濕性關節炎患者在靜脈注射一次D2E7抗體和 氨甲蝶呤后ACR反應的百分比。

發明詳述

本發明涉及治療失調的方法,在所述失調中施用抗TNFα抗體對 患者有益,所述方法包括施用分離的人抗體或其抗原結合部分,所述 抗體或其抗原結合部分以高親和力、低解離速率和高的中和能力與人 TNFα結合,從而治療失調。本發明的各個方面涉及用抗體和抗體片 段進行治療,以及它們的藥物組合物。

為了使本發明更易于理解,首先定義某些術語。

本文所用術語“用藥(dosing)”,是指施用一種物質(如抗TNFα 抗體)以獲得治療目的(如治療TNFα相關的失調)。

本文所用術語“兩周一次用藥方案”,“兩周一次用藥”,“兩 周一次施用”,是指為獲得治療目的(如治療TNFα相關的疾病)而給 受試者用藥(如抗TNFα抗體)的時間間隔。兩周一次用藥方案并不包 括每周一次用藥方案。優選每9-19天用藥一次,進一步優選的是每 11-17天用藥一次,更優選的是每13-15天用藥一次,最優選的是每 14天用藥一次。

本文所用術語“聯合治療”是指施用兩種或兩種以上的治療物質, 如抗TNFα抗體和氨甲蝶呤。氨甲蝶呤可以與抗TNFα抗體同時施 用,也可以在施用抗TNFα抗體前施用,或者在施用抗TNFα抗體 后施用。

本文所用術語“人TNFα”(縮寫為hTNFα或hTNF),是指一種 人的細胞因子,該因子以分泌形式存在時分子量為17kD,以膜相關 形式存在時分子量為26kD,生物活性形式是由17kD的分子以非共 價鍵方式結合的三聚體形式存在。TNFα的結構在如Pennica,D等 (1984)Nature?312:724-729;Davis,J.M.等(1987)Biochemistry?26: 1322-1326和Jones,E.Y.等Nature?338:225-228中有進一步的描述。 人TNFα包括重組人TNFα(rhTNFα),該蛋白可以通過標準的重組 表達方法制備或購自商品化的產品(R&D?systems,catalog?No.210-TA, Minneapolis,MN)。

本文所用術語“抗體”,是指由四條多肽鏈組成的免疫球蛋白分 子,其中兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)通過二硫鍵相互鏈接。每條重鏈 又由重鏈可變區(縮寫為HCVR或VH)和重鏈恒定區組成,重鏈恒定 區由CH1、CH2和CH3三個結構域組成;每條輕鏈又由輕鏈可變區(縮 寫為LCVR或VL)和輕鏈恒定區組成,輕鏈恒定區由CL一個結構域 組成。VH和VL又進一步的細分為超變區,命名為互補決定區(CDR), 分散分布的較保守的區域,命名為框架區(FR)。每條VH和VL又由 三個CDR區和4個FR區組成,從氨基端至羧基端按照下列順序排 列:FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。

本文所用的術語抗體的“抗原結合部分”(或簡寫為“抗體部分”), 是指抗體的一個或多個片段,該片段保留了特異性與抗原(如hTNFα) 結合的能力。抗體的抗原結合功能可由全長抗體的片段來實現。抗體 的“抗原結合部分”一詞所包含的結合片段實例,包括(1)Fab片段, 由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段;(2)F(ab’)2片段,由 兩個Fab片段在鉸鏈區通過一個二硫鍵結合在一起的雙價片段;(3) 由VH和VL組成的Fd片段;(4)由抗體的單臂的VL和VH結構域 組成的Fv片段;(5)dAb片段(Ward等,(1989)Nature?341:544-546),由 VH結構域組成;(6)分離的互補決定區(CDR)。雖然Fv片段的兩個 結構域VL和VH是由獨立的基因編碼,但通過重組方法,可以用合 成的接頭鏈接而成為一個蛋白,其中的VL和VH配對形成單價分子 (稱為單鏈Fv(scFv);參見Bird等(1988)Science?242:423-426;以及 Huston等(1988)Natl.Acad.Sci.USA?85:5879-5883)。這類單鏈抗體也 包括在抗體的“抗原結合部分”中。其它形式的單鏈抗體,如diabodies 也包括在內。Diabodies是雙價、雙特異性的抗體,其中VH和VL 結構域表達在單一的多肽鏈上,但由于所用的接頭太短而不能使同一 條鏈上的兩個結構域配對,因而迫使其與另一條鏈上的互補結構域配 對而產生了兩個抗原結合位點(參見Holliger,P.等(1993)Proc.Natl. Acad.Sci.USA?90:6444-6448;Poljak,R.J.等(1994)Structure?2:1121- 1123)。

進一步來講,抗體或其抗原結合部分可以是一個大的免疫粘附分 子的部分,可以由抗體或抗體部分通過共價或非共價方式與一個或多 個其它的蛋白或多肽連接形成。這類免疫粘附分子的實例包括,用鏈 霉抗生物素核心區制得的scFv的四聚體(Kipriyanov,S.M.等(1995) Human?antibodies?and?Hybridomas?6:93-101)和用一個半胱氨酸殘基, 一個標記肽和C末端多聚組氨酸標記而制成的雙價和生物素化的scFv 分子(Kipriyanov,S.M.等(1994)Mol.Immunol.31:1047-1058)。用常規 技術如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶分別消化完整抗體,可以從完整抗體制 備抗體部分,如Fab和F(ab’)2片段。而且,應用如本文所述的標準 重組DNA技術,可以制備抗體、抗體部分和免疫粘附分子。

本文所用的術語“人抗體”,包括那些具有從人種系(germline)免 疫球蛋白序列衍生的可變區和恒定區的抗體。本發明的人抗體可以包 括并非由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(如體外隨機或位 點特異性的突變或體內細胞突變),如在CDR區,尤其是在CDR3區。 然而,本文所用的“人抗體”,并不包括那些CDR區序列源自其它 哺乳動物種類(如鼠)的種系,然后移植至人框架序列的抗體。

本文所用的術語“重組人抗體”,包括那些通過重組方法制備、 表達、創造或分離的所有人抗體,如用重組表達載體轉染宿主細胞表 達的抗體(在下面第二部分詳述),分離自重組、組合人抗體文庫的抗 體(在下面第三部分詳述),分離自轉入人免疫球蛋白基因的轉基因動 物(如鼠)的抗體(參見Taylor,L.D等(1992)Nucl.Acids?Res.20:6287- 6295),或者是通過其它涉及人免疫球蛋白基因序列剪切至其它DNA 序列的方法而制備、表達、創造或分離的抗體。這類重組人抗體具有 源自人種系免疫球蛋白序列的可變區和恒定區。在某些實施方案中, 對這類重組人抗體進行體外誘變(或,當使用轉入人Ig序列的轉基因 動物時,進行體內體細胞誘變),因而這類重組人抗體的VH和VL 區的氨基酸序列是這樣一些序列,它們來源于人種系VH和VL序列 且與之相關,但不是體內人抗體種系所有組成部分(repertoire)中天然 存在的序列。

本文所用的“分離抗體”,是指基本上不含具有不同抗原特異性 的其它抗體的抗體(如特異性結合hTNFα的分離抗體,基本上不含與 除hTNFα外的抗原特異性結合的抗體)。然而,特異性結合hTNFα 的分離抗體可以與其它抗原(如源于其它物種的hTNFα)有交叉反 應性(下面將進一步討論)。而且,分離的抗體可以基本上不含其它的 細胞物質或化學物質。

本文所用的“中和抗體”(或“能夠中和hTNFα活性的抗體”), 是指能夠與hTNFα結合并導致其生物活性被抑制的一類抗體。hTNF α生物活性的抑制,可以通過檢測hTNFα生物活性的一種或多種指 標來測定,如檢測hTNFα誘導的細胞毒性(無論體內還是體外),hTNF α誘導的細胞活化以及hTNFα與其受體的結合。這些hTNFα的生 物活性指標可以通過本領域已知的幾種體內或體外標準方法中一種或 多種測定(見實施例4)。優選通過hTNFα誘導的L929細胞的細胞毒 性的抑制測定抗體中和hTNFα活性的能力。作為一種附加或可選的 hTNFα活性指標,可測定抗體抑制hTNFα誘導HUVEC上ELAM-1 的表達能力,作為hTNFα誘導細胞活化的量度。

本文所用的術語“表面等離子共振”,是指一種光學現象,可通 過檢測生物傳感器基質(matrix)中蛋白濃度的變化實時地分析生物特 異性反應,比如用BIAcore系統(Pharmacia?Biosensor?AB,Uppsala, Sweden?and?Piscataway,NJ)。進一步的描述參見實施例1和Jnsson?U. 等(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26;Jnsson?U.等(1991)Biotechniques 11:620-627;Johnsson,B等(1995)J.Mol.Recognit.8:125-131;和 Johnsson,B.等(1991)Anal.Biochem.198:268-277。

本文所用的術語“Koff”,是指抗體從抗體/抗原復合物上解離下 來的解離速率常數。

本文所用的術語“Kd”,是指特定抗體-抗原反應的解離常數。

本文所用的術語“核酸分子”,包括DNA和RNA分子。核酸分 子可以是單鏈或雙鏈的,優選雙鏈的。

本文在提及編碼與hTNFα結合的抗體或抗體部分(例如VH、 VL、CD3)的核酸時所用的“分離的核酸分子”,是指一種核酸分 子,其中編碼抗體或抗體部分的核苷酸序列沒有編碼可結合非hTNF α的抗原的抗體或抗體部分的其它核苷酸序列,所述其它序列可以天 然位于人基因組DNA序列的兩側。比如,本發明的分離的編碼抗TNF α抗體VH區的核酸序列不包括編碼結合非hTNFα抗原的其它VH 區的序列。

