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NOBILISIDEA隱形納米脂質體靜脈注射液及其制備方法.pdf

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NOBILISIDEA 隱形 納米 脂質體 靜脈 注射液 及其 制備 方法
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摘要
申請專利號:

CN201110063705.4

申請日:

20110316

公開號:

CN102133185A

公開日:

20110727

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A61K9/127,A61K9/10,A61K31/7048,A61K47/34,A61P35/00 主分類號: A61K9/127,A61K9/10,A61K31/7048,A61K47/34,A61P35/00
申請人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
發明人: 陳建明,顧芃,張瑩瑩,馬露露,凈曉龍,揭繼龍,張佳良,高保安,崔曉如
地址: 200433 上海市楊浦區翔殷路800號
優先權: CN201110063705A
專利代理機構: 上海德昭知識產權代理有限公司 代理人: 丁振英
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201110063705.4

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及醫藥技術領域,是具有抗腫瘤活性的Nobiliside?A的一種隱形納米脂質體靜脈注射液制劑及其制備方法,組分和配比為:Nobiliside?A?0.01-100mg/mL;磷脂1-50mg/mL;膽固醇0.01-20mg/mL;PEG脂質0.1-20mg/mL;注射用水,余量。動物實驗表明,本發明Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液制劑比Nobiliside?A的普通脂質體靜脈注射液制劑半衰期長,對肝臟和脾臟的毒副作用小,抑瘤率比Nobiliside?A普通脂質體靜脈注射液提高了約30%。本發明Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液制備方法簡單,能有效提高Nobiliside?A的抑瘤率,降低Nobiliside?A的毒副作用。

權利要求書

1.一種Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液,組分和配比如下:其中,磷脂選自大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿中的一種或幾種;PEG脂質選自聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-聚己內酯、聚乙二醇-聚乙交酯丙交酯、聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚十六烷基氰基丙烯酸酯、聚氧乙烯脂肪酸醚、聚氧乙烯甲基蓖麻油醚中的一種或幾種。2.按權利要求1所述的Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液,其特征在于所說的磷脂為大豆卵磷脂和/或蛋黃卵磷脂,所說的PEG脂質為聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。3.按權利要求1或2所述的Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液,其特征在于組分和配比如下:4.權利要求1或2或3所述Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液的制備方法,步驟如下:(1)制備類脂溶液:按配比將磷脂、膽固醇和PEG脂質溶解在50mL氯仿中,然后按氯仿和無水乙醇的體積比為1∶2-1∶4加入無水乙醇,得類脂溶液;(2)制備類脂薄膜:將類脂溶液置于旋轉蒸發器上,在50℃旋轉減壓蒸發1-1.5h,去除有機相氯仿和無水乙醇,類脂溶液即成類脂薄膜;(3)制備Nobiliside?A隱形脂質體混懸液:按配比加入Nobiliside?A水溶液和余量的注射用水,使類脂薄膜從容器壁洗脫下來并將其制成混懸液,即得Nobiliside?A隱形脂質體混懸液;(4)制備Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液將Nobiliside?A隱形脂質體混懸液按常規高壓均質,微孔濾膜過濾滅菌,即得Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液。

說明書

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技術領域

本發明涉及醫藥技術領域,是具有抗腫瘤活性的Nobiliside?A的一種隱形納米脂質體靜脈注射液制劑及其制備方法。

背景技術

Nobiliside?A是從黑乳海參中提取的一種具有抗腫瘤活性的三萜皂苷類化合物(詳見發明專利“黑乳海參中抗腫瘤化合物Nobiliside?A及其單乙酰化衍生物”,專利公開號:CN1740185),化學結構式如下:

Nobiliside?A不僅有良好的細胞毒性作用,而且還具有顯著的新生血管形成抑制作用,能誘導腫瘤內皮細胞和腫瘤細胞的調亡。已將Nobiliside?A制成普通脂質體靜脈注射液并申請了專利(詳見發明專利“抗腫瘤化合物Nobiliside?A單乙酰化物脂質體靜脈注射液及其制備法”,專利公開號:CN1739543),實驗結果顯示:Nobiliside?A普通脂質體靜脈注射液可以顯著降低Nobiliside?A體內外的溶血性,改善了Nobiliside?A對血管的刺激和致炎作用。然而,當Nobiliside普通脂質體進入體內后,易被網狀內皮系統(RES)攝取、清除,Nobiliside普通脂質體在血液中的?半衰期較短(半衰期通常為10h左右),還易對RES豐富的器官(如肝臟和脾臟)造成蓄積毒性,靶組織的靶向性差,抑瘤效果不理想。

