鬼佬大哥大
  • / 6
  • 下載費用:30 金幣  

一種抗禽傳染性支氣管炎病毒的植物提取物.pdf

關 鍵 詞:
一種 傳染性 支氣管炎 病毒 植物 提取物
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
摘要
申請專利號:

CN201610152260.X

申請日:

20160317

公開號:

CN105796798A

公開日:

20160727

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A61K36/8888,A61P31/14 主分類號: A61K36/8888,A61P31/14
申請人: 長江大學
發明人: 王真,方守國,梁雄燕,安紅柳,章松柏
地址: 434023 湖北省荊州市南環路1號
優先權: CN201610152260A
專利代理機構: 武漢河山金堂專利事務所(普通合伙) 代理人: 胡清堂
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN201610152260.X

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

一種抗禽傳染性支氣管炎病毒的植物提取物,包括如下步驟:S1、重組病毒的獲得;S2、對指示病毒的檢測;S3、半夏乙醇提取物的制備;S4、細胞無毒濃度的確定;S5、病毒感染;S6、酶活力的測定與病毒效力的評價。其優點是:通過替換IBV基因組上的3ab片段,以獲得能夠融合表達熒光素酶的指示病毒,侵染細胞,在病毒侵染細胞的前后過程中,加入半夏乙醇提取物,從而確定加入的半夏乙醇提取物對禽類IBV有抑制作用。

權利要求書

1.一種抗禽傳染性支氣管炎病毒的植物提取物,其特征在于:包括如下步驟:S1、重組病毒的獲得:在禽傳染性支氣管炎病毒基因組上,通過替換禽傳染性支氣管炎病毒基因組的3ab片段,以獲得能夠融合表達熒光素酶的重組病毒IBV-3ab-luc,用該重組病毒IBV-3ab-luc作為指示病毒;S2、對指示病毒的檢測:用指示病毒感染細胞,病毒復制一次,表達的熒光素酶的量也相應增加一次,感染后取樣,測定熒光素酶的活力,以確定該指示病毒具有與IBV相同的感染力;S3、半夏乙醇提取物的制備:在半夏生長旺盛期,采集半夏莖葉洗凈晾干后,切碎稱重,用溶劑浸泡切碎后的半夏莖葉后過濾備用;S4、細胞無毒濃度的確定:用乙醇做溶劑,等倍稀釋步驟S3中獲得的半夏乙醇提取物備用;將備用的不同濃度的半夏乙醇提取物分別加入細胞培養板中后觀察細胞生長情況,細胞變形脫落死亡視為該濃度的半夏乙醇提取物對細胞有害,據此選取對細胞無毒影響的半夏乙醇提取物最高濃度進行后續實驗;S5、病毒感染:在細胞培養板中,培養細胞,待細胞的覆蓋度達到85%以上時,選取步驟S4獲得的對細胞無毒影響的濃度的半夏乙醇提取物加入細胞培養液中,24h后,采用步驟S1制備的重組病毒IBV-3ab-luc感染;S6、酶活力的測定與病毒效力的評價:感染24h后,進行熒光素酶活力的檢測,明確抗病毒的效力,同時半夏乙醇提取物對重組病毒IBV-3ab-luc抑制效果明顯。2.如權利要求1所述的一種抗禽傳染性支氣管炎病毒的植物提取物,其特征在于:步驟S3中,用80%乙醇做溶劑浸泡切碎后的半夏莖葉,7d后,再過濾備用。3.如權利要求1所述的一種抗禽傳染性支氣管炎病毒的植物提取物,其特征在于:步驟S3中,過濾所采用的過濾器為0.22μm過濾器。4.如權利要求1所述的一種抗禽傳染性支氣管炎病毒的植物提取物,其特征在于:步驟S4中,選用80%乙醇做溶劑;細胞培養板為24孔,且經過48h后觀察細胞生長情況。

說明書

技術領域

本發明涉及生物技術領域,具體地說是一種抗禽傳染性支氣管炎病毒的植物提取物。

背景技術

現有技術中半夏乙醇提取物具有多種用途,例如:對桃蚜的控制、對人胃癌細胞的影響等等,而其在其它方面是否具有意想不到的效果,仍是我們追溯研究的方向。

發明內容

本發明的目的是研究半夏乙醇提取物在病毒抑制上的效用。

本發明一種抗禽傳染性支氣管炎病毒的植物提取物,包括如下步驟:

S1、重組病毒的獲得:在禽傳染性支氣管炎病毒基因組上,通過替換禽傳染性支氣管炎病毒基因組的3ab片段,以獲得能夠融合表達熒光素酶的重組病毒IBV-3ab-luc,用該重組病毒IBV-3ab-luc作為指示病毒;

S2、對指示病毒的檢測:用指示病毒感染細胞,病毒復制一次,表達的熒光素酶的量也相應增加一次,感染后取樣,測定熒光素酶的活力,以確定該指示病毒具有與IBV相同的感染力;

S3、半夏乙醇提取物的制備:在半夏生長旺盛期,采集半夏莖葉洗凈晾干后,切碎稱重,用溶劑浸泡切碎后的半夏莖葉后過濾備用;

S4、細胞無毒濃度的確定:用乙醇做溶劑,等倍稀釋步驟S3中獲得的半夏乙醇提取物備用;將備用的不同濃度的半夏乙醇提取物分別加入細胞培養板中后觀察細胞生長情況,細胞變形脫落死亡視為該濃度的半夏乙醇提取物對細胞有害,據此選取對細胞無毒影響的半夏乙醇提取物最高濃度進行后續實驗;

S5、病毒感染:在細胞培養板中,培養細胞,待細胞的覆蓋度達到85%以上時,選取步驟S4獲得的對細胞無毒影響的濃度的半夏乙醇提取物加入細胞培養液中,24h后,采用步驟S1制備的重組病毒IBV-3ab-luc感染;

S6、酶活力的測定與病毒效力的評價:感染24h后,進行熒光素酶活力的檢測,明確抗病毒的效力,同時半夏乙醇提取物對重組病毒IBV-3ab-luc抑制效果明顯。

優選地,步驟S3中,用80%乙醇做溶劑浸泡切碎后的半夏莖葉,7d后,再過濾備用;

優選地,上述過濾所采用的過濾器為0.22μm過濾器;

優選地,步驟S4中,選用80%乙醇做溶劑;細胞培養板為24孔,且經過48h后觀察細胞生長情況;

本發明一種抗禽傳染性支氣管炎病毒的植物提取物,其優點是:通過替換IBV基因組上的3ab片段,以獲得能夠融合表達熒光素酶的指示病毒,侵染細胞,在病毒侵染細胞的前后過程中,加入半夏乙醇提取物,從而確定加入的半夏乙醇提取物對禽類IBV有抑制作用。

具體實施方式

本發明的工作原理是:在禽傳染性支氣管炎病毒(IBV)基因組上,通過替換IBV基因組的3ab片段,獲得能夠融合表達熒光素酶的重組病毒IBV-3ab-luc,用該重組病毒作為指示病毒,侵染細胞,通過熒光素酶的活力可以明確病毒的復制量。采用這種方法體系,可在病毒侵染細胞的前后過程中,加入某些特定物質,從而確定加入的特定物質是否對禽傳染性支氣管炎病毒有抑制作用,同時,觀測出特定物質對禽傳染性支氣管炎病毒的抑制效力。

一種抗禽傳染性支氣管炎病毒的植物提取物,包括如下步驟:

S1、重組病毒的獲得:在禽傳染性支氣管炎病毒基因組上,通過替換禽傳染性支氣管炎病毒基因組的3ab片段,以獲得能夠融合表達熒光素酶的重組病毒IBV-3ab-luc,用該重組病毒IBV-3ab-luc作為指示病毒;

S2、對指示病毒的檢測:用指示病毒感染細胞,病毒復制一次,表達的熒光素酶的量也相應增加一次,感染后取樣,測定熒光素酶的活力,以確定該指示病毒具有與IBV相同的感染力。

S3、半夏乙醇提取物的制備:在半夏生長旺盛,采集半夏莖葉洗凈晾干后,切碎稱重,用80%乙醇做溶劑浸泡切碎后的半夏莖葉,7d后,用過濾器過濾后備用;

