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用于 調控 毒性 方法
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摘要
申請專利號:

CN03808776.6

申請日:

20030417

公開號:

CN1646121A

公開日:

20050727

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K31/401,A61K7/00,A61K7/48 主分類號: A61K31/401,A61K7/00,A61K7/48
申請人: 亞利桑那大學董事會
發明人: G·T·翁德拉克,M·J·羅伯茨,M·金,M·K·雅各布森,E·L·雅各布森
地址: 美國亞利桑那州
優先權: 60/374,033
專利代理機構: 中科專利商標代理有限責任公司 代理人: 王旭
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法律狀態
申請(專利)號:

CN03808776.6

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及使用膠原衍生分子來調控光損傷的方法,所述分子增強或抑制由紫外線引起的損傷。

權利要求書

1.用于在有所需要的受試者中調控光損傷的方法,包括對所述受試者的皮膚施用足以調控由紫外線引起的光損傷的光損傷調控物。2.權利要求1的方法,其中所述調控物增強光損傷。3.權利要求2的方法,其中所述調控物是由膠原衍生的。4.權利要求2的方法,其中所述調控物具有由3-羥基吡啶藥效團組成的結構。5.權利要求4的方法,其中所述調控物是N-烷基-3-羥基吡啶或其鹽。6.權利要求5的方法,其中所述N-烷基-3-羥基吡啶或其鹽包含2-20個碳原子的烷基部分。7.權利要求6的方法,其中所述烷基部分是乙基。8.權利要求2的方法,其中所述調控物與載體分子相連。9.權利要求2的方法,其中所述調控物是維生素B6、吡啶啉、或3-羥基吡啶。10.權利要求1的方法,其中所述調控物抑制光損傷。11.權利要求10的方法,其中所述調控物是脯氨酸、4-羥基脯氨酸、或其烷基酯。12.權利要求11的方法,其中所述脯氨酸烷基酯包含1-24個碳原子的烷基部分。13.權利要求12的方法,其中所述脯氨酸烷基酯是L-Pro-OCH或4-OH-L-Pro-OCH。14.權利要求1的方法,包括以乳劑、洗劑、洗發劑、噴霧劑、或貼片的形式施用所述調控物。15.一種4-羥基-L-脯氨酸烷酯化合物,其具有包含1-24個碳原子的烷基鏈。16.權利要求15的化合物,其具有大約-1.00至大約+8.00的logP值。17.權利要求15的化合物,其中所述烷基鏈包含1-10個碳原子。18.權利要求15的化合物,其中所述烷基鏈包含16-22個碳原子。19.權利要求15的化合物,其中所述烷基鏈包含11-24個碳原子。20.權利要求15的化合物,其為4-羥基-L-脯氨酸甲酯。

說明書

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相關申請

本申請要求2002年4月19日提交的臨時申請60/374,033的優先權。 將該申請的完整公開在本文引用作為參考

技術領域

本發明涉及可以用作皮膚細胞光毒性調控物的分子和組合物。具體而 言,“調控物”在用于本文時指能夠加速或延遲因暴露于光照而引起的對 細胞諸如皮膚細胞的損傷的物質。

背景技術

眾所周知,光,特別是UVA光,傷害皮膚細胞。光毒性細胞損傷是 通過光與某些皮膚內源化合物的反應發生的。光損傷發生的機制已經完全 清楚了,可以簡述如下。所涉及的分子(可以稱為皮膚損傷的敏化劑或甚 至加速劑)在存在氧氣時與光發生反應,導致“活性氧”或“ROS”的形 成。正是這些分子即ROS分子參與了導致細胞損傷的途徑,包括致癌作 用和光老化,但是又不限于這些現象。可以在Wondrak等人,J.Invest. Dermatol.,119:489-498,2002(完整引入本文作為參考)中找到這種 現象的更多細節。

內源(例如皮膚)分子參與光毒性加速的事實提出了靶向療法。詳細 地說,如果化合物在沒有光照時基本上是惰性的,但是在接觸光照后參與 細胞破壞,那么這些化合物就可以用于需要靶向細胞死亡的情況。這些情 況包括但不限于牛皮癬、痤瘡、惡化前和惡性過度增殖性疾病諸如光化性 角化病、以及本領域眾所周知的其它狀況。

相反,光活化分子的存在提出存在能夠淬滅或抑制光照對細胞作用的 分子。這些淬滅劑或抑制劑可用于需要逆轉和/或抑制有害光照作用的情 況。這些淬滅劑或抑制劑可用于預防和治療目的。

