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HIV
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摘要
申請專利號:

CN03802457.8

申請日:

20030630

公開號:

CN1620307A

公開日:

20050525

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A61K38/16,A61P31/18,A61P37/04,A61P43/00 主分類號: A61K38/16,A61P31/18,A61P37/04,A61P43/00
申請人: 扶桑藥品工業株式會社
發明人: 若宮伸隆,大谷克城,坂本隆志,芥子宏行,岸雄一郎
地址: 日本國大阪府大阪市
優先權: 189534/2002
專利代理機構: 上海新天專利代理有限公司 代理人: 衷誠宣
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法律狀態
申請(專利)號:

CN03802457.8

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明揭示了以結合甘露糖的蛋白質(MBP)為有效成分、能夠用于人免疫缺陷病毒(HIV)感染者的治療及有效抑制病癥發展的抗HIV劑。此外,還揭示了包括在MBP存在下對HIV感染細胞進行培養的步驟在內的MBP所顯現的抗HIV活性的評價方法。

權利要求書

1.抗HIV劑,其特征在于,以結合甘露糖的蛋白質(MBP)為有效成分。2.如權利要求1所述的抗HIV劑,其特征在于,前述MBP具有HIV增殖抑制作用。3.如權利要求2所述的抗HIV劑,其特征在于,前述增殖抑制作用為HIV中和作用。4.如權利要求2所述的抗HIV劑,其特征在于,前述增殖抑制作用為HIV萌芽抑制作用。5.如權利要求1或2所述的抗HIV劑,其特征在于,前述MBP分離自人血清并被精制。6.如權利要求1或2所述的抗HIV劑,其特征在于,前述MBP從動物細胞遺傳工程學式的分泌。7.如權利要求6所述的抗HIV劑,其特征在于,前述動物細胞為中國倉鼠卵巢細胞。8.如權利要求1或2所述的抗HIV劑,其特征在于,前述HIV是屬于HIV-1型的M組的B亞型的HIV株。9.如權利要求1或2所述的抗HIV劑,其特征在于,前述HIV是屬于HIV-1型的M組的D亞型的HIV株。10.如權利要求1或2所述的抗HIV劑,其特征在于,前述HIV是重組型流行株。11.如權利要求10所述的抗HIV劑,其特征在于,前述重組型流行株為CRF01_AE。12.如權利要求1或2所述的抗HIV劑,其特征在于,前述HIV是具有CCR5向性的病毒。13.如權利要求1或2所述的抗HIV劑,其特征在于,前述HIV是具有CXCR4向性的病毒。14.如權利要求1或2所述的抗HIV劑,其特征在于,前述HIV是同時具有CCR?5向性及CXCR4向性的病毒。15.如權利要求1或2所述的抗HIV劑,其特征在于,前述HIV是具有巨噬細胞向性的病毒。16.如權利要求1或2所述的抗HIV劑,其特征在于,前述HIV是具有T細胞向性的病毒。17.如權利要求1或2所述的抗HIV劑,其特征在于,前述HIV是對巨噬細胞及T細胞的雙方具有向性的病毒。18.MBP的抗HIV作用的評價方法,其特征在于,包括以下步驟:(1)培養使目標細胞和HIV共存而獲得的感染細胞,(2)對經過培養的感染細胞進行洗滌獲得洗凈細胞,(3)在MBP存在下對洗凈細胞進行培養,以及(4)測定來自培養上清液中的HIV的p24蛋白。19.MBP的抗HIV作用的評價方法,其特征在于,包括以下步驟:(a)培養HIV和MBP共存的第一混合系,(b)培養目標細胞和MBP共存的第二混合系,(c)合并第一混合系和第二混合系獲得感染細胞,(d)對所得感染細胞進行培養,(e)對經過培養的感染細胞進行洗滌獲得洗凈細胞,(f)對洗凈細胞進行培養,以及(g)測定來自培養上清液中的HIV的p24蛋白。20.如權利要求19所述的評價方法,其特征在于,前述步驟(a)及(b)同時進行。21.如權利要求19或20所述的評價方法,其特征在于,前述步驟(f)是在MBP存在下對洗凈細胞進行培養。22.如權利要求18或19所述的評價方法,其特征在于,前述抗HIV作用為HIV增殖抑制作用。23.如權利要求22所述的評價方法,其特征在于,前述增殖抑制作用為HIV中和作用。24.如權利要求22所述的評價方法,其特征在于,前述增殖抑制作用為HIV萌芽抑制作用。25.如權利要求18或19所述的評價方法,其特征在于,前述MBP分離自人血清并被精制。26.如權利要求18或19所述的評價方法,其特征在于,前述MBP通過基因工程方法從動物細胞分泌。27.如權利要求26所述的評價方法,其特征在于,前述動物細胞為中國倉鼠卵巢細胞。28.如權利要求18或19所述的評價方法,其特征在于,前述HIV是屬于HIV-1型的M組的B亞型的HIV株。29.如權利要求18或19所述的評價方法,其特征在于,前述HIV是屬于HIV-1型的M組的D亞型的HIV株。30.如權利要求18或19所述的評價方法,其特征在于,前述HIV是重組型流行株。31.如權利要求30所述的評價方法,其特征在于,前述重組型流行株為CRF01_AE。32.如權利要求18或19所述的評價方法,其特征在于,前述HIV是具有CCR5向性的病毒。33.如權利要求18或19所述的評價方法,其特征在于,前述HIV是具有CXCR4向性的病毒。34.如權利要求18或19所述的評價方法,其特征在于,前述HIV是同時具有CCR5向性及CXCR4向性的病毒。35.如權利要求18或19所述的評價方法,其特征在于,前述HIV是具有巨噬細胞向性的病毒。36.如權利要求18或19所述的評價方法,其特征在于,前述HIV是具有T細胞向性的病毒。37.如權利要求18或19所述的評價方法,其特征在于,前述HIV是同時具有巨噬細胞及T細胞向性的病毒。38.MBP,其特征在于,具有權利要求18或19所述的評價方法確定的抗HIV作用。39.以MBP為有效成分的抗HIV劑對HIV感染者的應用。40.如權利要求39所述的抗HIV劑的應用,其特征在于,前述HIV感染者為具有CCR5向性的病毒的感染者。