隱形納米脂質體又稱為長循環納米脂質體,這類脂質體粒徑小,通常在100nm左右。脂質體表面能形成空間位阻,有效阻止血漿蛋白的調理作用,使脂質體可以逃避RES的發現和捕獲,延長藥物的血液循環時間,有利于進入腫瘤組織,并增進其對腫瘤組織的滲透和滯留作用(EPR效應),使藥物高濃度、長時間蓄積在腫瘤組織中,提高治療效果(陶濤,脂質體遞藥系統的臨床研究進展[J].藥學服務與研究,2008,8(2):84-88)。然而至今未見有關將Nobiliside?A制成隱形納米脂質體靜脈注射液的報道。

發明內容

本發明提供一種體內半衰期長、毒副作用小、療效好、對腫瘤具有藥物被動靶向功能的Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液制劑。

本發明Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液的組分和配比如下:

優選:

其中,磷脂選自大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿中的一種或幾種,優選大豆卵磷脂和/或蛋黃卵磷脂。

PEG脂質選自聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-聚己內酯、聚乙二醇-聚乙交酯丙交酯、聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚十六烷基氰基丙烯酸酯、聚氧乙烯脂肪酸醚、聚氧乙烯甲基蓖麻油醚中的一種或幾種,優選聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。

制備方法為:

(1)制備類脂溶液:

按配比將磷脂、膽固醇和PEG脂質溶解在50mL氯仿中,然后按氯仿和無水乙醇的體積比為1∶2-1∶4加入無水乙醇,得類脂溶液;

(2)制備類脂薄膜:

將類脂溶液置于旋轉蒸發器上,在50℃旋轉減壓蒸發1-1.5h,去除有機相氯仿和無水乙醇,類脂溶液即成一層均勻薄膜;

(3)制備Nobiliside?A隱形脂質體混懸液:

按配比加入Nobiliside?A水溶液和余量的注射用水,使類脂薄膜從容器壁洗脫下來并將其制成混懸液,即得Nobiliside?A隱形脂質體混懸液;

(4)制備Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液

將Nobiliside?A隱形脂質體混懸液按常規高壓均質,微孔濾膜過濾滅?菌,即得Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液。

本發明的關鍵是采用PEG脂質制備Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液。PEG脂質含有親水基團,PEG脂質修飾脂質體,在脂質體表面形成空間位阻,使得隱形納米脂質體不易被RES識別和攝取,因此隱形納米脂質體在血液中的循環時間延長,使藥物更多地聚集到腫瘤組織;PEG脂質修飾脂質體,使隱形納米脂質體粒徑小于100nm,也增加Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液的穩定性。

動物實驗表明,本發明Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液制劑血液半衰期長達15.93小時;對肝臟和脾臟的毒副作用小,在肝臟和脾臟的Nobiliside?A濃度比Nobiliside?A普通脂質體靜脈注射液制劑分別減小了3倍和4倍;抑瘤率比Nobiliside?A普通脂質體靜脈注射液提高了約30%。

本發明Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液制備方法簡單,能有效提高Nobiliside?A的抑瘤率,降低Nobiliside?A的毒副作用。

附圖說明

圖1為Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液在大鼠體內的血藥濃度-時間曲線圖。

圖2為Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液在小鼠肝臟內的藥物濃度-時間圖。

圖3為Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液在小鼠脾臟內的藥物濃度-時間圖。

圖4為Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液對荷瘤小鼠抑瘤率?的曲線圖。

具體實施方式

實施例1:制備Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液

將大豆卵磷脂0.5g、膽固醇0.01g和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺0.5g、聚乙二醇-聚己內酯0.2g、聚乙二醇-聚乙交酯丙交酯0.3g溶解于50mL氯仿中,再按氯仿和無水乙醇的體積比為1∶2加入無水乙醇100mL,得類脂溶液;將類脂溶液置于旋轉蒸發器上,在50℃旋轉減壓蒸發1h去除有機相,類脂溶液即成一層均勻薄膜,加入10mL含有0.01gNobiliside?A的水溶液將薄膜洗脫下來并制成混懸液,即為Nobiliside?A的隱形脂質體混懸液;加入余量的注射用水定容至100mL,然后按常規高壓均質,0.22μm微孔濾膜過濾滅菌,即得Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液。

