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一種馬鞭草中提取的治療前列腺炎的馬鞭草提取物.pdf

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一種 馬鞭草 提取 治療 前列腺炎 提取物
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摘要
申請專利號:

CN201110053697.5

申請日:

20110307

公開號:

CN102133302B

公開日:

20120627

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A61K36/85,A61P13/08 主分類號: A61K36/85,A61P13/08
申請人: 河南中醫學院
發明人: 苗明三,張偉奇,白明
地址: 450008 河南省鄭州市金水區金水路1號
優先權: CN201110053697A
專利代理機構: 鄭州天陽專利事務所(普通合伙) 代理人: 聶孟民
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201110053697.5

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及馬鞭草中提取的治療前列腺炎的馬鞭草提取物,可有效解決制備治療前列腺炎的藥物問題,本發明解決的技術方案是,取馬鞭草藥材,粉碎,用乙醇加熱回流提取2次,合并提取液,過濾,減壓濃縮,用蒸餾水分散均勻,冷藏靜置后過濾,取上清液通過大孔吸附樹脂柱,先用蒸餾水洗脫,再用乙醇洗脫,棄去洗脫液,繼用乙醇洗脫,收集乙醇洗脫液,減壓回收乙醇,濃縮干燥,粉碎成細粉得含馬鞭草苷50%以上的馬鞭草提取物,本發明方法簡單,原材料豐富,易生產,提取物馬鞭草苷含量高,可有效實現在制備治療前列腺炎藥物中的應用,是中藥上的創新。

權利要求書

1.一種馬鞭草中提取的治療前列腺炎的馬鞭草提取物,其特征在于,該提取物是,取馬鞭草藥材,粉碎為粗粉,每次加粗粉8倍重量的質量濃度為80%的乙醇加熱回流提取2次,每次2小時,合并提取液,過濾,減壓濃縮至在50℃下相對密度為1.12-1.15的濃縮液,加入濃縮液4倍體積量的蒸餾水分散均勻,冷藏靜置后過濾,取上清液通過HP-20型大孔吸附樹脂柱,先用4倍柱體積的蒸餾水洗脫,再用4倍柱體積的質量濃度為20%的乙醇洗脫,棄去洗脫液,繼用8倍柱體積的質量濃度為80%的乙醇洗脫,收集洗脫液,減壓回收乙醇,濃縮干燥,粉碎成細粉得含馬鞭草苷50%以上的馬鞭草提取物。2.如權利要求1所述的馬鞭草提取物在制備治療前列腺炎藥物中的應用。

說明書

一、技術領域

本發明涉及醫藥,特別是一種馬鞭草中提取的治療前列腺炎的馬鞭草提取物。

二、背景技術

慢性前列腺炎(Chronic?Prostatis?CP)是成年男性生殖系統一種常見病、多發病,約占泌尿科門診病人的40%左右。據統計,35歲以上男性,30%-40%患者有不同程度的慢性前列腺炎。前列腺增生患者,多伴有慢性前列腺炎,為50歲后男性最常見的慢性生殖道感染。表現為尿頻、尿急、尿痛、排尿不盡、排尿困難等排尿異常癥狀,會陰部、下腹部、陰莖陰囊、腰骶部等部位不適或疼痛等癥狀,持續時間超過3個月,可伴有不同程度的排尿癥狀和性功能障礙,并伴精神差、記憶功能減退等神經衰弱癥狀,嚴重影響患者健康狀況和生活質量。

在CP中慢性非細菌性前列腺炎(CNP)的發病是慢性細菌性前列腺炎(CBP)的8倍,好發于中青年男性人群,而前列腺液(EPS)、精液及第三份膀胱中段尿標本(VB3)細菌培養結果陰性,提示可能與其它致病微生物的感染有關。近些年來,關于慢性非細菌性前列腺炎病因的研究很多,提出了很多假說,如微生物因素、免疫反應、尿液返流、心理因素等,但都未取得里程碑式的突破。由于病因和發病機制尚未明確,多以對癥治療為主,亦有針對可能發病機制的治療,如α-受體阻滯劑、花粉制劑、非甾體抗炎藥、皮質類固醇以及物理療法,抗菌治療,精神療法等,方法雖多,但實際的臨床效果卻令人失望。

現代醫學認為,本病纏綿難愈是由于前列腺囊包膜周圍纖維組織以及血-前列腺膜屏障作用,藥物很難到達病所而發揮效用所致。前列腺組織解剖結構特殊,前列腺腺管狹長,尿道病原菌進入后,不易隨分泌物排出和清除,前列腺一血液之間的屏障作用,藥物不易滲透前列腺上皮脂膜進入腺體內,在前列腺中難以達到有效濃度。延誤治療和對抗菌素的耐藥,導致慢性炎癥,而慢性炎性病變又使管腔狹窄,纖維組織增生,細菌長期滯留在前列腺組織內,形成慢性病灶,使其治療難度增大,以致治愈率極低,復發率極高。慢性前列腺炎的發病率在近年來顯上升趨勢,現有的西藥雖有一定的效果,但療效遠遠達不到人們的要求,而且副作用也較多。慢性非細菌性前列腺炎已成為近年來國內外醫學界研究的難點之一。