本文所用的術語“載體”,是指能夠轉運與其連接的另一種核酸 分子的核酸分子。載體類型之一是“質粒”,是一種環狀雙鏈DNA 環,能夠連接附加的DNA片段。另一類型的載體是病毒載體,其中 附加的DNA片段連接至病毒基因組。某些載體在引入的宿主細胞中 能夠自主復制(如具有細菌復制啟動子的細菌載體和游離的哺乳動物 載體)。其它的載體(如非游離的哺乳動物載體)可以在引入宿主細胞后 整合進宿主細胞的基因組,隨基因組的復制而復制。而且,某些載體 能夠表達其連接的基因。這類載體在本文中稱為“重組表達載體”(或 簡稱“表達載體”)。總的來說,重組DNA技術中所用的表達載體通 常是質粒。在本文中,“質粒”和“載體”可以混用,因為質粒是最 常用的載體。然而,本發明也包括其它形式的表達載體,如病毒載體 (如復制缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒),它們同樣具有一 樣的功能。

本文所用的術語“重組宿主細胞”(或簡稱“宿主細胞”),是指 引入重組表達載體的細胞。應理解,這一術語包括的不僅是特指的受 試者細胞,而且包括其傳代細胞。由于突變或環境影響在隨后的傳代 中會發生某些修飾,這樣事實上其傳代細胞可能與親代細胞不一樣, 但仍屬于本文所用的“宿主細胞”范疇。

在下面的各個小部分中詳細描述本發明的不同方面。

I.結合人TNFα的人抗體

本發明提供了用抗TNFα抗體而治療失調的方法,這些方法包括 每兩周皮下施用一次分離的人抗體或抗體的抗原結合部分,其中抗體 或抗原結合部分可以與人TNFα以高親和力、低解離常數和高中和 能力結合。本發明的人抗體優選重組的、具有中和活性的人抗TNF α抗體。本發明最優選的重組中和抗體在本文稱為D2E7(D2E7?VL區 氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示,D2E7?VH區氨基酸序列如SEQ?ID NO:2所示)。D2E7抗體的性質在Salfeld等的美國專利No.6090382 中已經描述過,在本文中引入作為參考。

一方面,本發明涉及用抗TNFα抗體治療失調,治療包括每兩周 皮下施用一次分離的D2E7抗體或抗體部分、D2E7相關抗體和抗體 部分,或與D2E7抗體具有相當的特性的人抗體或抗體部分,所述特 性如可以與人TNFα以高的親和力結合并具有低的解離動力學和高 的中和能力。在某一方案中,本發明提供了用分離的人抗體或抗體的 抗原結合部分進行治療的方法,抗體以Kd為1×10-8M或更小,Koff速率常數為1×10-3/秒或更小從人TNFα上解離,這二者都由表面等 離子共振測定,而且用體外標準L929檢測方法檢測中和人TNFα細 胞毒性的IC50為1×10-7M或更小。進一步優選的分離人抗體或其抗 原結合部分的Koff為5×10-4/秒或更小,或進一步優選Koff為1×10-4/ 秒或更小。再優選的分離的人抗體或抗原結合部分,用體外標準的 L929檢測方法檢測其中和人TNFα細胞毒性的IC50為1×10-8M或更 小,再一步優選的IC50為1×10-9M或更小,再優選的IC50為1×10-10M 或更小。在某一優選的方案中,抗體為分離的重組人抗體或其抗原結 合部分。

本領域中眾所周知,抗體的重鏈和輕鏈的CDR3結構域在抗體與 抗原的結合特異性/親和性中起重要作用。因而本發明的另一方面涉 及施用抗TNFα抗體治療失調的方法,其中施用人抗體方法是皮下 施用,該抗體與hTNFα結合的解離動力學常數低,其重鏈和輕鏈 CDR3結構域在結構上與D2E7一致或相關。D2E7?VL?CDR3區的第 9位可以是丙氨酸或蘇氨酸,這基本上不影響其Koff值。相應地,D2E7 VL?CDR3區的共有基元包含Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A)(SEQ?ID?NO:3) 的氨基酸序列。另外D2E7?VH?CDR3區的第12位可以是酪氨酸或天 冬酰胺,這基本上不影響Koff值。相應地,D2E7?VH?CDR3區的共有 基元包含V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D-(Y/N)(SEQ?ID?NO:4)的氨基酸序 列。而且,如實施例2所證實的,D2E7抗體的輕和重鏈CDR3結構 域,用單個丙氨酸替代(在VL的CDR3區位置1,4,5,7或8或在 VH的CDR3區位置2,3,4,5,6,8,9,10或11替換),基本上 并不影響Koff。進而,本領域的技術人員將意識到:既然D2E7抗體 VH和VL?CDR3結構域的氨基酸可以用丙氨酸替代,那么在保留抗 體低解離常數的前提下,CDR3區內的其它氨基酸的替代也是可能 的,尤其是用保守的氨基酸替代。本文所用的“保守氨基酸替代”, 是指某一氨基酸殘基被另一個具有相似側鏈的氨基酸殘基所替代。本 領域的具有相似側鏈的氨基酸殘基家族已經確定,包括堿性側鏈(如, 賴氨酸,精氨酸和組氨酸),酸性側鏈(如天冬氨酸,谷氨酸),不帶電 荷極性側鏈(如甘氨酸,天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪 氨酸和半胱氨酸),非極性側鏈(如丙氨酸,纈氨酸、亮氨酸、異亮氨 酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和色氨酸)以及芳香族側鏈(如酪氨酸、 苯丙氨酸,色氨酸和組氨酸)。D2E7?VL和/或VH?CDR3區內的保守 替代優選不超過1~5個;D2E7?VL和/或VH?CDR3結構域內的保 守替代進一步優選不超過1~3個。另外,保守氨基酸的替代不應在 與hTNF?α結合的關鍵位置上,D2E7抗體VL的CDR3區的第2和5 位的氨基酸和VH的CDR3區的第1和7位的氨基酸似乎對抗體與 hTNFα的相互作用很重要,因此優選這些位置的保守氨基酸不被替 代(雖然在D2E7抗體VL?CDR3第5位氨基酸用丙氨酸替代也可以接 受,如上所述)(參見美國專利No.6090382)。

相應地,在另一實施方案中,本發明提供了治療失調的方法,其 通過每兩周皮下施用一次分離的人抗體或其的抗原結合部分而進行。 抗體或其抗原結合部分優選包含下列特征:

a)與人TNFα的解離常數Koff為1×10-3/秒或更小,由表面等離 子其振測定。

b)其輕鏈CDR3結構域包含SEQ?ID?NO:3的氨基酸序列,或用 丙氨酸在1,4,5,7或8替代SEQ?ID?NO:3的氨基酸序列后的修飾 序列或在1,3,4,6,7,8和/或9位置上進行1~5個保守氨基酸 替代修飾的序列。

c)重鏈CDR3結構域包含SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列,或用丙 氨酸在2,3,4,5,6,8,9,10或11替代SEQ?ID?NO:4的氨基酸 序列后的修飾序列或在2,3,4,5,6,8,9,10,11或12位置上 進行1~5個保守氨基酸替代修飾的序列。

更優選的抗體或抗體的抗原結合部分與人TNFα解離Koff值為5 ×10-4/秒或更小;進一步優選抗體或抗體的抗原結合部分與人TNFα 解離Koff值為1×10-4/秒或更小。

在另一個實施方案中,本發明提供了治療失調的方法,通過每兩 周皮下施用一次分離的人抗體或其的抗原結合部分而進行治療。抗體 或抗原結合部分,優選其輕鏈可變區(LCVR)CDR3結構域包含SEQ?ID NO:3的氨基酸序列,或用丙氨酸在1,4,5,7或8替代SEQ?ID?NO: 3的氨基酸序列后的修飾序列,優選其重鏈可變區(HCVR)CDR3結 構域包含SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列,或用丙氨酸在2,3,4,5, 6,8,9,10或11替代SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列修飾序列。優選 LCVR進一步包含一個CDR2區,該區包含SEQ?ID?NO:5的氨基酸 序列(即D2E7抗體的VL中的CDR2區)以及HCVR進一步包含CDR2 區,該區包含SEQ?ID?NO:6的氨基酸序列(即D2E7抗體的VH中的 CDR2區)。再進一步優選LCVR進一步包含一個CDR1區,該區包 含SEQ?ID?NO:7的氨基酸序列(即D2E7抗體的VL中的CDR1區)以 及HCVR進一步包含一個CDR1區,該區包含SEQ?ID?NO:8的氨基 酸序列(即D2E7抗體的VH中的CDR1區)。VL區的框架區優選來自 VκI人種系家族,更優選來自A20人抗體產生種系家族Vk基因, 最優選美國專利No.6090382中圖1A和1B中所示的D2E7的VL框 架區序列。VH區的框架區優選來自VH3人抗體產生細胞族,更優選 來自人抗體產生細胞DP31的VH基因,最優選美國專利No.6090382 中圖2A和2B中所示的D2E7的VH框架區序列。

本發明的再一個實施方案中提供了治療失調的方法,通過每兩周 皮下施用一次分離的人抗體或其的抗原結合部分而進行治療。抗體或 抗原結合部分,優選其輕鏈可變區(LCVR)包含SEQ?ID?NO:1的氨基 酸序列(即D2E7?VL),優選其重鏈可變區(HCVR)包含SEQ?ID?NO:2 的氨基酸序列(即D2E7?VH)。在某些實施方案中,抗體包含重鏈的恒 定區,如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA,IgE,IgM或IgD的恒定 區;重鏈恒定區優選IgG1或IgG4的重鏈恒定區,而且抗體包含輕 鏈恒定區,無論是κ鏈還是λ鏈的恒定區。優選地,抗體包含κ輕鏈 恒定區。另外,抗體部分可以是例如Fab片段或是單鏈Fv片段。

