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白頭翁皂苷A的制備方法.pdf

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白頭翁 皂苷 制備 方法
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摘要
申請專利號:

CN201010624822.9

申請日:

20101231

公開號:

CN102133220B

公開日:

20130619

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K31/704,A61P35/00,A61P1/00,A61P1/16,A61P11/00,C07J63/00 主分類號: A61K31/704,A61P35/00,A61P1/00,A61P1/16,A61P11/00,C07J63/00
申請人: 江西中醫學院
發明人: 楊世林,李孝賢,朱衛豐,許瓊明,劉艷麗,饒毅,李笑然,羅曉健,簡暉,陳蘭英,馮育林,龔建平,范玫玫
地址: 330006 江西省南昌市陽明路56號
優先權: 201010160972.9,201010175546.2
專利代理機構: 江西省專利事務所 代理人: 楊志宇
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201010624822.9

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及一種白頭翁皂苷類物質的制備方法及其制劑的制備方法與其在制備治療癌癥藥物中的應用。本發明涉及一種白頭翁皂苷類物本身是白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A)或者是水解后產生白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A),因而共同擁有的23-羥基齊墩果酸-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷等結構單元,因這類物質水解后都容易白頭翁皂苷A,因而在人體中具有類似的治療功效。

權利要求書

1.一種白頭翁皂苷A的制備方法,其特征在于:將白頭翁藥材粉碎成粗粉,用50-95%乙醇浸泡0.5-2h,6-12倍量加熱回流提取2-3次,每次1-3h,過濾,合并濾液;上述濾液于50-70℃減壓濃縮至0.5-1.0g生藥材/mL,0-4℃冷藏過夜,析膠,濾過,濾渣上減壓硅膠柱,上樣后依次用二氯甲烷-甲醇或三氯甲烷-甲醇梯度洗脫,以白頭翁皂苷A作為對照品TLC檢測,合并相應流份;上述流份于50-70℃減壓蒸干,適量乙醇溶解,濾過,減壓回收乙醇至含醇量為10-40%之間,0-4℃冷藏過夜,析膠,濾過,濾液中加入適量的聚酰胺,攪拌0.5-4h,靜置4-12h,濾過,濾液中再加入適量的活性炭,攪拌0.5-4h,靜置4-12h,濾過,濾液用噴霧干燥法進行干燥,收集噴干粉,以10-40%乙醇重結晶,即得;其中白頭翁皂苷A的化學名為23-羥基齊墩果酸-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷。2.一種白頭翁皂苷A的制備方法,其特征在于:將白頭翁藥材粉碎成粗粉,用50%乙醇浸泡0.5h,12倍量加熱回流提取3次,每次1.5h,過濾,合并濾液。上述濾液于70℃減壓濃縮至1.0g生藥材/mL,0-4℃冷藏過夜,析膠,濾過,收集濾渣,晾干,乙醇溶解,加入濾渣量的60-100目硅膠拌勻,常溫干溶劑,研勻,干法上樣,減壓硅膠,60-100目,硅膠用量為濾渣量的20倍,柱層析,用二氯甲烷-甲醇梯度洗脫,以白頭翁皂苷A作為對照品TLC檢測,合并相應流份;上述流份于70℃減壓蒸干,適量乙醇溶解,濾過,減壓回收至含醇量為20%,0-4℃冷藏過夜,析膠,濾過,濾液中加入生藥量5%聚酰胺,攪拌0.5-4h,靜置4-12h,濾過,濾液中再加入生藥量2%的活性炭,攪拌0.5-4h,靜置4-12h,濾過,濾液用噴霧干燥法進行干燥,收集噴干粉,以20%乙醇重結晶,即得;采用上述方法制備白頭翁皂苷A的得率為0.05-0.1g/kg藥材,經HPLC檢測純度為98.2%,其中:白頭翁皂苷A?Pulsatilla?saponin?A的化學名為23-羥基齊墩果酸-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷;色譜條件:色譜柱:Diamonsil?C18色譜柱4.6mm×250mm,5μm;流動相:甲醇-水為75∶25;流速:1.0mL/min;柱溫:35℃;進樣量20ml;ELSD檢測器:SHIMADZU?ELSD-LTII型檢測器;檢測溫度:40℃;ELSD載氣:高純氮氣:載氣壓力:0.35MPa。

說明書

技術領域

本發明涉及一種白頭翁皂苷類物質的制備方法及其制劑的制備方法與其在制備治療癌癥藥物中的應用。本發明涉及一種白頭翁皂苷類物本身是白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A)或者是水解后產生白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A),因而共同擁有的23-羥基齊墩果酸-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷等結構單元,因這類物質水解后都容易白頭翁皂苷A,因而在人體中具有類似的治療功效。?