馬鞭草(Herba?Verbenae)為馬鞭草屬植物馬鞭草(Verbena?officinalis?L.)的地上部分。植物資源豐富,分布于全國各地。味苦性涼,入肝、脾、腎經,具有清熱解毒、涼血散瘀、利水消腫的功效,用于瘧疾、濕熱痢疾泄瀉,癰瘡腫毒,牙齦腫痛,喉痹腫痛,血滯經閉腹痛、癥瘕積聚,水腫腹脹等癥,但至今未見有馬鞭草提取物用于治療前列腺炎的報道。

三、發明內容

針對上述情況,為克服現有技術之缺陷,本發明之目的就是提供一種馬鞭草中提取的治療前列腺炎的馬鞭草提取物,可有效解決制備治療前列腺炎的藥物問題。

本發明解決的技術方案是,取馬鞭草藥材,粉碎,用乙醇加熱回流提取2次,合并提取液,過濾,減壓濃縮,用蒸餾水分散均勻,冷藏靜置后過濾,取上清液通過大孔吸附樹脂柱,先用蒸餾水洗脫,再用乙醇洗脫,棄去洗脫液,繼用乙醇洗脫,收集乙醇洗脫液,減壓回收乙醇,濃縮干燥,粉碎成細粉得含馬鞭草苷(又稱馬鞭草甙)50%以上的馬鞭草提取物。

本發明方法簡單,原材料豐富,易生產,提取物馬鞭草苷含量高,可有效實現在制備治療前列腺炎藥物中的應用,是中藥上的創新。

四、具體實施方法

以下結合實際和實驗資料,對本發明的具體實施方式做詳細說明。

本發明在具體實施中是,取馬鞭草藥材,粉碎為粗粉,每次加粗粉8倍重量的質量濃度為80%的乙醇加熱回流提取2次,每次2小時,合并提取液,濾過,減壓濃縮至在50℃相對密度為1.12-1.15的濃縮液,加入4倍量濃縮液體積的蒸餾水分散均勻,冷藏靜置后濾過,取上清液通過HP-20型大孔吸附樹脂柱,先用4倍柱體積的蒸餾水洗脫,再用4倍柱體積的質量濃度為20%的乙醇洗脫,棄去洗脫液,繼用8倍柱體積的質量濃度為80%的乙醇洗脫,收集洗脫液,減壓回收乙醇,濃縮干燥,粉碎成細粉得含馬鞭草苷50%以上的馬鞭草提取物。

該馬鞭草提取物可有效用于制備治療前列腺炎的藥物,以滿足對前列腺炎治療的需要,并經動物實驗,充分證明了馬鞭草提取物(主要是含馬鞭草苷),具有很好的治療前列腺炎之功效,有關實驗資料如下:

實驗1馬鞭草苷對小鼠前列腺炎模型的影響

1.1實驗動物

小鼠,昆明種,雄性,24~26g,動物合格證編號904013,購于河北省醫學實驗動物中心,飼養在河南中醫學院實驗動物中心,飼料為消毒飼料,墊料為消毒墊料,均由河南省實驗動物中心提供。飲水為消毒蒸餾水。飼養條件:溫度20~25℃,相對濕度40%~60%,自然光照,每籠10只,常規飼養,隔天更換墊料。

1.2實驗藥物和試劑

實驗藥物為本發明馬鞭草提取物。

由江蘇南京青澤醫藥科技有限公司提供,經HPLC檢測,馬鞭草苷含量為50.13%;

試劑為:前列康片,規格:每片含油菜花花粉0.5g,浙江康恩貝制藥股份有限公司,批號20090122;消痔靈注射液,規格:每支10ml,北京雙鶴藥業股份有限公司,批號20070405;戊巴比妥鈉,中國醫藥集團上海化學試劑公司,批號F20060715;注射用青霉素鈉,華北制藥股份有限公司,批號X0901038;醫用酒精,洛陽市潔康消毒劑廠,批號20080003;生理鹽水,鄭州永和制藥有限公司,批號090217221;冰醋酸,開封化學試劑總廠,批號061208;甲醛,中國萊陽市雙雙化工有限公司,批號20070512。

1.3實驗儀器

JY601電子秤,上海民橋醫療器械有限公司;FA(N)/JA(N)系列電子天平,上海民橋精密儀器有限公司;可調式移液器,上海雷勃分析儀器有限公司;OLYMPUS光學顯微鏡;BL-2000醫用圖像分析系統,成都泰盟科技有限公司。

2實驗方法

2.1造模與分組

實驗室常規飼養1周后,挑選體重在24~26g的雄性小鼠用于實驗。隨機選取10只作為空白對照組,其余用于造模。造模小鼠分別稱重,按35mg/kg劑量,腹腔注射戊巴比妥鈉,麻醉成功后,用酒精消毒皮膚,進行手術。于下腹正中切口達腹腔,提出膀胱及兩側精囊,暴露膀胱背側前列腺(背側葉),用微量注射器準確注入25%消痔靈注射液0.02ml,送復臟器,分層縫合肌肉、皮膚,用酒精消毒手術傷口,待小鼠清醒后放回鼠籠常規飼養。術后肌內注射青霉素20萬u/kg,連用3天,以預防感染。術后第8天,挑選恢復情況較好的造模小鼠50只按體重隨機分為5組,每組10只,即模型組,前列康組,馬鞭草苷高、中、低劑量組。