實施例2:制備Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液

將蛋黃卵磷脂0.4g、膽固醇0.002g和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺0.015g、聚乙二醇-聚乳酸0.005g溶解于50mL氯仿中,再按氯仿和無水乙醇的體積比為1∶3加入無水乙醇150mL,得類脂溶液;將類脂溶液置于旋轉蒸發器上,在50℃旋轉減壓蒸發1h去除有機相,類脂溶液即成一層均勻薄膜,加入10mL含有0.02g?Nobiliside?A的水溶液將薄膜洗脫下來并制成混懸液,即得Nobiliside?A的隱形脂質體混懸液;加入余量的注射用水溶液定容至200mL,然后按常規高壓均質,0.22μm微孔濾膜過濾滅菌,即得Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液。

實施例3:制備Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液

將大豆卵磷脂1.0g、蛋黃卵磷脂0.5g、膽固醇0.8g和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺0.3g、聚乙二醇-聚十六烷基氰基丙烯酸酯0.1g、聚氧乙烯脂肪酸醚0.1g溶解在50mL氯仿中,再按氯仿和無水乙醇的體積比為1∶4加入無水乙醇200mL,得類脂溶液;將類脂溶液置于旋轉蒸發器上,在50℃旋轉減壓蒸發1h去除有機相,類脂溶液即成一層均勻薄膜,加入20mL含有1.0g?Nobiliside?A的水溶液將薄膜洗脫下來并制成混懸液,即為Nobiliside?A的隱形脂質體混懸液;加入余量的注射用水定容至100mL,然后按常規高壓均質,0.22μm微孔濾膜過濾滅菌,即得Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液。

實施例4:制備Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液

將大豆卵磷脂1.0g、硬脂酰磷脂酰膽堿0.5g、二棕櫚酰磷脂酰膽堿0.5g、膽固醇1.0g和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺1.0g溶解在50mL氯仿中,再按氯仿和無水乙醇的體積比為1∶3加入無水乙醇150mL,得類脂溶液;將類脂溶液置于旋轉蒸發器上,在50℃旋轉減壓蒸發1.5h去除有機相,類脂溶液即成一層均勻薄膜,加入10mL含有5.0g?Nobiliside?A的水溶液將薄膜洗脫下來并制成混懸液,即為Nobiliside?A的隱形脂質體混懸液;加入余量的注射用水定容至50mL,然后按常規高壓均質,0.22μm微孔濾膜過濾滅菌,即得Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液。

實施例5:制備Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液

將大豆卵磷脂0.9g、和二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿0.1g、膽固醇0.5g和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺0.3g、甲基蓖麻油醚0.1g溶解在50mL氯仿中,再按氯仿和無水乙醇的體積比為1∶3加入無水乙醇150mL,得類脂溶?液;將類脂溶液置于旋轉蒸發器上,在50℃旋轉減壓蒸發1h去除有機相,類脂溶液即成一層均勻薄膜,加入10mL含有0.05g?Nobiliside?A的水溶液將薄膜洗脫下來并制成混懸液,即為Nobiliside?A的隱形脂質體混懸液;加入余量的注射用水定容至100mL,然后按常規高壓均質,0.22μm微孔濾膜過濾滅菌,即得Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液。

實施例6:制備Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液

將蛋黃卵磷脂1.7g、二硬脂酰磷脂酰膽堿0.8g、膽固醇0.75g和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺0.45g、聚乙二醇-聚己內酯0.55g溶解在50mL氯仿中,再按氯仿和無水乙醇的體積比為1∶4加入無水乙醇200mL,得類脂溶液;將類脂溶液置于旋轉蒸發器上,在50℃旋轉減壓蒸發1.5h去除有機相,類脂溶液即成一層均勻薄膜,加入20mL含有2.5g?NobilisideA的水溶液將薄膜洗脫下來并制成混懸液,即為Nobiliside?A的隱形脂質體混懸液;加入余量的注射用水定容至50mL,然后按常規高壓均質,0.22μm微孔濾膜過濾滅菌,即得Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液。