在另外的實施方案中,本發明提供了治療失調的方法,通過每兩 周皮下施用一次分離的人抗體或其的抗原結合部分而進行治療。抗體 或其抗原結合部分優選包含D2E7相關的VL和VH的CDR3結構域, 例如下列的抗體或抗原結合部分,其中輕鏈可變區(LCVR)具有CDR3 結構域,其包含的氨基酸序列選自SEQ?ID?NO:3,SEQ?ID?NO:11, SEQ?ID?NO:12,SEQ?ID?NO:13,SEQ?ID?NO:14,SEQ?ID?NO:15, SEQ?ID?NO:16,SEQ?ID?NO:17,SEQ?ID?NO:18,SEQ?ID?NO:19, SEQ?ID?NO:20,SEQ?ID?NO:21,SEQ?ID?NO:22,SEQ?ID?NO:23, SEQ?ID?NO:24,SEQ?ID?NO:25和SEQ?ID?NO:26,或重鏈可變區 (HCVR)具有CDR3結構域,其包含的氨基酸序列選自SEQ?ID?NO:4, SEQ?ID?NO:27,SEQ?ID?NO:28,SEQ?ID?NO:29,SEQ?ID?NO:30, SEQ?ID?NO:31,SEQ?ID?NO:32,SEQ?ID?NO:33,SEQ?ID?NO:34和 SEQ?ID?NO:35。

本發明的抗體或抗體部分可被衍化為或連接至另一個功能分子 (如另一個肽或蛋白)。相應地,被發明的抗體或抗體部分包含本文所 述的人抗hTNFα抗體的衍生物或其它修飾體,包括免疫粘附分子。 比如,本發明的抗體或抗體部分可以有效地結合(通過化學偶聯、基 因融合以及非共價連接等)到一個或多個其它的分子實體上,如另一 種抗體(如雙特異性抗體或diabody)、檢測試劑、細胞毒性試劑、藥 物和/或蛋白或肽上,其中蛋白或肽能夠介導抗體或抗體部分與另一 種分子(如鏈霉抗生物素核心區或多聚組氨酸標記)相連接。

通過交連兩種或兩種以上的抗體(相同或不同類型,如產生雙特 異性抗體)可獲得一種衍生抗體。適于交連的物質包括那些具有異質 雙官能,具有兩個不同的反應基團并被合適的間隔物分開的物質(如 m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide?ester)或同質雙官能基團(如 disuccinimidyl?suberate)。這些連接物可從Pierce?Chemical?Company, Rockford,IL公司獲得(p14-36)。

能夠與本發明抗體或抗體部分連接的可檢測試劑包括熒光化合 物。代表性的熒光檢測試劑包括熒光素、異硫氰熒光素,若丹明、5- 二甲胺-1-萘磺酰氯,藻紅蛋白等。抗體也可以與檢測性的酶生成衍 生物,如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、葡糖氧化酶等。當抗體與可 檢測性的酶生成衍生物時,可以通過添加另外一種酶能夠利用而產生 可檢測反應產物的試劑而進行檢測。比如,當存在辣根過氧化物酶檢 測試劑時,加入過氧化氫和聯苯胺就可產生可檢測的顏色反應。抗體 也可以和生物素生成衍生物,然后通過間接地檢測親和素或鏈親和素 來檢測。

II.抗體表達

本發明的抗體或抗體部分能夠通過在宿主細胞中重組表達免疫球 蛋白的輕鏈和重鏈而制備。為了表達重組抗體,用一個或多個攜帶編 碼免疫球蛋白抗體輕鏈和重鏈的DNA片段的表達載體轉染宿主細 胞,這樣在宿主細胞中就可以表達輕鏈和重鏈,優選的宿主細胞能夠 分泌表達物至培養細胞的培養基,從而可以回收培養基而制備抗體。 正如Sambrrok,Fritsch和Maniatis編著的分子克隆:實驗室操作手 冊,第二版,冷泉港,紐約(1989);Ausubel?F.M.等編著的分子生物 學操作程序,Greene出版社(1989)以及Boss等的美國專利No.4816397 中所描述的,標準的重組DNA技術可用于獲得抗體的輕鏈和重鏈基 因,然后將這些基因克隆入重組表達載體,介導這些載體進入宿主細 胞。

為了表達D2E7或D2E7相關的抗體,首先需要獲得編碼輕鏈和 重鏈的可變區DNA片段。這些DNA片段可以通過聚合酶鏈反應(PCR) 擴增和修飾抗體生產細胞的輕鏈和重鏈可變區而獲得。本領域中,擴 增人輕鏈和重鏈可變區基因的種系DNA序列是眾所周知的(參見 “Vbase”人germline序列數據庫;參見Kabat?EA等(1991)Sequences of?Proteins?of?Immunological?Interest第五版,US?Department?of?Health and?Human?Services,NIH?Publication?No.91-3242;Tomlinson?I.M.等 (1992)“the?Repertoire?of?Human?Germline?VH?Sequences?Reveals?about Fifty?Groups?of?VH?Segments?with?Different?Hypervariable?Loops”J.Mol. Biol.227:776-798;以及Cox.J.P.L.等(1994)“A?Directory?of?Human Germline?V78?Segments?Reveals?a?Strong?Bias?in?their?Usage”Eur.J. Immunol.24:827-836;這些文獻內容在本文中引入作為參考)。為了獲 得編碼D2E7或D2E7相關抗體重鏈的DNA片段,可用標準PCR方 法從人種系VH基因中VH3家族中的一員擴增。最優選擴增DP-31?VH 種系序列。為獲得編碼D2E7或D2E7相關抗體輕鏈的DNA片段, 可用標準PCR方法從人種系細胞VL基因中VκI家族中的一員擴增。 最優選擴增A20?VL種系基因。基于上述文獻所揭示的核酸序列,用 標準的方法設計擴增DP-31?VH和A20?VL序列的PCR引物。

一旦獲得了種系VH和VL片段,可以突變成本文所述的編碼D2E7 或D2E7相關的氨基酸序列。首先比較種系VH或VL?DNA編碼的氨 基酸序列和D2E7或D2E7相關VH和VL的氨基酸序列,找出與D2E7 或D2E7相關抗體序列不同的氨基酸,然后根據基因密碼子確定需突 變的核酸,適當的突變獲得的DNA序列而獲得突變的種系序列,該 序列編碼D2E7或D2E7相關抗體的氨基酸。種系序列突變由標準的 方法完成,如PCR介導的突變(其中突變的核酸置于PCR引物中, 這樣PCR產物就包含了突變)或定點突變。

一旦獲得了編碼D2E7或D2E7相關抗體的DNA片段(如上所述, 通過抗體生產細胞的VH和VL擴增和修飾獲得),可以進一步通過 標準重組DNA技術操作這些DNA片段,比如將可變區基因轉化為 全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在這些操作中,編碼 VL和VH的DNA片段可操作性連接至編碼另一種蛋白的DNA片段 上,如抗體的恒定區或一個柔性接頭上。在此意義上,“可操作性連 接”一詞,是指兩個DNA片段連接使得兩段DNA編碼的氨基酸序 列保持在框架中。

分離的編碼VH區的DNA可以轉化成全長的重鏈基因,方法是 可操作性地連接編碼VH的DNA至另一個編碼重鏈恒定區(CH1,CH2 和CH3)的DNA分子。人重鏈恒定區的序列在本領域是已知的(參見 Kabat?EA等(1991)Sequences?of?Proteins?of?Immunological?Interest第 五版,US?Department?of?Health?and?Human?Services,NIH?Publication?No. 91-3242),而且包含這些區域的DNA片段可以通過標準的PCR擴增 方法獲得。重鏈恒定區可以是IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA,IgE, IgM或IgD的恒定區,但最優選的是IgG1或IgG4的恒定區。對Fab 片段的重鏈基因,編碼VH的DNA可操作性的連接至另一僅編碼重 鏈CH1恒定區的DNA分子上。

分離的編碼VL區的DNA可以轉化成全長的輕鏈基因(和Fab輕 鏈基因),方法是可操作性的連接編碼VL?DNA至另一個編碼輕鏈恒 定區CL?DNA分子。人輕鏈恒定區序列在本領域是已知的(參見Kabat EA等(1991)Sequences?of?Proteins?of?Immunological?Interest第五版, US?Department?of?Health?and?Human?Services,NIH?Publication?No.91- 3242),而且包含這些區域的DNA片段可以通過標準的PCR擴增方 法獲得。輕鏈恒定區可以是κ鏈或λ鏈恒定區,但最優選的是κ鏈的 恒定區。

為構建scFv基因,可將編碼VH和VL的DNA片段可操作性連 接至編碼一柔性接頭的片段上,如編碼氨基酸序列(Gly4-Ser)3,這樣 VH和VL就可以表達成一條連續的單鏈蛋白,其中VL和VH區被 柔性接頭連接在一起(參見Bird等(1988)Science?242:423-426;Huston 等(1988)Proc?Natl?Acad?Sci?USA?85:5879-5883;McCafferty等 Nature(1990)348:552-554)。

為表達本發明的抗體或抗體部分,如上述獲得的編碼部分或全部 輕鏈和重鏈的DNA,可以插入表達載體,這樣基因就被可操作性的 連接至轉錄和翻譯調控基因。在本文中,“可操作性連接”表達的意 思是:抗體基因連接至載體后,載體中轉錄和翻譯調控基因就能夠如 同設計的功能一樣調節抗體基因的轉錄和翻譯,選擇的載體和表達調 控序列需與宿主細胞相容。抗體的輕鏈基因和重鏈基因可插入獨立的 載體,或更為普遍的是將兩段基因插入同一表達載體。抗體基因可用 標準方法插入表達載體(如連接抗體基因片段和載體上互補的酶切位 點,或如果沒有限制性酶切位點時用鈍端連接)。在D2E7或D2E7相 關的輕鏈和重鏈序列插入之前,表達載體可已經攜帶有抗體的恒定區 基因序列。比如,一種轉化D2E7或D2E7相關VH和VL序列為全 長抗體基因的方法是將它們分別插入至含編碼輕鏈和重鏈恒定區的表 達載體中,這樣VH片段就可操作性的連接至載體內CH片段上,而 VL片段就可操作性的連接至載體內CL片段上。另外的或可選擇性 的做法是:重組表達載體可編碼信號肽,這樣利于宿主細胞分泌抗體 鏈。抗體鏈基因可被克隆入載體,就使信號肽與抗體鏈基因連接并保 持了氨基酸讀碼框架不變。信號肽可以使免疫球蛋白的信號肽或異源 的信號肽(即源于非免疫球蛋白的蛋白信號肽)。