2.2給藥方法

2.2.1實驗用藥的配制

根據預試驗的情況,馬鞭草苷高、中、低劑量組小鼠每日給藥劑量分別為:200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg,用生理鹽水分別配制成濃度為10、5、2.5mg/ml的溶液;

前列康片:前列康按成人臨床用量的15倍給藥。小鼠每日劑量為1.5g/kg,臨用前用生理鹽水配成濃度為0.075g/ml的混懸液;

消痔靈注射液:臨用前用滅菌注射用水配制成25%的濃度。

2.2.2給藥劑量和方法

空白對照組:灌胃給予生理鹽水0.2ml/10g,1日1次,連續21天;模型組:灌胃給予生理鹽水0.2ml/10g,1日1次,連續21天;前列康組:灌胃給予前列康混懸液0.2ml/10g,濃度為0.075g/ml,1日1次,連續21天;馬鞭草苷高劑量組:灌胃給予馬鞭草苷溶液0.2ml/10g,濃度為10mg/ml,1日1次,連續21天;馬鞭草苷中劑量組:灌胃給予馬鞭草苷溶液0.2ml/10g,濃度為5mg/ml,1日1次,連續21天;馬鞭草苷低劑量組:灌胃給予馬鞭草苷溶液0.2ml/10g,濃度為2.5mg/ml,1日1次,連續21天。

2.3指標測定

小鼠24h內飲水量:于造模后的第14天和第28天分別測定每組小鼠24h內的飲水量。

白細胞計數以及卵磷脂小體密度評分:于末次給藥24h后,稱小鼠體重,然后以頸椎脫臼法處死,迅速取出部分前列腺組織,精密稱重,剪碎,按每1mg前列腺組織加生理鹽水4μl,充分混勻。取試管1支,加白細胞稀釋液(1%冰醋酸水溶液)380μl,用微量加樣器準確吸取上述制備好的標本20μl,于試管稀釋液底部輕輕放出,吹打3次混勻,充池,用低倍鏡計數四角4個大方格內的白細胞總數及卵磷脂小體密度。白細胞計數采用顯微鏡直接觀察計算:白細胞數/L=4個大方格內的白細胞總數×50×106;卵磷脂小體密度按臨床檢驗標準進行評分:滿視野為4分,3/4視野為3分,1/2視野為2分,1/4視野為1分。

前列腺及相關組織的形態學檢查:取一部分前列腺組織以及睪丸、附睪、腎臟、胸腺用生理鹽水漂洗干凈,固定于10%福爾馬林溶液中,石蠟包埋,常規脫水,切片,HE染色。用顯微鏡結合計算機圖形圖像分析系統,在×400倍鏡下觀察前列腺及相關組織的形態學變化。

2.4統計學處理方法

數據分析用SPSS?13.0?for?windows統計軟件包進行數據資料的統計學處理,計量資料用平均數±標準差()表示,組間比較用單因素方差分析,計數資料采用Ridit分析。

3實驗結果

3.1對前列腺炎模型小鼠飲水量的影響

分別在造模后的第14天和第28天,分別測定每組小鼠在24h內的飲水量,結果見表1。

表1馬鞭草苷對前列腺炎模型小鼠飲水量的影響(m1)

從上表可看出,模型組小鼠在造模后第14天和第28天飲水量均比空白對照組少,分別減少5.0%和19.8%,說明隨著造模時間的延長,模型小鼠前列腺炎癥狀加重。與模理組比,馬鞭草苷高、中、低劑量組在第14天和第28天飲水量分別增加2.8%、19.1%,2.4%、14.8%,0.4%、7.7%,說明隨著給藥時間延長,對前列腺炎癥狀減輕越明顯。

3.2對前列腺炎模型小鼠前列腺組織中白細胞數及卵磷脂小體密度的影響

按相應實驗方法及標準,觀察并記錄前列腺組織中白細胞總數及卵磷脂小體密度積分,結果見表2。

表2馬鞭草苷對前列腺炎模型小鼠前列腺組織中白細胞數及卵磷脂小體密度的影響(n=10)

表示與模型組相比,P<0.01

從上表可看出,與空白對照組相比,模型組前列腺組織中白細胞數顯著增加(P<0.01)、卵磷脂小體密度積分顯著減少(P<0.01),說明前列腺炎模型復制成功。與模型組相比,馬鞭草苷高、中、低劑量組和前列康組前列腺中白細胞數均顯著減少(P<0.01),前列腺卵磷脂小體密度積分均顯著增加(P<0.01),且以馬鞭草苷高、中劑量效果明顯。