實施例7:制備Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液

將大豆卵磷脂0.6g、蛋黃卵磷脂0.2g、二硬脂酰磷脂酰膽堿0.1g、膽固醇0.4g和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺0.4g溶解在50mL氯仿中,再按氯仿和無水乙醇的體積比為1∶2加入無水乙醇100mL,得類脂溶液;將類脂溶液置于旋轉蒸發器上,在50℃旋轉減壓蒸發1h去除有機相,類脂溶液即成一層均勻薄膜,加入5mL含有0.04g?Nobiliside?A的水溶液將薄膜洗脫下來并制成混懸液,即為Nobiliside?A的隱形脂質體混懸液;加入余量的注射用水定容至100mL,然后按常規高壓均質,0.22μm微孔濾膜過?濾滅菌,即得Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液。

實施例8:制備Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液

將大豆卵磷脂4.0g、蛋黃卵磷脂3.5g、膽固醇3.0g和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺2.25g溶解在50mL氯仿中,再按氯仿和無水乙醇的體積比為1∶3加入無水乙醇150mL,得類脂溶液;將類脂溶液置于旋轉蒸發器上,在50℃旋轉減壓蒸發1.5h去除有機相,類脂溶液即成一層均勻薄膜,加入15mL含有3.0g?Nobiliside?A的水溶液將薄膜洗脫下來并制成混懸液,即為Nobiliside?A的隱形脂質體混懸液;加入余量的注射用水定容至150mL,然后按常規高壓均質,0.22μm微孔濾膜過濾滅菌,即得NobilisideA隱形納米脂質體靜脈注射液。

實施例9:制備Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液

將大豆卵磷脂0.5g、膽固醇0.25g和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺0.1g、聚乙二醇-聚己內酯0.1g溶解在50mL氯仿中,再按氯仿和無水乙醇的體積比為1∶3加入無水乙醇150mL,得類脂溶液;將類脂溶液置于旋轉蒸發器上,在50℃旋轉減壓蒸發1h去除有機相,類脂溶液即成一層均勻薄膜,加入5mL含有0.02g?Nobiliside?A的水溶液將薄膜洗脫下來并制成混懸液,即為Nobiliside?A的隱形脂質體混懸液;加入余量的注射用水定容至100mL,然后按常規高壓均質,即得Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液。

實施例10:制備Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射溶液

將大豆卵磷脂2.0g、膽固醇1.0g和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺2.0g、溶解在50mL氯仿中,再按氯仿和無水乙醇的體積比為1∶3加入無水?乙醇150mL,得類脂溶液;將類脂溶液置于旋轉蒸發器上,在50℃旋轉減壓蒸發1.2h去除有機相,類脂溶液即成一層均勻薄膜,加入10mL含有1.0g?Nobiliside?A的水溶液將薄膜洗脫下來并制成混懸液,即為NobilisideA的隱形脂質體混懸液;加入余量的注射用水定容至200mL,然后按常規高壓均質,0.22μm微孔濾膜過濾滅菌,即得Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液。

實施例11:制備Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液

將大豆卵磷脂1.0g、膽固醇0.5g和聚乙二醇-聚己內酯0.2g、聚乙二醇聚乙交酯丙交酯0.1g溶解在50mL氯仿中,再按氯仿和無水乙醇的體積比為1∶2加入無水乙醇100mL,得類脂溶液;將類脂溶液置于旋轉蒸發器上,在50℃旋轉減壓蒸發1.5h去除有機相,類脂溶液即成一層均勻薄膜,加入5mL含有0.03g?Nobiliside?A的水溶液將薄膜洗脫下來并制成混懸液,即為Nobiliside?A的隱形脂質體混懸液;加入余量的注射用水定容至100mL,然后按常規高壓均質,0.22μm微孔濾膜過濾滅菌,即得NobilisideA隱形納米脂質體靜脈注射液。

實施例12:制備Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液

將大豆卵磷脂3.5g、和二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿0.5g、膽固醇2.0g和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺0.75g、甲基蓖麻油醚0.25g溶解在50mL氯仿中,再按氯仿和無水乙醇的體積比為1∶4加入無水乙醇200mL,得類脂溶液;將類脂溶液置于旋轉蒸發器上,在50℃旋轉減壓蒸發1.4h去除有機相,類脂溶液即成一層均勻薄膜,加入5mL含有0.2g?Nobiliside?A的水溶液將薄膜洗脫下來并制成混懸液,即為Nobiliside?A的隱形脂質體混?懸液;加入余量的注射用水定容至200mL,然后按常規高壓均質,0.22μm微孔濾膜過濾滅菌,即得Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液。