背景技術

白頭翁藥材取自毛茛科白頭翁屬植物白頭翁(Pulsatilla?chinensis(Bunge)Regel)的干燥根,味苦,性寒。歸胃、大腸經,具清熱解毒,涼血止痢之功。用于熱毒血痢,陰癢帶下,阿米巴痢。據文獻報道,白頭翁中含原白頭翁素(Protoanemonin)、白頭翁素(Anemonin)、白頭翁靈(Okinalin,C32H46O2)、白頭翁英(Okinalein,C4H6O2)等,近年來國內外學者從白頭翁屬植物中分離鑒定出幾十種五環三萜皂苷成分,這些皂苷主要為齊墩果烷型和羽扇豆烷型兩種。蔡鷹等通過細胞計數法,MTT法,集落形成實驗,研究了白頭翁水提液和醇提液的體外抗腫瘤作用,顯示水提液、醇提液有直接細胞毒作用,并和時間、劑量呈正相關,且水提液作用比醇提液強,表明白頭翁抗腫瘤活性成分系水溶性物質,亦可部分溶于乙醇中。鐘邱等研究了白頭翁總皂苷的體外抑制腫瘤細胞生長的生物活性,發現其對人肝癌7721、人宮頸癌HeLa生長有抑制作用。?

白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A)的化學名為23-羥基齊墩果酸-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷,其結構式如下圖所示。Mimaki?Y等于1999年報道白頭翁皂苷A在體外對人類血癌HL-60細胞顯示中等強度的抑制活性,而未進行更深入的研究。目前關于白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A)在任何一種癌癥治療方面的研究還沒有報道,我們通過系統的體內外實驗研究,首先發現其對胃癌、肝癌、肺癌等多種癌癥具有良好的治療作用。?

發明內容

本發明目的是提供一種白頭翁皂苷類物質的制備方法及其制劑的制備方法與其在制備治療癌癥藥物中的應用。?

本發明的技術方案是:?

白頭翁皂苷類物質在制備治療癌癥藥物中的應用,其中:該白頭翁皂苷類物質是白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A),白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A)的化學名為23-羥基齊墩果酸-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷。?

白頭翁皂苷類物質在制備治療癌癥藥物中的應用,其中:該白頭翁皂苷類物質是水解后會產生白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A)的物質。?

白頭翁皂苷類物質在制備治療癌癥藥物中的應用,其中:該白頭翁皂苷類物質是水解后會產生白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A)的物質,該物質是白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A)的化學名為23-羥基齊墩果酸-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷中的皂苷元的第28位的羧基中的氫被脂肪鏈烷烴基、環鏈烷烴基、芳香族取代基、酰胺基中的任意一種取代。?

28位羧基與脂肪鏈烷烴基、環鏈烷烴基、芳香族取代基、酰胺基形成酯鍵或酰胺鍵,易水解得到白頭翁皂苷A。?

白頭翁皂苷類物質在制備治療癌癥藥物中的應用,其中:該白頭翁皂苷類物質是水解后會產生白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A)的物質,該物質是白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A)的化學名為23-羥基齊墩果酸-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷中的皂苷元的第23位的羥基中的氫被酰胺基中的任意一種取代。?

23位羥基與酰胺基形成酰胺鍵,易水解得到白頭翁皂苷A。?

白頭翁皂苷類物質在制備治療癌癥藥物中的應用,其中:所涉及的癌癥是胃癌、肝癌、肺癌中的任意一種。?

白頭翁皂苷類物質在制備治療癌癥藥物中的應用,其中:所述藥物包括口服液、片劑、膠囊、涂劑、巴布劑、噴霧劑和注射劑等各種劑型。?

白頭翁皂苷類物質在制備治療癌癥藥物中的應用,其中:所述藥物還包括各種單方和復方制劑。?

白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A)的制備方法為:將白頭翁藥材粉碎成粗粉,用0-95%乙醇浸泡0.5-2h,6-12倍量加熱回流提取2-3次,每次1-3h,過濾,合并濾液。上述濾液于50-70℃減壓濃縮至0.5-1.0g生藥材/mL,0-4℃冷藏過夜,析膠,濾過,濾渣上減壓硅膠柱,上樣后依次用二相或多相有機溶劑梯度洗脫,以白頭翁皂苷A作為對照品TLC檢測,合并相應流份。上述流份于50-70℃減壓蒸干,適量乙醇溶解,濾過,減壓回收乙醇至含醇量為10-40%之間,0-4℃冷藏過夜,析膠,濾過,濾液中加入適量的聚酰胺,攪拌0.5-4h,靜置4-12h,濾過,濾液中再加入適量的活性炭,攪拌0.5-4h,靜置4-12h,濾過,濾液用噴霧干燥法進行干燥,收集噴干粉,以10-40%乙醇重結晶,即得。?