3.3對前列腺炎模型小鼠器官組織形態的影響

3.3.1對前列腺組織的影響

光鏡下對小鼠前列腺組織觀察可見:空白對照組前列腺腺體正常,腺上皮均呈皺褶狀排列,間質未見炎細胞浸潤和纖維的增生;模型組前列腺出現明顯增生,腺腔擴張,腺上皮變平,間質組織增寬,間質有明顯的炎細胞(中性粒細胞)浸潤和纖維的增生;前列康組前列腺腺體擴大,腺上皮細胞呈皺褶狀排列,而腺體周圍出現少量纖維增生和少量的炎癥細胞;馬鞭草苷高劑量組前列腺腺體正常,腺上皮細胞呈皺褶狀排列,間質未見炎細胞浸潤和纖維的增生;馬鞭草苷中劑量組前列腺腺腔基本恢復正常,腺體上皮細胞大部分呈皺褶狀排列,間質中有少量的纖維增生和炎細胞;馬鞭草苷低劑量組前列腺出現明顯的增生,腺腔明顯擴張,上皮變平呈扁平狀,間質中有少量的纖維增生和炎癥細胞浸潤。

表3馬鞭草苷對前列腺炎模型小鼠前列腺組織的影響

“-”前列腺腺體、腺上皮和間質均正常;“+”前列腺腺體少有擴張,腺上皮呈現扁平狀,腺體周圍少有纖維增生和少量的炎細胞浸潤;“++”前列腺腺體明顯增生、腺腔擴張,腺上皮扁平狀,間質有少量纖維增生和炎細胞浸潤;“+++”前列腺腺體明顯增生、腺腔擴張,腺上皮扁平狀,間質有明顯的纖維增生和炎細胞浸潤。

從表3可看出,經Ridit檢驗,與空白對照組比,模型組出現顯著的前列腺炎癥的病理變化(P<0.01),說明造模型成功。與模型組比,大、中劑量馬鞭草苷組的前列腺炎癥病理變化顯著減輕(P<0.01),小劑量組病理變化僅有減輕趨勢。

根據實驗各組前列腺的不同的病理改變采用細胞立體計量學方法,用測試格點記數法進行測定,計算炎癥區的炎細胞的體密度(Vv)。實驗各組前列腺的不同的病理改變測得結果見表4。

公式:Vv=P∑n/參照系∑n×100%

表4馬鞭草苷對前列腺炎模型小鼠前列腺體體密度(Vv)的影響(n=10)

表示與模型組相比,P<0.01

從上表可看出,與空白對照組比,模型組前列腺體密度(Vv)顯著增加(P<0.01)。與模型組相比,前列康組及馬鞭草苷高、中、低劑量組小鼠的前列腺體密度(Vv)均顯著減小(P<0.01)。

通過對實驗各組小鼠前列腺體的立體計量學測定結果分析,可以看出,小鼠前列腺炎動物模型的主要立體計量學改變為前列腺腺體的體密度(Vv)增加。前列康及馬鞭草苷均具有減小體密度,抑制小鼠前列腺炎的作用,其中以馬鞭草苷高、中劑量作用最好,主要在病理組織學表現為腺體不擴張,間質中炎癥細胞減少,腺體體密度下降。

3.3.2對腎臟組織的影響

光鏡下對小鼠腎臟組織觀察可見:空白對照組腎小球、腎小囊、腎小管及上皮細胞均正常;模型組腎小球、腎小囊、腎小管未見明顯的病理改變;前列康組腎小球基本正常,腎小囊未見異常,腎小管上皮細胞出現空泡變性;馬鞭草苷高劑量組腎小球、腎小囊及腎小管上皮細胞均正常;馬鞭草苷中劑量組腎小球、腎小囊及腎小管未見有明顯病理改變;馬鞭草苷低劑量組腎小球、腎小囊及腎小管及上皮細胞均基本正常。

表5馬鞭草苷對前列腺炎模型小鼠腎臟組織的影響

“-”腎小球、腎小囊、腎小管及上皮細胞均正常;“+”腎小球、腎小囊、腎小管及上皮細胞約有25%細胞出現泡變;“++”腎小球、腎小囊、腎小管及上皮細胞約有50%細胞出現泡變;“+++”腎小球、腎小囊、腎小管及上皮細胞約有75%細胞出現泡變。

從表5可看出,經Ridit檢驗,各組之間無明顯差異,但可看出,馬鞭草苷高、中劑量對腎臟有一定的益處,可減輕潛在的病理變化;前列康反使腎臟的病理變化加重。

3.3.3對睪丸組織的影響

光鏡下對小鼠睪丸組織觀察可見:空白對照組睪丸曲細精管各級精原細胞、支持細胞及間質均正常;病理模型組睪丸曲細精管中各級精原細胞基本正常,而在精子之后出顯許多嗜酸性的精原細胞;前列康組睪丸曲細精管中的精原細胞中有嗜酸性變的精原細胞;馬鞭草苷高劑量組睪丸曲細精管中各級精原細胞均正常;馬鞭草苷中劑量組睪丸曲細精管中有1/3的精原細胞呈現嗜酸性改變;馬鞭草苷低劑量組睪丸曲細精管中的精原細胞大部分呈現嗜酸性改變。

表6馬鞭草苷對前列腺炎模型小鼠曲細精管中精原細胞的影響

“-”睪丸曲細精管精原細胞無嗜酸性改變;“+”睪丸曲細精管精原細胞約有25%出現嗜酸性改變;“++”睪丸曲細精管精原細胞約有50%出現嗜酸性改變;“+++”睪丸曲細精管精原細胞約有75%出現嗜酸性改變。

