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一種含有二甲雙胍囊泡類給藥系統及其應用.pdf

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一種 含有 二甲雙胍 囊泡類 系統 及其 應用
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摘要
申請專利號:

CN201110105030.5

申請日:

20110426

公開號:

CN102755292B

公開日:

20140423

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K9/127,A61K47/16,A61K31/155,A61P35/00 主分類號: A61K9/127,A61K47/16,A61K31/155,A61P35/00
申請人: 沈陽藥科大學
發明人: 鄧意輝,楊強,張小飛
地址: 110016 遼寧省沈陽市沈河區文化路103號
優先權: CN201110105030A
專利代理機構: 沈陽杰克知識產權代理有限公司 代理人: 李宇彤
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法律狀態
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CN201110105030.5

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摘要

本發明屬于藥物制劑領域,具體公開一種含有二甲雙胍囊泡類給藥系統及其應用。本發明用二甲雙胍替代經典銨離子梯度中的部分銨,建立脂質體內外水相的銨梯度和/或二甲雙胍梯度,制備一種新的囊泡類給藥系統(包括各種脂質體),利用跨膜梯度將抗腫瘤藥主動裝載入脂質體,同時二甲雙胍仍滯留于脂質體內水相,以使二者共同包封于脂質體內。即以表面活性物質為基本膜材、以含胍基陽離子化合物的溶液為水化介質制備獲得空白囊泡,然后將空白囊泡建立跨膜梯度即得。本發明提供的囊泡類給藥系統具有載藥范圍廣、藥物包封率高及穩定性好的特點,且可降低藥物毒性,抑制腫瘤復發。

權利要求書

1.一種含有二甲雙胍囊泡類給藥系統,其特征在于,所述的給藥系統是以表面活性物質為基本膜材、以含胍基陽離子化合物的溶液為水化介質制備獲得空白囊泡,然后將空白囊泡建立跨膜梯度獲得,所述的含胍基陽離子化合物的結構通式如下:?所述的水化介質為含胍基陽離子化合物與一價、二價、三價或多價陰離子所形成的鹽的溶液;所述的陰離子包括但不限于SO、PO、HPO、HPO、Cl、枸櫞酸根、醋酸根、EDTA、六偏磷酸根、蔗糖八硫酸酯根、三聚磷酸根、焦磷酸根、甘油磷酸根、果糖二磷酸根、三磷酸腺苷根、植酸根、鄰苯二甲酸根、間苯二甲酸根、對苯二甲酸根、苯甲酸根、間苯二甲酸根、間苯三甲酸根、乳糖酸根、二巰基丁二酸根、二乙三胺五乙酸根、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸根或氨基三乙酸根;所述含胍基陽離子化合物的溶液濃度為50-300?mmol·L;?所述的含胍基陽離子化合物的溶液pH值在6.0-9.0?之間。2.如權利要求1所述的囊泡類給藥系統,其特征在于,所述的含胍基陽離子化合物的溶液中加入氨水、三乙胺、三乙醇胺等無機或有機堿調節溶液pH值在6.0-9.0?之間。3.權利要求1所述的囊泡類給藥系統在制備抗腫瘤藥物中的應用。4.如權利要求3所述的應用,其特征在于,囊泡類給藥系統中,胍基陽離子化合物與抗腫瘤藥物的質量比為0.05-5:1。5.如權利要求1所述的囊泡類給藥系統,其特征在于,所述的基本膜材優選磷脂,選自下列物質中的至少一種:大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂、EPG、磷脂酸、心肌磷脂、鞘磷脂、磷脂酸絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、氫化大豆卵磷脂、氫化蛋黃卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二月桂酰磷脂酰膽堿、二癸酰磷脂酰膽堿、二辛酰磷脂酰膽堿、二己酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰甘油及其鈉鹽、二棕櫚酰磷脂酰甘油及其鈉鹽、L-α-二肉豆蔻酰磷脂酰甘油及其鈉鹽、二月桂酰磷脂酰甘油、二癸酰磷脂酰甘油、二辛酰磷脂酰甘油、二己酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰乙醇胺、雙二硬脂酰磷脂酰甘油及其鈉鹽、雙二棕櫚酰磷脂酰甘油及其鈉鹽、雙二肉豆蔻酰磷脂酰甘油及其鈉鹽、雙二月桂酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰肌醇、二棕櫚酰磷脂酰肌醇、二油酰磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰磷脂酰肌醇、二月桂酰磷脂酰肌醇、棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿、棕櫚酰亞油酰磷脂酰膽堿、硬脂酰亞油酰磷脂酰膽堿、硬脂酰油酰磷脂酰膽堿、硬脂酰花生四烯酰磷脂酰膽堿、DSPE-PEG、DPPE-PEG、DMPE-PEG、DLPE-PEG、其中所述DSPE-PEG、DPPE-PEG、DMPE-PEG、DLPE-PEG中PEG的分子量為100~10000。6.如權利要求1所述的囊泡類給藥系統,其特征在于,所述的基本膜材中加入PEG?衍生物,其用量為脂質總用量的0~50%。