提供白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A)的制備方法及其在各種癌癥治療藥物中的用途。所述藥物包括口服液、膠囊、涂劑、巴布劑、噴霧劑和注射劑等,所述藥物還包括各種單方和復方制劑。?

盡管白頭翁及其提取物在臨床上已用于治療用于熱毒血痢,陰癢帶下,阿米巴痢,但目前還沒有文獻報道白頭翁所含單體成分白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A)可通過口服、鼻(口)粘膜噴霧、透皮給藥和注射給藥能治療癌癥,尤其是胃癌、肝癌、肺癌方面的報道。我們研究發現白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A)在體外對多種人源性瘤株具有較強的生物活性,尤其對胃癌、肝癌、肺癌的細胞毒活性更強,在此基礎上,我們通過裸鼠動物實驗系統地考察了白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A)對人MKN45胃癌、7402肝癌、A549肺癌裸鼠等的體內生物活性,均表現出很好的治療作用。這一發現,將對胃癌、肝癌、肺癌的研究和藥物開發產生重大的影響,并具有臨床實用價值,為胃癌、肝癌、肺癌等腫瘤疾病提供新的治療藥物。?

本發明的優點是:?

1.白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A)在體內外對多種人源性瘤株均表現出較強的生物活性,尤其對胃癌、肝癌、肺癌的活性更強。?

2.白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A)在胃癌、肝癌、肺癌等多種癌癥治療中安全性好,治療系數(LD50/ED50)>10。?

3.白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A)多種給藥途徑包括皮膚給藥、口服、口(鼻)粘膜噴霧和注射等均有效,優選注射給藥途徑及口服。?

4.白頭翁皂苷A的制備方法主要通過從天然藥物中提取,為純天然組分,具有良好的生物相容性。?

附圖說明

圖1是白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A)的分子結構式;?

圖2是白頭翁皂苷A的核磁共振碳譜圖;?

圖3是白頭翁皂苷A的核磁共振氫譜圖;?

圖4是白頭翁皂苷A的核磁共振電噴霧質譜圖。?

具體實施例

下面結合實施例對本發明作進一步描述:?

實施例一、白頭翁皂苷A的制備方法,其中:將白頭翁藥材粉碎成粗粉,用50%乙醇浸泡0.5h,12倍量加熱回流提取3次,每次1.5h,過濾,合并濾液。上述濾液于70℃減壓濃縮至1.0g生藥材/mL,0-4℃冷藏過夜,析膠,濾過,收集濾渣,晾干,乙醇溶解,加入濾渣量的60-100目硅膠拌勻,常溫匯干溶劑,研勻,干法上樣,減壓硅膠(60-100目,硅膠用量為濾渣量的20倍)柱層析,用二氯甲烷-甲醇梯度洗脫,以白頭翁皂苷A作為對照品TLC檢測,合并相應流份。上述流份于70℃減壓蒸干,適量乙醇溶解,濾過,減壓回收至含醇量為20%,0-4℃冷藏過夜,析膠,濾過,濾液中加入生藥量5%聚酰胺,攪拌0.5-4h,靜置4-12h,濾過,濾液中再加入生藥量2%的活性炭,攪拌0.5-4h,靜置4-12h,濾過,濾液用噴霧干燥法進行干燥,收集噴干粉,以20%乙醇重結晶,即得。采用上述方法制備白頭翁皂苷A的得率約為0.05-0.1g/kg藥材,經HPLC檢測純度為98.2%,?

其中:白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A)的化學名為23-羥基齊墩果酸-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷。?

色譜條件:色譜柱:Diamonsil?C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm);流動相:甲醇-水(75∶25);流速:1.0mL/min;柱溫:35℃;進樣量20ml;ELSD檢測器:SHIMADZU?ELSD-LT?Ⅱ型檢測器;檢測溫度:40℃;ELSD載氣:高純氮氣:載氣壓力:0.35MPa。?

實施例二、白頭翁皂苷A的制備方法,其中:將白頭翁藥材粉碎成粗粉,用50%乙醇浸泡0.5h,12倍量加熱回流提取3次,每次1.5h,過濾,合并濾液。上述濾液于70℃減壓濃縮至1.0g生藥材/mL,0-4℃冷藏過夜,析膠,濾過,收集濾渣,晾干,乙醇溶解,加入濾渣量的60-100目硅膠拌勻,常溫匯干溶劑,研勻,干法上樣,減壓硅膠(60-100目,硅膠用量為濾渣量的20倍)柱層析,用二氯甲烷-甲醇梯度洗脫,以白頭翁皂苷A作為對照品TLC檢測,合并相應流份。上述流份于70℃減壓蒸干,適量乙醇溶解,濾過,減壓回收至含醇量為20%,0-4℃冷藏過夜,析膠,濾過,濾液中加入生藥量5%聚酰胺,攪拌0.5-4h,靜置4-12h,濾過,濾液中再加入生藥量2%的活性炭,攪拌0.5-4h,靜置4-12h,濾過,濾液用噴霧干燥法進行干燥,收集噴干粉,以30%乙醇重結晶,即得。采用上述方法制備白頭翁皂苷A的得率約為0.05-0.1g/kg藥材,經HPLC檢測純度為95%。?