從表6可看出,經Ridit檢驗,與空白對照組比,病理模型組出現明顯的睪丸病理變化(P<0.05),與模型組比,馬鞭草苷高、中、低劑量組均可顯著減輕睪丸的病理變化(P<0.01)。

3.3.4對附睪組織的影響

光鏡下對小鼠附睪組織觀察可見:空白對照組附睪的附睪管和間質均正常;模型組附睪中附睪管內含有豐富的精子,管腔周圍出現明顯纖維增生和炎細胞浸潤;前列康組附睪管內含有豐富的精子,管腔周圍有大量纖維增生和炎細胞浸潤;馬鞭草苷高劑量組附睪管和間質細胞均正常;馬鞭草苷中劑量組附睪周圍纖維增生明顯變薄減少,炎細胞明顯減少;馬鞭草苷小劑量組附睪周圍可見明顯纖維增生和少數炎細胞。

表7馬鞭草苷對前列腺炎模型小鼠附睪組織的影響

“-”附睪腺體周圍無纖維增生和炎細胞浸潤,均正常;“+”附睪腺體周圍有少數纖維增生和炎細胞浸潤;“++”附睪腺體周圍有明顯纖維增生和炎細胞浸潤;“+++”附睪腺體周圍有大量纖維增生和炎細胞浸潤。

從表7可看出,經Ridit檢驗,與空白對照組比,模型組出現顯著的附睪病理變化(P<0.01)。與模型組相比,馬鞭草苷高劑量組附睪的病理變化顯著減輕(P<0.01),馬鞭草苷中劑量組附睪的病理變化明顯減輕(P<0.05),而馬鞭草苷低劑量和前列康減輕附睪病理變化的作用不明顯。

3.3.5對胸腺組織的影響

光鏡下對小鼠胸腺組織觀察可見:空白對照組實驗動物的胸腺小葉分界清楚,皮質髓質分界清楚,皮質的淋巴細胞較為密集;模型組實驗動物的皮質變薄,淋巴細胞較為稀疏;前列康組動物胸腺皮質增厚,淋巴細胞較密集;馬鞭草苷高、中劑量組動物的皮質明顯增厚,淋巴細胞較為密集;馬鞭草苷低劑量組動物的皮質增厚,淋巴細胞較密集。

采用測微尺測定胸腺皮質最寬處和最窄處求均數為皮質厚度,利用測微尺基線計算壓在基線上的淋巴細胞數求均數為淋巴細胞數。實驗各組測得結果見表8。

表8馬鞭草苷對前列腺炎模型小鼠胸腺皮質厚度及淋巴細胞個數的影響

表示與模型組相比,P<0.01

從上面表、圖可看出,與空白組比較,模型組小鼠的胸腺皮質顯著變薄,淋巴細胞個數顯著減少(P<0.01),提示細胞免疫功能下降。前列康組和馬鞭草高、中、低劑量組小鼠胸腺皮質顯著增厚(P<0.01),淋巴細胞個數顯著增加(P<0.01),提示馬鞭草苷和前列康均能夠顯著增強前列腺炎模型小鼠的免疫功能。

4實驗小結

本實驗采用25%消痔靈注射液0.02ml/只注入小鼠前列腺(背側葉),建立小鼠前列腺炎模型。本實驗從前列腺炎模型組小鼠的飲水量相對減少,前列腺組織中白細胞數顯著增多、卵磷脂小體密度積分顯著減少,前列腺Vv(體密度)顯著性升高幾方面闡述了消痔靈注射液對小鼠前列腺的影響,結合小鼠前列腺炎模型組小鼠前列腺組織形態學的病理改變,說明了本實驗小鼠前列腺炎模型成功建立。

本實驗通過馬鞭草苷高、中、低劑量組小鼠飲水量相對增加、卵磷脂小體密度積分顯著增加,前列腺組織中白細胞數顯著減少,前列腺Vv顯著降低,使前列腺炎癥的病理變化顯著減輕等方面驗證了馬鞭草苷對前列腺炎模型組小鼠的治療作用,其中以馬鞭草苷高、中劑量組對小鼠前列腺炎的抑制作用較好。馬鞭草苷高、中、低劑量可減輕睪丸、附睪的病理變化,而且對腎臟可產生有益的影響,可以改善其潛在的病理變化。證明了馬鞭草苷對小鼠前列腺炎模型炎性癥狀干預有效,可改善模型相關組織的病理變化及改善小鼠列腺炎模型引起的繼發性機體病變。

本實驗探索性的研究了馬鞭草苷對小鼠免疫功能的影響,通過馬鞭草苷高、中、低劑量可以顯著增加模型小鼠胸腺厚度,增加淋巴細胞個數,證明馬鞭草苷有增強前列腺炎動物模型免疫功能的作用。通過增強機體免疫功能來逆轉其病理生理過程,從而對慢性前列腺炎起到治療作用。

