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虎駒乙肝膠囊及其制備工藝.pdf

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乙肝 膠囊 及其 制備 工藝
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摘要
申請專利號:

CN200410065020.3

申請日:

20041019

公開號:

CN1634329A

公開日:

20050706

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K35/78,A61K9/48,A61P1/16,A61P31/14 主分類號: A61K35/78,A61K9/48,A61P1/16,A61P31/14
申請人: 淮安天照藥業有限公司
發明人: 張文鵠,夏培元
地址: 210007江蘇省南京市苜蓿園大街天地花園28幢
優先權: CN200410065020A
專利代理機構: 南京天華專利代理有限責任公司 代理人: 徐冬濤;劉成群
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法律狀態
申請(專利)號:

CN200410065020.3

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了虎駒乙肝膠囊及其制備方法。該中藥由虎杖、螞蟻、板藍根、茵陳、黃芪、枸杞子、丹參、五味子、柴胡、大棗、三七等十一味原料藥組成,通過將螞蟻的水煮濃縮液,黃芪、枸杞子、大棗的水煮濃縮液,虎杖、板藍根、丹參、五味子、柴胡、茵陳乙醇提取的濃縮液合并,與螞蟻粉和三七粉混和,干燥,制備而成。本發明提供的中藥組方精當,標本兼治,效果確切,毒副作用小,用藥安全,且螞蟻為資源的有效開發,具有良好的療效和生物利用前景;制備方法中螞蟻進行前處理加工,并根據藥材中護肝、降酶、提高機體免疫功能等作用的有效成分的理化性質分別進行提取分離,其殘渣還用作輔料,可提高主要成分的含量,增加療效,節約成本。

權利要求書

1、虎駒乙肝膠囊,其特征在于它是主要由下列重量份的原料藥制成:虎杖1.77-5.32份,螞蟻0.75-2.3份,板藍根0.89-2.67份,茵陳0.7-2份,黃芪0.45-1.34份,枸杞子0.35-1.06份,丹參0.45-1.34份,三七0.05-0.14份,大棗0.13-0.4份,五味子0.35-1.06份,柴胡0.35-1.06份。2、根據權利要求1所述的虎駒乙肝膠囊,其特征在于各重量份的原料藥優選:虎杖2.66份,螞蟻1.15份,板藍根1.33份,茵陳1份,黃芪0.67份,枸杞子0.53份,丹參0.67份,三七0.07份,大棗0.2份,五味子0.53份,柴胡0.53份。3、根據權利要求1或2所述的虎駒乙肝膠囊,其特征在于所用螞蟻原料為黑螞蟻。4、權利要求1或2所述的虎駒乙肝膠囊的制備工藝,其特征是包含下列步驟:a.按配方取三七用水洗凈后,烘干粉碎,用60-90%乙醇噴濕,密閉放置12-36小時,取出,60-100℃烘干,過50-250目篩,得三七粉,備用;b.按配方取螞蟻除雜質,清洗,加水煎煮1-3次,每次1-3小時,濾過,合并濾液,濃縮至30-60℃時測相對密度為1.1-1.4的濃縮液,藥渣烘干打粉,過30-80目篩,得螞蟻粉,備用;c.按配方取黃芪、枸杞子、大棗加水煎煮1-3次,每次1-3小時,過濾,保留藥渣備用,取濾液合并濃縮至30-60℃時測相對密度為1.1-1.4的濃縮液,備用;d.按配方取虎杖、板藍根、茵陳、丹參、五味子、柴胡及步驟c所得藥渣,加60-90%乙醇回流提取1-3次,每次1-4倍量,提取1-3小時,濾過,合并提取液,濃縮至30-60℃時測相對密度至相對為1.1-1.4的濃縮液,同時,回收乙醇;e.將上述步驟b、c、d所得各濃縮液合并,與步驟a、b所得三七粉、螞蟻粉混勻,干燥,加入適量輔料,制成膠囊劑。5、根據權利要求4所述的制備工藝,其特征是步驟a中三七的粉碎可以是微粉粉碎,過100-250目篩;或常溫細粉粉碎。6、根據權利要求4所述的制備工藝,其特征是將步驟b中所得濃縮液于-10~-20冷凍干燥成粉,備用。7、根據權利要求4所述的制備工藝,其特征是分別將步驟c、d中所得濃縮液噴霧干燥成細粉,備用。8、根據權利要求4所述的制備工藝,其特征是分別將步驟c、d中所得濃縮液干燥,常溫粉碎成細粉,備用。

說明書

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技術領域

本發明涉及一種治療和預防乙型病毒性肝炎的中藥,特別是涉及虎駒乙肝膠囊,本 發明還涉及該藥物的制備工藝。

背景技術

肝炎,尤其是乙型病毒性肝炎,是我國常見病、多發病,嚴重危害人民的身體健康。 祖國醫學認為肝炎多為感受濕熱致病,濕熱病邪,侵入人體,留戀日久,隱伏體內,則 易傷及肝、脾等臟,肝為藏血之臟,濕熱遷延持續不解,必致久病及血,瘀滯肝絡,或 濕瘀互結或熱郁血瘀。脾喜燥惡濕,濕熱邪毒,蘊遏交蒸,肝病及脾,困遏中焦,土壅 木郁,勢必導致肝之疏泄失司,脾之運化失常,而至形成肝郁脾虛,濕熱瘀滯之證。治 療原則是扶正祛邪,調理肝脾,祛邪重點在于清熱利濕,祛瘀解毒,扶正重點在于健脾 養肝,舒達肝氣,使其邪祛正復,以達康復之目的。