其中:白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A)的化學名為23-羥基齊墩果酸-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷。?

色譜條件:色譜柱:Diamonsil?C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm);流動相:甲醇-水(75∶25);流速:1.0mL/min;柱溫:35℃;進樣量20ml;ELSD檢測器:SHIMADZU?ELSD-LT?Ⅱ型檢測器;檢測溫度:40℃;ELSD載氣:高純氮氣:載氣壓力:0.35MPa。?

實施例三、白頭翁皂苷A的制備方法,其中:將白頭翁藥材粉碎成粗粉,用50%乙醇浸泡0.5h,12倍量加熱回流提取3次,每次1.5h,過濾,合并濾液。上述濾液于70℃減壓濃縮至1.0g生藥材/mL,0-4℃冷藏過夜,析膠,濾過,收集濾渣,晾干,乙醇溶解,加入濾渣量的60-100目硅膠拌勻,常溫匯干溶劑,研勻,干法上樣,減壓硅膠(60-100目,硅膠用量為濾渣量的20倍)柱層析,用二氯甲烷-甲醇梯度洗脫,以白頭翁皂苷A作為對照品TLC檢測,合并相應流份。上述流份于70℃減壓蒸干,適量乙醇溶解,濾過,減壓回收至含醇量為20%,0-4℃冷藏過夜,析膠,濾過,濾液中加入生藥量5%聚酰胺,攪拌0.5-4h,靜置4-12h,濾過,濾液中再加入生藥量2%的活性炭,攪拌0.5-4h,靜置4-12h,濾過,濾液用噴霧干燥法進行干燥,收集噴干粉,以40%乙醇重結晶,即得。采用上述方法制備白頭翁皂苷A的得率約為0.05-0.1g/kg藥材,經HPLC檢測純度為94.4%。?

其中:白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A)的化學名為23-羥基齊墩果酸-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷。?

色譜條件:色譜柱:Diamonsil?C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm);流動相:甲醇-水(75∶25);流速:1.0mL/min;柱溫:35℃;進樣量20ml;ELSD檢測器:SHIMADZU?ELSD-LT?Ⅱ型檢測器;檢測溫度:40℃;ELSD載氣:高純氮氣:載氣壓力:0.35MPa。?

實施例四-1、白頭翁皂苷A的制備方法,其中:將白頭翁藥材粉碎成粗粉,用10%乙醇浸泡0.5h,6倍量加熱回流提取2次,每次1h,過濾,合并濾液。上述濾液于50℃減壓濃縮至0.5g生藥材/mL,0℃冷藏過夜,析膠,濾過,濾渣上減壓硅膠柱,上樣后依次用三氯甲烷-甲醇梯度洗脫,以白頭翁皂苷A作為對照品TLC檢測,合并相應流份。上述流份于50℃減壓蒸干,適量乙醇溶解,濾過,減壓回收乙醇至含醇量為10%之間,0℃冷藏過夜,析膠,濾過,濾液中加入適量的聚酰胺,攪拌0.5h,靜置4h,濾過,濾液中再加入適量的活性炭,攪拌0.5h,靜置4h,濾過,濾液用噴霧干燥法進行干燥,收集噴干粉,以10%乙醇重結晶,即得,經HPLC檢測純度為96.7%。其余同實施例1。?

實施例四-2、白頭翁皂苷A的制備方法,其中:將白頭翁藥材粉碎成粗粉,用95%乙醇浸泡2h,12倍量加熱回流提取3次,每次3h,過濾,合并濾液。上述濾液于70℃減壓濃縮至1.0g生藥材/mL,4℃冷藏過夜,析膠,濾過,濾渣上減壓硅膠柱,上樣后依次用三氯甲烷-甲醇梯度洗脫,以白頭翁皂苷A作為對照品TLC檢測,合并相應流份。上述流份于70℃減壓蒸干,適量乙醇溶解,濾過,減壓回收乙醇至含醇量為40%之間,4℃冷藏過夜,析膠,濾過,濾液中加入適量的聚酰胺,攪拌4h,靜置12h,濾過,濾液中再加入適量的活性炭,攪拌4h,靜置12h,濾過,濾液用噴霧干燥法進行干燥,收集噴干粉,以40%乙醇重結晶,即得,經HPLC檢測純度為94.5%。其余同實施例1。?