實驗2馬鞭草苷對大鼠前列腺炎模型的影響

1實驗材料

1.1實驗動物

大鼠,Wister,雄性,240~260g,動物合格證編號904012,購于河北省醫學實驗動物中心,飼養在河南中醫學院實驗動物中心,飼料為消毒飼料,墊料為消毒墊料,均由河南省實驗動物中心提供。飲水為消毒蒸餾水。飼養條件:溫度20~25℃,相對濕度40%~60%,自然光照,每籠10只,常規飼養,每天更換墊料。

1.2實驗藥物和試劑

馬鞭草苷,由江蘇南京青澤醫藥科技有限公司提供,經HPLC檢測,含量為50.13%);前列康片,規格:每片含油菜花花粉0.5g,浙江康恩貝制藥股份有限公司,批號20090122;消痔靈注射液,規格:每支10ml,北京雙鶴藥業股份有限公司,批號20070405;戊巴比妥鈉,中國醫藥集團上海化學試劑公司,批號F20060715;注射用青霉素鈉,華北制藥股份有限公司,批號X0901038;醫用酒精,洛陽市潔康消毒劑廠,批號20080003;生理鹽水,鄭州永和制藥股份有限公司,批號20090302;冰醋酸,開封化學試劑總廠,批號061208;甲醛,中國萊陽市雙雙化工有限公司,批號20070512;IL-2放射免疫分析藥盒,北京普爾偉業生物科技有限公司,批號20090424;IL-1β放射免疫分析藥盒,北京普爾偉業生物科技有限公司,批號20090424;TNF-α放射免疫分析藥盒,北京普爾偉業生物科技有限公司,批號20090424;

1.3實驗儀器

JY601電子秤,上海民橋醫療器械有限公司;FA(N)/JA(N)系列電子天平,上海民橋精密儀器有限公司;可調式移液器,上海雷勃分析儀器有限公司;BCD-248T冰箱,新飛集團有限公司;OLYMPUS光學顯微鏡;BL-2000醫用圖像分析系統,成都泰盟科技有限公司;TGL-16G高速冷凍離心機,上海安亭科學儀器廠;DY89-1電動玻璃勻漿機,寧波新芝生物科技股份有限公司;Sn-895B型智能放免γ測量儀,上海原子核研究所四環儀器一廠。

2實驗方法

2.1造模與分組

實驗室常規飼養1周后,挑選體重在240~260g的雄性大鼠用于實驗。隨機選取10只作為空白對照組,其余用于造模。每只大鼠分別稱重,按30mg/kg的劑量,腹腔注射戊巴比妥鈉,麻醉成功后,固定于手術臺上,用酒精消毒腹部皮膚,于下腹正中切口達腹腔,提出膀胱及兩側精囊,暴露膀胱背側前列腺(背側葉),準確注入25%消痔靈注射液0.2ml,送復臟器,分別縫合肌肉、皮膚,用酒精消毒手術傷口,待大鼠清醒后放回鼠籠常規飼養。術后肌內注射青霉素20萬u/kg,連用3天,以預防感染。術后第8天,挑選恢復情況較好的造模大鼠50只按體重隨機分為5組,每組10只,即模型組、前列康組、馬鞭草苷高、中、低劑量組。

2.2給藥方法

2.2.1實驗用藥的配制

根據預試驗的情況,馬鞭草苷高、中、低劑量組大鼠每日給藥劑量分別為:120mg/kg、60mg/kg、30mg/kg,臨用前用生理鹽水分別配制成濃度為12、6、3mg/ml的溶液;

前列康片:前列康片按成人臨床用量的10倍給藥,每日劑量為1g/kg,臨用前用蒸餾水配成濃度為0.1g/ml的混懸液;

消痔靈注射液:臨用前用滅菌注射用水配制成25%的濃度。

2.2.2給藥方法

空白對照組:灌胃給予生理鹽水1ml/100g,1日1次,連續22天;病理模型組:灌胃給予生理鹽水1ml/100g,1日1次,連續22天;前列康組(前列康片組):灌胃給予前列康混懸液1ml/100g,濃度為0.1g/ml,1日1次,連續22天;馬鞭草苷高劑量組:灌胃給予馬鞭草苷溶液1ml/10g,濃度為12mg/ml,1日1次,連續22天;馬鞭草苷中劑量組:灌胃給予馬鞭草苷溶液0.2ml/10g,濃度為6mg/ml,1日1次,連續22天;馬鞭草苷低劑量組:灌胃給予馬鞭草苷溶液0.2ml/10g,濃度為3mg/ml,1日1次,連續22天。

2.3指標測定

前列腺組織外觀形態:于末次給藥24h后,稱大鼠體重,斷頭處死,剖開大鼠下腹部,暴露前列腺組織,用肉眼觀察每組大鼠的前列腺形態、大小、色澤及周圍組織粘連情況等。

白細胞計數和卵磷脂小體密度評分:取前列腺液10μl放入1ml白細胞稀釋液中,充分混勻后吸取1μl混合液鏡檢白細胞數,另取前列腺液10μl涂片,觀察并記錄卵磷脂小體密度,評分標準為:滿視野4分,3/4視野3分,1/2視野2分,1/4視野1分。