因此,正如將在下文公開書中看到的,對細胞光毒性的調控是本文所 述發明的焦點。調控物在用于本文時指可以由皮膚成分特別是膠原衍生的 分子。

附圖說明

圖1描繪了實施例中所采用的各種分子的結構。

圖2描繪的結果顯示了具有3-羥基吡啶中心結構的分子在暴露于光照 后有效激發對細胞增殖的抑制。

圖3比較了在存在光照時使用圖1的3-羥基吡啶化合物在HaCaT細 胞即角質細胞上獲得的結果。

圖4描繪了使用本文所述N-乙基衍生物在惡性黑素瘤上獲得的結果。

圖5與圖4平行,但是所使用的細胞是乳癌細胞。

圖6通過FACS(流式細胞計數)分析展示了N-乙基衍生物推動細胞 凋亡的證據。

圖7圖示了BSA-B6復合物的合成方法。

圖8顯示了圖7的復合物有效抑制細胞增殖。

圖9是通過能量轉移(圖中的“ET”)淬滅光激活分子的提議機制。 “S*”指完全激發的敏化劑,而“S”指敏化劑。

圖10描繪了作為淬滅劑測試的脯氨酸衍生物的結果。

圖11描繪了設計用于顯示脯氨酸衍生物淬滅光敏化DNA損傷的功效 的測定法的結果。

圖12顯示了如何確定本文所述化合物是否淬滅單體氧。

圖13顯示了抑制皮膚細胞光損傷的各種淬滅劑分子的保護作用。

優選實施方案的詳述

實施例1

認為內源皮膚成分膠原最有可能是光毒性損傷和/或其抑制的起因。 因此研究了這些分子。

吡啶啉(pyridinoline)是涉及交聯膠原分子的氨基酸,并且研究了它在 光毒性中的作用。吡啶啉的結構是眾所周知的,以及本文所述其它分子的 結構,描繪于圖1中。

在HaCaT角質細胞和人CF3成纖維細胞上進行了一系列實驗。在這 些實驗中,使細胞樣品接觸500μM吡啶啉、500μM鎖鏈素(具有吡啶 啉相關結構的彈性蛋白組分)、或500μM維生素B6(吡哆素)。對照不 接受額外化合物。在一組實驗中,細胞不接受外部光源。在另一組實驗中, 它們接受UVA光照,強度是3.3J/cm2。CF3成纖維細胞接受模擬日光或 “SSL”,即2.3J/cm2?UVA光照與0.12J/cm2?UVB光照的組合。結果顯示 于圖2中,即相對于對照(不添加化合物,無光照)的細胞增殖百分比。 測量在激發后3天進行。

結果指示吡啶啉具有抗增殖效果,但是只在進行光照時。維生素B6 顯示明顯更有效的抑制細胞增殖。

添加400U/ml過氧化氫酶(過氧化物清除劑)進行第二組實驗。過氧 化氫酶對維生素B6敏化絕對沒有影響,說明該分子涉及過氧化物形成以 外的機制。

根據這些結果,比較化合物的結構以確定能否鑒定分子的共有結構特 征或“藥效團”。注意到維生素B6和吡啶啉共享3-羥基吡啶中心結構, 繼而提出了下一個實驗系列。

實施例2

在與上文所述平行的實驗中研究了一組羥基吡啶衍生物。簡而言之, 測試了2、3、和4-羥基吡啶,還有N-乙基-3-羥基吡啶。所有結構描繪于 圖1中。

在增殖抑制測定法中測試了上文所述HaCaT細胞。細胞樣品接受等 量的上文所列4種化合物之一,并接觸或不接受上文所述模擬日光 (“SSL”)或單獨接觸同樣上文所述UVA光照。

結果描繪于圖3中。

與對照相比,3-羥基吡啶具有抑制效果,而N-乙基衍生物具有殺傷效 果。N-乙基衍生物在存在UVA和UVB兩種光照時也發揮功能,而3-羥 基吡啶在存在UVB光照時發揮細胞增殖抑制劑的功能。

實施例3

繼續上文所述實驗,使用惡性黑素瘤細胞(G-361細胞)和惡性乳癌 細胞(MCF-7)進行額外實驗。在這些實驗中,如上所述,在不同濃度和 9.9J/cm2的UVA光照測試上文所述N-乙基衍生物。測量處理后2天的存 活率。作為對照,只使用N-乙基衍生物和只進行UVA光照來進行實驗。