除抗體鏈基因外,本發明重組表達載體攜帶調控序列,能夠調節 抗體鏈在宿主細胞中的表達。“調控序列”包括啟動子、增強子和其 它表達控制元件(如多聚腺甘酸信號),這些序列控制抗體基因的轉錄 或翻譯。這些調控序列在許多文獻中有詳述,比如在Goeddel所著的 Gene?Expression?Technology:Methods?In?Enzymology?185,Academic Press,San?Diego,CA(1990)。本領域的技術人員可以理解:表達載體 的設計,包括調控序列的選擇,取決于如要轉化的宿主細胞、欲表達 的蛋白表達狀況等。優選的調控哺乳動物細胞表達的序列包括:能夠 指導蛋白在哺乳動物細胞中高水平表達的病毒元件,如源于巨細胞病 毒(如CMV的啟動子/增強子),猴病毒40(SV40)(如SV40啟動子/增 強子),腺病毒(如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))和多瘤病毒的啟動 子和/或增強子。關于病毒調控元件的詳盡描述以及序列,參見Stinski 的美國專利No.5168062,Bell的美國專利No.4510245以及Schaffner 等的美國專利No.4968615。

除抗體鏈基因和調控序列外,本發明的重組病毒載體可攜帶其它 的序列,如調控載體在宿主細胞中復制的序列(如復制起點)和選擇性 標記基因。選擇性標記基因利于將轉入載體的宿主細胞篩選出來(參 見Axel等的美國專利No.4399216、4634665和5179017)。比如,通 常的選擇性標記基因賦予轉入載體的細胞以藥物抗性,如抗G418、 潮霉素和氨甲蝶呤抗性。優選的選擇性標記基因包括二氫葉酸還原酶 (DHFR)基因(將氨甲蝶呤用于篩選和擴增培養dhfr-的宿主細胞)以及 neo基因(用于G418篩選)。

為了表達輕鏈和重鏈,用標準技術可將編碼輕鏈和重鏈的表達載 體轉染一種宿主細胞。術語“轉染”的不同形式包括通常用于將外源 DNA引入原核或真核宿主細胞的廣泛技術,如電穿孔、磷酸鈣沉淀、 DEAE-右旋糖苷轉染等。雖然理論上無論原核還是真核細胞都可能表 達本發明的抗體,但最優選的是真核細胞表達抗體,尤其優選哺乳動 物細胞表達,因為這類真核細胞尤其是哺乳動物細胞比原核細胞更傾 向于組裝和分泌出正確折疊的、有免疫學活性的抗體。有研究報告稱: 抗體基因的原核病毒不能有效制備高產的活性抗體(Boss?MA和 Wood?CR(1995)Immunology?Today?6:12-13)。

優選的表達本發明重組抗體的哺乳動物宿主細胞,包括中國倉鼠 卵巢細胞(CHO)(包括dhfr-CHO細胞,在Urlaub和Chasin(1980)Proc Natl?Acad?Sci?USA?77:4216-4220中有說明,用DHFR篩選標志,如 R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol?Bio?159:601-621),NS0骨髓瘤 細胞,COS細胞和SP2細胞。當編碼抗體基因的重組表達載體轉入 哺乳動物宿主細胞后,將其培養一段時間使抗體在宿主細胞中表達而 獲得抗體,最優選的是細胞將抗體分泌至培養細胞的培養基中。然后 用標準的蛋白純化方法從培養基中回收。

宿主細胞可用于生產完整抗體的部分,如Fab片段或scFv分子。 可以理解上述方法的任何變通都包括在本發明的范圍之內。比如,可 能需要用編碼本發明輕鏈或重鏈的DNA(但不是兩個)轉染一宿主細 胞。重組DNA技術也可用于去除部分或全部的編碼輕鏈和重鏈中對 結合TNFα不是必需的DNA。從這樣剪切后的DNA分子表達的分 子也包括在本發明抗體范疇。另外,通過標準的化學交連方法將本發 明的抗體與第二種抗體交連而生產出雙功能抗體,其中一條輕鏈和一 條重鏈是本發明的抗體,另一條輕鏈和另一條重鏈是特異性結合另一 種抗原而非hTNFα的抗體。

在優選的表達本發明抗體或抗原結合部分的重組表達系統中,編 碼抗體輕、重鏈的重組表達載體用磷酸鈣介導的轉染方法轉入dhfr- CHO細胞中,重組表達載體中抗體輕鏈和重鏈基因可操作性的連接 至CMV增強子/AdMLP啟動子等調控元件,以使基因的轉錄水平提 高。重組表達載體同時也攜帶DHFR基因,可以用氨甲蝶呤篩選/擴 增轉染了載體的宿主細胞。然后培養篩選出的宿主細胞,讓其表達抗 體的輕鏈和重鏈并從培養基中回收完整的抗體。標準的分子生物學技 術用于制備重組表達載體,轉染宿主細胞,篩選轉染細胞,培養宿主 細胞以及從培養基中回收抗體。

III.重組人抗體的選擇

除D2E7或其抗原結合部分或本文所述的D2E7相關抗體外的重 組人抗體,可以通過篩選重組聯合抗體文庫而分離,優選scFv噬菌 體展示文庫,該文庫是用源于人淋巴細胞mRNA制備的VL和VH cDNA構建的。本領域內,制備和篩選這類文庫的方法是已知的(如: the?Pharmacia?Recombinant?Phage?Antibody?System,catalog?no.27-9400- 01;以及the?Stratagene?SurfZAPTM?phage?display?kit,catalog?no. 240612)。從下列文獻中可以找出確實可行的制備和篩選抗體展示文 庫的方法和試劑的實例,如Ladner等的美國專利No.5223409;Kang 等的PCT出版物WO92/18619;Dower等的PCT出版物WO91/17271; Winter等的PCT出版物WO92/20791;Markland等的PCT出版物WO 92/15679;Breitling等的PCT出版物WO93/01288;MaCafferty等的 PCT出版物WO92/01047;Garrard等的PCT出版物WO92/09690; Fuchs等(1991)Bio/Technology?9:1370-1372;Hay等(1992)Hum?Antibod Hydridoma?3:81-85;Huse等(1989)Science?246:1275-1281;McCafferty 等Nature(1990)348:552-554;Griffiths等(1993)EMBO?J?12:725-734; Hawkins等(1992)J.Mol?Biol?226:889-896;Clackson等(1991)Nature 352:624-628;Gram等(1992)PNAS?89:3576-3580;Garrard等 (1991)Bio/Technology?9:1373-1377;Hoogenboom等(1991)Nuc?Acid Res?19:4133-4137;以及Barbas等(1991)PNAS?88:7978-7982。

在一優選實施方案中,為了分離具有高親和力以及低解離常數的 與hTNFα結合的人抗體,首先施用具有高親和力以及低解離常數的、 與hTNFα結合的鼠抗hTNFa抗體(如MAK195雜交瘤,其保藏號為 ECACC87050801)篩選具有相似結合hTNFα活性的人輕鏈和重鏈序 列,所用方法為Hoogenboom等的PCT出版物WO93/06213中所述 的表位印跡方法,該方法中所用文庫優選scFv文庫,文庫的制備與 篩選參見McCafferty等的PCT出版物WO92/01047,McCafferty等 Nature?348:552-554;以及Griffiths等(1993)EMBO?J?12:725-734。優 選用重組人TNFα作為抗原篩選scFv抗體文庫。

一旦篩選出人VH和VL片段,可以進行“混合和匹配”實驗, 即將選出的不同對的VL和VH片段用于篩選其與hTNFα的結合, 篩選出優化的VL/VH對。此外,為進一步提高親和力和/或降低從 hTNFα的解離常數,可對優選出的VL/VH對的VL和VH片段進行 隨機突變,優選在VH和/或VL區的CDR3區突變,其過程類似于 體內體細胞突變過程,該過程對應于天然免疫反應中抗體親和力的突 變。體外親和力突變可以用分別與VH?CDR3和/或VL?CDR3互補的 PCR引物來擴增VH和VL區而實現,其中在引物的某位置嵌入隨機 的四核甘酸,這樣獲得的編碼VH和VL的CDR3區的PCR產物中 就引入了隨機突變。這些隨機突變的VH和VL片段再用于hTNFα 結合的篩選,選出具有高親和力以及低解離常數的與hTNFα結合的 序列。

從重組的免疫球蛋白展示文庫中篩選、分離出本發明的抗hTNF α抗體后,從噬菌體包裝體(如,從噬菌體基因組)中回收編碼選出的 抗體核酸序列,然后亞克隆入其它的表達載體,方法為標準重組DNA 技術。如果愿意,可對該核酸可以進一步操作,以轉化成本發明的其 它的抗體形式(如與編碼免疫球蛋白的其它結構域的核酸連接,比如 恒定區)。為了表達從聯合文庫中篩選的重組人抗體,可將編碼抗體 的基因克隆入重組表達載體,然后轉入哺乳動物宿主細胞,這在上面 第二部分中已詳細論述過了。