說明書

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技術領域

本發明涉及結合甘露糖的蛋白質(MANNOSE?BINDING?PROTEIN,以下簡稱為“MBP”) 的新用途,特別涉及MBP在由人免疫缺陷病毒(HUMAN?IMMUNODEFICIENCY?VIRUS,以下 簡稱為“HIV”)引起的感染癥的治療時采用的抗HIV劑中的應用。

背景技術

MBP是被稱為結合甘露聚糖的蛋白質、結合甘露聚糖的外源凝集素、結合甘露糖的 外源凝集素等的物質,是分子內部具有膠原樣結構及鈣要求性的糖識別區域的C型外源 凝集素,即屬于膠原凝集素的物質[Kozutsumi,Y.等,Biochem.Biophys.Res.Commun., 95,pp.658-664(1980)]。

參考圖4,MBP一般從其N末端側至C末端側(圖4的左端至右端)由N末端區域(富 半胱氨酸區域)、膠原樣區域、頸區域及糖識別區域(CRD)這4個區域構成。通過頸區域 及膠原樣區域中的螺旋形結構,每根約30kDa~約33kDa的3根多肽發生分子間結合, 形成1個約90kDa~約99kDa的亞單位結構(3倍體)。然后,2~6個該亞單位結構又結 合成花束樣,形成同型低聚物。

從關于MBP的目前為止的基礎研究看,對于進入生物體內的微生物,MBP與該微生 物表面的糖鏈結合,使補體系活化,暗示其與微生物感染的初期防御有關[Holmskov,U. 等,Immunol.Today, 15,pp.67-74(1994)及Turner,M.W.等,Immunol.Today, 17, pp.532-540(1996)]。此外,目前有MBP缺少者容易引發感染癥[Summerfield,J.A. 等,Lancet, 345,pp.886-889(1995)]、動脈硬化性動脈粥樣硬化患者中MBP缺少者居 多[Madsen,H.O.等.,Lancet, 352,pp.959-960(1998)]、MBP基因變異易引發重癥瘧疾 [Luty,A.J.等,J.Infect.Dis., 178,pp.1221-1224(1998)],MBP基因變異使囊性纖維 癥中的肺感染癥加重[Garred,P.等,J.Clin.Invest., 104,pp.431-437(1999)]等報道。

此外,作為對MBP的治療藥物用途的探討,有給MBP缺少者服用MBP,使補體依賴 性的調理活性正常化,從而改善易感染性的報道[Valdimarsson,H. 等,Scand.J.Immunol., 48,pp.116-123(1998)]。此外,有給囊性纖維癥患者服用MBP, 使患者的臨床癥狀穩定化的報道[Garred,P.等,Pediatr.Pulmonol., 33(3), pp.201-207(2002)]。

但是,HIV感染者的數目在世界范圍內每年都在持續增長,大多數發生在發展中國 家,這些國家中,后天免疫缺陷綜合征(AIDS)患者急劇增加。特別是被稱為泰國子類群 (Clade)E型的病毒(E亞型病毒)的感染性極高,世界衛生組織(WHO)預測今后世界上E 亞型病毒的感染者將會最多。

在日本與歐美一樣,B亞型病毒的感染者居多,但最近也有E亞型病毒感染者增加 的趨勢。

為了能夠有效控制HIV感染癥,預防新感染者的產生,即疫苗的開發成為了很緊 急的課題。尤其是美國和法國等國家,對疫苗的研究正積極地進行,但現狀是目前研究 中的疫苗都是針對B亞型病毒的,對E亞型病毒的疫苗研究幾乎沒有。而且,作為D亞 型病毒,已知的是主要分布于亞洲和中非的顯現暴發性病癥的NDK株。

如前所述,現狀是B亞型病毒雖然廣泛地分布于世界各地,但其疫苗還在研究中, 離實用化還差得很遠。此外,E亞型病毒CRF01_AE的感染力很強,預測今后其感染范圍 將會擴大。另外,D亞型病毒是顯現暴發性病癥的病毒。因此,希望開發出能夠有效抑 制屬于這種亞型的病毒的藥物。

此外,艾滋病(AIDS)疫苗中,研究了直接使用艾滋病毒的病毒顆粒的生疫苗、使 用病毒顆粒的一部分的組成性疫苗、進行病毒基因重組而獲得的再組合疫苗、使病毒滅 活僅保留其蛋白結構的滅活疫苗等。但是,如果考慮它們的實用性,則不僅要考慮HIV 感染的防御效果,即有效性(免疫性的誘導),還必須考慮到其安全性。

現在,在艾滋病的治療中,大多數采用多劑并用療法(HAART)。提倡HAART療法時 它被稱為跨時代的化學療法,但現在認識到出現耐藥性病毒、HIV的基因組高度變異、 長期及大量服用會產生副作用等問題,所用的藥物的選擇及使用方法極為復雜。

HIV是具有高度的基因組多樣性的病毒,其原因主要有以下2種。

首先第一,HIV基因組的復制錯誤導致多樣性增加。通常采取從基因組RNA通過逆 轉錄酶轉變為DNA,然后被編入宿主細胞基因組的復制過程。由于逆轉錄酶缺乏3′→5′ 核酸外切酶活性,所以對被復制的堿基序列不具有校正功能。此外,由于逆轉錄酶的底 物特異性低,所以逆轉錄反應時的堿基置換、缺失、插入、重復等變異的發生頻率極高 [Mansky,L.M.,J.Gen.Virol., 79,pp.1337-1345(1998)]。