圖4(G-361細胞)和圖5(MCF-7細胞)所示結果顯示了該組合產 生顯著的細胞毒性。

在通過FACS分析G-361細胞時,數據顯示細胞被推入程序化細胞死 亡即凋亡。這在圖6中可以看到,其中凋亡標記膜聯蛋白V和碘丙錠的 染色顯示在使用N-乙基衍生物時染色細胞急劇增加,尤其是UVA濃度為 3.3J/cm2時。

實施例4

本發明的有效物質是小分子。盡管小分子是有用的,然而有時希望將 這些分子與較大分子復合,諸如蛋白質。例如,如果將小分子與對細胞上 特定標記特異的抗體、特定受體的配體、核相關蛋白質、等等復合,那么 這將有助于引導小分子。

為了測試這種方法的可行性,將維生素B6分子與牛血清清蛋白偶聯。 簡而言之,將350mg牛血清清蛋白(BSA)分子與64mg維生素B6即吡 哆醛一起反應,從而共價修飾牛血清清蛋白的賴氨酸側鏈而形成Schiff 堿。繼而在1.5ml?0.25M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中于37℃用58mg?NaCNBH3還原Schiff堿過夜,并充分透析(48小時,4℃)。通過質譜和熒光光譜 鑒定由此生成的BSA-B6加合物。然后將蛋白質凍干,并用于下面的實施 例。圖7描繪了合成方法。光譜實驗指示每個BSA分子平均復合了5-6 個吡哆醛分子。

實施例5

不加任何物質(對照)或者添加BSA或BSA-B6復合物,并用SSL 處理HaCaT角質細胞樣品或不進行處理,由此測試了實施例4中所述復 合物的抗增殖效果。BSA和BSA-B6的濃度是10mg/ml,而SSL指2.3J/cm2UVA加0.12J/cm2?UVB。處理后3天,使用Coulter計數器和標準方法測 量增殖情況。

在圖8所示結果中可以看到,BSA-B6復合物非常有效的抑制角質細 胞增殖。

實施例6

上文實施例1-5中所列資料研究的是增強細胞破壞的分子。然而并 非總是希望這樣,而且在這個實施例和下面的實施例中,所述實驗描述了 抑制這個過程的分子。這些分子將稱為光激發態淬滅劑或下文中的 “QPES”。這些化合物的特征是能夠滅活分子的光激發態,然后激發上文 所述那類細胞死亡。

這些分子發揮功能的提議機制描繪于圖9中,但是注意申請人不希望 受到這種提議機制的約束。簡而言之,對分子進行UV照射而發生電子激 發(激發態,圖中的“S*”),以及激發單體的形成,并在系統間過渡(ISC) 后形成三體狀態。這些是細胞光損傷中的關鍵中間體。QPES化合物通過 能量轉移(“ET”)接受與光損傷有關的化合物的激發能,中和光毒性中 間體使之松弛回到基態,通過無害振動能或發熱消散能量,從而消除這種 作用。QPES化合物自身在此過程中不衰竭,并中和多個光損傷分子。

實施例7

眾所周知ΦX174質粒只能由模擬日光的照射與作為UV敏化劑的 AGE色素富集蛋白的組合作用進行切割。AGE-BSA(經過“高級glycation 末端產物”修飾的牛血清清蛋白)是用于積累上文所述那類內源皮膚敏化 劑的模型。可以在Wondrak等人,Photochem.Photobiol.Sci.,1:355-363, 2002(完整引入本文作為參考)中找到顯示這種特性的測定法的細節。這 個實施例使用了這種測定法。

通過將樣品在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳來顯現質粒切割,并通過光 密度分析法將損傷定量,即由閉環形式(未受損)形成松弛的開環形式, 從而能夠評估化合物的保護作用。

AGE切割在缺氧時進行,而且不能由抗氧化劑完全抑制。因此,如 果化合物抑制質粒切割,那么不能簡單的認為它是抗氧化劑。相反,必須 假設上文所述經由淬滅激發態的抑制。

結果展示于下面的表中。已知是光激發態淬滅劑的細胞毒性NaN3是 有效的,還有硫醇化合物,包括谷胱甘肽(“GSH”)、D-青霉胺、和N- 乙酰-L-半胱氨酸(“NAC”)。