實施例13:制備Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液

將大豆卵磷脂0.6g、和二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿0.6g、膽固醇0.55g和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺0.3g、甲基蓖麻油醚0.1g溶解在50mL氯仿中,再按氯仿和無水乙醇的體積比為1∶3加入無水乙醇150mL,得類脂溶液;將類脂溶液置于旋轉蒸發器上,在50℃旋轉減壓蒸發1.3h去除有機相,類脂溶液即成一層均勻薄膜,加入10mL含有0.05g?Nobiliside?A的水溶液將薄膜洗脫下來并制成混懸液,即為Nobiliside?A的隱形脂質體混懸液;加入余量的注射用水定容至100mL,然后按常規高壓均質,0.22μm微孔濾膜過濾滅菌,即得Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液。

實施例14:制備Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液

將大豆卵磷脂1.25g、蛋黃卵磷脂1.0g、膽固醇0.15g和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺0.6g、聚乙二醇-聚己內酯0.3g溶解在50mL氯仿中,再按氯仿和無水乙醇的體積比為1∶4加入無水乙醇200mL,得類脂溶液;將類脂溶液置于旋轉蒸發器上,在50℃旋轉減壓蒸發1.2h去除有機相,類脂溶液即成一層均勻薄膜,加入10mL含有0.15g?Nobiliside?A的水溶液將薄膜洗脫下來并制成混懸液,即為Nobiliside?A的隱形脂質體混懸液;加入余量的注射用水定容至150mL,然后按常規高壓均質,0.22μm微孔濾膜過濾滅菌,即得Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液。

實施例15:制備Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液

將蛋黃卵磷脂0.8g、二硬脂酰磷脂酰膽堿0.7g、膽固醇0.55g和聚乙?二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺0.3g,聚氧乙烯脂肪酸醚0.2g溶解在50mL氯仿中,再按氯仿和無水乙醇的體積比為1∶4加入無水乙醇200mL,得類脂溶液;將類脂溶液置于旋轉蒸發器上,在50℃旋轉減壓蒸發1.5h去除有機相,類脂溶液即成一層均勻薄膜,加入5mL含有0.055g?Nobiliside?A的水溶液將薄膜洗脫下來并制成混懸液,即為Nobiliside?A的隱形脂質體混懸液;加入余量的注射用水定容至100mL,然后按常規高壓均質,0.22μm微孔濾膜過濾滅菌,即得Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液。

實施例16:制備Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液

將蛋黃卵磷脂0.1g、二硬脂酰磷脂酰膽堿0.1g、膽固醇0.004g和聚乙二醇-聚乳酸0.0035g,聚氧乙烯甲基蓖麻油醚0.0005g溶解在50mL氯仿中,再按氯仿和無水乙醇的體積比為1∶4加入無水乙醇200mL,得類脂溶液;將類脂溶液置于旋轉蒸發器上,在50℃旋轉減壓蒸發1.5h去除有機相,類脂溶液即成一層均勻薄膜,加入5mL含有0.004g?Nobiliside?A的水溶液將薄膜洗脫下來并制成混懸液,即為Nobiliside?A的隱形脂質體混懸液;加入余量的注射用水定容至200mL,然后按常規高壓均質,0.22μm微孔濾膜過濾滅菌,即得Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液。

施例17:制備Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液

將二硬脂酰磷脂酰膽堿0.8g、二棕櫚酰磷脂酰膽堿0.8g、膽固醇0.8g和聚乙二醇-聚乳酸0.35g,聚乙二醇-聚十六烷基氰基丙烯酸酯0.25g溶解在50mL氯仿中,再按氯仿和無水乙醇的體積比為1∶3加入無水乙醇150mL,得類脂溶液;將類脂溶液置于旋轉蒸發器上,在50℃旋轉減壓蒸發1.5h去除有機相,類脂溶液即成一層均勻薄膜,加入10mL含有0.06g?Nobiliside?A的水溶液將薄膜洗脫下來并制成混懸液,即為Nobiliside?A的隱形脂質體混懸液;加入余量的注射用水定容至100mL,然后按常規高壓均質,0.22μm微孔濾膜過濾滅菌,即得Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液。