說明書

技術領域

本發明屬于藥物制劑領域,具體涉及一種含有二甲雙胍并可以利用梯度實現主動載藥的囊泡類給藥系統及其應用。

背景技術

腫瘤復發及轉移始終是惡性腫瘤治療過程中難以徹底解決的兩大難題。在以往腫瘤研究過程中,?傳統理論認為腫瘤的發生和發展是所有腫瘤細胞共同增殖的結果,因此研究一直致力于如何殺滅大量的腫瘤細胞群體。但是近年來研究發現并非所有腫瘤細胞都具有無限增殖潛能,只有少量干細胞性質的細胞群體即腫瘤干細胞具有自我更新和無限增殖的潛能。

腫瘤干細胞學說認為腫瘤細胞之間存在異質性,只有一小部分腫瘤干細胞具有無限增殖和形成腫瘤的能力。2006年AACR?(American?Association?for?Cancer?Research)?對腫瘤干細胞(Cancer?stem?cell/Tumor?stem?cell,?CSC?/TSC)的定義是:腫瘤中具有自我更新能力并能產生異質性腫瘤細胞的細胞。目前研究發現CSC與普通干細胞之間存在著極為相似的特征:(?1?)?都具有無限增殖和分化的特點;(?2?)?存在相似的調節自我更新的信號傳導途徑;(?3?)?都具有不同表型,異質性;(?4?)?都具有端粒酶活性,可以修復DNA損傷;(?5?)?都能轉移到各種不同的組織且有相似的歸巢和轉移途徑。當然,CSC?還具有不同于普通干細胞的特點::(?1?)?自我更新信號轉導途徑的負反饋機制已被破壞;(?2?)?缺乏分化成熟能力;(?3)?傾向于累積復制的錯誤,而干細胞能夠防止復制錯誤的發展等。目前認為腫瘤干細胞可能的來源有三種:(1)具有癌性表型正常干細胞;(2)具有致癌突變的定向祖細胞重新獲得自我更新能力;(3)干細胞與其它細胞之間罕見的融合事件。到目前為止,除了在粒細胞白血病、乳腺癌和腦腫瘤中鑒定了腫瘤干細胞的存在,科學家們已經相繼在肺癌、惡性黑色素瘤、前列腺癌、卵巢腫瘤、結腸癌、肝癌中得到了腫瘤干細胞的證據。特異性靶向腫瘤干細胞、清除腫瘤干細胞庫,對于惡性腫瘤的長期穩定、緩解乃至治愈至關重要。

目前常用的靶向腫瘤干細胞的治療藥物主要有以下三類:小分子物質、蛋白和病毒。

哈佛大學醫學院的研究人員在2009年9月14日?Cancer?Research?發布的研究表明二甲雙胍可以改善乳腺癌發展。研究發現二甲雙胍可以選擇性殺死四種基因型不同的乳腺癌中的腫瘤干細胞,阿霉素與二甲雙胍的聯合使用殺死了培養的腫瘤干細胞和非腫瘤干細胞,有效抑制了異種移植小鼠腫瘤的生長。

某些兩親性分子,如許多天然的或合成的表面活性劑及不能簡單締合成膠團的磷脂,分散于水中時會自發形成一類具有封閉雙層結構的分子有序組合體,稱為囊泡(vesicle),也稱為脂質體(liposome)?。囊泡和脂質體這兩個術語的意義在文獻中有些含混。一般認為,如果這些兩親分子是天然表面活性劑卵磷脂,則形成的結構就稱為脂質體;若由合成表面活性劑組成,則稱為囊泡。因此,脂質體特指由磷脂形成的一類特殊的囊泡,它是人類最先發現的囊泡體系。

脂質體是由單個或多個脂質雙層包裹親水內核組成的,脂質層的主要成分是磷脂,在大多數情況下也含有膽固醇。親脂性藥物可以被包裹到脂質雙層中,而親水性藥物則可以進入到脂質層之間的水層或是水性內核中。脂質體的雙分子層結構類似細胞膜,具有良好的生物相容性,與其它藥物載體相比,脂質體具有獨特的優勢:(1)脂質體的主要成分是磷脂和膽固醇,為哺乳動物細胞膜的天然成分,具有生物相容性,可生物降解、無毒性和無免疫原性;(2)脂質體的大小、磷脂成分、表面電荷等有很大的選擇空間;(3)脂質體能包裹親水性和親脂性藥物,將藥物包封入脂質體中,可保護藥物在體內不被降解,同時避免藥物對受體識別配體的干擾;(4)易獲得適宜的藥物-載體比,制備簡單;(5)與固體聚合物載體系統(如微粒、納米粒)不同,脂質體雙層脂膜在相變溫度以上處于液晶態,允許表面結合的靶向分子有更大的自由度,因此靶向分子能以最優構型與靶部位受體結合;(6)脂質體還為所包裹藥物的靶向性提供了新的可能,包括細胞外釋放、細胞膜融合和內吞,提高了藥物的靶向范圍;(7)脂質體與藥物間無共價鍵連接,利于藥物在溶酶體內釋放;(8)在載藥脂質體表面結合不同的配基如抗體、糖酯等可將藥物遞送到特定靶組織和靶細胞。