此測定法檢驗了實施例7中討論的原理。

?????????????????表1:對AGE敏化DNA切割的抑制

化合物?????????????????????????????????????????%抑制(±SD)

過氧化氫酶[400U/ml]????????????????????????????57.5±4.7

SOD[300U/ml]???????????????????????????????????48.0±1.1

甘露醇[20mM]???????????????????????????????????47.5±2.5

L-組氨酸[20mM]?????????????????????????????????43.7±0.4

NaN3[20mM]????????????????????????????????????94.0±0.5

DABCO[20mM]????????????????????????????????????32.9±1.1

DFO[1mM]???????????????????????????????????????51.3±1.0

D-青霉胺[20mM]?????????????????????????????????95.7±0.7

NAC[20mM]??????????????????????????????????????99.4±0.9

GSH[20mM]??????????????????????????????????????100.0±0.0

使用這種測定法測試了一系列脯氨酸相關化合物和脯氨酸。化合物的 結構描繪于圖10中。圖11列出了這些實驗的結果。加入100mM待測化 合物,并使質粒接觸UVA光照(2.3J/cm2)和AGE-BSA(10mg/ml)之 一、二者、或二者皆不。

L-Pro-OCH3是最有效的淬滅劑,但是測試的所有化合物都是有效的。

實施例8

如上所述,光激發氧即單體氧或“1O2”是基態三體氧或“3O2”的旋 轉配對同系物,也是已知涉及光毒性的最重要激發態分子。已經證明單體 氧參與對細胞DNA、膜脂、以及結構蛋白像角蛋白和膠原蛋白等的光氧 化損傷。開發了用于測定化合物諸如上文所述脯氨酸衍生物在淬滅單體氧 中的功效的測定法。參閱Lion等人,Nature,263:442-443,1976(完 整引入本文作為參考)。

眾所周知,甲苯胺藍(“TB”)在照射后生成1O2。在一種已知方法中, 使用2,2,6,6-四甲基哌啶或“TEMP”捕捉1O2。形成穩定的自由基即2,2,6,6- 四甲基哌啶-1-氧基或“TEMPO”,然后可以對它進行測量作為對1O2生成 的測定。這種測定法的關鍵是以下事實,即其它活性氧不與TEMP發生 反應而生成TEMPO,從而確保了該測定法對1O2形成是特異的。

將TEMP、TB、和上文所述分子之一組合,并用可見光照射5分鐘, 接受的總劑量是36J/cm2。詳細地說,將100μM?TB、7mM?TEMP、與 20mM待測化合物在磷酸鹽緩沖液中在100μl體積的石英毛細管 (1.5×90mm)中組合,使用商品化裝置通過電子順磁共振測量TEMPO 自由基信號。同樣測量對照,以測定不含待測化合物但進行光照時的信號 以及標準TEMPO共振信號。

展示于圖12板塊A-G中的結果提供了下列資料。圖A顯示了完整 的單體氧生成系統以及TEMPO信號生成。圖B顯示了商品化TEMPO參 照物的旋轉信號。圖C證明了在圖D-G中觀察到的效果不是由待測化合 物與TEMPO的直接反應引起的。圖D和G證明了脯氨酸衍生物對單體 氧的淬滅,并證明了脯氨酸羧基衍生物或4-羥基化不影響淬滅活性。另外, 它還顯示所有化合物都是有效的淬滅劑。

為了證明淬滅分子是物理淬滅劑而且在反應中不消耗,使用用于氨基 酸分析的標準反相HPLC法,在長時間暴露于可見光(36J/cm2)之前和 之后測量PBS中TB與L-脯氨酸混合物的氨基酸含量。在峰值、保持時 間、或AUC值中都沒有觀察到變化,指示對1O2的化學惰性,從而提供 了物理淬滅而非反應物消耗的證據。

實施例9

這些實驗設計用于確定已經證明是淬滅劑的化合物是否有效保護皮 膚細胞。

將培養的皮膚成纖維細胞(CF3細胞)暴露于來自通過染料敏化而原 位形成的1O2的光氧化壓力。

簡而言之,在35mm培養皿中接種50,000個成纖維細胞,一天后在 含有或不含TB(3.3μM,溶于Hanks緩沖鹽溶液)時用可見光(暴露90 秒鐘,提供10.8J/cm2)進行處理。處理5分鐘后,用磷酸鹽緩沖液清洗 細胞。照射過程中培養液中含有或不含待測化合物(10mM)。培養3天 后,通過胰蛋白酶消化收獲細胞,并使用Coulter計數器進行計數。