施例18:制備Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液

將大豆卵磷脂1.1g、蛋黃卵磷脂0.5g、二硬脂酰磷脂酰膽堿0.1g、二棕櫚酰磷脂酰膽堿0.1g、膽固醇0.6g和聚乙二醇-聚乳酸0.3g,聚乙二醇-聚己內酯0.6g溶解在50mL氯仿中,再按氯仿和無水乙醇的體積比為1∶3加入無水乙醇150mL,得類脂溶液;將類脂溶液置于旋轉蒸發器上,在50℃旋轉減壓蒸發1.5h去除有機相,類脂溶液即成一層均勻薄膜,加入10mL含有0.12g?Nobiliside?A的水溶液將薄膜洗脫下來并制成混懸液,即為Nobiliside?A的隱形脂質體混懸液;加入余量的注射用水定容至150mL,然后按常規高壓均質,0.22μm微孔濾膜過濾滅菌,即得Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液。

施例19:制備Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液

將大豆卵磷脂0.8g、蛋黃卵磷脂0.5g、二硬脂酰磷脂酰膽堿0.4g、膽固醇0.7g和聚乙二醇-聚乳酸0.3g,聚乙二醇-聚己內酯0.2g溶解在50mL氯仿中,再按氯仿和無水乙醇的體積比為1∶3加入無水乙醇150mL,得類脂溶液;將類脂溶液置于旋轉蒸發器上,在50℃旋轉減壓蒸發1.5h去除有機相,類脂溶液即成一層均勻薄膜,加入10mL含有0.08g?Nobiliside?A的水溶液將薄膜洗脫下來并制成混懸液,即為Nobiliside?A的隱形脂質體混懸液;加入余量的注射用水定容至100mL,然后按常規高壓均質,0.22μm?微孔濾膜過濾滅菌,即得Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液。

施例20:制備Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液

將大豆卵磷脂0.5g、蛋黃卵磷脂0.5g、二硬脂酰磷脂酰膽堿0.5g、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿0.5g、膽固醇1.2g和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺0.8g,聚乙二醇-聚己內酯0.8g溶解在50mL氯仿中,再按氯仿和無水乙醇的體積比為1∶4加入無水乙醇200mL,得類脂溶液;將類脂溶液置于旋轉蒸發器上,在50℃旋轉減壓蒸發1.4h去除有機相,類脂溶液即成一層均勻薄膜,加入10mL含有0.1g?Nobiliside?A的水溶液將薄膜洗脫下來并制成混懸液,即為Nobiliside?A的隱形脂質體混懸液;加入余量的注射用水定容至100mL,然后按常規高壓均質,0.22μm微孔濾膜過濾滅菌,即得Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液。

動物實驗

1.Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液在大鼠體內的藥代動力學實驗

材料與試劑:Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液(由實施例1制備,下同);瑞舒伐他汀鈣(上海醫藥工業研究院);肝素鈉(上海第一生化藥業有限公司);甲醇(色譜純,Sigma-Aldrich,USA)。

質譜條件:API?3000型三重四極串聯質譜儀,電噴霧離子源(Turbo?Ionspray)和Analyst?1.4數據處理系統(美國應用生物系統有限公司);Agilent?1100液相色譜系統(美國Agilent公司);離子噴霧電壓為3.50kV;霧化溫度400℃;霧化氣(N2)為900L·h-1;加熱輔助氣(N2)為8.0L·min-1;簾氣CUR為8.0L·min-1;碰撞氣(N2)4.0L·min-1;掃描時間為0.2s;采用?負離子方式檢測;掃描方式為多反應監測(MRM);用于定量分析的離子反應分別為m/z1183.4-m/z?96.9amu(Nobiliside?A)和m/z?421.2>m/z?101.0amu(內標:瑞舒伐他汀鈣)。

色譜條件:色譜柱:Waters?Xbridge?C18(2.1×50mm,3μm);預柱:Waters?Xbridge?C18(2.1×10mm,3μm);流動相:甲醇∶水(70∶30,V/V);流速:0.2mL/min;柱溫:30℃。

動物:SD大鼠,雄性,200±20g,由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供,生產許可證號SCXK(滬)(2007-2005)。

實驗方法:取SD雄性大鼠10只,隨機分成兩組,每組5只,分別為Nobiliside?A普通脂質體靜脈注射液組和Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液組,給藥劑量均為按體重尾靜脈注射1mg/kg,分別于給藥后5min,10min,15min,30min,45min,1h,2h,4h,8h,12h,24h,48h和72h眼眶取血0.3mL,置于加有肝素鈉的離心管內,搖勻,15000rpm離心5min,取100μl血漿樣品置離心管中,加入甲醇20μl,加入內標溶液500μl(200ng/mL),渦旋1min,15000rpm離心5min,取上清液進行LC/MS/MS分析,分別測定Nobiliside?A的含量,取平均值并作圖,結果見圖1。