近年來,脂質體作為藥物載體在許多疾病,尤其是癌癥的治療中顯示出明顯的優越性。將抗腫瘤藥物制備成脂質體后可以明顯減少系統和特定部位的毒副作用(如心臟毒性、腎臟毒性),并能提高藥物靶向性、增強藥物療效。目前認為脂質體療效增強是由于藥物從脂質載體成分中緩慢釋放以及脂質體對腫瘤部位被動靶向作用所引起的,而毒性降低的原因則是減少了藥物與體內正常組織的接觸。

脂質體作為藥物載體臨床應用較早,發展較為完善。目前已上市的脂質體產品有阿霉素脂質體(Doxil、Caelyx及Myocet)、柔紅霉素脂質體(DaunoXome)和阿糖胞苷脂質體(DepoCyt)等。

作為藥物載體,脂質體裝載藥物的方法主要包括被動載藥法和主動載藥法,但是傳統的被動載藥法制得的脂質體通常包封率低,特別是包封一些兩親性弱酸或弱堿藥物,由于其油水分配系數受介質的pH值和離子強度影響較大,包封條件不易掌握,制備的脂質體包封率差異較大。因此,包封率低及易滲透問題在很大程度上限制了脂質體作為藥物載體的推廣。主動載藥法(也稱離子梯度法)可以將某些兩親性藥物高效地裝載入脂質體內,克服了早期藥物突釋和泄漏,在一定程度上解決了這些藥物脂質體制劑的大規模工業化生產難題。離子梯度法的實現取決于適宜離子梯度差的建立,如氫離子梯度,即通過形成“質子池”,酸性的內部環境使擴散入脂質體內部的中性兩親性藥物發生質子化作用而荷正電,阻止其再次跨膜。

離子梯度法細分為:(1)pH梯度法;(2)硫酸銨梯度法;(3)醋酸鈣梯度法;(4)離子梯度-細胞離子載體法。其中后三種方法將藥物主動裝載入脂質體的原動力都可歸結為pH梯度,即通過適當離子梯度誘導產生pH梯度,這三種方法其實是pH梯度法的特殊形式。裝載弱堿性藥物可采用pH梯度法或硫酸銨梯度法,裝載弱酸性藥物則可采用醋酸鈣梯度法。

離子梯度法制備脂質體的基本原理為:(1)脂質體磷脂雙層膜可以選擇性地將脂質體內外的水溶性物質,包括H+、K+、Na+、Ca2+、Mn2+等各種陽離子,SO42-、枸櫞酸根、醋酸根等各種陰離子有效地分隔開,形成脂質體內外水相兩個相對獨立的環境;(2)弱堿或弱酸性藥物在非離子狀態呈脂溶性,可以依據梯度差透過磷脂膜進入脂質體內水相。在生物體系中,許多物質進出細胞也是通過離子梯度(也稱作離子通道或離子泵)為動力而實現轉運的。一般認為,離子梯度法可以高效裝載藥物主要依賴以下兩種機制:直接產生pH梯度和間接產生pH梯度。

直接產生pH梯度:pH梯度法(pH?gradient?method)是通過調節脂質體內外水相的pH形成一定的pH梯度差,利用弱酸或弱堿性藥物在不同pH溶液中解離狀態的差異,使藥物在外水相中以分子狀態存在,透過脂質體雙分子膜后在內水相中再形成離子型藥物而被包封。空白脂質體在高于相變溫度孵育時處于液晶態,雙分子膜流動性增加,通透性增大,有利于分子型藥物透過脂質體雙分子膜。在pH梯度的作用下,外水相中的藥物通過脂質雙分子膜不斷擴散進入到內水相中,這個過程一直持續到內水相與外水相中藥物濃度比與氫離子濃度比相等([D]i/[D]o=?[H+]i/[H+]o)pH梯度法中藥物包封的動力學方程見公式(1):

[D(t)]i=[D(eq)]i(1-e-kt)????????????????????(1)

其中,k=PAmKd/Vo[H+]o,[D(t)]i為t時刻內水相藥物濃度,[D(eq)]i為載藥平衡后內水相藥物濃度,k為速率常數,P為中性藥物分子的膜透過系數,Am為膜表面積,Kd為藥物的解離常數,Vo為外水相體積,[H+]o為外水相氫離子濃度。

間接產生的pH梯度:盡管通過內水相為枸櫞酸緩沖鹽形成的pH梯度已經成功將多種藥物裝載入脂質體,但是并不是所有的弱堿性藥物都適合用這種方法裝載,如環丙沙星。環丙沙星在酸性或堿性環境中荷電且可溶解,但是在生理pH范圍內確切地說是載藥技術的外水相中呈中性且溶解性低,因此,很難采用檸檬酸梯度法將其載入脂質體(包封率通常低于20%)。但是使用硫酸銨形成的跨膜梯度就能夠達到很高的包封率。