結果指示細胞增殖受到TB與光照組合的高度抑制(70%),但是二 者單獨使用都不能如此。化合物L-Pro-OCH3和4-OH-L-Pro-OCH3顯示很 清楚的保護效果,正如圖13所示并在下表中定量:

??表2:針對敏化光損傷的細胞保護[%±SD,n=3]

QPES-化合物:??????L-Pro?????????????????6.2±5.4

???????????????????L-Pro-OCH3???????????83.8±10.9

???????????????????4-OH-L-Pro????????????7.3±2.5

???????????????????4-OH-L-Pro-OCH3??????71.0±13.4

保護作用是通過下面的公式測定的:

在這些實驗中較活潑的化合物是酯類化合物。如圖10所示,在使用 本領域眾所周知的方法測定這些化合物的logP值時,酯類的logP值顯著 大于非酯化化合物。因為較大的logP值指示較大的親脂性,所以可能的 情況是它們的卓越功效要歸于在皮膚中維持較長的停留時間并與細胞膜 相互作用。預計具有大約-1.00至大約+8.00的logP值的脯氨酸酯衍生物 特別有用。

實施例10

認為上文所述化合物4-羥基-L-脯氨酸甲酯是新的化合物,是新的一 組化合物的代表。現在陳述該化合物的合成方法以及該家族其它成員的合 成方針。

將4-羥基-L-脯氨酸與二碳酸二叔丁基酯在1N?NaOH中于5℃反應30 分鐘,隨后于室溫攪動3.5小時。

然后將由此生成的受保護4-羥基脯氨酸與二甲基甲酰胺、碳酸鉀、和 甲基碘于0℃反應30分鐘,隨后于室溫攪動1小時以生成甲酯。

然后使用三氟乙酸和標準方法對二碳酸叔丁基酯進行去保護。

這個反應中的關鍵成分是甲基碘。通過改變鹵代烷,可以獲得包含1 -30個、優選1-26個碳原子的烷基的酯。

上述實施例陳述了本發明的各個方面,它涉及通過對受試者施用至少 一種調控紫外線作用的物質來調控光損傷的方法。“調控”在用于本文時 通常指提高光損傷速度(可用于需要抑制細胞增殖的情況)或降低損傷速 度的能力。前一類的實例包括例如牛皮癬、痤瘡、惡化前和惡性過度增殖 性疾病諸如光化性角化病、黑素瘤、非黑素瘤皮膚癌、乳癌、和其它癌癥、 以及本領域技術人員知道的需要降低細胞增殖的其它狀況。

優選的是,導致細胞增殖降低的光損傷增加是通過使用至少一種具有 3-羥基吡啶環作為其“藥效團”結構且由皮膚成分諸如膠原衍生的化合物 實現的。這些化合物的實例是3-羥基吡啶自身、維生素B6、和最優選的 N-烷基-3-羥基吡啶衍生物諸如鹽類,其中衍生物的烷基鏈包含至少2個 且可多達20個碳原子,優選直鏈,但是任選支鏈,可以進行或不進行取 代。更優選的是,烷基在直鏈中包含2-10個碳原子,且最優選2-5個 碳原子。正如上文所述資料所示,尤其優選N-乙基衍生物。增強化合物 在皮膚中的停留時間長度的較長的N-烷基衍生物在特定情況中可能是優 選的,諸如但不限于需要局部遞送化合物的情況。

這些分子可以組合例如標準制藥學成分和載體,諸如乳劑、洗劑、洗 發劑、噴霧劑、貼片、或將治療劑施用于皮膚的任何已知藥學傳遞系統中 所采用的那些成分和載體。

在特別期望靶向療法時,可以將活性成分附著于第二種分子(可以是 較大的)以改進靶向傳遞。這些較大分子包括例如抗體、受體的配體、激 素、以及靶向細胞和/或由細胞選擇性攝取的其它分子。

本發明的另一個特色是光損傷的淬滅特性。如上所述,脯氨酸及其衍 生物是光損傷的有效淬滅劑。特別有效的是脯氨酸的烷基酯,諸如 L-Pro-OCH3和4-OH-L-脯氨酸;然而,其它化合物也是有用的,正如已經 顯示的。應用模式正如上文關于討論的增強劑所述。

本發明的其它特色對本領域普通技術人員而言是清楚的,因而無需本 文贅述。

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