而且,HIV在生物體內以109-10/天的比例繁殖[Perelson,A.S.等,Science, 271,pp.1582-1586(1996)],一年要重復進行300次循環的復制。因此,感染HIV的同 時開始變異的蓄積,進一步造成基因組的多樣性。

此外,不同體系的病毒間的基因組重組也會增加多樣性。HIV所屬的逆轉錄病毒的 基因重組通常是通過在病毒顆粒內進入具有相同性的2個RNA基因組和通過逆轉錄酶的 模板轉換(template?switch)功能奏效的被稱為強制復制選擇(forced?copy?choice) [Coffin,J.M.,J.Gen.Virol., 42,pp.1-26(1979)]的機理而以高頻率發生[Jetzt,A.E. 等,J.Virol., 74,pp.1234-1240(2000)]。因此,有通過獲得這種高度的基因組多樣性, 引發了HIV的準種性、亞型的分化、重組病毒的出現、耐藥性變異、CTL逃逸變異等的 看法。

HIV根據遺傳學體系被大致分為HIV-1型(HIV-1)和HIV2型(HIV-2)這2種。HIV-1 又被分為M組、O組及N組。

M組是HIV-1中最主要的組,被分為A~D、F~H、J及K亞型9種。A及F亞型又 分別被分為A亞-亞型、A2及F1、F2。

E亞型目前被作為CRF01_AE分類,所以本說明書中將E亞型作為“CRF01_AE”(前 述)。

HIV-2被分為A~G亞型[Charneau,P.等,Virology, 205,pp.247-253(1994); Gurtler,L.G.等,J.Virol., 68,pp.1581-1585(1994);Simon,F.等,Nat.Med., 4,pp. 1032-1037(1998);Triques,K.等,AIDS?Re?s.Hum.Retroviruses, 16,pp.139-151 (2000);Robertoson,D.L.等,Science, 288,pp.55-56(2000);Trique?s,K.等, Virology, 259,pp.99-109(1999)]。

作為HIV的重組病毒的分類,有報道包括重組型流行株(CRFs:CRF01~CRF12)、孤 立型重組病毒(URFs:URFsA/C、URFsA/D、URFsB/E、URFsB/C)、歸屬不明的重組病毒(MAL 株)、M組/O組間的重組病毒等[Carr,J.K.等,Virology, 247,pp.22-31(1998); Motomura,K.等,AIDS?Res.Hum.Restroviruses, 16,pp.1831-1843(2000);Peeters,M. 等,J.Virol., 73,pp.7368-7375(1999);Takehisa,J.等,J.Virol., 73,pp.6810-6820 (1999);武部豐,日本病毒學會雜志, 50(2),pp.123-138(2001)]。

作為HIV的糖蛋白,有包膜糖蛋白gp120和膜貫通糖蛋白gp41。被稱為病毒基因 組狀的“env”的基因編碼的gp160被宿主蛋白酶切斷可生成這些糖蛋白[Hallenberger,S. 等,Nature, 360,pp.358-361(1992)]。

由于gp120中存在24處N-結合型糖鏈結合部位[Leonard,C.K.等,J.Biol.Chem., 265,pp.10373-10382(1990)],糖鏈占gp120分子的約一半[Allans,J.S.等,Science, 228,pp.1091-1094(1985)],所以,HIV可以說是被糖鏈覆蓋的病毒。各種實驗證明, HIV對目標細胞進行感染時gp120的糖鏈是必須的[Fennie,C.等,J.Virol., 63, pp.369-646(1989);Matthews,T.J.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 84,pp.5424-5428 (1987);Montefiori,D.C.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 85,pp.9248-9252(1988); Pal,R.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 86,pp.3384-3388(1989)]。

但是,作為HIV-1顆粒感染細胞時的作用機制,考慮是首先gp120與細胞膜上的 CD4結合,然后gp120的V3環與復合受體(趨化因子受體)結合,接著gp41侵入細胞膜 引發膜融合這一系列的作用。目前報道了多種趨化受體,例如,報道了CCR5(巨噬細胞 向性病毒的復合受體)、CXCR4(T細胞向性病毒的復合受體)、CCR1、CCR2b、CCR3、CCR4、 CCR8、CCR9、CXCR2、CXCR5、CXCR6/STRL33及CX3CR1等。作為HIV的分類方法,除了 前述遺傳學體系的方法之外,還有基于這些趨化因子受體分類的方法。例如,作為復合 受體介入CCR5的病毒被分類為CCR5(簡稱為R5)向性病毒、作為復合受體介入CXCR4的 病毒被分類為CXCR4(簡稱為X4)向性病毒,同樣,被分類為CCR1向性病毒和CCR2b向 性病毒等。其中,R5向性病毒是巨噬細胞向性病毒,X4向性病毒被分類為T細胞向性 病毒。此外,R5X4向性病毒被分類對巨噬細胞及T細胞都具有向性的病毒。

關于MBP和HIV的關系,具有MBP的同源變異的人感染HIV的機率較高,此外, 有報道認為這類人被診斷為AIDS后的生存時間較短[Garred,P.等,Lancet, 349,pp. 236-240(1997)]。但是,然后有報道認為相反是具有基因變異的組很難感染 AIDS[Mass,J.等,Aids, 12,pp.2275-2280(1998)]。也有基因變異和AIDS的預后無關 的報道[McBride,M.O.等,Int.J.STD.AIDS., 9,pp.683-688(1998)]。此外,有MBP與 gp120結合的報道[Larkin,M.等,AIDS, 3,pp.793-798(1989);Mizuochi,T.等, J.Biol.Chem., 264,pp.13834-13839(1989);Saifuddin,M.等,J.Gen.Virol., 81,pp. 949-955(2000)]。