IV.藥物組合物和藥物施用

本發明的抗體和抗體部分可以配伍至給受試者施用的藥物組合物 中,適合的方法為本文所述,如每兩周皮下定量施用。通常,藥物組 合物包含本發明的抗體(或抗體部分)和/或氨甲蝶呤以及藥學上接受的 載體。本文所用的“藥學上可接受的載體”包括任意和全部的溶劑、 分散介質、包衣、抗生素與抗真菌藥物、等滲和吸收緩釋藥物等,這 些物質是生理學上相容的、適用于本文所述的給受試者的用藥方法。 藥學上可接受的載體實例包括水、鹽水、磷酸鹽緩沖液、葡萄糖、甘 油、乙醇等的一種或多種,以及這些物質聯用。多數情況下,組合物 中優選施用的物質包括等滲試劑,如糖、多元醇諸如甘露醇、山梨醇 或氯化鈉。藥學上可接受的載體實例可能進一步包含少量的附加物 質,如增濕或乳化試劑、保護劑或緩沖液,這些物質可以提高抗體或 抗體部分的保存限期或有效性。

本發明的組合物可以多種形式出現,包括比如液體、半固體和固 體劑型,如液體溶液(注射和輸注溶液),分散劑或懸液,片劑,丸劑, 粉劑,脂質體以及栓劑。優選的形式因施用組合物的預想模式而定。 優選的組合物是注射和輸注溶液形式,如類似于用其他抗體被動免疫 人時所用的組合物。用藥的優選方式是胃腸外方式(如靜脈注射,皮 下注射、腹膜注射、肌肉注射)。優選實施方案中,通過靜脈注射和 輸注方式施用抗體。在另一優選實施方案中,通過肌肉注射方式施用 抗體。在特別優選實施方案中,通過皮下注射方式施用抗體(如每兩 周皮下注射方式用藥一次)。

治療組合物在制造和存儲時,通常必須是無菌而且穩定的。這些 組合物可以配制成溶液、微乳化劑、分散劑、脂質體或其它適于高濃 度施用的預定結構。無菌注射溶液可通過將活性化合物(抗體或抗體 部分)以所需的濃度在合適的溶劑中溶解后,與需要的其它聯用組分 的一種或多種配伍,然后過濾除菌。通常,分散藥劑是通過將活性組 分與無菌的載體配伍后制備,載體包含基本的分散基質和其它所需的 乳化組分。制備無菌注射溶液用的無菌粉末時,優選的制備方法是真 空干燥和冷凍干燥,以獲得含有活性的組分以及前述的過濾的添加組 分。溶液適當的流動性可以通過使用,如卵磷脂等的包衣,或使用分 散劑維持所需的顆粒大小或通過使用表面活性劑等維持。延緩注射組 分的吸收可以通過在組分中添加延緩吸收的制劑,比如單硬脂酸鹽和 凝膠。

盡管對于多數治療應用而言,優選的途徑/模式是皮下注射,但 本發明抗體和抗體部分的許多施用方法在本領域內都是已知的。如本 領域內技術人員理解的一樣,用藥途徑和/或模式取決于想要的結果。 在某些實施方案中,活性組分與載體制備在一起,載體將阻止化合物 的快速釋放,包括比如植入、皮膚貼劑以及微膠囊用藥等可控釋放制 劑。生物降解性的、生物兼容性的多聚體,如乙烯乙酸乙烯酯,聚乙 二醇(PEG),聚酐,聚羥乙酸,膠原,polyorthoesters和聚乳酸等都可 使用。許多制備這些制劑的方法已經申請專利或對本領域的技術人員 而言是已知的。參見Sustained?and?controlled?release?drug?delivery systems,J.R.Robinson編著,Marcel?Dekker,Inc.,New?York,1978。

在某些實施方案中,本發明抗體或抗體部分可以口服,如與無活 性的稀釋液或可同化、消化的載體一起。化合物(和其它需要的組分) 也可以包在硬或軟的膠囊殼中,壓縮在片劑中或配伍至受試者飲食 中。為了口服治療,化合物可以摻入賦形劑,而且以可消化的片劑、 咀嚼片、片劑、膠囊、藥液、懸浮液、糖漿、薄膜等方式施用。為了 在消化道應用,可以用其它物質包裹本發明的化合物或共用施用,以 免其失活。

附加的活性化合物也可以配制進該組合物中。在某些實施方案 中,本發明的抗體或抗體部分與一種或多種附加治療藥物配伍或共同 施用。比如,本發明的抗體或抗體部分可以與氨甲蝶呤配伍或共同施 用,可以與一種或多種結合其它抗原的抗體(如,與細胞因子或細胞 表面分子結合的抗體),一種或多種細胞因子,可溶性TNFα受體(參 見PCT出版物WO93/06476)和/或一種或多種抑制hTNFα產生或其 活性的化學物質(如PCT出版物WO93/197501?cyclohexaneylidene的 衍生物)。再者,本發明的一種或多種抗體可以與前述的兩種或兩種 以上的治療劑施用。這類聯合治療便于施用小劑量的治療劑,因而避 免了可能的毒性或與不同的單治療劑施用帶來的相關問題。本發明抗 體或抗體部分與其它治療藥物的聯用將在第IV部分中進一步詳細討 論。

可以與本發明抗體或抗體部分聯用的、治療類風濕性關節炎的藥 物非限制性實例包括:非類固醇抗炎性藥物(NSAIDs);細胞因子抑 制性抗炎性藥物(CSAIDs);CDP-571/BAY-10-3356(人源化的抗TNF α抗體;Celltech/Bayer);cA2(嵌合抗TNFα抗體;Centocor); 75kdTNFR-IgG(75kd的TNF受體-IgG融合蛋白;Immunex;參見 Arthritis?&?Rheumatism(1994)Vol.37,S295;J.Invest. Med.(1996)vol.44,235A);55kdTNFR-IgG(55kd的TNF受體-IgG融合 蛋白;Hoffmann-LaRoche);IDEC-CE9.1/SB210396(非消耗性靈長化抗 CD4抗體;IDEC/SmithKline;參見Arthritis?&?Rheumatism(1995)Vol. 38,S185);DAB486-IL-2和/或DAB389-IL-2(IL2融合蛋白;Seragen; 參見Arthritis?&?Rheumatism(1993)Vol.36,1223);Anti-tac(人源化抗 IL-2Rα;Protein?Design?Labs/Roche);IL-4(抗炎性因子; DNAX/Schering);IL-10(SCH52000;重組IL10,抗炎性因子; DNAX/Schering);IL-4;IL-10和/或IL-4激動劑(如激動抗體);IL- 1RA(IL-1受體拮抗劑;Synergen/Amgen);TNF-bp/s-TNFR(可溶性TNF 結合蛋白;參見Arthritis?&?Rheumatism(1996)vol.39,No.9(supplement), S284;Amer.J.Physiol.-Heart?and?Circulatory?Physiology(1995)vol?268, pp?37-42;R974301(IV型磷酸二酯酶抑制劑;參見Arthritis?& Rheumatism(1996)vol.39,No.9(supplement),S282);MK-966(COX- 2抑制劑;參見Arthritis?&?Rheumatism(1996)vol?39, No.9(supplement),S81);Iloprost(參見Arthritis?&?Rheumatism(1996) vol39,No.9(supplement),S82);氨甲蝶呤;酞胺哌啶酮(參見Arthritis &?Rheumatism(1996)vol.39,No.9(supplement),S282)和酞胺哌啶酮 相關藥物(例如Celgen);leflunomide(抗炎性和細胞因子抑制劑;參見 Arthritis?&?Rheumatism(1996)vol.39,No.9(supplement),S131; Inflammation?Research(1996)vol.45,pp.103-107);氨甲環酸(纖溶酶原 激活抑制劑,參見Arthritis?&?Rheumatism(1996)vol.39, No.9(supplement),S284);T-614(細胞因子抑制劑;參見Arthritis?& Rheumatism(1996)vol.39,No.9(supplement),S282);前列腺素E1(參 見Arthritis?&?Rheumatism(1996)vol.39,No.9(supplement),S282); Tenidap(非類固醇類抗炎藥,參見Arthritis?&?Rheumatism(1996)vol. 39,No.9(supplement),S280);Naproxen(非類固醇類抗炎藥;參見Neuro Report(1996)vol.7,pp.1209-1213);美洛昔康(非類固醇類抗炎藥);布 洛芬(非類固醇類抗炎藥);吡羅昔康(非類固醇類抗炎藥);二氯芬酸(非 類固醇類抗炎藥);indomethacin(非類固醇類抗炎藥);水楊酸偶氮磺 胺吡啶(參見Arthritis?&?Rheumatism(1996)vol.39,No.9(supplement), S281);硫唑嘌呤(參見Arthritis?&?Rheumatism(1996)vol.39, No.9(supplement),S281);ICE抑制劑(白介素1β轉化酶抑制劑);zap-70 和/或1ck抑制劑(酪氨酸激酶zap-70或1ck抑制劑);VEGF抑制劑和/ 或VEGF-R抑制劑(血管內皮細胞生長因子抑制劑或血管內皮細胞生 長因子受體;血管生成抑制劑);類皮質酮抗炎性藥物(例如SB203580); TNF蛋白轉化酶抑制劑;抗白介素2抗體;白介素11(參見Arthritis?& Rheumatism(1996)vol.39,No.9(supplement),S296);白介素13(參見 Arthritis?&?Rheumatism(1996)vol.39,No.9(supplement),S308);白 介素17(參見Arthritis?&?Rheumatism(1996)vol.39,No.9(supplement), S120);gold;青霉胺;氯奎;羥氯喹;苯丁酸氮芥;環磷酰胺;環 孢霉素;全身淋巴放射治療藥物;抗胸腺細胞球蛋白;抗CD4抗體; CD5-毒素;口服肽和膠原蛋白;氯苯扎利二鈉;細胞因子調控藥物 (CRAs)HP228和HP466(Houghten?Pharmaceuticals公司);ICAM-1二 硫代磷酸酯的反義寡聚脫氧核酸(ISIS2302;Isis醫藥公司);可溶性補 體受體1(TP10;T細胞科學公司);潑尼松;奧古蛋白;硫酸葡糖胺聚 糖;美滿霉素;抗白介素2受體抗體;海產品和植物脂類(魚和植物 種子脂肪酸;參見Deluca等(1995)Rheum.Dis.Clin.North?Am.21: 759-777);金諾芬;保泰松;甲氯芬那酸;氟奮那酸;靜脈用免疫球 蛋白;齊留通;麥考酚酸(RS-61443);tacrolimus(FK-56);西羅莫司(雷 怕霉素);氨普立糖(therafectin);克拉屈濱(2-氯脫氧腺苷)和阿扎立平。