實施例四-3、白頭翁皂苷A的制備方法,其中:將白頭翁藥材粉碎成粗粉,用50%乙醇浸泡1h,8倍量加熱回流提取2.5次,每次2h,過濾,合并濾液。上述濾液于60℃減壓濃縮至0.7g生藥材/mL,3℃冷藏過夜,析膠,濾過,濾渣上減壓硅膠柱,上樣后依次用三氯甲烷-甲醇梯度洗脫,以白頭翁皂苷A作為對照品TLC檢測,合并相應流份。上述流份于60℃減壓蒸干,適量乙醇溶解,濾過,減壓回收乙醇至含醇量為30%之間,3℃冷藏過夜,析膠,濾過,濾液中加入適量的聚酰胺,攪拌3h,靜置6h,濾過,濾液中再加入適量的活性炭,攪拌3h,靜置6h,濾過,濾液用噴霧干燥法進行干燥,收集噴干粉,以30%乙醇重結晶,即得,經HPLC檢測純度為93.8%。其余同實施例1。?

實施例五、白頭翁皂苷A在制備治療癌癥藥物中的應用,其中:白頭翁皂苷A含量為93%以上。其余同實施例一。?

實施例六、所述白頭翁皂苷A制成的制劑,其中:該白頭翁皂苷A中皂苷類成分與藥物輔料配制成藥劑學上的各種制劑。其余同實施例四至五中的任意一項。?

實施例七、所述白頭翁皂苷A制成的制劑,其中:該白頭翁活性組分中皂苷類成分在制劑中的分散狀態可以是液體,也可以是固體。其余同實施例六。?

實施例八、所述的白頭翁抗腫瘤活性組分,其中:該制劑的給藥途徑可以是口服、注射和局部給藥。其余同實施例八。?

實施例九、白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A)的制備方法,其中:將白頭翁藥材粉碎成粗粉,用水浸泡0.5-2h,6-12倍量水加熱回流提取2次,每次1h,過濾,合并濾液。上述濾液于50℃減壓濃縮至0.5g生藥材/mL,0℃冷藏過夜,析膠,濾過,濾渣上減壓硅膠柱,上樣后依次三氯甲烷-甲醇梯度洗脫,以白頭翁皂苷A作為對照品TLC檢測,合并相應流份。上述流份于50℃減壓蒸干,適量乙醇溶解,濾過,減壓回收乙醇至含醇量為10%之間,0℃冷藏過夜,析膠,濾過,濾液中加入適量的聚酰胺,攪拌0.5h,靜置4h,濾過,濾液中再加入適量的活性炭,攪拌0.5h,靜置4h,濾過,濾液用噴霧干燥法進行干燥,收集噴干粉,以10%乙醇重結晶,即得。白頭翁抗腫瘤活性組分中皂苷類成分含量為93.9%;白頭翁抗腫瘤活性組分中皂苷類成分含量的測定方法同實施例一。?

實施例十、白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A)的制備方法,其中:將白頭翁藥材粉碎成粗粉,用95%乙醇浸泡2h,12倍量加熱回流提取3次,每次3h,過濾,合并濾液。上述濾液于70℃減壓濃縮至1.0g生藥材/mL,4℃冷藏過夜,析膠,濾過,濾渣上減壓硅膠柱,上樣后依次用三氯甲烷-甲醇梯度洗脫,以白頭翁皂苷A作為對照品TLC檢測,合并相應流份。上述流份于70℃減壓蒸干,適量乙醇溶解,濾過,減壓回收乙醇至含醇量為40%之間,4℃冷藏過夜,析膠,濾過,濾液中加入適量的聚酰胺,攪拌4h,靜置12h,濾過,濾液中再加入適量的活性炭,攪拌4h,靜置12h,濾過,濾液用噴霧干燥法進行干燥,收集噴干粉,以40%乙醇重結晶,即得。白頭翁抗腫瘤活性組分中皂苷類成分含量為96.6%;白頭翁抗腫瘤活性組分中皂苷類成分含量的測定方法同實施例一。?

實施例十一、白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A)的制備方法,其中:將白頭翁藥材粉碎成粗粉,用75%乙醇浸泡0.9h,10倍量加熱回流提取3次,每次2h,過濾,合并濾液。上述濾液于60℃減壓濃縮至0.7g生藥材/mL,2℃冷藏過夜,析膠,濾過,濾渣上減壓硅膠柱,上樣后依次用三氯甲烷-甲醇梯度洗脫,以白頭翁皂苷A作為對照品TLC檢測,合并相應流份。上述流份于60℃減壓蒸干,適量乙醇溶解,濾過,減壓回收乙醇至含醇量為20%之間,2℃冷藏過夜,析膠,濾過,濾液中加入適量的聚酰胺,攪拌2h,靜置6h,濾過,濾液中再加入適量的活性炭,攪拌2h,靜置8h,濾過,濾液用噴霧干燥法進行干燥,收集噴干粉,以30%乙醇重結晶,即得。白頭翁抗腫瘤活性組分中皂苷類成分含量為97.7%;白頭翁抗腫瘤活性組分中皂苷類成分含量的測定方法同實施例一。?