但是,完全不知MBP有無抗HIV作用,且MBP有無抑制HIV增殖作用。這些雖然 都是判定MBP作為抗HIV劑是否有用的最重要的因素,但目前為止表示沒有任何證明。

此外,能夠評價MBP的抗HIV作用的評價體系也不存在,所以利用MBP的抗HIV 劑的開發目前無任何進展。

此外,藥物治療HIV時擔心的耐藥性病毒的出現、HIV的基因組高度變異、長期及 大量服用引發的副作用等問題還未解決。另外,疫苗的開發也是極為困難的,特別是E 亞型的研究現在完全沒有開展。

但是,現在已經知道R5向性病毒很難由中和抗體被中和,與病癥的進展有很大關 系。尤其是感染初期時對R5向性病毒的治療方法對患者的預后會產生很大的影響,所 以,要求在初期感染時能夠對R5向性病毒進行正確的處理。此外,感染傳播的HIV大 多數為CCR5向性病毒,所以CCR5作為預防治療和抑制感染·傳播的目標倍受矚目。另 一方面,隨著臨床治療病癥臨近后期階段,CCR5向性病毒向CXCR4向性病毒進行轉變, 到后期階段,CXCR4向性病毒的存在變得非常明顯為一般所知。

這種趨化因子受體的存在是最近才知道的,以這些趨化因子受體為目標的治療藥 物的開發目前僅處于基礎藥劑階段。對這些趨化因子受體的抑制劑的開發也在進行中, 但服用CCR5抑制劑時,還有CXCR4向性病毒的出現加快,可能會加快病癥的發展等令 人擔心的重大問題未解決。

因此,臨床醫生希望開發出能夠避免上述這一連串的問題,而安全且與HIV病毒 的亞型、趨化因子受體向性、巨噬細胞和T細胞向性等各種要素都無關的顯現抗HIV作 用的藥物。

尤其希望開發出對B亞型病毒、CRF01_AE、D亞型病毒顯現出抗病毒作用的藥物, 還希望開發出對CCR5向性病毒、CXCR4向性病毒、CCR5/CXCR4向性病毒顯現出抗HIV 作用的藥物。同樣也希望開發出對巨噬細胞向性病毒、T細胞向性病毒、巨噬細胞/T細 胞向性病毒顯現出抗HIV作用的藥物。

發明內容

本發明是鑒于上述以往技術中指出的問題完成的發明,尤其是本發明者率先確立 了能夠定量評價MBP的抗HIV作用的體系。此外,通過利用該評價體系,第一次證明了 MBP的抗HIV作用,即HIV增殖抑制作用,開辟了MBP作為抗HIV劑的用途。此外,本 發明者還證明MBP不僅對E亞型HIV,對屬于其它子類群(Clade)(亞型)的HIV也顯現 出抗HIV作用。

即,本發明的主題是以MBP為有效成分的抗HIV劑。以MBP為有效成分的本發明 的抗HIV劑,由于MBP的目標是糖鏈,所以其優點是很難受到因HIV基因組變異而出現 的MBP耐性株的影響。此外,由于MBP是生物體中常見的物質,所以具有不會產生用于 以往的化學療法的化合物所確認出現的副作用。

本發明還提供了抗HIV作用的評價方法,即提供了包括以下4個步驟的MBP顯現 抗HIV作用的評價方法,

(1)培養使目標細胞和HIV共存而獲得的感染細胞,

(2)對經過培養的感染細胞進行洗滌獲得洗凈細胞,

(3)在MBP存在下對洗凈細胞進行培養,以及

(4)測定來自培養上清液中的HIV的p24蛋白。

本發明還提供了另一抗HIV作用的評價方法,即提供了包括以下7個步驟的MBP 顯現抗HIV作用的評價方法,

(a)培養HIV和MBP共存的第一混合系,

(b)較好的是與第一混合系同時培養目標細胞和MBP共存的第二混合系,

(c)合并第一混合系和第二混合系獲得感染細胞,

(d)對所得感染細胞進行培養,

(e)對經過培養的感染細胞進行洗滌獲得洗凈細胞,

(f)較好的是在MBP存在下對洗凈細胞進行培養,以及

(g)測定來自培養上清液中的HIV的p24蛋白。

利用這些評價方法,能夠客觀且容易地確認及驗證MBP潛在的抗HIV作用。

附圖說明

圖1為表示HIV感染細胞NDK/M8166中的重組型結合甘露糖的蛋白質(rMBP)和HIV 活性間的關系的圖表。

圖2為表示HIV感染細胞LP65/M8166中的重組型結合甘露糖的蛋白質(rMBP)和HIV 活性間的關系的圖表。

圖3為表示HIV感染細胞NDK/M8166中的天然型結合甘露糖的蛋白質(nMBP)和HIV 活性間的關系的圖表。

圖4為表示結合甘露糖的蛋白質的結構的略圖。

具體實施方式

本發明的抗HIV劑由于利用了作為有效成分的MBP顯現的HIV增殖抑制作用,例 如,HIV中和作用和HIV萌芽抑制作用等,所以對艾滋病患者及HIV感染者的治療和病 癥發展的抑制有用。

此外,本發明的抗HIV劑的有效成分MBP不論是天然物及合成物(包括重組體)還 是其它,只要具有規定的HIV增殖抑制作用,可以是任何一種。尤其適用于本發明的MBP 包括分離自人血清并精制的MBP以及動物細胞,較好的是通過基因工程方法從中國倉鼠 卵巢(CHO)細胞(以下簡稱為“CHO細胞”)分泌的MBP。