可以與本發明抗體或抗體部分聯用的、治療炎性腸道疾病的藥物 的非限制性實例包括:budenoside;表皮生長因子;類皮質酮;環孢 菌素,水楊酸偶氮磺胺吡啶;氨基水楊酸鹽;巰基嘌呤;硫唑嘌呤; metronidazole;脂加氧酶抑制劑;氨基水揚酸;奧沙拉秦;巴柳氮; 抗氧化劑;血栓素抑制劑;白介素1受體拮抗劑;抗白介素1β單抗; 抗白介素6單抗;生長因子;彈性蛋白酶抑制劑;吡啶-咪唑化合物; CDP-571/BAY-10-3356(人源化的抗TNFα抗體;Celltech/Bayer); cA2(嵌合抗TNFα抗體;Centocor);75kdTNFR-IgG(75kd的TNF受 體-IgG融合蛋白;Immunex;參見Arthritis?&?Rheumatism(1994)Vol.37, S295;J.Invest.Med.(1996)vol.44?235A);55kdTNFR-IgG(55kd的TNF 受體-IgG融合蛋白;Hoffmann-LaRoche);IL-10(SCH52000;Schering Plough);IL-4;IL-10和/或IL-4激動劑(如激動抗體);白介素11;葡 糖苷酸或葡聚糖連接的潑尼松龍,地塞米松或布德松前藥;ICAM-1 二硫代磷酸酯的反義寡聚脫氧核酸(ISIS2302;Isis醫藥公司);可溶性 補體受體1(TP10;T細胞科學公司);緩釋氨基水楊酸;氨甲蝶呤;血 小板活化因子(PAF)拮抗劑;環丙沙星和利諾卡因。

可以與本發明抗體或抗體部分聯用的、治療多發性硬化病的藥物 的非限制性實例包括:類皮質酮;脫氫皮質醇;甲基脫氫皮質醇;咪 唑硫嘌呤;環磷酰胺;環孢菌素;氨甲蝶呤,4-氨基吡啶;替托尼定; 干擾素-β1a(AvonexTM;Biogen);干擾素β1b(BetaseronTM; Chiron/Berlex);共聚物1(Cop-1;CopaxoneTM;Teva?Pharmaceutical Industries,Inc.);高壓氧法;靜脈用免疫球蛋白;clabribine;CDP- 571/BAY-10-3356(人源化的抗TNFα抗體;Celltech/Bayer);cA2(嵌 合抗TNFα抗體;Centocor);75kdTNFR-IgG(75kd的TNF受體-IgG 融合蛋白;Immunex;參見Arthritis?&?Rheumatism(1994)Vol.37,S295; J.Invest.Med.(1996)vol?44?235A);55kdTNFR-IgG(55kd的TNF受體- IgG融合蛋白;Hoffmann-LaRoche);IL-10;IL-4;IL-10和/或IL-4激 動劑(如激動抗體)。

可以與本發明抗體或抗體部分聯用的、治療敗血病的藥物的非限 制性實例包括:高滲鹽溶液;抗生素;靜脈用γ免疫球蛋白;連續血 液濾過;κ青霉烯(如米諾配能);如TNFα、IL-1β、IL6和/或IL8 細胞因子的拮抗劑;CDP-571/BAY-10-3356(人源化的抗TNFα抗體; Celltech/Bayer);cA2(嵌合抗TNFα抗體;Centocor);75kdTNFR- IgG(75kd的TNF受體-IgG融合蛋白;Immunex;參見Arthritis?& Rheumatism(1994)Vol.37,S295;J.Invest.Med.(1996)vol.44,235A); 55kdTNFR-IgG(55kd的TNF受體-IgG融合蛋白;Hoffmann-LaRoche); 細胞因子調控藥物(CRAs)HP228和HP466(Houghten?Pharmaceuticals 公司);SK?&?F107647(小分子肽;SmithKline?Beecham);四價丙咪腙 CNI-1493(Picower?Institute);組織因子途徑抑制劑(TFPI;Chiron); PHP(化學修飾的血色素;APEX?Bioscience);鐵鰲合劑和鰲合物,包 括二乙撐三胺五乙酸-鐵(III)復合物(DTPA鐵(III);Molichem Medicines);利索茶堿(合成的小分子甲基黃嘌呤;Cell?Therapeutics 公司);PGG-葡聚糖(水溶性的β1,3葡聚糖;Alpha-Beta技術公司); 載脂的載脂蛋白A-1;手性異羥肟酸(合成的能夠抑制脂質A生物合 成的抗菌素);抗內毒素抗體;E5531(合成的脂質A拮抗劑;Eisai America公司);rBPI21(重組的人殺菌/滲透性增強蛋白的N末端片段); 以及合成的抗內毒素肽(SAEP;BiosYnth研究實驗室)。

可以與本發明抗體或抗體部分聯用的、治療成人呼吸窘迫綜合征 的藥物的非限制性實例包括:抗IL-8抗體;表面活性劑替代療法; CDP-571/BAY-10-3356(人源化的抗TNFα抗體;Celltech/Bayer); cA2(嵌合抗TNFα抗體;Centocor);75kdTNFR-IgG(75kd的TNF受 體-IgG融合蛋白;Immunex;參見Arthritis?&?Rheumatism(1994)Vol.37, S295;J.Invest.Med.(1996)vol.44?235A);55kdTNFR-IgG(55kd的TNF 受體-IgG融合蛋白;Hoffmann-LaRoche)。

本發明藥物組合物包含“治療有效量”或“預防有效量”的本發 明抗體或抗體部分。“治療有效量”是指在一定劑量和必需的一段時 間下,有效地達到預期的治療效果的量。抗體或抗體部分的治療有效 總量可根據如疾病狀態、年齡、性別或個體體重以及抗體或抗體部分 在每個個體內誘導預期反應的能力等因素而不同。治療有效量同時也 是一種抗體或抗體部分治療效果要大于其帶來的任何毒性或有害性的 劑量。“預防有效量”是指在一定劑量和必需的一段時間下,有效地 達到預期的預防效果的量。通常,由于預防用藥是預先或在發病的早 期給受試者用藥,所以預防有效量低于治療有效量。

用藥方案可以調整以達到最佳效果(如治療或預防效果)。比如, 一次大劑量用藥、一段時間內分幾次用藥或根據治療情形的緊迫程度 按比例減少或增加劑量。以劑量單位形式配制的胃腸外組合物施用方 便、劑量統一,這是其最大的優點。本文所用的劑量單位形式是指: 不連續劑量,且該劑量是適于給哺乳動物受試者治療用的單個劑量單 位;每個單位含有預定量的活性化合物,與所需的藥學載體一起,預 計可以產生預期的治療效果。本發明的劑量單位方式直接由下列因素 確定和決定:(a)活性化合物的特性,要達到的確切的治療或預防效 果;(b)化合物領域的內在限制,如一種活性化合物對每個個體治療 的敏感性。

例如,本發明抗體或抗體部分的治療或預防有效量的非限制性范 圍是10~100毫克,較優選的是20~80毫克,最優選的約40毫克。 應當注意劑量值可隨要緩解的病情類型以及嚴重程度變化而變化。對 于確切的個體,在一段時間內按照個體需要以及施用藥物的人或監督 用藥人的專業判斷,用藥方案應當調整,這都是應當能夠理解的,本 文提供的劑量范圍僅是實例性的,并不是對所保護組合物的范圍或應 用的限制。

V.本發明抗體的應用

本發明抗hTNFα抗體或其部分,具有結合hTNFα的活性,因此 用常規的免疫學檢測方法可檢測hTNFα(如血清或血漿等生物樣本中 的),所述免疫學檢測方法如酶聯免疫吸附檢測法(ELISA)、放免檢測 (RIA)或免疫組織化學檢測。本發明提供了檢測生物樣本中hTNFα的 方法,這些方法包括檢測與抗體或抗體部分作用的生物樣本和檢測與 hTNFα結合的或不結合的抗體或抗體部分,進而檢測生物樣品中的 hTNFα。抗體可以用可檢測的底物直接或間接標記,利于檢測結合 或未結合的抗體。可用的可檢測底物包括各種酶、互補基團、熒光物 質、發光物質和放射性物質。適用的酶的實例包括辣根過氧化物酶、 堿性磷酸酶、β半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶;適用的互補基團實例包 括鏈親和素/生物素和親和素/生物素;適用的熒光物質實例包括傘形 酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪氨熒光素、丹磺酰 氯或藻紅蛋白;發光物質的一個實例包括魯米諾;適用的放射性物質 包括125I、131I、35S或3H。

除標記抗體外,生物體液中的hTNFα可以用競爭性免疫檢測法 檢測,該方法使用標記了可檢測物質的重組人TNFα作為標準和未 標記的抗TNFα抗體。在該檢測中,生物樣品、標記的rhTNFα標 準品和抗TNFα抗體結合聯用,測定結合至未標記抗體的、標記的 rhTNFα的量,生物樣品中的hTNFα的量與結合在抗TNFα抗體上 的標記的TNFα的量呈反比。

本發明的D2E7抗體也可以用于檢測來源于非人的其它種的TNF α,尤其是來源于靈長類(如黑猩猩,狒狒,絨,獼猴和恒河猴)以及 豬和鼠的TNFα,因為D2E7能夠與這些TNFα結合。