西醫也認為,慢性乙型病毒性肝炎的發病機理,一是由于乙肝病毒(外邪)長期存 在,二是機體免疫功能的紊亂,治療原則是抗病毒治療(祛邪)和免疫調節治療(扶正) 兼顧。

目前對乙型病毒性肝炎尚無特效治療藥物,市場上各種藥物也療效不一,各有側重。

發明內容

本發明的目的是提供一種副作用少、療效好、成本低、對乙型病毒性肝炎標本兼治 的虎駒乙肝膠囊。

本發明的另一目的是提供該藥的制備工藝。

本發明的技術方案是利用祖國醫學的明顯優勢,通過多種藥物的有機配伍,達到祛 邪扶正、標本兼治的效果。

本發明由虎杖、螞蟻、板藍根、茵陳、黃芪、枸杞子、丹參、三七、大棗、五味子、 柴胡等十一味中藥組成,其中虎杖清熱解毒,利濕退黃,配以茵陳、柴胡、板藍根,用 其清熱解毒,利膽退黃,抑制病毒,疏肝,解郁止痛,護肝及促進肝細胞的修復作用; 加上黃芪、枸杞子、五味子、大棗,具益氣養陰的補益作用,增強網狀細胞的吞噬作用, 提高機體的免疫功能,達到護肝降酶,防止肝糖元減少的作用;丹參、三七具活血化瘀、 止痛,改善微循環,提高機體耐氧能力,促進組織修復,縮小軟化腫大的肝脾,減少纖 維化程度的作用;螞蟻具扶正固本養肝益腎之功效,也有抗炎護肝作用,螞蟻體內的草 體蟻醛可以調節人體免疫系統功能,螞蟻還含有較多蛋白質、氨基酸及多種維生素、微 量元素及酶、三萜類化合物,具有護肝、降酶、增加免疫機能的作用。

綜上所述,本方以虎杖清熱解毒,利濕退黃,活血化瘀;螞蟻養肝益腎,強身補虛, 二藥合而為君,有利于祛邪與扶正的互補增效。板藍根、茵陳清熱利濕解毒;黃芪、枸 杞子益氣補脾養肝,共為臣藥,前二者助虎杖清除濕熱,后二者助螞蟻補虛強身。佐以 丹參、三七,活血化瘀,護肝通絡,大棗、五味子補脾養肝。柴胡入肝經以疏肝解郁, 理氣調血,為佐而兼使。全方祛邪與扶正相互結合,既能清熱利濕,活血化瘀以除邪, 又能對肝脾兩虛、虛實摻雜的病理特點綜合治療。

本發明的目的可以通過下列措施實現的:

虎駒乙肝膠囊,它是主要由下列重量份的原料藥制成:

虎杖1.77-5.32份,螞蟻0.75-2.3份,板藍根0.89-2.67份,茵陳0.7-2份,黃芪0.45-1.34 份,枸杞子0.35-1.06份,丹參0.45-1.34份,三七0.05-0.14份,大棗0.13-0.4份,五味 子0.35-1.06份,柴胡0.35-1.06份。

所述的虎駒乙肝膠囊,其中各重量份的原料藥優選:

虎杖2.66份,螞蟻1.15份,板藍根1.33份,茵陳1份,黃芪0.67份,枸杞子0.53 份,丹參0.67份,三七0.07份,大棗0.2份,五味子0.53份,柴胡0.53份。

所述的虎駒乙肝膠囊,其中所用螞蟻原料為黑螞蟻。

所述的虎駒乙肝膠囊的制備工藝,包含下列步驟:

a.按配方取三七用水洗凈后,烘干粉碎,用60-90%乙醇噴濕,密閉放置12-36小 時,取出,60-100℃烘干,過50-250目篩,得三七粉,備用;

b.按配方取螞蟻除雜質,清洗,加水煎煮1-3次,每次1-3小時,濾過,合并濾液, 濃縮至30-60℃時測相對密度為1.1-1.4的濃縮液,藥渣烘干打粉,過30-80目篩,得螞 蟻粉,備用;

c.按配方取黃芪、枸杞子、大棗加水煎煮1-3次,每次1-3小時,過濾,保留藥渣 備用,取濾液合并濃縮至30-60℃時測相對密度為1.1-1.4的濃縮液,備用;

d.按配方取虎杖、板藍根、茵陳、丹參、五味子、柴胡及步驟c所得藥渣,加60-90% 乙醇回流提取1-3次,每次1-4倍量,提取1-3小時,濾過,合并提取液,濃縮至30-60 ℃時測相對密度至相對為1.1-1.4的濃縮液,同時,回收乙醇;

e.將上述步驟b、c、d所得各濃縮液合并,與步驟a、b所得三七粉、螞蟻粉混勻, 干燥,加入適量輔料,制成膠囊劑。

所述的制備工藝步驟a中三七的粉碎可以是微粉粉碎,過100-250目篩;或常溫細 粉粉碎。

所述的制備工藝中將步驟b中所得濃縮液于-10~-20冷凍干燥成粉,備用。

所述的制備工藝中分別將步驟c、d中所得濃縮液噴霧干燥成細粉,備用。

所述的制備工藝中分別將步驟c、d中所得濃縮液干燥,常溫粉碎成細粉,備用。

本說明書中的細粉指符合藥典(2001年版)規定的能全部通過五號篩(80目)并 含能通過六號篩(100目)不少于95%的粉末。

本發明的有益效果:

本發明提供的中藥組方精當,標本兼治,效果確切,毒副作用小,用藥安全,且選 用藥物中主藥之一的螞蟻為資源的有效開發,具有良好的療效和生物利用前景,該藥不 但可用于治療和預防乙型病毒性肝炎,而且還具有改善脂肪肝及肝硬化的效果;制備方 法中螞蟻進行前處理加工,并根據藥材中護肝、降酶、提高機體免疫功能等作用的有效 成分的理化性質進行提取分離,其殘渣還用作輔料,提高了主要成份的含量,增加了療 效,節約了成本。

以下通過本發明藥物虎駒乙肝膠囊的動物試驗情況進一步說明本發明的有益效果。

本發明的藥效學試驗:

實驗動物:昆明種小鼠,18-25g;SD大鼠,130-150g;麻鴨,12月齡,平均體重 與性別比例相近,在相同條件下飼養。

實驗藥物:

1、虎駒乙肝膠囊:按實施例1制備,用1%CMC(羧甲基纖維素)配成混懸液,分 別按0.5g/kg(相當于2.34g生藥/kg)和1g/kg(相當于4.67g生藥/kg)給藥。(注:根據 中藥命名規則,“虎駒乙肝膠囊”中的“虎”代表虎杖,“駒”代表玄駒,即螞蟻,以上 兩字表示該藥所用的君藥為虎杖和螞蟻;“乙肝”表示可用于治療和預防乙型病毒性肝 炎;“膠囊”表示劑型。)

2、聯苯雙酯片:江蘇吳江制藥廠生產。

3、阿昔洛韋片:上海黃河制藥廠生產。

方法和結果:

一、虎駒乙肝膠囊對四氯化碳(CCL4)致小鼠肝損傷的影響

取小鼠50只,雌雄各半,體重23±2g,平均分為5組,虎駒乙肝膠囊二組,分別 灌胃給予0.5g/kg和1g/kg,聯苯雙酯組灌胃給予100mg/kg,模型組及正常對照組,分 別灌胃給予蒸餾水,每天一次,連續10天,末次給藥后腹腔注射0.1%CCL4橄欖油10 ml/kg(正常對照組不注射),禁食不禁水,20小時后斷頭處死動物,收集血液,分離血 清,測定天門冬氨酸氨基轉換酶(AST)和丙氨酸氨基轉換酶(ALT),結果見表1,并 取每只動物的同一葉肝臟作病理切片,進行組織形態學檢查。

表1虎駒乙肝膠囊對CCL4致小鼠肝損傷的影響( x±SD?IU/L) 組別 ??劑量(g/kg) ??動物數(只) ??ALT ??AST 正常對照組 ??- ??10 ??39.75±6.51 ??54.93±13.61 模型組 ??- ??10 ??130.25±55.23 ??192.26±57.68 虎駒乙肝膠囊組 ??0.5 ??10 ??80.63±31.65* ??128.68±46.94* 虎駒乙肝膠囊組 ??1.0 ??10 ??54.75±16.78* ??95.78±24.31** 聯苯雙酯組 ??100mg/kg ??10 ??46.18±12.34** ??72.55±18.29**

與模型組比較:*P<0.05??**P<0.01

結果表明,虎駒乙肝膠囊具有明顯的降酶作用,且隨用藥劑量加大而作用增強。

肝臟組織形態學檢查表明,正常組未見異常變化;模型組可見肝小葉結構紊亂,肝 細胞普遍腫脹,且成團排列,并可見小灶性壞死,大部分為溶解性壞死,壞死處有炎性 細胞浸潤,虎駒乙肝膠囊二個組及聯苯雙酯組動物病變程度與范圍較模型組明顯減輕, 肝小葉結構基本完整,肝細胞呈索狀排列,僅有部分肝細胞出現輕度變性和點狀壞死。

二、虎駒乙肝膠囊對CCL4致大鼠肝損傷的影響

取大鼠50只,雌雄各半,體重140±10g,平均分為5組,虎駒乙肝膠囊二組,分 別灌胃給予0.5g/kg和1g/kg,聯苯雙酯組灌胃給予100mg/kg,模型組及正常對照組, 分別灌胃給予蒸餾水,每天一次,連續10天,末次給藥后腹腔注射0.1%CCL4橄欖油 10ml/kg(正常對照組不注射),禁食不禁水,20小時后斷頭取血,分離血清,測定AST 和ALT(結果見表2),并取每只動物的同一葉肝臟作病理切片,進行組織形態學檢查。

表2虎駒乙肝膠囊對CCL4致大鼠肝損傷的影響( x±SD?IU/L)

組別 ??劑量(g/kg) ??動物數(只) ????ALT ????AST 正常對照組 ??- ??10 ????30.71±4.68 ????42.44±8.96 模型組 ??- ??10 ????116.48±41.07 ????171.93±56.38 虎駒乙肝膠囊組 ??0.5 ??10 ????80.24±28.04* ????116.89±43.84* 虎駒乙肝膠囊組 ??1.0 ??10 ????51.87±14.69** ????83.49±35.84** 聯苯雙酯組 ??100mg/kg ??10 ????44.17±12.03** ????65.78±28.81**

與模型組比較:*P<0.05??**P<0.01

結果表明,虎駒乙肝膠囊具有明顯降酶作用,且隨用藥劑量加大而作用增強。肝臟 組織形態學檢查表明,正常組未見異常變化,模型組可見肝細胞腫脹,細胞輪廓不清、 肝竇變窄,并可見小灶性壞死,虎駒乙肝膠囊二個組及聯苯雙酯組動物病變程度與范圍 較模型組明顯減輕,肝細胞僅有部分點狀變性壞死而無灶性壞死。

三、虎駒乙肝膠囊對D-氨基半乳糖致大鼠肝損傷的影響

取大鼠50只,雌雄各半,體重140±10g,平均分為5組,虎駒乙肝膠囊二組,分 別灌胃給予0.5g/kg和1g/kg,聯苯雙酯組灌胃給予100mg/kg,模型組及正常對照組, 分別灌胃給予蒸餾水,每天一次,連續10天,末次給藥后腹腔注射D-氨基半乳糖 400ml/kg(正常對照組不注射),禁食不禁水,20小時后斷頭取血,分離血清,測定AST 和ALT(結果見表3),并取每只動物的同一葉肝臟作病理切片,進行組織形態學檢查。