實施例十二、用本發明實施例一或實施例二或實施例三或實施例四或實施例五、實施例九、實施例十、實施例十一中的方法制備的白頭翁皂苷A為原料,或者其他方式獲得的白頭翁皂苷A為原料進行下列制劑制備。?

1、片劑制備?

處方(50片):?

成分????????????????重量(g)?

白頭翁皂苷A?????????5.0?

乳糖????????????????4.8?

糊精????????????????9?

微晶纖維素??????????6?

硬脂酸鎂????????????0.2?

按照常規片劑的操作方法,以上混合均勻,濕法制粒,最后加入硬脂酸鎂混合均勻壓制成每片500mg。?

2、膠囊制備?

處方(90粒):?

成分????????????????重量(g)?

白頭翁皂苷A?????????9?

乳糖????????????????6?

糊精????????????????9?

微晶纖維素??????????6?

按照常規片劑的操作方法,以上混合均勻,濕法制粒,灌裝成膠囊,每粒300mg。?

3、巴布劑制備?

處方:?

成分????????????????重量(g)?

白頭翁皂苷A?????????2?

聚丙烯酸酯??????????18?

月桂氮卓酮??????????0.6?

月桂酸??????????????1.8?

丙二醇??????????????5.4?

乙酸乙酯????????????15?

按照通常巴布劑的做作進行,將上述攪拌均勻,涂布于聚酯防粘層上,60度干燥2分鐘后,覆蓋聚氨基甲酯膜背襯層,切片即可。?

4、粉針劑制備?

處方:?

成分????????????????重量(g)?

白頭翁皂苷A?????????0.05?

鹽酸????????????????適量?

甘露醇????????????50?

按照常規凍干粉針的操作進行,將本發明白頭翁皂苷A加適量注射用水溶解,加入甘露醇,定容至1000ml,調節PH值至4.0-5.5之間,除菌過濾,冷凍干燥即得。?

5、水針劑的制備?

白頭翁皂苷A,溶于適量注射用水中,加入計量的注射用水溶性輔料,加0.1-0.5%的活性炭除去熱原,調節PH至6.0-7.5,經微孔濾膜超濾后,補充注射用水至規定量,灌裝于安瓿瓶中或輸液瓶中,熔封/軋蓋,經檢驗合格后,包裝即得。?

6、亞微乳注射劑的制備?

白頭翁皂苷A,溶于適量注射用水中,加入計量的注射用水溶性輔料,加0.1-0.5%的活性炭除去熱原,調節PH至6.0-7.5,經微孔濾膜超濾后,補充注射用水至規定量,灌裝于安瓿瓶中或輸液瓶中,熔封/軋蓋,經檢驗合格后,包裝即得。?

實施例十三、用本發明實施例一中的方法制備的白頭翁皂苷A原料,進行抗腫瘤藥效學研究。

本實驗方案中涉及的PSA代表的是白頭翁皂苷A。?

1祛邪作用?

1.1對動物移植性腫瘤的抑制作用?

采用7402肝癌裸鼠、MKN45胃癌裸鼠和A549肺癌裸鼠模型,考察白頭翁皂苷A(PSA)的體內抗腫瘤作用?

分別將接種好的裸鼠,隨機分為陽性對照組(環磷酰胺)、溶劑對照組(空白對照)、本發明白頭翁皂苷A(PSA)高、中、低三個劑量組(10,20,40mg/kg),連續腹腔注射給藥10天,環磷酰胺隔天給藥,連續20天,末次給藥24小時后,處死動物,分離腋下腫瘤并稱重,計算腫瘤抑制率。按下式計算抑瘤率:抑瘤率(%)=[(空白對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/空白對照組平均瘤重]×100%。實驗結果如下:?

(1)對7402肝癌的影響:實驗結果顯示PSA(10,20,40mg/kg)可顯著抑制裸鼠的瘤重,三個劑量抑制率分別為41.76、54.11和63.53%,均在30%以上。結果見表2。?

表2白頭翁皂苷A(PSA)對7402肝癌裸鼠的影響?

*P<0.05,**P<0.01與空白對照組相比?

(2)對MKN45胃癌裸鼠的影響:PSA(10,20,40mg/kg)對裸鼠瘤重均有一定的抑制作用。抑制率分別為33.14,52.66,70.41%。結果見表3。?

表3?白頭翁皂苷A(PSA)對MKN45胃癌裸鼠的影響?

*P<0.05,**P<0.01與空白對照組相比?