本發明的抗體和抗體部分能夠在體內外中和hTNFα的活性(參見 美國專利No.6090382)。而且至少本發明的某些抗體,如D2E7抗體, 能夠中和其它物種的hTNFα。因此,本發明的抗體或抗體部分可用 于抑制hTNFα活性,如在含hTNFα的細胞培養物、以及具有與本 發明抗體交叉反應的TNFα的人或其它哺乳動物(如黑猩猩,狒狒, 絨,獼猴和恒河猴以及豬和鼠)中。在一個實施方案中,本發明提供 了抑制TNFα活性的方法,該方法包含施用本發明的抗體或抗體部 分與TNFα作用,從而抑制TNFα活性。優選的TNFα是人TNFα。 例如,在含有或懷疑含有TNFα的細胞培養物中,可將本發明的抗 體或抗體部分加入培養液中以抑制其中hTNFα活性。

在優選的實施方案中,本發明提供了治療失調的方法,其中施用 抗TNFα抗體是有益的,所述方法包括每兩周給受試者皮下施用一 次本發明的抗體或抗體部分,來治療疾病。在特別優選的實施方案中, 抗體的施用是按每兩周皮下施用一次抗體。在另一個特別優選的實施 方案中,施用氨甲蝶呤前,施用過程中和施用后,皮下施用抗體。優 選的受試者是人。此外,受試者可以是表達與本發明的抗體交叉反應 的TNFα的哺乳動物。受試者也可以是引入hTNFα的哺乳動物(如 施用hTNFα或表達hTNFα轉基因的動物)。本發明的抗體為治療目 的而給人受試者施用(下面進一步討論)。本發明的抗體也可為醫治動 物目的而給表達TNFα的非人哺乳動物(如靈長類、豬或鼠)施用,該 動物表達的TNFα與所用抗體有交叉反應,或作為人類疾病的一種 動物模型而施用。對于后者,這種動物模型對于評價本發明抗體的療 效是有用的(如測試施用劑量和時間)。

本文所用的術語“一種失調,其中施用抗TNFα抗體是有益的” 包括下列疾病或其它失調,即該病患者體內的TNFα的存在是或懷 疑是該病病理學的發病原因或對該病惡化起作用,或者已有證據表明 另一種抗TNFα抗體或其抗體部分成功用于治療該疾病。因此,由 于TNFα活性有害致病的一種疾病,是一種可通過抑制TNFα活性 預期能夠緩解該病癥狀和/或進程的疾病。這類疾病可被證明,如, 患這種疾病的患者個體的生物體液中的TNFα濃度增高(如患者的血 清、血漿、滑液等的TNFα濃度升高),這一特點可以用如上所述的 抗TNFα抗體檢測。不少疾病中TNFα活性有害。下面將進一步討 論治療特定疾病中的抗體或抗體部分的施用:

A.敗血癥

腫瘤壞死因子在敗血癥的病理學中的作用和生物學效應已經確 定,這些生物學效應包含血壓過低,心肌抑制,血管泄漏綜合癥,器 官壞死,刺激有害的第二介質的釋放和激活凝血過程(參見Tracey和 Cerami等(1994)Annu?Rev?Med?45:491-503;Russell,D.和Thompson R.C.等(1993)Curr.Opin.Biotech.4:714-721)。因此,本發明人抗體 或抗體部分可用于治療任何臨床發病的敗血癥,包括感染性休克、內 毒素性休克、革蘭氏陰性膿毒癥和中毒性休克綜合征。

此外,為了治療敗血癥,本發明的抗TNFα抗體或抗體部分可以 與一種或多種其它可進一步緩解敗血癥的治療藥物聯用,這些藥物如 白介素1抑制劑(如PCT出版物WO92/16221和WO92/17583),細胞 因子白介素6(參見PCT出版物WO93/11793)或血小板活化因子的拮 抗劑(參見歐洲專利申請出版物EP374510)。

另外,在優選的實施方案中,給患敗血癥的個體施用本發明的抗 TNFα抗體或抗體部分時,其血清或血漿IL6濃度達到500pg/ml以 上,較優選的為1000pg/ml。

B.自身免疫性疾病

腫瘤壞死因子在各種自身免疫性疾病的病理學中起一定的作用。 比如,TNFα參與了組織炎癥的激活和類風濕性關節炎中關節的破壞 (參見Tracey和Cerami,見上;Arend?W.P.和Dayer?J-M(1995)Arth Rheum.38:151-160;Fava?R.A.等(1993)Clin?Exp?Immunol,94:261 -266)。TNFα也參與了糖尿病患者體內胰島細胞死亡的啟動以及調 控胰島素抗性(參見上述Tracey和Cerami;PCT出版物WO94/08609)。 TNFα也參與了多發性硬化癥患者體內,對少突膠質細胞細胞毒性的 介導和誘導炎癥斑塊(參見上述Tracey和Cerami)。嵌合抗體和人源 化鼠抗hTNFα抗體已經通過了臨床上治療類風濕性關節炎的實驗(參 見Elliott?M.J.等(1994)Lancet?344:1125-1127;Elliott?M.J.等(1994) Lancet?344:1105-1110;Rankin?E.C.等(1995)Br.J.Rheumatol.34: 334-342)。

本發明的人抗體或抗體部分可用于治療自身免疫性疾病,尤其是 那些與炎癥有關的疾病,包括類風濕性關節炎,類類風濕性脊椎炎, 骨關節炎,痛風性關節炎,多發性硬化癥,自免性糖尿病,自免性色 素層炎和腎病綜合征。雖然對某種疾病,在炎癥部位局部施用抗體或 抗體部分(在類風濕性關節炎患者關節部位局部用藥或給糖尿病性潰 瘍局部涂藥,單獨或與環己烷亞基衍生物聯用,如PCT出版物 WO93/19751所述)是有效的,但通常為系統用藥。

C.傳染病

在多種傳染病觀察到:腫瘤壞死因子參與了介導的生物學效應。 比如,TNFα與瘧疾中腦部炎癥和毛細血管血栓以及梗塞有關(參見 上述Tracey和Cerami);TNFα也與腦膜炎中腦部炎癥有關,包括血 腦屏障障礙,觸發感染性休克以及激活靜脈栓塞(參見上述Tracey和 Cerami);TNFα也與獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)中的惡疾、激活 病毒復制以及介導中樞神經系統損傷有關(參見上述Tracey和 Cerami);因此,本發明的抗體或抗體部分可用于治療的傳染病,包 括細菌性腦膜炎(參見歐洲專利申請出版物EP585705),腦型瘧,艾 滋病和艾滋病相關復征(ARC)(參見歐洲專利申請出版物EP230574), 以及移植后的巨細胞病毒感染(參見Fietze?E等(1994)Transplanation 58:675-80)。本發明的抗體或抗體部分也可用于緩解與傳染病相關的 癥狀,包括感染(如流感)所致的發熱和肌痛以及感染后的惡疾(AIDS 或ARC后繼發的)

D.移植

腫瘤壞死因子是同種移植排斥和移植物抗宿主疾病(GVHD)的關 鍵因素,并且介導一種有害反應,這種反應在施用直接與T細胞受 體CD3結合的大鼠抗體OKT3可抑制腎移植排斥反應中觀察到(參見 上述Tracey和Cerami;Eason,J.D.等(1995)Transplanation?59:300- 305;Suthanthiran?M.和Strom?T.B.(1994)New?Engl.J.Med.331:365- 75)。因此,本發明的抗體或抗體部分可用于抑制移植排斥,包括同 種異體移植排斥和異種移植排斥以及抑制GVHD。雖然本發明的抗 體或抗體部分可以單獨施用,但優選與一種或多種能夠抑制同種異體 移植排斥或抑制GVHD的藥物聯用。比如,在某一實施方案中,本 發明的抗體或抗體部分可以與OKT3聯用,抑制OKT3誘導的反應。 在另一個實施方案中,本發明的抗體或抗體部分與一種或多種抗體聯 用,其中聯用的抗體直接與其它調節免疫反應的靶標結合,比如細胞 表面分子CD25(白介素2受體-α),CD11a(LFA-1),CD54(ICAM-1), CD4,CD45,CD28/CTLA4,CD80(B7-1)和/或CD86(B7-2)。在另一 個實施方案中,本發明的抗體或抗體部分與一種或多種通用的免疫抑 制劑如環磷酰胺A或FK506聯用。

E.惡性腫瘤

腫瘤壞死因子與惡性腫瘤所致的惡疾、刺激腫瘤生長、增強腫瘤 轉移可能性以及介導的惡性腫瘤細胞毒性有關(參見上述Tracey和 Cerami)。因此,本發明的抗體或抗體部分可用于惡性腫瘤治療,抑 制腫瘤生長或轉移和/或緩解腫瘤后的惡疾。本發明的抗體或抗體部 分可以系統施用或在腫瘤部位局部用藥。

F.肺病

腫瘤壞死因子與成人呼吸窘迫綜合征的病理學有關,包括白細胞 -內皮細胞活化,導致對肺細胞的細胞毒性以及誘導血管泄漏綜合癥 (參見上述Tracey和Cerami)。因而,本發明的抗體或抗體部分可用 于治療不同的肺病,包括成人呼吸窘迫綜合征(參見PCT出版物 WO91/04054),肺休克,慢性肺炎,肺部肉狀瘤病,肺纖維化和硅肺 病。抗體或抗體部分可以系統施用和在肺部表面局部施用,如作為氣 溶劑施用。

G.腸道疾病

腫瘤壞死因子與炎性腸道疾病的病理學有關(參見Tracy,K.J.等 (1986)Science?234:470-474;Sun?X-M等(1998)J.Clin.Invest.81: 1328-1331;MacDonald?T.T.等(1990)Clin.Exp.Immunol.81:301-305)。 嵌合的鼠抗TNFα抗體已經通過治療局限性腸炎臨床實驗(van Dullemen?H.M.等(1995)Gastroenterology?109:129-135)。本發明的人 抗TNFα抗體或抗體部分也可用于治療腸道疾病,如特發性腸道炎 癥,包括局限性腸炎和潰瘍性結腸炎。