表3虎駒乙肝膠囊對D-氨基半乳糖致大鼠肝損傷的影響( x±SD?IU/L) 組別 ??劑量(g/kg) ??動物數(只) ????ALT ????AST 正常對照組 ??- ??10 ????42.94±7.86 ????56.78±15.23 模型組 ??- ??10 ????176.34±41.28 ????187.28±51.36 虎駒乙肝膠囊組 ??0.5 ??10 ????135.17±33.65* ????141.46±35.73* 虎駒乙肝膠囊組 ??1.0 ??10 ????67.72±15.53** ????75.09±18.71** 聯苯雙酯組 ??100mg/kg ??10 ????71.42±18.12** ????81.36±20.24**

與模型組比較:*P<0.05??**P<0.01

結果表明,虎駒乙肝膠囊具有明顯降酶作用,且隨用藥劑量加大而作用增強。肝臟 組織形態學檢查表明,正常組未見異常變化,模型組可見肝細胞明顯腫脹,并廣泛壞死, 虎駒乙肝膠囊二個組動物肝臟病變程度明顯輕于模型組,且可見枯氏細胞增生,二組動 物肝損傷程度,大劑量組明顯輕于小劑量組,聯苯雙酯組動物病變程度與虎駒乙肝膠囊 大劑量組相似。

四、虎駒乙肝膠囊對CCL4誘發大鼠肝硬變的影響

取大鼠90只,雌雄各半,體重130±10g,按相近體重分為5組,除正常對照組(不 注射CCL4)為10只外,其余各組均為20只,分別于皮下注射10%CCL4橄欖油5ml/kg, 每周二次,連續3個月,于注射CCL4?3個月起,開始給藥,分別灌胃給予虎駒乙肝膠 囊0.5g/kg、1g/kg、以及聯苯雙酯100mg/kg,模型組及正常對照組分別灌胃給予蒸餾水 10ml/kg,每日一次,連續給藥2個月,末次給藥后24小時,分別取各組10只動物, 斷頭取血,分離血清,測定AST、ALT、總蛋白、白蛋白、A/G比例,結果見表4,并 取各鼠同一葉肝臟作病理切片,進行組織形態學檢查。

表4虎駒乙肝膠囊對CCL4誘發大鼠肝損傷的影響(n=10, x±SD,IU/L) 組別 ??劑量 ??(g/kg ??) ??ALT ??(IU/L) ??AST ??(IU/L) ??總蛋 ??白 ??白蛋 ??白 ??A/G ??????????病理變化 ??變性 ??壞死 ??硬變 正常對照 組 ??- ??28.12 ??±3.87 ??35.83 ??±5.61 ??67.48 ??±5.01 ??36.87 ??±4.10 ??1.20/1 ??0 ??0 ??0 模型組 ??- ??89.76 ??± ????25.39 ??114.37 ??±46.81 ??48.21 ??±7.16 ??21.96 ??±4.93 ??0.84/1 ??10/ ??10 ??6/10 ??7/10 虎駒乙肝 膠囊組 ??0.5 ??78.58 ??± ????18.62 ??87.01 ??±36.42 ??51.35 ??±6.64 ??26.09 ??±5.31 ??1.03/1 ??6/10 ??3/10 ??4/10 虎駒乙肝 膠囊組 ??1.0 ??59.86 ??± ????15.49* ??62.71 ??± ????22.46* ??59.77 ??±8.32* ??32.17 ??±5.64* ??1.17/1 ??4/10 ??1/10 ??2/10 聯苯雙酯 組 ??100 ??mg/kg ??42.51 ??± ????14.38* ??58.64 ??± ????21.76* ??61.18 ??±5.14* ??28.41 ??±4.86* ??1.15/1 ??1/10 ??1/10 ??1/10

與模型組比較:*P<0.05

結果表明,虎駒乙肝膠囊1g/kg組及聯苯雙酯組,具有改善肝功能,降酶及升高蛋 白含量等作用,對肝實質性病理變化有明顯改善作用。

五、虎駒乙肝膠囊對大鼠膽汁分泌量的影響

取大鼠40只,體重250±10g,雌雄各半,先以烏拉坦1g/kg腹腔注射麻醉動物, 分別將動物固定于大鼠固定板上,打開腹腔,于總膽管內插入引流管,收集1小時膽汁, 然后將動物均分為4組,虎駒乙肝膠囊二組分別灌胃給予0.5g/kg、1g/kg、聯苯雙酯組 灌胃給予100mg/kg、空白對照組灌胃給予蒸餾水,給藥后繼續收集膽汁4小時,每小 時記錄膽汁一次,并灌胃給予5%葡萄糖鹽水5ml/kg一次,結果見表5。

表5虎駒乙肝膠囊對大鼠膽汁分泌量的影響( x±SD) 組別 ??劑量 ??(g/kg) ??????????????????????????膽汁流量(ml/h·kg, x±SD) ??動物數 ??(只) ??給藥前 ????????????????????給藥后(h) ??1h ????1 ????2 ????3 ????4 空白對照 組 ??- ??10 ??1.68± ????0.20 ????1.63± ????????0.21 ????1.61± ????????0.19 ????1.46± ????????0.19 ????1.34± ????????0.16 虎駒乙肝 膠囊組 ??0.5 ??10 ??1.63± ????0.18 ????1.79± ????????0.12 ????1.88± ????????0.15** ????1.81± ????????0.11* ????1.61± ????0.09 虎駒乙肝 膠囊組 ??1.0 ??10 ??1.66± ????0.16 ????1.91± ????????0.18 ????2.08± ????????0.21** ????1.85± ????????0.20* ????1.72± ????????0.15 聯苯雙酯 組 ??100mg ??/kg ??10 ??1.61± ????0.15 ????1,75± ????????0.18 ????1.78± ????????0.14 ????1.76± ????????0.17 ????1.74± ????????0.16