(3)對A549肺癌裸鼠的影響:第1批實驗結果表明PSA(10,20,40mg/kg)對裸鼠瘤重的抑制率分別為30.82%,48.43%和61.64%,與空白對照組均有顯著差異。結果見表4。?

表4?白頭翁皂苷A(PSA)對小鼠Lewis肺癌的影響?

**P<0.01與空白對照組相比?

2扶正作用?

2.1白頭翁皂苷A(PSA)對荷瘤動物免疫功能的影響?

實驗結果提示白頭翁皂苷A(PSA)可明顯升高荷瘤小鼠的脾指數、脾淋巴細胞轉化率和NK細胞的殺傷活性。?

建立H22荷瘤小鼠動物模型,白頭翁皂苷A(PSA)(10,20,40mg/kg)腹腔注射給藥,連續10天,末次給藥24小時后,將動物處死,取荷瘤小鼠胸腺和脾臟,稱重,分別計算胸腺指數:[胸腺重(mg)/體重(g)]×10,脾指數:[脾重(mg)/體重(g)]×10。另外一部分采用MTT法做小鼠脾淋巴細胞轉化試驗和NK細胞活性的測定實驗。?

(1)對小鼠胸腺指數和脾指數的影響?

與空白對照組相比,PSA(20,40mg/kg)能明顯提高H22荷瘤小鼠的脾指數和胸腺指數,但環磷酰胺卻明顯降低脾指數和胸腺指數。提示,環磷酰胺可引起荷瘤小鼠脾和胸腺萎縮。初步說明PSA在發揮抗癌作用的同時可能提高小鼠的免疫力,結果見表7。?

表7.白頭翁皂苷A(PSA)對H22荷瘤小鼠免疫系統的影響

*P<0.05,**P<0.01,與空白對照組相比?

(2)對外周血免疫細胞的影響?

經計數分析,與空白對照組比較,環磷酰胺組小鼠白細胞總數、淋巴細胞和紅細胞顯著降低(p<0.01),PSA各組小鼠白細胞總數、淋巴細胞、單核細胞和中性粒細胞數有上升的趨勢,但無顯著差異(p>0.05)。提示,環磷酰胺明顯抑制小鼠免疫細胞,而PSA各組與環磷酰胺的作用明顯不同,對小鼠免疫細胞無抑制作用,并有增強免疫功能的趨勢。結果見表8。?

表8?白頭翁皂苷A(PSA)對荷瘤小鼠外周血免疫細胞的影響?

*P<0.05,與空白對照組相比?

(3)對脾淋巴細胞轉化功能的影響?

小鼠脾淋巴細胞經刀豆蛋白刺激后細胞活性顯著增高(p<0.01),而PSA與刀豆蛋白共刺激后細胞活性更高,與刀豆蛋白組比較差異顯著(p<0.01)。實驗結果提示,PSA在體外可提高脾淋巴細胞轉化效率,見表9。?

表9?白頭翁皂苷A(PSA)對H22荷瘤小鼠脾淋巴細胞轉化功能的影響(?n=4)?

**p<0.05與刀豆蛋白組相比?

(4)對NK細胞活性的影響?

實驗結果表明,PSA(2.5,5.0,10.0μg/ml)組NK活性高于正常對照組,提示PSA顯著提高NK細胞的殺傷能力,其作用呈現一定的量效關系,結果見表10。?

表10?PSA對NK細胞活性的影響(?n=4)?

**p<0.01,*p<0.05??與空白對照組相比?

3增效作用?

將小鼠分為空白對照組、PSA(20mg/kg)組、環磷酰胺(30mg/kg)組及PSA(20mg/kg)+CTX(30mg/kg)合用組。取H22小鼠腹水,接種于小鼠右側腋下,接種后隨機分組,第2天起腹腔注射給藥,每天1次,共10天,各組給藥體積均為0.2ml/10g體重,對照組給予相同體積的蒸餾水。末次給藥24h后處死動物,取瘤稱重。按下式計算抑瘤率:抑瘤率(%)=[(對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/對照組平均瘤重]×100%。?

兩藥合用療效是否增強,按Burgi修正公式:q=E(A+B)/[EA+(1-EA)×EB],算出q值,其中E(A+B)為兩藥合用療效發生率;EA和EB分別為A藥和B藥單用的療效發生率;q=0.85~1.15,表示兩藥作用單純相加;q>1.15,表示兩藥有協同作用;q<0.85,表示兩藥作用拮抗。實驗結果如下:?

PSA(20mg/kg)組單用抑瘤率分別為62.58%。環磷酰胺單用抑瘤率分別為67.48%,兩藥和用后抑瘤率為73.62%,提示PSA和環磷酰胺合用,兩藥作用單純相加。結果見表11。?

表11?白頭翁皂苷A(PSA)對H22小鼠瘤重的影響

*P<0.05,**P<0.01,vs空白對照組相比?