例如,參考國際公開公報第WO?99/37676號公報,經過以下一系列的步驟,能夠 制得作為本發明可使用的一種MBP的重組型人結合甘露聚糖的蛋白質(以下簡稱為 “rhMBP”),即,(i)在質粒pNOW1中插入對應于天然型人結合甘露聚糖的蛋白質(以下 簡稱為“nhMBP”)的cDNA的堿基序列(序列號:1)的66bp~812bp的747個連續的多核 苷酸(序列號:2),構建表達載體pNOW1-hMBP;(ii)將表達載體pNOW1-hMBP導入二氫 葉酸還原酶缺陷(dhfr-)的CHO細胞,獲得轉化體;(iii)將所得轉化體在含有新霉素的 培養基中進行培養,獲得新霉素耐性細胞;(iv)將選擇的新霉素耐性細胞在含有甲氨喋 呤(MTX)的培養基中進行培養,獲得甲氨喋呤耐性細胞;以及(v)從選擇的甲氨喋呤耐性 細胞回收rhMBP。

以下,對前述制造方法進行詳細說明。

首先,進行表達載體pNOW1-hMBP的構建。關于構成nhMBP的氨基酸,Herman等 已經有所分析和報道[Sastry等,“人結合甘露糖的蛋白質基因。外顯子結構揭示其與人 類肺表面活性物質基團的進化關系以及在10號染色體上的定 位。”,J.Exp.Med. 170(4),pp.1175-1189(1989)]。構成nhMBP的氨基酸序列用序列號: 3表示。

根據這些序列信息,從人肝臟cDNA文庫(クロ-ンラツク公司制)擴增起始密碼子 到終止密碼子的nhMBP,所得nhMBP的cDNA被限制性酶消化,獲得對應于nhMBP的cDNA 的66~812bp的747個連續的多核苷酸(序列號:2),將其作為插入體。然后,用限制 性酶消化表達載體pMOW1,在pCMV和BGP多聚A間用DNA連結試劑盒(寶酒造制)插入前 述插入體。將籍此獲得的表達載體命名為質粒pNOW1-hMBP。

然后,進行表達克隆的選擇。在二氫葉酸還原酶缺陷(dhfr-)的CHO細胞導入表達 載體pNOW1-hMBP按照以下步驟進行。即,調制添加了胎牛血清的IMDM培養基(GIBCO 公司),在其中混合(dhfr-)DG44CHO細胞株,在37℃、5%二氧化碳氣體的條件下進行24 小時的培養。然后廢棄培養上清液,替其將表達載體pNOW1-hMBP混入脂轉染溶液中, 在其中加入添加了含有預先調制的溶液的FCS的IMDM,在加入次黃嘌呤(GIBCO公司制) 和胸苷(GIBCO公司制)后進行培養,進行表達載體pNOW1-hMBP向dhfr-的宿主CHO細胞 的導入。然后,廢棄培養上清液,加入添加了FCS、次黃嘌呤和胸苷的IMDM再進行培養。

為了獲得新霉素(G418)耐性CHO細胞,在培養導入了表達載體pNOW1-hMBP的細胞 后,用胰蛋白酶對其進行處理,使細胞懸浮于添加了含有新霉素(G418)的FCS的IMDM。 然后,將該懸浮物接種于微型板,在37℃、5%二氧化碳(CO2)的條件下培養2周,出現 新霉素耐性細胞(克隆)。

從確認了rhMBP的產生的克隆中選擇數個,進行各克隆的培養。廢棄各培養上清 液,加入與前述同樣組成的添加了FCS的IMDM,培養4天,回收該培養上清液。測定回 收的培養上清液中的rhMBP的產生量。用對應于作為對照的nhMBP、膠原凝集素的糖識 別區域(CRD)及頸區域的(在大腸菌顯現)的抗兔子多克隆抗體及nhMBP(定量對象),按照 鈴木等的方法[Y.Suzuki等,“哺乳動物細胞中表達的重組牛膠固素的特 性”,Biothem.Biophys.Res.Comun., 238,pp.856-863(1997)]能夠對rhMBP的產生量進 行定量。

為了獲得甲氨喋呤耐性的CHO細胞,對rhMBP產生的克隆進一步進行傳代培養使 其穩定化后,在培養基中加入低濃度的甲氨喋呤進行基因擴增。首先,在添加了加入甲 氨喋呤、新霉素(G418)的10%經過透析的FCS(JRH生物科學公司制)(JRH?Biosciences) 的IMDM中混合選擇的各細胞克隆,播種。在37℃、5%二氧化碳(CO2)的條件下,通過2 周的培養,出現甲氨喋呤耐性細胞(克隆)。通過確認這些甲氨喋呤耐性的克隆的rhMBP 產生性,高水準的產生水平得到確認。

從這些克隆選擇任意的克隆,各自播種,培養2周。廢棄培養上清液,加入與前 述同樣組成的添加了FCS的IMDM(加入了甲氨喋呤、新霉素(G418)的物質),培養4天, 回收培養上清液,確認rhMBP的產生水平。

為了精制rhMBP,播種所得克隆中產生效率最高的克隆,并進行培養。然后,廢棄 培養上清液,添加含有甲氨喋呤和新霉素(G418)的CHO-S-SFM?II培養基(添加維生素C 時,添加維生素C直至終濃度為100mM),培養4天。回收該培養上清液,進行對應于 TBS(由TBS粉(寶酒造社制)調制)的透析,然后,進行對應于TBSC(5mM?CaCl2,TBS)的 透析。接著,利用甘露聚糖-瓊脂糖(SIGMA公司制)進行精制。即,將甘露聚糖-瓊脂 糖裝入柱子(Column?PD-10,空,法瑪西亞公司制)中,在其中通入經過透析的培養液, 用TBSC洗滌后,用TBSE(10mM?EDTA,TBS)溶出。溶出后,加入1M的CaCl2,使終濃度 達到15mM。然后,再次用于甘露聚糖-瓊脂糖,用TBSC洗滌后,用含10mM的甘露糖的 TBS溶出。接著,再次進行對應于TBSC的透析,獲得rhMBP的精制品。