在內外水相具有硫酸銨梯度的大單室脂質體中,會有少量的中性氨分子從內水相中游離出來,形成內水相pH為2.7的非緩沖體系,從而間接產生一個內外水相的pH梯度。這時外水相的中性藥物分子就會在濃度差的作用下擴散進入脂質體內水相,同時消耗一個質子,形成荷電粒子被包入脂質體。隨著中性分子進入脂質體內水相,質子被消耗,導致更多的中性氨分子擴散到外水相產生更多的質子,作為載藥的動力。直到所有的藥物被包封完成或內水相的質子完全消耗時該過程結束。該技術適合于環丙沙星等以鹽酸鹽形式供給的藥物,或溶解于水后呈弱酸性和可溶性的藥物。此外,銨梯度制得的阿霉素脂質體的包封率也很高。該方法一直以來被應用于多數藥物脂質體的制備,如阿霉素,表柔比星,環丙沙星,長春新堿。該法也可以使用烴基銨鹽(如硫酸甲基銨)代替銨鹽形成梯度達到載藥目的。

發明內容

本發明旨在用二甲雙胍替代經典銨離子梯度中的部分銨,建立脂質體內外水相的銨梯度和/或二甲雙胍梯度,制備一種新的囊泡類給藥系統(包括各種脂質體),利用跨膜梯度將抗腫瘤藥主動裝載入脂質體,同時二甲雙胍仍滯留于脂質體內水相,以使二者共同包封于脂質體內,從而實現增強療效、降低毒性,靶向腫瘤細胞、殺滅腫瘤細胞及腫瘤干細胞并抑制腫瘤復發的作用。

為實現本發明的目的,發明人提供如下技術方案。

一種囊泡類給藥系統(包括脂質體),其采用下述方法制備:

首先以表面活性物質為基本膜材、以含胍基陽離子化合物的溶液為水化介質制備獲得空白囊泡,然后將空白囊泡建立跨膜梯度即得。

本發明以表面活性物質為基本膜材,包括適宜的離子型與非離子型表面活性劑、大分子物質,如各種磷脂及其衍生物,脫水山梨醇脂肪酸脂類、聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸脂類,還可選甾醇類及其衍生物,以及其它必要膜材。

上述跨膜梯度為本專業領域中概念,即囊泡內外水相的成分、濃度梯度;空白囊泡水化介質中含有可交換的各種陽離子或者陰離子或者陰陽兩種離子,離子種類可以是一種或者兩種或者兩種以上,以任意比例混合的任意濃度。建立跨膜梯度的方法可按照現有的常規方法操作,如透析法、切向流、葡聚糖凝膠分子篩法、大孔樹脂法或高速離心法等等。也可按照離子交換法建立跨膜梯度,所謂離子交換法即采用適宜的離子交換劑去除囊泡外水相中的陰離子、陽離子,或者陰陽離子同時除去,而內水相中的陰陽離子未被除去或者除去很少,從而建立膜內外梯度,實現主動載藥。

作為優選方案,根據本發明所述的囊泡類給藥系統,其中,所述的含胍基陽離子化合物結構通式如下:

即所述的含胍基陽離子化合物為二甲雙胍。

作為優選方案,根據本發明所述的囊泡類給藥系統,其中,所述含胍基陽離子化合物的溶液濃度為10-1000?mmol·L-1。作為更優選方案,所述的含胍基陽離子化合物的溶液濃度50-300?mmol·L-1。

作為優選方案,根據本發明所述的囊泡類給藥系統,其中,所述的含胍基陽離子化合物溶液的pH值在3.0-9.0之間。作為更優選方案,所述的含胍基陽離子化合物的溶液的pH值在5.0-8.0之間。

作為優選方案,根據本發明所述的囊泡類給藥系統,其中,所述的含胍基陽離子化合物溶液可采用下述方法制備:向常規水化介質(如硫酸銨溶液、枸櫞酸-枸櫞酸鈉溶液、乙二胺四乙酸銨溶液、醋酸鈣溶液等)中加入二甲雙胍鹽,如鹽酸二甲雙胍、硫酸二甲雙胍,枸櫞酸二甲雙胍等。

作為優選方案,根據本發明所述的囊泡類給藥系統,其中,所述的含胍基陽離子化合物的溶液中加入氨水、三乙胺、三乙醇胺等無機或有機堿調節溶液pH值在3.0-9.0?之間。作為更優選方案,所述的含胍基陽離子化合物的溶液中加入氨水、三乙胺、三乙醇胺等無機或有機堿調節溶液pH值在5.0-8.0之間。

作為優選方案,根據本發明所述的囊泡類給藥系統,其中,當其用于裝載抗腫瘤藥物時,胍基陽離子化合物與抗腫瘤藥物的質量比為0.05-5:1。作為更優選方案,當其用于裝載抗腫瘤藥物時,胍基陽離子化合物與抗腫瘤藥物的質量比為0.1-2:1。

作為優選方案,根據本發明所述的囊泡類給藥系統,其中,所述的水化介質為含胍基陽離子化合物與一價、二價、三價或多價陰離子所形成的鹽溶液。

作為優選方案,根據本發明所述的囊泡類給藥系統,其中,所述的陰離子為含有下列的一個或多個陰離子的化合物:羧酸根、硫酸根、磺酸根、磷酸根、枸櫞酸根或膦酸根。作為最優選方案,其中所述的陰離子化合物的溶液濃度為150-500mmol·L-1。

本發明所述的陰離子選自下列物質中的至少一種:

HP042?-、H2P04-?、Cl-、蘋果酸根、酒石酸根、醋酸根、六偏磷酸根、三聚磷酸根、焦磷酸根、甘油磷酸根、果糖二磷酸根、三磷酸腺苷根、植酸根、鄰苯二甲酸根、間苯二甲酸根、對苯二甲酸根、磺酸基、對苯二甲酸、苯甲酸、間苯二甲酸、間苯三甲酸、乳糖酸、2-5二羥基苯磺酸、羥基苯磺酸、DNA、RNA、siRNA、RNAi、蛋白質、琥珀明膠、酶、荷電多糖或琥珀酰甲殼胺等。也可以與各種膦酸類藥物(衍生物)及其鹽類組合,如噻唑磷、替魯膦酸、氯屈膦酸二納、磷霉素胺基丁三醇、乙二胺四甲叉酸、依替膦酸納;二亞乙基二胺五亞甲基磷酸七納鹽、2-磷酸基丁烷、1,2,4-?三羧酸四納、氨基三亞甲基膦酸、帕米磷酸鈉、(3-氨基苯基)膦酸、己二胺四亞甲基膦酸鉀鹽、苯膦酸鈉、阿倫膦酸及其鹽類、甲基膦酸(5-?乙基-2-?甲基-2-氧代-1,3,2二氧磷雜環己-5基)基甲基脂、帕米膦酸、二膦酸丁烷-1,2,4三羧酸納鹽、己二胺四甲叉膦酸六鉀鹽、2-膦酸-l、2,4-三羧酸、羥基亞乙基二膦酸四納、二己烯三胺五甲叉膦酸、利塞膦酸、氨甲基膦酸、伊班膦酸、利賽膦酸納、唑來滕酸、帕米膦酸納、西多福韋、替魯膦酸二納、乙烯基膦酸、(3-((是甲基)氨基)-3-羰基丙基)-膦酸二甲酯、2-?氨基乙基膦酸、氨基三甲叉膦酸納、福沙吡坦(即[3-[[(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5-雙(三氟甲基)苯基]乙氧基]-3-(4-氟苯基)-4-嗎啉基]甲基]-2,5-二氫-5-氧代-1H-1,2,4-三唑-1-基]膦酸)。

作為更優選,本發明所述的陰離子化合物選自下列物質中的至少一種:硫酸根離子、磷酸根離子、枸櫞酸根離子、乙二胺四乙酸根離子、甘油磷酸根離子、植酸根離子、果糖二磷酸根離子或蔗糖八硫酸酯根離子。

所述膜材中磷脂可選自下列物質中的至少一種:大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂、EPG、磷脂酸、心肌磷脂、鞘磷脂、磷脂酸絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、氫化大豆卵磷脂、氫化蛋黃卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二月桂酰磷脂酰膽堿、二癸酰磷脂酰膽堿、二辛酰磷脂酰膽堿、二己酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰甘油及其鈉鹽、二棕櫚酰磷脂酰甘油及其鈉鹽、L-α-二肉豆蔻酰磷脂酰甘油及其鈉鹽、二月桂酰磷脂酰甘油、二癸酰磷脂酰甘油、二辛酰磷脂酰甘油、二己酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰乙醇胺、雙二硬脂酰磷脂酰甘油及其鈉鹽、雙二棕櫚酰磷脂酰甘油及其鈉鹽、雙二肉豆蔻酰磷脂酰甘油及其鈉鹽、雙二月桂酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰肌醇、二棕櫚酰磷脂酰肌醇、二油酰磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰磷脂酰肌醇、二月桂酰磷脂酰肌醇、棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿、棕櫚酰亞油酰磷脂酰膽堿、硬脂酰亞油酰磷脂酰膽堿、硬脂酰油酰磷脂酰膽堿、硬脂酰花生四烯酰磷脂酰膽堿、DSPE-PEG、DPPE-PEG、DMPE-PEG、DLPE-PEG、其中所述DSPE-PEG、DPPE-PEG、DMPE-PEG、DLPE-PEG中PEG的分子量為100~10000。

基本膜材可以加入PEG?衍生物,其用量為脂質總用量的0~50%。

作為優選方案,本發明所述的囊泡類給藥系統中所加入PEG?衍生物占脂質相原料總質量的2-50%?。作為更更優選方案,所述的基本膜材中加入的PEG?衍生物占脂質相原料總質量的5-40%?。作為最優選方案,所述的基本膜材中加入的PEG?衍生物占脂質相原料總質量的5-20%。其中,上述PEG?衍生物包括但不限于各種磷脂PEG?衍生物,如DSPE-PEG?、DPPE-PEG、DMPE-PEG、DLPE-PEG,其中PEG?的分子量為100–100000;也包括其他各種PEG?脂質衍生物,如PEG?甾醇類衍生物、PEG脂肪酸衍生物、PEG脂肪醇類衍生物,具體講如膽固醇半琥硝酸脂PEG衍生物、Solulan?C-24(PEG-24?cholesterol?ether)?、吐溫類、Brij?(芐澤)、維生素類的PEG?衍生物(如TPGS)、PEG?脂肪酸酣衍生物(賣澤),聚甘油脂質衍生物,如聚甘油磷脂衍生物、聚甘油單(雙)油酸醋、硬脂酸甜等;聚丙二醇脂質衍生物;聚氨基酸脂質衍生物;甾醇類衍生物;氧乙烯-氧丙烯共聚,如F68、聚乙二醇-二酸甘油脂(或者單脂)等等。