給藥前后比較:*P<0.05??**P<0.01

六、虎駒乙肝膠囊對小鼠碳粒廓清功能的影響

取小鼠40只,體重19±1g,雌雄各半,均分為4組,虎駒乙肝膠囊二組分別灌胃 給予0.5g/kg、1g/kg、聯苯雙酯組灌胃給予100mg/kg、空白對照組灌胃給予蒸餾水,每 天一次,連續7天,第8天尾靜脈注射印度墨汁(1∶1.5生理鹽水稀釋)10ml/kg,注 射后1分鐘和5分鐘,分別從眼眶取血20μl,加入0.1%Na2CO3溶液2ml中搖勻,然 后用分光光度計于680nm處比色,測定光密度(OD),同時取各鼠肝臟稱重,并計算廓 清指數(K值)和吞噬指數(a值),結果見表6。

表6虎駒乙肝膠囊對小鼠碳粒廓清功能的影響( x±SD) 組別 ??劑量(g/kg) ??動物數(只) ????K值 ??a值 空白對照組 ??- ??10 ????0.070±0.043 ??0.019±0.008 虎駒乙肝膠囊組 ??0.5 ??10 ????0.093±0.07 ??0.022±0.010 虎駒乙肝膠囊組 ??1.0 ??10 ????0.107±0.09* ??0.031±0.011* 聯苯雙酯組 ??100mg/kg ??10 ????1.100±0.08* ??0.038±0.013*

與空白對照組比較:*P<0.05

結果表明,虎駒乙肝膠囊能明顯提高小鼠碳粒的廓清指數和吞噬指數,表明其對網 狀內皮系統吞噬功能有增強作用。

七、虎駒乙肝膠囊對小鼠血清溶血素形成的影響

取小鼠40只,體重23±1g,雌雄各半,均分為4組,虎駒乙肝膠囊二組分別灌胃 給予0.5g/kg、1g/kg、聯苯雙酯組灌胃給予100mg/kg、空白對照組灌胃給予蒸餾水,每 天一次,連續7天,給藥第3天于每鼠腹腔注射20%綿羊血細胞(SRBC)0.2ml,免疫 后第5天,眼眶取血,分離血清,觀察SRBC半數溶血值(HC50),結果見表7。

表7虎駒乙肝膠囊對小鼠血清溶血素形成的影響( x±SD) 組別 ??劑量(g/kg) ??動物數(只) ??HC50 空白對照組 ??- ??10 ??205±87 虎駒乙肝膠囊組 ??0.5 ??10 ??214±60 虎駒乙肝膠囊組 ??1.0 ??10 ??289±71* 聯苯雙酯組 ??100mg/kg ??10 ??243±64

與空白對照組比較:*P<0.05

結果表明,虎駒乙肝膠囊具有增加小鼠血清溶血素形成的作用。

八、虎駒乙肝膠囊對小鼠血清總補體活性的影響

取小鼠40只,體重23±1g,雌雄各半,均分為4組,虎駒乙肝膠囊二組分別灌胃 給予0.5g/kg、1g/kg、聯苯雙酯組灌胃給予100mg/kg、空白對照組灌胃給予蒸餾水,每 天一次,連續7天,然后用50%溶血試驗法測定血清中總補體活性,結果見表8。

表8虎駒乙肝膠囊對小鼠血清總補體活性的影響( x±SD) 組別 ??劑量(g/kg) ??動物數(只) ??血清總補體含量(單位/ml) 空白對照組 ??- ??10 ??64.6±18.7 虎駒乙肝膠囊組 ??0.5 ??10 ??70.2±21.5 虎駒乙肝膠囊組 ??1.0 ??10 ??86.3±20.9* 聯苯雙酯組 ??100mg/kg ??10 ??72.6±23.4

與空白對照組比較:*P<0.05

結果表明,虎駒乙肝膠囊大劑量組具有增加小鼠血清總補體活性的作用。

九、虎駒乙肝膠囊對二硝基氟苯(DNFB)誘發小鼠遲發型變態反應的影響

取小鼠40只,體重22±1g,雌雄各半,先將動物腹部脫毛(3×3cm2),然后均分 為4組,虎駒乙肝膠囊二組分別灌胃給予0.5g/kg、1g/kg、聯苯雙酯組灌胃給予100mg/kg、 空白對照組灌胃給予蒸餾水,每天一次,連續5天,給藥第一天于各鼠腹部脫毛處均勻 涂抹1%DNFB50μl,致敏動物,致敏后第5天,將1%DNFB10μ1,均勻涂抹于小鼠 右耳進行攻擊,24小時后處死動物,用直徑為9mm的打孔器分別取耳片一塊(左右耳 相同部位),進行稱重,同時取各鼠脾臟稱重,以左右耳片重量之差為腫脹度,并以每 10g小鼠的脾重(mg)作為脾指數,最后計算組間差異,結果見表9。

表9虎駒乙肝膠囊對二硝基氟苯誘發小鼠遲發型變態反應的影響( x±SD) 組別 ??劑量(g/kg) ??動物數(只) ??耳重差(mg) ??脾指數(mg) 空白對照組 ??- ??10 ??3.375±1.93 ??40.01±9.68 虎駒乙肝膠囊組 ??0.5 ??10 ??1.816±0.89* ??52.32±14.21* 虎駒乙肝膠囊組 ??1.0 ??10 ??1.065±0.678** ??63.48±21.53** 聯苯雙酯組 ??100mg/kg ??10 ??2.045±0913* ??49.47±16.58*

與空白對照組比較:*P<0.05??**P<0.01

結果表明,虎駒乙肝膠囊明顯抑制由二硝基氟苯誘發的小鼠遲發型變態反應。

小結:

上述實驗結果表明,虎駒乙肝膠囊對由CCL4、D-氨基半乳糖引起的小鼠、大鼠肝 損傷,具有明顯的降酶作用和改善肝臟組織病變作用,其作用強度均隨用藥劑量增加而 加大,另外,虎駒乙肝膠囊還具有一定的調節免疫功能的作用和利膽作用。