由圖1可見,Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液的藥時曲線下面積(AUC)是Nobiliside?A普通脂質體靜脈注射液的AUC的8倍,Nobiliside?A血液消除半衰期由Nobiliside?A普通脂質體靜脈注射液的10.58h延長到了22.93h。說明將Nobiliside?A制備成本發明制劑能夠使Nobiliside?A的血液循環時間延長。

2.Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液在小鼠體內的組織分布實驗

材料與試劑、質譜條件、色譜條件同上。

動物:ICR小鼠,雄性,體重20±2g,由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供,生產許可證號SCXK(滬)(2007-2005)。

取ICR小鼠50只,隨機分成兩組,每組25只,分別為Nobiliside?A普通脂質體靜脈注射液組和Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液組,給藥劑量均為按體重尾靜脈注射1mg/kg,分別于給藥后5min、1h、8h、24h和48h各處死5只,分別取每只小鼠肝、脾各100mg,各組織分別剪碎后,各加入0.3mL生理鹽水按常規勻漿,取100μl勻漿液置于離心管中,加入甲醇20μl,加入內標瑞舒伐他汀鈣甲醇溶液(200ng/mL)500μl,渦旋1min,15000rpm離心5min,取上清液進行LC/MS/MS分析,分別測定NobilisideA的含量,取各時間點的平均值并作圖,結果見圖2、圖3。

由圖2和圖3可見,在富含網狀內皮細胞的肝臟和脾臟中,注射Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液組的小鼠Nobiliside?A含量明顯低于Nobiliside?A普通脂質體靜脈注射溶液組,說明本發明制劑能降低對肝臟和脾臟的毒副作用。

3.Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液對小鼠S180淋巴肉瘤的治療實驗

陽性對照藥為注射用環磷酰胺(CTX),山西普德藥業有限公司,生產批號:20100308,200mg/10mL支,使用時用生理鹽水稀釋。

動物:ICR小鼠,雄性,體重20±2g,由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供,生產許可證號SCXK(滬)(2007-2005)。

瘤株:小鼠S180淋巴肉瘤(由中國科學院上海藥物所提供)。

將小鼠淋巴瘤S180瘤株按常規腹腔傳代接種,接種1周左右將小鼠頸椎脫臼處死,抽出腹水,用生理鹽水稀釋,制成1-2×107個/mL細胞懸液;取ICR小鼠80只,分別給每只小鼠右前肢腋窩部皮下注射瘤株稀釋液0.2mL,待瘤體長到150mm3左右,隨機分為八組,每組10只,分別為陰性對照組、陽性對照組、Nobiliside?A普通脂質體靜脈注射溶液低、中、高劑量組和Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射溶液低、中、高劑量組,Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液和Nobiliside?A普通脂質體靜脈注射溶液的高、中、低劑量組給藥劑量均依次為按體重2mg/kg,1mg/kg,0.5mg/kg,陽性對照組給藥劑量為CTX?20mg/kg,尾靜脈注射給藥,每天一次,每次0.2mL,陰性對照組尾靜脈注射等體積生理鹽水,連續給藥7天,觀察瘤體生長情況。停藥24小時后,處死動物,分別稱體重、瘤重,按照下列公式計算出藥物對腫瘤的抑制率:

抑瘤率%=(1-給藥組的平均瘤重/空白組的平均瘤重)×100%

療效評價標準:腫瘤抑制率<40%為無效;腫瘤抑制率≥40%,并經統計學處理p<0.05為有效。用腫瘤抑制率作圖,見圖4。圖中,CTX表示陽性對照組;C?low,C?middle,C?high依次表示Nobiliside?A普通脂質體靜脈注射液低、中和高劑量組;S?low,S?middle,S?high依次表示Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射液低、中和高劑量組。

由圖4可見,Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射溶液低、中、高劑量組的抑瘤率依次為38.9%,45.1%和63.7%,顯著高于Nobiliside?A普通脂質體靜脈注射溶液低、中、高劑量組的抑瘤率10.7%,21.2%和32.3,說明本發明Nobiliside?A隱形納米脂質體靜脈注射溶液能顯著提高?Nobiliside?A對腫瘤的抑制率。

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