本發明的空白囊泡中各種模材之間的比例可根據具體實驗結果和實際需要由技術人員確定。所述的膜材除了基本膜材、PEG衍生物外,還包括酸敏、溫敏、光敏或靶向性物質。具體如何添加可根據載藥的種類和需要來確定,參照本領域的常用技術手段操作即可。

本發明還提供上述的囊泡類給藥系統在抗腫瘤藥物上的應用。

作為優選方案,所述的抗腫瘤藥物選自下列藥物中的一種:蒽環類/蒽二酮類抗腫瘤抗生素、長春花屬生物堿類、喜樹堿類藥物或二氟核苷類抗腫瘤藥。具體來說包括但不限于下列藥物或其鹽:多柔比星、柔紅霉素、表柔比星、左柔比星、阿克拉霉素、絲裂霉素C、米托蒽醌、比生群、羥喜樹堿、伊立替康、拓撲替康、9-氨基喜樹堿、長春堿、長春新堿、長春地辛、長春瑞濱、10,11-亞甲二氧基喜樹堿、9-硝基喜樹堿、7-(4-甲基-哌嗪基-亞甲基)-10,11-亞甲二氧基-20(S)喜樹堿、7-(2-N-異丙胺基)乙基-20(S)喜樹堿、雙氟脫氧胞苷、甲氨蝶呤、生物堿、舒尼替尼、吉非替尼。用于各種腫瘤的治療。

上述囊泡類給藥系統可按下述方法進行載藥:將已建立跨膜梯度的空白囊泡(包括各種脂質體)與藥物溶液混勻,在20~70℃下孵育,即可制得載藥囊泡。

本發明中,在囊泡建立跨膜梯度之前可根據需要做均質化處理,以獲得粒徑適宜的囊泡,比如粒徑在30-300nm之間的囊泡,更有利于載藥。

本發明具有以下優點:

本發明采用二甲雙胍替代銨離子間接建立的pH梯度載藥,制備的含二甲雙胍的囊泡類給藥系統具有的特點包括:1)、可以同時殺滅腫瘤干細胞和普通腫瘤細胞;2)、載藥范圍廣,適用于很多抗腫瘤藥物的裝載;3)、給藥后腫瘤停止生長;4)、可以達到高包封率,降低抗腫瘤藥的毒性;5)、可延長患者的生存時間;6)、制劑儲存穩定性高,泄漏量少,可以長期儲存;7)、包含二甲雙胍的囊泡由于EPR效應進入腫瘤,從而提高二甲雙胍在腫瘤組織中的濃度,發揮與鹽酸表阿霉素聯合抑瘤的作用;8)制劑中的二甲雙胍既可以殺滅腫瘤干細胞也可以提供將抗腫瘤藥裝載進入脂質體內的動力。

附圖說明

圖1為腫瘤體積隨時間變化曲線

其中“■”代表生理鹽水對照組(NS)、?“▲”代表鹽酸表阿霉素溶液組、“▼”代表(MetH)4EDTA-梯度脂質體組、“

”代表(NH4)4EDTA-鹽酸表阿霉素脂質體組、“◆”代表(MetH)4EDTA-鹽酸表阿霉素脂質體組。

圖2為實施例9中接瘤后小鼠生存分析

其中“■”代表生理鹽水對照組(NS)、?“▲”代表鹽酸表阿霉素溶液組、“▼”代表(MetH)4EDTA-梯度脂質體組、“◆”代表(NH4)4EDTA-鹽酸表阿霉素脂質體組、?“

”代表(MetH)4EDTA-鹽酸表阿霉素脂質體組。

具體實施方式

下面結合實施例,更具體地說明本發明的內容。應當理解,本發明的實施并不局限于下面的實施例,對本發明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發明保護范圍。

在本發明中,若非特指,所有的設備和原料等均可從市場購得或是本行業常用的。下述實施例中的方法,如無特別說明,均為本領域的常規方法。

實施例1????磷脂、膽固醇比例的選擇

磷脂和膽固醇的比例會顯著影響脂質體膜的穩定性和藥物裝載效率。以200?mmol·L-1?(MetH)4EDTA(即乙二胺四乙酸二甲雙胍)作為水化介質,制備空白脂質體,建立跨膜梯度,裝載鹽酸表阿霉素。測定制劑的平均粒徑和包封率,結果見表1。

表1?不同磷脂、膽固醇比例的影響

注:水化介質中二甲雙胍濃度為600?mmol·L-1(HSPC?為氫化大豆卵磷脂;CH為膽固醇;PEG2000-CHS為分子量2000的聚乙二醇單甲醚與膽固醇半琥珀酸酯反應所得產物,即膽固醇半琥珀酸酯聚乙二醇酯)。

由表1可知處方1的粒徑略大于處方2,但處方1包封率更高,且二者均大于95%。

實施例2????pH值影響

配制pH分別為5.50、6.00、6.50、7.00、7.50、8.00、9.00的200?mmol·L-1?(MetH)4EDTA溶液作為水化介質,根據實驗例1下方法制備鹽酸表阿霉素脂質體,考察包封率,結果見表2。

表2?水化介質pH值對鹽酸表阿霉素脂質體包封率的影響

?