S4、細胞無毒濃度的確定:用80%乙醇做溶劑,2倍稀釋步驟S3中獲得的半夏乙醇提取物,半夏乙醇提取物的初始濃度為0.8534g/mL,稀釋后濃度依次為:0.4267g/mL、0.2134g/mL和0.1067g/mL;將備用的不同濃度的6μL半夏乙醇提取物分別加入盛有DF-1細胞(雞胚成纖維細胞,培養液為DMEM,血清為FBS)的24孔細胞板中,48h后觀察細胞的生長情況,細胞變性脫落死亡視為該濃度的半夏乙醇提取物對細胞有害,據此選取對細胞無毒影響的半夏乙醇提取物濃度(0.2134g/mL)進行后續實驗;

S5、病毒感染:在24孔細胞培養板中,用500μLDMEM培養DF-1細胞,待細胞的覆蓋度達到85%以上時,進行試驗,選取步驟S4獲得的對細胞無毒的最大濃度半夏乙醇提取物2-6μL,在指示病毒侵染細胞前24h和病毒侵染細胞2h后,分別加入到細胞培養液中(其中提取物處理細胞24h后,換掉培養液,加入500μL的DMEM,再行病毒感染);

S6、酶活力的測定與病毒效力的評價:病毒感染24h后,處理細胞,進行熒光素酶活力的檢測,明確抗病毒的效力。(具體結果見下表),半夏乙醇提取物在病毒感染細胞前24h處理細胞后,病毒再感染受阻明顯(酶活力與對照相比,比值達到255897),而病毒侵染細胞2h之后,再用半夏提取物處理,抑制效果很差(比值為39),綜合結果表明:半夏乙醇提取物具有預防病毒侵染的作用。

下面結合具體實施例為本發明作進一步說明:

實施例一:

半夏乙醇提取物對雞傳染性支氣管炎病毒的性能測定:

S1、重組病毒的獲得:選取感染有傳染性支氣管炎病毒的雞,獲取雞上傳染性支氣管炎病毒基因組,再通過替換雞的傳染性支氣管炎病毒基因組的3ab片段,以獲得能夠融合表達熒光素酶的重組病毒IBV-3ab-luc,將此病毒命名為重組病毒Ⅰ,用重組病毒Ⅰ作為指示病毒;

S2、對指示病毒的檢測:用重組病毒Ⅰ感染細胞,病毒復制一次,表達的熒光素酶的量也相應增加一次,感染后取樣,測定熒光素酶的活力,以確定該指示病毒具有與IBV相同的感染力;

S3、將無毒濃度的半夏乙醇提取物2mL,攝入對未感染傳染性支氣管炎病毒的雞體內,將雞放入感染有傳染性支氣管炎病毒的雞群中生長,觀察7d之后,發現放入的雞未出現禽傳性支氣管炎典型癥狀,室內realtime-PCR檢測,發現雞體內存在禽傳染性支氣管炎病毒,但是病毒量很低,雞的生長狀況良好;

根據實施例一,結論為:半夏乙醇提取物具有良好的預防IBV侵染的作用。

實施例二:

半夏乙醇提取物對鴨傳染性支氣管炎病毒的性能測定:

S1、重組病毒的獲得:選取感染有傳染性支氣管炎病毒的鴨,獲取鴨上傳染性支氣管炎病毒基因組,再通過替換鴨的傳染性支氣管炎病毒基因組的3ab片段,以獲得能夠融合表達熒光素酶的重組病毒IBV-3ab-luc,將此病毒命名為重組病毒Ⅱ,用重組病毒Ⅱ作為指示病毒;

S2、對指示病毒的檢測:用重組病毒Ⅱ感染細胞,病毒復制一次,表達的熒光素酶的量也相應增加一次,感染后取樣,測定熒光素酶的活力,以確定該指示病毒具有與IBV相同的感染力。

S3、將無毒濃度的半夏乙醇提取物3mL,攝入對未感染傳染性支氣管炎病毒的鴨體內,將鴨放入感染有傳染性支氣管炎病毒的鴨群中生長,觀察7d之后,發現放入的鴨未出現禽傳性支氣管炎典型癥狀,室內realtime-PCR檢測,發現鴨體內存在禽傳染性支氣管炎病毒,但是病毒量很低,鴨的生長狀況良好;

根據實施例二,結論為:半夏乙醇提取物具有良好的預防IBV侵染的作用。

關于本文
本文標題:一種抗禽傳染性支氣管炎病毒的植物提取物.pdf
鏈接地址:http://www.wwszu.club/p-6898668.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 zhuanlichaxun.net網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開
鬼佬大哥大