十、本發明對鴨乙型肝炎動物模型的藥物抑制試驗

采用垂直傳播感染鴨乙型肝炎病毒(DHBV)、DHBV-DNA檢測陽性麻鴨,分設6 組,各組均為12只隨機選擇的十二月齡麻鴨,虎駒乙肝膠囊低、中、高三個劑量(分 別為0.2g/kg、0.6g/kg、1.8g/kg)組和陽性藥物(阿昔洛韋100mg/kg)對照組,口腔途 徑喂飼給藥,每周隔日3次給藥,連續12周;DHBV-DNA(+)對照組和DHBV-DNA (-)對照組均喂飼乳酶生片劑各一粒,連續十二周。以上各組麻鴨分別在給藥前、給 藥后第四周、第八周、第十二周和停藥后第二周靜脈采血,根據陳淵卿等建立的方法(陳 淵卿等,中華傳染病雜志[1983]1(2)163),作血清的DHBV-DNA斑點雜交試驗(結果 見表10)。在停藥的第二周,各組麻鴨同時放血致死取肝臟,并置福爾馬林固定液和2.5% 戊二醛固定液保存,分別作鴨肝常規病理檢查(結果見表11及圖1-6)和電鏡檢查(結 果見圖7-12)。

表10虎駒乙肝膠囊對麻鴨血清DHBV-DNA含量的影響 ????組別 ????劑量 ??動物 ??編號 ??????????????????????????采血時間 ??統計 ??學檢 ??驗 ?????給藥前 ???????????給藥后 ?停藥后 第4周 ??第8周 ??第12周 ??第2周 虎駒乙肝膠 囊低劑量組 ??0.2g/kg ??A1 ++ + - - +++ ??P<0.05 ??A2 + - + - - ??A3 ++ +++ +++ + + ??A4 + + + + - ??A5 + - - - - ??A6 + ++ +++ - + ??A7 + + + - - ??A8 + + +++ - + ??A9 + + - - - ??A10 + - - - - ??A11 + +++ + ++ +++ ??A12 +++ ++ + - - 虎駒乙肝膠 囊中劑量組 ??0.6g/kg ??B1 ++ ++ ++ - + ??P<0.05 ??B2 +++ ++ ++ + ++ ??B3 + - ++ - - ??B4 + ++ ++ ++ - ??B5 + - - - - ??B6 + + - - + ??B7 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ??B8 + + + +++ ++ ??B9 +++ ++ +++ + ++ ??B10 + +++ ++ ++ + ??B11 ++ + - - - ??B12 ++ + ++ - ++ 虎駒乙肝膠 囊高劑量組 ??1.8g/kg ??C1 + + ++ + ++ ??P<0.05 ??C2 +++ + - - - ??C3 + ++ ++ + ++ ??C4 ++ + +++ +++ +++ ??C5 + + ++ - - ??C6 + - - - - ??C7 + + ++ - + ??C8 + + + - - ??C9 + - - - - ??C10 + - + - +++ ??C11 + + + + - ??C12 + ++ + + + DHBV-DN ??D1 + + + ++ ++++ ??P>0.05

??A(+)對照 ??組 D2 + - - - - D3 +++ - + ++ + D4 +++ ++++ ++++ + - D5 ++ +++ + + + D6 ++ + + + + D7 + + + + + D8 ++ ++ +++ +++ ++ D9 + + + + + D10 + + + + + D11 + + + + - D12 ++++ ++ +++ +++ ++++ ??DHBV-DN ??A(+)對照 ??組 E1 - - - - - P>0.05 E2 - ++ - - + E3 - - - - - E4 - - - - - E5 - - - - - E6 - - - - - E7 - - - - - E8 - - - - - E9 - - - - - E10 - - - - - E11 - - - - - E12 - - - - - ??阿昔洛韋對 ??照組 ??100mg/ ??kg F1 ++++ - + + - P<0.01 F2 +++ - + + + F3 +++ + - - + F4 ++ + + + ++ F5 + - - - - F6 + - - - - F7 + - - - - F8 + - - - + F9 + - - - - F10 + - + + + F11 ++ - - - +++ F12 + - + + +

表中++++相當于DHBV-DNA含量為100pg;+++為50pg;++為25pg;+為10pg。

表列數據經自然對數轉換后作為方差分析,用藥前后有顯著性差異。

結果表明,本發明不同劑量組麻鴨血清DHBV-DNA含量在用藥前后有比較明顯的 變化,用藥期間三組的DHBV-DNA平均含量均有不同程度的下降。在用藥12周時, 各組分別有6-9只麻鴨血清DHBV-DNA轉為陰性,轉陰率分別為75%、50%、58.33%, 提示虎駒乙肝膠囊有較明顯的抗病毒作用,能抑制DHBV-DNA的復制,降低血清 DHBV-DNA的含量,此外還發現三個藥物組麻鴨的血清DHBV-DNA含量即使在停藥 后第2周仍能基本維持于停藥時的水平,未見某些藥物(如膦甲酸鈉和阿昔洛韋)所常 見的停藥后明顯“反跳”或回升現象,表明虎駒乙肝膠囊有較好的持續抑制病毒復制的 作用。本實驗中,DHBV-DNA(+)對照組麻鴨血清DHBV-DNA含量雖略有變化,統 計學檢驗無顯著性意義,但與藥物組的變化相比有明顯差別。