H.心臟疾病

本發明的抗體或抗體部分也可以用于治療各種心臟病,包括心臟 缺血(參見歐洲專利申請出版物EP453898)和心衰(心肌衰弱)(參見PCT 出版物WO94/20139)。

I.其它疾病

本發明的抗體或抗體部分也可用于治療其它的疾病,這些疾病中 TNFα的活性有害。這些疾病和失調的與TNFα參與了疾病的病理學 有關,因此可以應用本發明的抗體或抗體部分治療,其實例包括炎性 骨失調和骨吸收障礙(參見Bertolini?D.R.等(1986)Nature?319:516- 518;Konig?A.等(1998)J.Bone?Miner.Res.3:621-627;Lerner,U.H. 和Ohlin?A(1993)J.Bone?Miner.Res.8:147-155;和Shanker?G.和Stern, P.H.(1993)Bone?14:871-876),肝炎,包括酒精性肝炎(參見McClain?C.J. 和Cohen?D.A.(1989)Hepatology?9:349-351;Felver?M.E.等 (1990)Alcohol.Clin.Exp.Res.14:255-259;和Hansen?J.等,Hepatology 20:461-474)和病毒性肝炎(參見Sheron,N.等(1991)J.Hepatol.12: 241-245;和Hussain?M.J.等(1994)J.Clin.Pathol.47:1112-1115), 凝血障礙(參見van?der?Poll,T.等(1990)N.Engl.J.Med.322:1622- 1627;和van?der?Poll,T.等(1991)Prog.Clin.Biol.Res.367:55-60),燒 傷(參見Giroir,B.P.等(1994)Am.J.Physiol.267:H118-124;和Liu?X.S. 等(1994)Burns?20:40-44),再輸注損傷(參見Scales,W.E.等(1994)Am. J.Physiol.267:G1122-1127;Serrick,C.等(1994)Transplanation?58: 1158-1162;和Yao?Y.M.等(1995)Resuscitation?29:157-168),瘢痕瘤 形成(參見McCauley?R.L等(1992)J?Clin?Immunol?12:300-308),瘢痕組 織形成和發熱。

本發明將通過下面的實施例進一步闡明,但這些實施例不應當解 釋為一種限制。本發明中所引用的參考文獻、專利以及公開的專利申 請的內容,在本文中引入作為參考。

實施例1用抗TNFα抗體治療

皮下施用D2E7后的效力

本研究中,24例患活動類風濕性關節炎每周施用一次施用D2E7 抗體(n=18)或安慰劑(n=6),劑量為0.5毫克/公斤,途徑為皮下注射, 時間達3個月。參與本研究的患者平均患病10.1年,在治療前疾病 活動分值(DAS)為4.87和平均3.4?DMARDs(disease?modifying?anti- rheumatic?drugs);這又相當大的程度上反映了疾病的活動度。用D2E7 抗體治療有反應的患者,繼續公開標記(open-label)的治療;而對0.5 毫克/公斤劑量沒有反應或失去了DAS反應患者,在本研究進行12 周后提高至1毫克/公斤,途徑仍是皮下注射。

第一位參加的患者接受60次注射,并持續60周的研究。皮下注 射劑量效率與靜脈注射相似。在治療的第一周內,高達78%的患者 達到DAS和ACR20反應。以0.5毫克/毫升劑量皮下施用D2E7?12 周,與基線相比,有54%的關節腫脹(SWJ)減輕,關節壓痛(CRP)61 %減輕,CRP減輕39%,而所有的指標與安慰劑組相比都升高。完 成本研究的安慰劑對照期后,患者持續用維持效力的抗體治療長達14 個月。因此這些結果表明:皮下施用D2E7,劑量為0.5毫克/公斤/周, 可以安全地自己施用,而且局部耐受性不錯。

施用D2E7和氨甲蝶呤

本研究中,患者除施用正在施用的(氨甲蝶呤)MTX外,接受皮下 或靜脈注射安慰劑或D2E7,劑量為1毫克/公斤。54位患者參加本 研究,18位接受D2E7和安慰劑靜脈注射,18位接受靜脈注射安慰 劑和皮下注射D2E7,18位患者接受靜脈或皮下注射安慰劑。患者僅 在他們無可見反應狀態時,接受第二劑量藥物,但第一劑量后不得早 于4周。此后,所有患者都接受公開標記的每兩周一次皮下注射D2E7 抗體。

本研究的研究總體統計學特征包括:平均患類風濕性關節炎11.1 年,用藥前平均3.6DMARDs(不是氨甲蝶呤)和本研究開始時DAS平 均為4.81。到29天時,72%靜脈注射D2E7治療患者和44%皮下注 射D2E7治療患者獲得了DAS標準反應,相比較而言,安慰劑治療 的患者只有28%患者達到標準(見圖5)、本研究有反應的患者中,至 29天時28%安慰劑治療患者維持ACR20反應,而對應的有72%靜 脈注射D2E7治療患者和67%皮下注射D2E7治療患者,他們的ACR20 反應持續一至三個月。

實施例2皮下施用抗TNFα抗體的全身劑量

每周皮下施用一次D2E7

本研究有284名類風濕性關節炎患者參加,設計目的為確定皮下 施用D2E7的、優化全身劑量。患者每周隨機接受20,40或80毫克 的D2E7或安慰劑,施用12周。安慰劑治療后的患者轉用D2E7,劑 量為40毫克/周。

接近49%的患者在施用20毫克時達到ACR20,55%的患者在施 用40毫克時達到ACR20,54%的患者在施用80毫克時達到ACR20(見 圖1A)。接近23%的患者在施用20毫克時達到ACR50,27%的患者 在施用40毫克時達到ACR50,20%的患者在施用80毫克時達到 ACR50,而接受安慰劑的患者僅有2%達到ACR50。這些資料表明 說明,皮下施用D2E7,尤其在劑量為40毫克/周時,獲得良好的反 應。

實施例3:每兩周皮下施用一次抗TNFα抗體

每兩周皮下施用一次D2E7

以不同的劑量在隔周皮下(s.c.)施用安慰劑或D2E7并持續與MTX 聯用24周后,研究對氨甲蝶呤部分反應的類風濕性關節炎患者的臨 床效果、安全性、免疫原性和耐受性。

研究設計

對氨甲蝶呤效果不明顯或對其耐受的類風濕性關節炎患者,進行 有安慰劑對照、雙盲、隨機、多中心的研究。在試驗期間,患者持續 施用恒定劑量的氨甲蝶呤,以及按照下面所述的特定的內在標準的劑 量范圍。

本研究由兩部分組成:1)在施用第一劑量的藥物前四周為一段 “藥力消散期”,在此期間DNARDs(氨甲蝶呤除外)消退;(二)“安慰 劑控制期”,在此期間67位患者隨機分配成四組接受安慰劑,20毫 克、40毫克、80毫克的D2E7(作為全身總劑量)的治療,隔周皮下給 藥,用藥長達24周。每個劑量的研究藥物分兩次皮下注射,注射劑 量位1.6ml/次。患者第一次用藥由醫務人員給藥,并作為培訓患者的 一個環節。隨后在醫務人員的直接觀察下由患者自己用藥四周。此后, 在研究地點外由患者自己、或由患者指定的受訓人員或醫務人員用 藥。每次臨床評估后分發給患者4或5周的藥量。患者連續在第一、 二、三、四、六、八、十二、十六、二十和二十四周進行關節檢查, 檢查由不知情的、與治療醫生無關的輔助人員進行。

本研究有271名類風濕性關節炎患者參加。本研究的總體適度的 代表了北美嚴重類風濕性關節炎患者的情況:70%女性,大部分年齡 超過40歲。該總體有本領域中技術人員根據標準選擇出來,如患者 必須接受類風濕性關節炎的診斷,按照1987年修訂的美國風濕學會 (ACR)標準定義來診斷(參見附錄A)

結果

圖1B和2-4表明每兩周皮下施用一次D2E7,且與氨甲蝶呤聯用, 在24周內減輕類風濕性關節炎征兆和癥狀方面明顯好于安慰劑。統 計分析表明,所有D2E7三種劑量與每周施用安慰劑相比明顯有效, 而且40和80毫克劑量的D2E7比20毫克劑量效率更高。

等價方案?

本領域內的那些技術人員,將認識到或僅通過常規的試驗就能夠 確定有許多和本發明所述特定方法等價的方案。這類等價方案包括在 下面的權利要求中。

附錄A

類風濕性關節炎的ACR定義

類風濕性關節炎(RA)的1987年分類標準和功能 標準 定義 1.3個或3個以上 關節區域關節炎 醫生觀察到至少有3個關節區域有軟組 織腫脹或流體(不是單純的骨過度生 長)。14個可能的關節區域是左或右 PIP,MDP,腕、肘、踝和MTP關節。 2.手關節炎 腕關節炎 掌指關節炎 掌指或腕關節炎 掌指或腕關節炎 醫生觀察到特定區域有軟組織腫脹或流 體(不是單純的骨過度生長)。其中2 個區域是特定的、同時發病。 3.對稱性腫脹(關 節炎) 左右相同關節同時發病(如定義1中的 PIPs、MCPs或MTPs,在身體兩側(雙 邊)并非對稱性的發病是可以接受的) 4.血清類風濕因子 用任何方法檢測出血清類風濕因子總量 不正常,其中所用方法的結果在正常對 照人群中有小于5%的人是陽性的。 5.類風濕關節炎的 X光片的變化 典型的類風濕關節炎的X光片的變化 是在posteroanterior手和腕部X光片的 變化,其中包括浸蝕或明確的骨脫鈣作 用,定位于或多數標記的發病的關節附 近(骨關節炎變化未作定義)

如果他或她包含表7中5個亞類中類風濕性關節炎的一個以及由 其醫生臨床診斷為類風濕性關節炎的患者認為是類風濕性關節炎。標 準1、2和3必須是至少6周出現的癥狀。

Arthritis?and?Rheumatism,vol?31?No.3(March?1988)

附錄B

SEQ?ID?NO:1:

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