前列腺指數測定:迅速取出前列腺,稱其濕重,計算前列腺指數。前列腺指數=前列腺濕重mg/體重g。

前列腺勻漿中細胞因子水平測定:精密稱取200mg前列腺組織,用眼科剪剪碎,倒入勻漿器中,用移液管加入生理鹽水1ml,進行勻漿(其中勻漿器下端浸入冰水中)。隨后將組織勻漿在低溫下以3000r/min離心15min。取上清液按試劑盒說明書方法測定前列腺組織中IL-2、IL-1β、TNF-α水平。

測定原理:利用液相競爭抑制原理,采用平衡閥對樣品進行測定。待測樣品或標準品與限量的抗血清及標記抗原加在一起進行競爭結合反應,反應完全后,加入免疫分離劑,分離出抗原-抗體復合物,測定復合物的放射性(B),計算各標準管的結合率(B/B0%),作出標準曲線,查出樣品濃度。

白細胞介素-2水平測定加樣程序表:單位μl

測定范圍:1~81ng/ml

結果計算:用自動r計數器預先編制好程序直接給出參數、標準曲線、樣品濃度白細胞介素-1β水平測定加樣程序表:單位μl

測定范圍:0.03~8.1ng/ml

結果計算:用自動r計數器預先編制好程序直接給出參數、標準曲線、樣品濃度腫瘤壞死因子-α水平測定加樣程序表:單位μl

測定范圍:0.3~24.3ng/ml

結果計算:用自動r計數器預先編制好程序直接給出參數、標準曲線、樣品濃度。

前列腺及相關組織的形態學檢查:取一部分前列腺組織和胸腺用生理鹽水漂洗干凈,固定于10%福爾馬林溶液中,石蠟包埋,常規脫水,切片,HE染色。用顯微鏡結合計算機圖形圖像分析系統,在高倍鏡下觀察前列腺組織和胸腺的形態學變化。

2.4統計方法

數據分析用SPSS?13.0?for?windows統計軟件包進行數據資料的統計學處理,計量資料用平均數±標準差表示,組間比較用單因素方差分析。

3實驗結果

3.1前列腺組織外觀形態

空白對照組大鼠前列腺表面紅潤有光澤,無結節、硬化,腺體組織柔軟而有彈性,與周圍組織無粘連,易于分離;模型組大鼠前列腺明顯增大,有充血或瘀血狀態,彈性較差,與周圍組織有不同程度的粘連,部分可見有結節和硬化;前列康組大鼠前列腺與周圍組織粘連較輕,有些腺體僅輕度水腫,硬結小;馬鞭草苷各劑量組大鼠前列腺柔軟有光澤,呈淺肉色,與周圍組織無明顯粘連,腺體大小無明顯改變,未見結節。

3.2對大鼠前列腺炎模型大鼠前列腺指數的影響

稱取前列腺濕重,計算前列腺指數,結果見表。

表9馬鞭草苷對前列腺炎模型大鼠前列腺指數的影響(n=10)

表示與模型組相比,P<0.01

從上表可看出,與空白對照組比,模型組前列腺指數顯著增高(P<0.01),說明大鼠前列腺炎建立成功。與模型組比,馬鞭草苷高、中、低劑量組和前列康組大鼠前列腺指數顯著降低(P<0.01),說明馬鞭草苷可以顯著改善前列腺炎癥狀。

3.3對前列腺炎模型大鼠前列腺液中白細胞數及卵磷脂小體密度積分的影響

按相應實驗方法及標準,觀察并記錄前列腺液中白細胞總數及卵磷脂小體密度積分,結果見表10。

表10馬鞭草苷對前列腺炎模型大鼠前列腺液中白細胞數及卵磷脂小體密度積分的影響(n=10)

表示與模型組相比,P<0.01

由上表可以看出,與空白對照組相比,模型組大鼠前列腺液中白細胞數顯著增加(P<0.01),卵磷脂小體密度積分顯著減少(P<0.01),表明模型組大鼠前列腺炎癥狀明顯,模型建立成功。與模型組相比,前列康組及馬鞭草苷高、中、低劑量組大鼠前列腺液白細胞數顯著減少(P<0.01),卵磷脂小體密度積分顯著增加(P<0.01)。實驗結果表明,馬鞭草苷具有改善前列腺炎模型大鼠前列腺炎癥狀的作用。

3.4馬鞭草苷對大鼠前列腺炎模型大鼠前列腺勻漿中IL-2、IL-1β、TNF-α水平的影響

制備前列腺勻漿,按試劑盒說明書方法測定前列腺勻漿中的IL-2、IL-1β、TNF-α水平,結果見表11。

表11馬鞭草苷對前列腺炎模型大鼠前列腺勻漿中IL-2、IL-1β、TNF-α水平的影響(n=10)

表示與模型組相比,P<0.01;

表示與模型組相比,P<0.05

從上面表、圖可看出,與空白對照組比,模型組大鼠前列腺勻漿中IL-2、IL-1β、TNF-α水平均顯著升高(P<0.01),說明大鼠前列腺炎模型建立成功。與模型組比,前列康組和馬鞭草苷高、中、低劑量組大鼠前列腺勻漿中TNF-α水平顯著降低(P<0.01),IL-2水平明顯降低(P<0.05)。前列康組和馬鞭草苷高劑量組IL-1β水平顯著降低(P<0.01),馬鞭草苷中、低劑量組IL-1β水平明顯降低(P<0.05)。提示馬鞭草苷抑制模型大鼠前列腺炎的作用可能與其降低炎癥因子水平有關,從而改善前列腺炎癥狀。