表11光鏡下實驗組和對照組鴨肝病理炎癥變化比較 ??組別 ???????????????????????????等級權重 ??合計 ??加權平 ??均 ????± ??±~+ ??+ ????+~++ ????++ ??++~+++ ????0.25 ??0.5 ??1.0 ????1.5 ????2.0 ????2.5 ??DHBV-DNA(-)組 ????2 ??5 ??5 ????0 ????0 ????0 ??12 ??0.5625 ??DHBV-DNA(+)組 ????0 ??2 ??6 ????0 ????1 ????3 ??12 ??1.0833 ??阿昔洛韋組 ????2 ??4 ??3 ????3 ????0 ????0 ??12 ??0.6458 ??虎駒乙肝膠囊低劑量組 ????0 ??4 ??7 ????1 ????0 ????0 ??12 ??0.6475 ??虎駒乙肝膠囊中劑量組 ????0 ??6 ??5 ????1 ????0 ????0 ??12 ??0.6458 ??虎駒乙肝膠囊高劑量組 ????0 ??6 ??4 ????1 ????0 ????0 ??12 ??0.6363

結果表明,光鏡下DHBV-DNA(+)組麻鴨肝組織炎性改變介于“±~+++”之間, 平均加權為1.0833,出現較明顯的炎癥改變,類似慢性遷延性肝炎的變化,主要表現為 肝組織匯管區炎癥和小葉實質炎癥明顯,肝細胞腫脹顯著,竇細胞活躍,匯管區膽管增 生,并有明顯脂肪性變。虎駒乙肝膠囊組的鴨肝病理均有所改善,炎癥減輕,變化向陰 性對照組靠攏,其中尤以中、高劑量組較為明顯。阿昔洛韋組情況與虎駒乙肝膠囊三個 劑量組基本相似。

本發明的毒理學試驗:

一、急性毒性試驗

由于虎駒乙肝膠囊毒性較低,無法測出口服LD50值,且該藥不宜腹腔注射,故以 最大濃度和最大給藥體積進行小鼠口服最大耐受量試驗。

1、小鼠急性毒性試驗

取小鼠50只,雌雄各半,隨機分5組,每組為一個劑量,劑量分別為1.27g/kg、 1.69g/kg、2.25g/kg、3.00g/kg、4.00g/kg,試驗前禁食不禁水,16小時后各組分別按 上述劑量以0.4ml/10g一次灌胃給藥,給藥后連續觀察7天,記錄動物一般情況及死亡 情況,7天后處死動物進行尸檢。

結果:按上述劑量給藥后,各組動物除給藥當天活動減少處,余無異常反應,7天 內各組均未出現死亡,見表12,無法測出LD50值。尸檢各組動物主要臟器,肉眼觀察 未見異常改變。

表12虎駒乙肝膠囊的小鼠LD50測定結果 ??劑量(g/kg) ??對數劑量 ??動物數(只) ??死亡數(只) ??死亡率(%) ??LD50及置倍限 ??1.27 ??0.104 ??10 ??0 ??0 ??未測出 ??1.69 ??0.228 ??10 ??0 ??0 ??2.25 ??0.352 ??10 ??0 ??0 ??3.00 ??0.477 ??10 ??0 ??0 ??4.00 ??0.602 ??10 ??0 ??0

2、最大耐受量試驗

分別取小鼠(體重19±1g)、大鼠(體重220±20g)各20只,雌雄各半,先禁食 16小時,然后用100mg/ml(最大濃度)濃度的虎駒乙肝膠囊混懸液,小鼠按0.4ml/10g 體重、大鼠按2ml/100g體重灌胃給藥,每隔4小時給藥一次,連續給藥3次,給藥后 觀察7天內動物的外觀行為、攝食、糞便和死亡情況及毒性反應,未死亡動物于7天后 處死進行尸檢。

結果:小鼠、大鼠分別連續3次(1天內)給藥后,連續觀察7天,動物無一死亡, 外觀行為無異常,活動自如,無興奮及抑制現象,攝食量分別為小鼠6.5±1.3g/天、大鼠 32.6±4.8g/天,糞便呈顆粒狀,無拉稀現象,毛色柔順有光澤,尸檢示主要臟器肉眼觀察 均無異常改變。結果表明小鼠最大耐受量為12g/kg(折生藥量56.04g/kg),相當于成 人一日劑量的240倍,大鼠最大耐受量為6g/kg,相當于成人一日劑量的120倍(臨床 成人一日口服量為3g/60kg)。

二、長期毒性試驗

SD大鼠160只,體重109.37±19.56g,鼠齡為6周,隨機分為四組,每組40只, 雌雄各半,即空白對照組(給予等體積溶媒1%CMC)及本發明高、中、低劑量組(分 別為1g/kg、2g/kg、4g/kg),每天上下午各灌服一次,灌胃體積為2ml/100g體重,連 續6個月,給藥結束再觀察3周。結果示整個實驗期間,各組動物生長、食飲、活動、 增重、糞便等一般情況均無異常變化;給藥三個月、給藥結束、觀察期結束后三個給藥 劑量組動物均未見明顯毒性反應,血常規、血小板、凝血時間及肝、腎功能等血液生化 指標及病理學檢查與對照組相比無明顯差異(P>0.05)。試驗劑量相當于成人臨床用量 的20、40、80倍,提示本發明用于臨床比較安全。

附圖說明

圖1是DHBV-DNA(-)對照組鴨肝病理切片光鏡照片。

圖2是虎駒乙肝膠囊低劑量組鴨肝病理切片光鏡照片。

圖3是虎駒乙肝膠囊中劑量組鴨肝病理切片光鏡照片。

圖4是虎駒乙肝膠囊高劑量組鴨肝病理切片光鏡照片。

圖5是DHBV-DNA(+)對照組鴨肝病理切片光鏡照片。

圖6是阿昔洛韋對照組鴨肝病理切片光鏡照片。

圖7是DHBV-DNA(-)對照組鴨肝病理切片電鏡照片。

圖8是虎駒乙肝膠囊低劑量組鴨肝病理切片電鏡照片。

圖9是虎駒乙肝膠囊中劑量組鴨肝病理切片電鏡照片。

圖10是虎駒乙肝膠囊高劑量組鴨肝病理切片電鏡照片。

圖11是DHBV-DNA(+)對照組鴨肝病理切片電鏡照片。

圖12是阿昔洛韋對照組鴨肝病理切切片電鏡照片。

具體實施方式

下面通過實施例進一步對本發明加以說明,所列實施例中每份的量均以100克計。

實施例1

配方:虎杖2.66份,黑螞蟻1.15份,板藍根1.33份,茵陳1份,黃芪0.67份,枸 杞子0.53份,丹參0.67份,三七0.07份,大棗0.2份,五味子0.53份,柴胡0.53份。