以上獲得的精制的rhMBP用凝膠過濾色譜法進行處理時的280nm的吸光度在 1000~1300kDa的分子量,特別是1150kDa的分子量顯現出特定峰。此外,在200~400kDa 的分子量,特別是300kDa的分子量顯現出特定峰。再者rhMBP的凝膠滲透色譜分析在 使用20mM?Tris-HCl(pH8.0)、0.15mM?NaCl、5mM?EDTA,以0.5ml/分鐘的流速,超級玫 瑰(Superrose)6HR10/30(φ10mm×長300mm,法瑪西亞株式會社制)的條件下進行。 40μg的rnMBP通過該柱子,在280nm的吸光度下進行測定。

按照國際公開公報第WO?99/37676號記載的方法合成的rhMBP作為本發明的抗HIV 劑的有效成分使用時,最好采用前述精制的rhMBP。也可采用該精制rhMBP再次通過凝 膠過濾色譜法而獲得的、利用280nm的吸光度測定在1000~1300kDa的分子量出現的級 分、在200~400kDa的分子量出現的級分或含有上述兩種級分的精制rhMBP。

本發明的抗HIV劑對任一類型的HIV株都有效,從后述的實施例的記載可知,除 了對屬于HIV-1的M組的B亞型的HIV顯示出明顯的抗HIV作用之外,還對屬于HIV-1 的M組的D亞型的HIV、重組型流行株,特別是CRF01_AE株顯現出明顯的抗HIV作用。

本發明的抗HIV劑還對CCR5向性病毒、CXCR4向性病毒及CCR5/CXCR4向性病毒顯 現出明顯的抗HIV作用。此外,本發明的抗HIV劑對巨噬細胞向性病毒、T細胞向性病 毒及巨噬細胞/T細胞向性病毒同樣顯現出明顯的抗HIV作用。

本發明的抗HIV劑作為艾滋病治療劑或HIV感染的病癥發展抑制劑使用時,最好 選擇蛋白質容易與生物體結合的合適的劑型及給藥途徑(靜脈內給藥等)。例如,作為本 發明的醫藥組合物的給藥方法,除了靜脈內給藥外,還可適當選擇經粘膜給藥、經皮給 藥、肌肉內給藥、皮下給藥、直腸內給藥、經口給藥等。而根據給藥方法,可采用各種 形態的制劑。以下所述為靜脈給藥制劑,但本發明所用的劑型并不僅限于這些,可利用 醫藥制劑領域內常用的各種制劑。

研究日本人(479例)的MBP的基因變異及血中MBP濃度后有報道,僅有密碼子 54(GGC→GAC)的突變導致MBP的基因變異,各基因型的比例是野生型/野生型為70.8%、 野生型/突變型為22.5%、突變型/突變型為6.7%。此外,有報道認為血中的MBP濃度是 野生型/野生型為0.18~4.35μg/ml(平均1.26μg/ml)、野生型/突變型為0.00~0.80 μg/ml(平均0.23μg/ml)、突變型/突變型為0.00~0.20μg/ml(平均0.04μg/ml)[芥 子宏行等,醫學的進展,194(12),pp.957-958(2000)]。

本發明的抗HIV劑作為艾滋病治療劑或HIV感染后的病癥進展抑制劑使用時,由 于健康常人的血中MBP濃度為約1μg/ml~約1.5μg/ml,利用ELISA等的方法測定血 中MBP濃度后,因丙型肝炎等肝病癥的影響MBP的產量下降,或因基因變異血中濃度較 低時,最好按血中MBP濃度達到約1μg/ml~約1.5μg/ml的標準也可以決定本發明的 抗HIV劑的靜脈內給藥量。此外,必須定期對HIV-RNA量及CD4陽性細胞數進行監控, 掌握監控結果和MBP給藥量的關系后再決定有效的血中MBP濃度值。血中MBP濃度如果 為正常值,也可以慢慢提高血中濃度(例如,約1.5μg/ml~約5.0μg/ml),定期對 HIV-RNA量及CD4陽性細胞進行定期監控,在掌握監控結果和MBP給藥量的關系后再決 定有效的血中MBP濃度值。

MBP的有效血中濃度由于受個人天生的血中MBP濃度的左右,所以并不是一定的, 較好設定為約1.0μg/ml~約50μg/ml,更好設定為約1.5μg/ml~約10μg/ml,給藥 前或給藥后的血中濃度可在此范圍外。由于基因變異也會導致血中MBP濃度下降,所以 決定MBP給藥量時也需考慮到基因變異的因素。

此外,根據其劑型(口服劑、注射劑、栓劑等公知的劑型),作為制劑原料可加入 溶劑、賦形劑、覆膜劑、基劑、粘合劑、潤滑劑、崩解劑、溶解助劑、懸浮劑、粘稠劑、 乳化劑、穩定劑、緩沖劑、等張劑、無痛化劑、保存劑、矯味劑、芳香劑和著色劑等添 加劑。

這些添加劑的具體例子如下所述,但并不僅限于此。

溶劑:精制水、注射用水、生理鹽水、花生油、乙醇、甘油。

賦形劑:淀粉類、乳糖、葡萄糖、白糖、結晶纖維素、硫酸鈣、碳酸鈣、滑石粉、 二氧化鈦、海藻糖、木糖醇。

覆膜劑:白糖、明膠、乙酸鄰苯二甲酸纖維素及上述高分子賦形劑。

基劑:凡士林、植物油、聚乙二醇、水包油型乳劑性基劑、油包水型乳劑性基劑。

粘合劑:淀粉及其衍生物、纖維素及其衍生物、明膠、褐藻酸鈉、西黃耆膠、阿 拉伯膠等天然高分子化合物、聚乙烯吡咯烷酮等合成高分子化合物、糊精、羥丙基淀粉。

潤滑劑:硬酯酸及其鹽類、滑石粉、蠟類、小麥淀粉、聚乙二醇、加氫植物油、 蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇。