根據表2可知隨著水化介質pH值的升高其包封率隨之升高,水化介質pH值為6~9時,包封率大于80%。

實施例3???水化介質濃度的影響

配制濃度分別為100、200、300、400?mmol·L-1?(MetH)4EDTA溶液(pH7.0)作為水化介質,根據優化的處方制備鹽酸阿霉素脂質體,考察不同濃度制劑不同時間載藥包封率的變化,結果見表3。

表3?水化介質濃度對鹽酸表阿霉素脂質體包封率的影響

由表3可知,100?mmol·L-1和400?mmol·L-1的(MetH)4EDTA脂質體在120?min包封率未達到90%以上,300?mmol·L-1的(MetH)4EDTA脂質體在80?min時包封率最大,而200?mmol·L-1的(MetH)4EDTA在60?min時包封率最大。

實施例4??載藥溫度對包封率的影響

建立200?mmol·L-1?(MetH)4EDTA梯度制劑,將梯度制劑與鹽酸表阿霉素溶液按藥脂比1:10(w/w)混勻,分別于30、40、50、60?℃水浴中孵育60?min,測定鹽酸表阿霉素脂質體的包封率,實驗結果見表4。

表4載藥溫度對包封率的影響

由表4可知,(MetH)4EDTA-鹽酸表阿霉素脂質體包封率隨溫度升高而增加,30?℃時包封率僅為17.2%,50℃、60?℃時包封率大于90%。

實施例5??水化介質中二甲雙胍加入量對包封率的影響

水化介質的制備:精密稱取EDTA0.5845?g各7份,分別置于25?mL燒杯中,加入蒸餾水6?mL,并分別加入二甲雙胍0、0.013,0.065,0.130,0.260,0.390和0.764?g,分別用氨水調節溶液pH值為7.00,轉移至10?mL容量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻。

空白脂質體的制備

處方:

?????HSPC????????????????????200?mg

?????CH??????????????????????66.6?mg

?????PEG2000-CHS?????????????66.6?mg

制備方法:65?℃下,用5%乙醇(v/v)溶解處方量膜材,得脂質相;將預熱至相同溫度的水化介質,以中速注入脂質相,孵育20?min,制得脂質體初品。經200?W超聲初步混合2?min后,400?W超聲分散6?min(工作3?s,間歇3?s),依次通過0.8、0.45、0.22?μm的微孔濾膜,即得空白脂質體。

梯度脂質體的制備及載藥:采用混合離子交換樹脂法建立脂質體跨膜梯度,將鹽酸表阿霉素溶液(藥脂比,1:4,w/w)與梯度脂質體混勻,于60?℃孵育,不同時間取樣300?μL,冰浴終止載藥,測定包封率,結果見表5。

表5二甲雙胍加入量對包封率的影響

注:表中“—”表示未測定包封率。

由表5可知,當二甲雙胍加入量≤200?mmol·L-1時,其對鹽酸表阿霉素脂質體包封率無顯著影響,即在載藥過程中內水相的二甲雙胍未參與載藥,這樣既可以提高載藥速度,在一定程度上還增加了二甲雙胍在脂質體內水相的滯留,借助EPR效應(enhanced?permeability?and?retention?effect)可以將更多的二甲雙胍轉運至腫瘤部位,以使其更好的發揮抗腫瘤活性。

實施例6?水化介質中不同二甲雙胍鹽加入量對包封率的影響

不同水化介質的制備:分別稱取硫酸銨、乙二胺四乙酸和枸櫞酸適量,加入一定量的鹽酸二甲雙胍、硫酸二甲雙胍和枸櫞酸二甲雙胍,加入適量蒸餾水,并用氨水調節乙二胺四乙酸和枸櫞酸溶液pH值為7.00,使得最終水化介質中硫酸銨、乙二胺四乙酸和枸櫞酸濃度分別為200、200和300?mmol·L-1,二甲雙胍濃度分別為200、400和600?mmol·L-1。

空白脂質體的制備

處方:

?????HSPC????????????????????200?mg

?????CH??????????????????????66.6?mg

?????PEG2000-CHS?????????????66.6?mg??????

制備方法:65?℃下,用5%乙醇(v/v)溶解處方量膜材,得脂質相;將預熱至相同溫度的水化介質,以中速注入脂質相,孵育20?min,制得脂質體初品。經200?W超聲初步混合2?min后,400?W超聲分散6?min(工作3?s,間歇3?s),依次通過0.8、0.45、0.22?μm的微孔濾膜,即得空白脂質體。

梯度脂質體的制備及載藥:采用混合離子交換樹脂法建立脂質體跨膜梯度,將鹽酸表阿霉素溶液(藥脂比,1:10,w/w)與梯度脂質體混勻,于60?℃孵育20?min,冰浴終止載藥,測定包封率,結果見表6。

表6水化介質中不同二甲雙胍鹽加入量對包封率的影響

注:“200”、“400”、“600”表示最終水化介質中二甲雙胍濃度為200、400、600?mmol·L-1

由表6可知,當水化介質中鹽酸二甲雙胍加入量超過200?mmol·L-1時,由于氯離子的存在,會使包封率有一定程度的降低,但是當硫酸二甲雙胍和枸櫞酸二甲雙胍的加入量不超過600?mmol·L-1時對脂質體包封率不會產生顯著影響。