3.5對大鼠前列腺炎模型大鼠前列腺組織形態的影響

光鏡下對大鼠前列腺組織觀察可見:空白對照組前列腺多數腺體處于靜止狀態,腺上皮皺褶排列,腺腔內無分泌物,腺腔明顯縮小,間質炎癥細胞少見;模型組前列腺腺腔明顯擴張,腺上皮呈扁平狀,腺腔內充滿著大量紅色分泌物,間質可見大量炎癥細胞;前列康組少部分腺體顯著縮小,大部分腺體處擴張狀態,分泌物減少,周圍可見少量炎癥細胞;馬鞭草苷高劑量組前列腺上皮呈皺褶狀,腺腔明顯縮小,間質基本恢復正常;馬鞭草苷中劑量組前列腺大部分腺體縮小,腺腔內有分泌物,腺上皮呈皺褶狀態,間質有少量的炎細胞浸潤;馬鞭草苷低劑量組前列腺腺體處于明顯的擴張狀態,腺上皮變薄呈扁平狀,間質有大量炎細胞胞浸潤。各用藥組對前列腺炎模型均有不同程度的抑制作用,以馬鞭草苷高、中劑量對模型大鼠前列腺炎抑制作用最好。

根據實驗各組動物前列腺出現不同程度的腺體、大小差異和腺上皮皺褶的不同程度差異,采用立體計量學定量測定,可以客觀地反映其病理變化的程度。按照每組動物10只,每只拍三張照片即30張,求X數。觀測指標為腺體體密度(Vv)。測得結果見表12。

表12馬鞭草苷對前列腺炎模型大鼠前列腺體的體密度(Vv)的影響(n=10)

表示與模型組相比,P<0.01

從上表可看出,與空白對照組比,模型組前列腺Vv顯著增加(P<0.01),說明大鼠前列腺炎模型建立成功。與模型組比,馬鞭草苷高、中、低劑量組和前列康組大鼠前列腺體的Vv顯著降低(P<0.01),以馬鞭草苷高劑量的作用最強。

3.6對大鼠前列腺炎模型大鼠胸腺組織形態的影響

光鏡下對大鼠胸腺組織觀察可見:空白對照組大鼠的胸腺小葉分界清楚,皮質髓質分界清楚,皮質的淋巴細胞較為密集;模型組大鼠的皮質變薄,淋巴細胞較為稀疏;前列康組動物胸腺皮質變薄,淋巴細胞較密集;馬鞭草苷高劑量組動物的皮質明顯增厚,淋巴細胞密集,馬鞭草苷中、低劑量組大鼠的皮質變薄,淋巴細胞較為密集。

采用測微尺測定胸腺皮質最寬處和最窄處求均數為皮質厚度,利用測微尺基線計算壓在基線上的淋巴細胞數求均數為淋巴細胞數。實驗各組測得結果見表13。

表13馬鞭草苷對前列腺炎模型小鼠胸腺皮質厚度及淋巴細胞個數的影響

表示與模型組相比,P<0.01

從上表可看出,與空白組比較,模型組大鼠的胸腺皮質顯著變薄(P<0.01),淋巴細胞個數顯著減少(P<0.01),提示細胞免疫功能下降。馬鞭草高劑量組大鼠的胸腺皮質顯著增厚(P<0.01),淋巴細胞個數顯著增加(P<0.01),提示馬鞭草苷能夠顯著增強前列腺炎模型大鼠的免疫功能。

4實驗小結

本實驗采用25%消痔靈注射液0.2ml/只注入大鼠前列腺(背側葉),復制大鼠前列腺炎模型。本實驗從前列腺炎模型組大鼠前列腺指數顯著增大,前列腺液中白細胞數顯著增加、卵磷脂小體密度積分顯著減少,前列腺Vv顯著增加幾方面闡述了消痔靈注射液對大鼠前列腺的影響,結合模型組大鼠前列腺組織形態學的病理改變,說明了本實驗大鼠前列腺炎模型成功復制。

本實驗通過馬鞭草苷大、中、小劑量組大鼠的前列腺指數顯著降低,列腺液中白細胞水平顯著降低,卵磷脂小體密度評分顯著增加,前列腺勻漿中IL-2、IL-1β、TNF-α水平顯著或明顯降低及前列腺Vv顯著降低,顯示馬鞭草苷可較好地改善前列腺炎模型大鼠的前列腺炎癥狀。

按上述方法,經多次反復實驗(12次),均取得了相同或相近似的結果,這充分表明本發明的馬鞭草提取物具有很好的治療前列腺炎的功效,可有效用于制備治療前列腺炎的藥物,實現馬鞭草提取物在制備治療前列腺炎的藥物中的應用,開拓了馬鞭草的新用途,是治療前列腺炎藥物上的一大創造。

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