崩解劑:淀粉及其衍生物、瓊脂、明膠末、碳酸氫鈉、纖維素及其衍生物、羧甲 基纖維素鈣、羥丙基淀粉、羧甲基纖維素及其鹽類及其交聯體、低取代型羥丙基纖維素。

溶解助劑:環糊精、乙醇、丙二醇、聚乙二醇。

懸浮劑:阿拉伯膠、西黃耆膠、褐藻酸鈉、單硬酯酸鋁、檸檬酸、各種表面活性 劑。

粘稠劑:羧甲基纖維素鈉、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、 聚乙烯醇、西黃耆膠、阿拉伯膠、褐藻酸鈉。

乳化劑:阿拉伯膠、膽固醇、西黃耆膠、甲基纖維素、各種表面活性劑、卵磷脂。

穩定劑:亞硫酸氫鈉、天冬氨酸、維生素E、螯和劑、惰性氣體、還原性物質。

緩沖劑:磷酸氫鈉、乙酸鈉、硼酸。

等張劑:氯化鈉、葡萄糖。

無痛化劑:鹽酸普魯卡因、利多卡因、苯甲醇。

保存劑:苯甲酸及其鹽類、對羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、逆性肥皂、苯甲醇、苯 酚、乙汞智利水楊酸鈉。

矯味劑:白糖、糖精、肝精、山梨糖醇、木糖醇、甘油。

芳香劑:苦橙皮酊、玫瑰油。

著色劑:水溶性食用色素、色淀染料。

本發明的抗HIV劑除了上述成分之外,還可含有制藥上允許的鹽。制藥上允許的 鹽(類)例如包括與無機堿、有機堿等堿形成的鹽,與無機酸、有機酸、堿性或酸性氨基 酸等的酸加成鹽。這些鹽(類)的具體例子如下所示,但并不僅限于此。

無機堿:鈉、鈣等堿金屬,鈣、鎂等堿土金屬,鋁和銨等。

有機堿:乙醇胺等伯胺,二乙胺、二乙醇胺、二環己胺、N,N′-二苯甲基乙二胺 等仲胺,三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、三乙醇胺等叔胺。

無機酸:鹽酸、氫溴酸、硝酸、硫酸、磷酸。

有機酸:甲酸、乙酸、乳酸、三氟乙酸、富馬酸、草酸、酒石酸、馬來酸、苯甲 酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸。

堿性氨基酸:精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸。

酸性氨基酸:天冬氨酸、谷氨酸。

實施例

以下,通過實施例對本發明進行具體說明,這些實施例的揭示,并不是對本發明 進行限定性的解釋。

以下實施例中被確證的抗HIV作用的用語不僅包括對HIV的中和作用,還包括對 HIV的萌芽抑制作用,但為了方便起見簡稱為“中和作用”。

實施例1及2所用的HIV株的詳細情況示于表1。

表1 病毒株 向性 趨化因子受體 亞型 92Th014 巨噬細胞 CCR5 ?B JRCSF 巨噬細胞 CCR5 ?B LP65 巨噬細胞/T細胞 CCR5/CXCR4 ?E NDK 巨噬細胞/T細胞 CCR5/CXCR4 ?D

實施例1

本實施例對MBP的抗HIV活性進行研究。

首先,作為HIV株準備HIV-NDK實驗株(D亞型,以下簡稱為“NDK”)和重組型流 行株CRF01-AE(臨床分離株,以下簡稱為“LP65”)。

然后,用這些HIV株使通過植物凝集素胚細胞化的人外周血單核細胞(人PBMC,以 下簡稱為“PBMC”)和T細胞系的株化細胞M8166(以下簡稱為“M8166”)分別感染。

NDK和M8166都是能從美國國立衛生研究所(NIH)的AIDS?Research?and?Reference Regent?Program獲得的菌株。

但是,MBP采用從人血液精制的nhMBP和通過國際公開公報第WO?99/37676號記載 的方法合成的rhMBP。

在PBMC及M8166中分別添加暴發癥型病毒NDK,在37℃對它們培養1小時使它們 感染,所得感染株分別被稱為NDK/PBMC及NDK/M8166。此外,分別在PBMC及M8166中 添加LP65,在37℃對它們培養1小時使它們感染HIV。然后,在5×106個/ml的細胞中 同時添加相當于100?TCID50的病毒的量的NDK及LP65。所得感染細胞分別被稱為 “LP65/PBMC”及“LP65/M8166”。

然后,用PBS對感染細胞洗滌2次。以1~100μg/ml的濃度(圖1)或1~30μg/ml 的濃度(圖2~3)在4種病毒感染細胞(NDK/PBMC、NDK/M8166、LP65/PBMC、LP65/M8166) 中添加nhMBP或rhMBP。此時的細胞濃度每200μl為1×106個/ml(即,2×105個/200 μl)。即,1/5規模的200μl體系內放置了MBP1~100μg/l×106個/ml或1~30μg/l ×106個/ml濃度的細胞,在添加了人血清的培養基中,在37℃、5%二氧化碳存在下對 這些細胞培養1周。作為培養后的病毒量的變化指標,用全自動化學發光酶免疫測定系 統(LUMIPULSE?F:富士REBIO株式會社制),對培養上清液中的來自HIV的p24抗原量 進行ELISA測定,與未添加MBP的組進行比較。

其結果是,如圖3所示,確認了添加nhMBP的組對HIV量的抑制(HIV增殖抑制)。 此外,如圖1所示,確認NDK/M8166在rhMBP濃度為10μg/ml~30μg/ml的情況下, 培養上清液中的p24抗原量在培養后迅速被抑制為未添加rhMBP的組的約50%。此外, 從圖2可明顯看出,對于臨床分離株LP65(HIV-1的重組型流行株CRF01_AE),rhMBP在 依賴濃度中和LP65的IC50約為10μg/ml時顯現出抗HIV效果(HIV增殖抑制效果),即, 其抗HIV作用(中和作用)與亞型無關。