制備工藝:按配方取三七用水洗凈后,烘干粉碎,用80%乙醇噴濕,密閉放置24 小時,取出,90℃烘干,微粉粉碎,過200目篩,得三七粉,備用;按配方取黑螞蟻除 雜質,清洗,加水煎煮3次,每次2小時,濾過,合并濾液,濃縮至50℃時測相對密度 為1.3的濃縮液備用,藥渣A烘干打粉,過50目篩,得螞蟻粉,備用;按配方取黃芪、 枸杞子、大棗加水煎煮3次,每次2小時,過濾,保留藥渣B備用,取濾液合并濃縮 50℃時測相對密度為1.25的濃縮液,備用;按配方取虎杖、板藍根、茵陳、丹參、五味 子、柴胡及藥渣B,加80%乙醇回流提取3次,每次3倍量,提取2小時,濾過,合并 提取液,回收乙醇,濃縮至50℃時測相對密度至相對為1.3的濃縮液;將上述各濃縮液 合并,與所得三七粉、螞蟻粉混勻,干燥,加入適量輔料,打成細粉,常規工藝制成膠 囊。

實施例2

配方:虎杖1.77份,黑螞蟻2.3份,板藍根2.67份,茵陳2份,黃芪0.45份,枸 杞子0.35份,丹參1.34份,三七0.05份,大棗0.13份,五味子1.06份,柴胡1.06份。

制備工藝:按配方取三七用水洗凈后,烘干粉碎,用60%乙醇噴濕,密閉放置36 小時,取出,70℃烘干,微粉粉碎,過250目篩,得三七粉,備用;按配方取黑螞蟻除 雜質,清洗,加水煎煮2次,每次3小時,濾過,合并濾液,濃縮至30℃時測相對密度 為1.1的濃縮液,濃縮液于-20冷凍干燥后過篩得細粉A備用,另螞蟻藥渣烘干打粉, 過80目篩,得螞蟻粉,備用;按配方取黃芪、枸杞子、大棗加水煎煮2次,每次3小 時,過濾,保留藥渣D備用,取濾液合并濃縮至30℃時測相對密度為1.15的濃縮液, 濃縮液噴霧干燥過篩得細粉B備用;按配方取虎杖、板藍根、茵陳、丹參、五味子、柴 胡及藥渣D,加70%乙醇回流提取3次,每次3倍量,提取2小時,濾過,合并提取液, 濃縮至40℃時測相對密度至相對為1.1的濃縮液,濃縮液噴霧干燥過篩得細粉C備用, 同時,回收乙醇;將細粉A、B、C合并,與所得三七粉、螞蟻粉混勻,加入適量輔料, 常規工藝制成膠囊。

實施例3

配方:虎杖5.32份,黑螞蟻0.75份,板藍根0.89份,茵陳0.7份,黃芪1.34份, 枸杞子1.06份,丹參0.45份,三七0.14份,大棗0.4份,五味子0.35份,柴胡0.8份。

制備工藝:按配方取三七用水洗凈后,烘干粉碎,用90%乙醇噴濕,密閉放置12 小時,取出,60℃烘干,過80目篩,得三七粉,備用;按配方取黑螞蟻除雜質,清洗, 加水煎煮2次,每次3小時,濾過,合并濾液,濃縮至40℃時測相對密度為1.2的濃縮 液備用,藥渣A烘干打粉,過70目篩,得螞蟻粉,備用;按配方取黃芪、枸杞子、大 棗加水煎煮3次,每次2小時,過濾,保留藥渣B備用,取濾液合并濃縮至40℃時測相 對密度為1.25的濃縮液,備用;按配方取虎杖、板藍根、茵陳、丹參、五味子、柴胡及 藥渣B,加60%乙醇回流提取3次,每次3倍量,提取3小時,濾過,合并提取液,回 收乙醇,濃縮至40℃時測相對密度至相對為1.2的濃縮液;將上述各濃縮液合并,與所 得三七粉、螞蟻粉混勻,干燥,加入適量輔料,打成細粉,常規工藝制成膠囊。

實施例4

配方:虎杖3.8份,黑螞蟻2.0份,板藍根1.5份,茵陳1.3份,黃芪0.8份,枸杞 子1.0份,丹參0.8份,三七0.1份,大棗0.18份,五味子0.5份,柴胡0.7份。

制備工藝:按配方取三七用水洗凈后,烘干粉碎,用70%乙醇噴濕,密閉放置24 小時,取出,70℃烘干,過50目篩,得三七粉,備用;按配方取黑螞蟻除雜質,清洗, 加水煎煮3次,每次2小時,濾過,合并濾液,濃縮至60℃時測相對密度為1.1的濃縮 液,藥渣A烘干打粉,過50目篩,得螞蟻粉,備用;按配方取黃芪、枸杞子、大棗加 水煎煮3次,每次2小時,過濾,保留藥渣B備用,取濾液合并濃縮至60℃時測相對 密度為1.1的濃縮液,備用;按配方取虎杖、板藍根、茵陳、丹參、五味子、柴胡及藥 渣B,加80%乙醇回流提取3次,每次3倍量,提取2小時,濾過,合并提取液,回收 乙醇,濃縮至60℃時測相對密度至相對為1.1的濃縮液;將上述各濃縮液合并,與所得 三七粉、螞蟻粉混勻,干燥,加入適量輔料,打成細粉,常規工藝制成膠囊。

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