4.1PSA對環磷酰胺所致小鼠骨髓抑制的保護作用?

與空白對照組相比,環鱗酰胺可引起骨髓有核細胞和DNA含量明顯減少,呈明顯的骨髓抑制作用(P<0.01),而PSA則能有效地保護環磷酰胺所致的骨髓抑制作用,小鼠骨髓DNA含量及有核細胞數量均可明顯升高(P<0.01),提示,PSA對環鱗酰胺所致骨髓損傷具有一定的保護作用,見表12。?

表12?白頭翁皂苷A(PSA)對環磷酰胺所致小鼠骨髓抑制的保護作用(n=8,)?

*P<0.05,**P<0.01,vs環磷酰胺組比較?

5半數致死量?

采用白頭翁皂苷A粉末,用蒸餾水配制成所需濃度的溶液,采用清潔級小鼠,由蘇州大學實驗動物中心提供。急性毒性實驗結果表明白頭翁皂苷A口服時的半數致死量為1.85g/kg(n=20),腹腔注射時的半數致死量為0.152g/kg(n=20)。?

實施例十四、采用實施例二或實施例三或實施例四-1或實施例四-2或實施例四-3或實施例五、實施例九、實施例十、實施例十一中的方法制備的白頭翁皂苷A為原料,分別進行抗腫瘤活性組分藥效學研究,效果與實施例十類似。?

實施例十五、白頭翁皂苷類物質在制備治療癌癥藥物中的應用,其中:該白頭翁皂苷類物質是白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A),白頭翁皂苷A?(Pulsatilla?saponin?A)的化學名為23-羥基齊墩果酸-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷。?

實施例十六、皂苷類物質在制備治療癌癥藥物中的應用,其中:該白頭翁皂苷類物質是水解后會產生白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A)的物質。?

實施例十七、白頭翁皂苷類物質在制備治療癌癥藥物中的應用,其中:該白頭翁皂苷類物質是水解后會產生白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A)的物質,該物質是白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A)的化學名為23-羥基齊墩果酸-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷中的皂苷元的第28位的羧基中的氫被脂肪鏈烷烴基、環鏈烷烴基、芳香族取代基、酰胺基中的任意一種取代。?

實施例十八、白頭翁皂苷類物質在制備治療癌癥藥物中的應用,其中:該白頭翁皂苷類物質是水解后會產生白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A)的物質,該物質是白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A)的化學名為23-羥基齊墩果酸-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷中的皂苷元的第23位的羥基中的氫被酰胺基中的任意一種取代。?

實施例十九、白頭翁皂苷類物質在制備治療癌癥藥物中的應用,其中:該白頭翁皂苷類物質是水解后會產生白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A)的物質,該物質是白頭翁皂苷A(Pulsatilla?saponin?A)的化學名為23-羥基齊墩果酸-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷中的皂苷元的第23位的羥基中的氫被酰胺基中的任意一種取代。?

實施例二十、白頭翁皂苷類物質在制備治療癌癥藥物中的應用,其中:所涉及的癌癥是胃癌、肝癌、肺癌中的任意一種。?

實施例二十一、白頭翁皂苷類物質在制備治療癌癥藥物中的應用,其中:所述藥物包括口服液、片劑、膠囊、涂劑、巴布劑、噴霧劑和注射劑等各種劑型。?

實施例二十二、白頭翁皂苷類物質在制備治療癌癥藥物中的應用,其中:所述藥物還包括各種單方和復方制劑。?

實施例二十二、白頭翁皂苷類物質在制備治療癌癥藥物中的應用,其中:?

在上述實施例一至二十一每一例中涉及到的有關二氯甲烷-甲醇梯度洗脫的技術內容如下:其中:采用二氯甲烷和甲醇(5∶5-10∶0)的混合液進行梯度洗脫,梯度洗脫液依次有五組,其體積配比分別為?

第一組二氯甲烷5份∶甲醇5份;?

第二組二氯甲烷6份∶甲醇4份;?

第三組二氯甲烷7份∶甲醇3份;?

第四組二氯甲烷8份∶甲醇2份;?

第五組二氯甲烷10份∶甲醇0份。?

實施例二十三、白頭翁皂苷類物質在制備治療癌癥藥物中的應用,其中:?

在上述實施例一至二十一每一例中涉及到的有關二氯甲烷-甲醇梯度洗脫的技術內容如下:其中:采用三氯甲烷和甲醇(5∶5-10∶0)的混合液進行梯度洗脫,梯度洗脫液依次有五組,其體積配比分別為?

第一組三氯甲烷5份∶甲醇5份;?

第二組三氯甲烷6份∶甲醇4份;?

第三組三氯甲烷7份∶甲醇3份;?

第四組三氯甲烷8份∶甲醇2份;?

第五組三氯甲烷10份∶甲醇0份。?

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