此外,在所用的MBP濃度范圍內確認nhMBP及rhMBP都對細胞沒有明顯的增殖抑 制作用和細胞毒性。本實驗體系中,也暗示HIV的萌芽抑制作用,即從感染細胞釋放HIV 的抑制作用。

如上所述,本發明的抗HIV劑對E亞型HIV及D亞型HIV都顯現出抗HIV作用。 同樣,本發明的抗HIV劑對CCR5/CXCR4向性病毒、巨噬細胞/T細胞向性病毒也顯現出 抗HIV作用。

實施例2

作為HIV株準備92Th014實驗株(B亞型)和JRCSF實驗株(B亞型)。這些實驗株都 可從美國國立衛生研究所的AIDS?Research?and?Reference?Regent?Program獲得。此 外,PBMC、nhMBP及rhMBP與實施例1所用相同。

首先,混合相當于100?TCID50的效價的病毒溶液50μl和終濃度為2、6、20、60 μg/ml的nhMBP或rhMBP溶液50μl。然后,在37℃、5%二氧化碳氣體存在下,對該混 合溶液培養1小時,調制出nhMBP或rhMBP的終濃度為1、3、10、30μg/ml的第一混 合系。

與此同時,將PBMC的濃度調整為2×105個/50μl,在其中混合終濃度為2、6、20、 60μg/ml的nhMBP或rhMBP溶液50μl。然后,在37℃、5%二氧化碳氣體存在下,對該 混合溶液培養1小時,調制出nhMBP或rhMBP的終濃度為1、3、10、30μg/ml的第二 混合系。

接著,合并MBP濃度(終濃度)被調整為1、3、10、30μg/ml的任何一個的第一混 合系和第二混合系,于37℃培養一晝夜后,洗滌除去未反應的MBP和病毒。洗滌后,為 了與洗滌前的MBP終濃度相等,添加新鮮的nhMBP或rhMBP,在含有10%的FCS的RPMI 培養基(含有20單位/ml的白細胞介素2、50單位/ml的青霉素、50單位/ml的鏈霉素) 中培養7天。作為培養后的病毒量變化指標,用全自動化學發光酶免疫測定系統 (LUMIPULSE?F:富士REBIO株式會社制),對培養上清液中的來自HIV的p24抗原量進 行ELISA測定,與未添加MBP的組進行比較。

其結果是,對作為野生株病毒的JRCSF及92Th014都具有明顯的抗HIV活性(HIV 增殖抑制活性)。使p24抗原量減半所必須的MBP量(50%抑制濃度)在用于JRCSF時,nhMBP 為0.19μg,rhMBP在2.74μg以下。同樣,在用于92Th014時,nhMBP為7μg,rhMBP 在1.57μg以下。從這些事實可說明,MBP對野生型B亞型病毒株也具有很好的抗HIV 活性(中和活性)。

此外,從本實施例的結果可看出,本發明的抗HIV劑對CCR5向性病毒、巨噬細胞 向性病毒也顯現出抗HIV作用。本實施例中,直接證明了MBP對CCR5向性病毒顯現出 的抗HIV作用,所以MBP不僅可用于HIV感染初期的治療,還可有效用于預防治療和對 感染·傳播的抑制。另外,本實施例中直接證明了本發明的抗HIV劑對CCR5/CXCR4向 性病毒也具有抗HIV作用,所以不僅對HIV感染的感染初期有效,對臨床發展病癥(即, 不僅對HIV感染者對HIV患者)也有效。

從實施例1及實施例2獲得結果可看出,因為對CCR5/CXCR4向性病毒顯現出抗HIV 作用的MBP對CCR5向性病毒顯現出同樣的抗HIV作用,所以認為MBP對CXCR4向性病 毒也應顯現出抗HIV作用。同樣,因為對巨噬細胞/T細胞向性病毒顯現出抗HIV作用的 MBP對巨噬細胞向性病毒顯現出同樣的抗HIV作用,所以認為MBP對T細胞向性病毒也 應顯現出抗HIV作用。

從實施例1及實施例2的實驗結果可看出,本發明的抗HIV劑對CCR5向性病毒、 CXCR4向性病毒及CCR5/CXCR4向性病毒都顯現出抗HIV作用。此外,本發明的抗HIV 劑對巨噬細胞向性病毒、T細胞向性病毒及巨噬細胞/T細胞向性病毒都顯現出抗HIV作 用。

產業上利用的可能性

以MBP為有效成分的本發明的抗HIV劑對包含活性中和最困難的重組型流行株 CRF01_AE病毒的多種HIV株顯現出中和活性。即,本發明的抗HIV劑與病毒的亞型、趨 化因子受體向性、巨噬細胞/T細胞向性的種類和程度無關,尤其是對目前最不確定的B 亞型HIV、D亞型HIV及CRF01_AE顯現出規定的抗HIV作用。

此外,本發明的抗HIV劑也對CCR5向性病毒、CXCR4向性病毒及CCR5/CXCR4向性 病毒都顯現出抗HIV作用。另外,本發明的抗HIV劑還對巨噬細胞向性病毒、T細胞向 性病毒及巨噬細胞/T細胞向性病毒顯現出抗HIV作用。

本發明的抗HIV劑由于以糖鏈為目標,所以因HIV基因組變異而出現MBP耐性株 的可能性很小。而且,由于MBP本身存在于生物體內,所以沒有以往的HIV治療中所用 的化合物所產生的副作用。

因此,本發明的抗HIV劑能夠應對多種因HIV而導致的感染癥,對其治療極為有 用。

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<110>扶桑藥品工業株式會社(FUSO?PHARMACEUTICAL?INDUSTRIES,LTD.)

<120>抗HIV劑(Anti-HIV?Agent)

<130>03P451WO

<150>JP?2002-189534

<151>2002-06-28

<160>3

<210>1

<211>3605

<212>DNA

<213>智人(Homo?sapiens)

<400>1

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<210>2

<211>747

<212>DNA

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