實施例7??????(MetH)4EDTA-鹽酸阿霉素脂質體

其原料的基本處方見表7。

制備工藝:65°C水浴中,用10%乙醇(v/v)溶解處方量膜材得脂質相,然后將預熱至相同溫度的水相(即以200?mmol·L-1乙二胺四乙酸二甲雙胍為水化介質),以現有技術中常規的方法注入脂質相,孵育30?min,制得脂質體初品。200?W超聲初步混合2?min后,400?W超聲分散6?min(工作3?s,間歇3?s),依次通過0.8、0?.45、0.22?μm?的微孔濾膜,即得空白脂質體。采用混合離子交換樹脂法建立脂質體跨膜梯度,得到的梯度脂質體與藥物溶液(藥脂比,1:8,?w/w)?混勻,于60°C?孵育20?min,即得二甲雙胍鹽酸阿霉素脂質體(即(MetH)4EDTA-鹽酸阿霉素脂質體,最終制劑中鹽酸阿霉素濃度為1.67?mg·mL-1即2.88?mmol·L-1,二甲雙胍濃度為0.83?mg·mL-1即6.43?mmol·L-1)。

?表7?脂質體膜材組成

實施例8?????(MetH)4EDTA-鹽酸阿霉素脂質體長期放置穩定性考察

根據藥物穩定性試驗指導原則,參照上市產品阿霉素Doxilò儲存條件,在4±2?℃下對實施例1得到的(MetH)4EDTA-鹽酸阿霉素脂質體進行長期穩定性試驗。取3批(MetH)4EDTA-鹽酸阿霉素脂質體溶液分裝于西林瓶中,充氮、密封,在4±2?℃條件下,避光放置,分別于0、30、90、150?天取樣,考察制劑外觀、粒度、包封率變化,結果見表8。

表8?長期穩定性試驗結果

表8結果表明,優化的鹽酸阿霉素脂質體在4±2?℃冷藏條件下,150?d內平均粒徑略有增大,包封率約降低了3.0%。

實施例9????(MetH)4EDTA-鹽酸表阿霉素脂質體體內藥效學研究

參照“實施例7”制備(MetH)4EDTA-鹽酸表阿霉素脂質體。包封率98.3%、粒徑106nm。

將50只接種S-180腫瘤的小鼠隨機分為5組,即生理鹽水對照組(NS)、鹽酸表阿霉素溶液組、(MetH)4EDTA-梯度脂質體組、(NH4)4EDTA-鹽酸表阿霉素脂質體組和(MetH)4EDTA-鹽酸表阿霉素脂質體組,每組10只動物,第0天接種,接種后用游標卡尺測定腫瘤體積,當腫瘤體積增加至20~50?mm3時,開始給藥,劑量以鹽酸表阿霉素計為5?mg/kg,以二甲雙胍計為2.5?mg/kg,給藥間隔為2天,給藥次數為3次。給藥后繼續測定腫瘤體積,并繪制腫瘤體積隨時間變化曲線,結果見圖1。

由圖1可知,停藥后20天,NS組、鹽酸表阿霉素溶液組和(MetH)4EDTA-梯度脂質體組小鼠腫瘤生長較快,(NH4)4EDTA-鹽酸表阿霉素脂質體組小鼠腫瘤已開始復發,而(MetH)4EDTA-鹽酸表阿霉素脂質體組小鼠腫瘤已完全消失,即將鹽酸表阿霉素裝載入(MetH)4EDTA-脂質體后有效的抑制了腫瘤的復發,這一藥效學結果在一定程度上證明了腫瘤干細胞假說的正確性,即通過EPR效應(enhanced?permeability?and?retention?effect)脂質體將鹽酸表阿霉素和二甲雙胍共同靶向腫瘤組織,借助鹽酸表阿霉素對腫瘤細胞以及二甲雙胍對腫瘤干細胞的殺傷,達到了治療腫瘤并防止腫瘤復發的目的。

本實施例中,二甲雙胍的給藥劑量為2.5?mg/kg,換算成口服劑量約為10?mg/kg,按照小鼠每日飲水5?mL計算,文獻(Cancer?Res,?2009,?69(19):7507-7511)中小鼠口服二甲雙胍劑量為每日25?mg/kg,且其為每天連續給藥,因此本實施例在達到抑制腫瘤復發的同時,進一步降低了二甲雙胍的給藥劑量,這樣一方面提高了二甲雙胍在抗腫瘤方面的療效,另一方面又降低了二甲雙胍可能帶來的副作用,為今后臨床應用帶來了方便。

?實施例10???生存分析

以實施例9中小鼠作為研究對象,以接瘤后小鼠生存時間為指標進行生存分析,結果見圖2。

由圖2可知,接瘤后第12天生理鹽水對照組(NS)小鼠開始出現死亡,第52天時已全部死亡,鹽酸表阿霉素溶液組小鼠第24天開始出現死亡,并且第46天時鹽酸表阿霉素溶液組小鼠已全部死亡,(MetH)4EDTA-梯度脂質體組小鼠第28天開始出現死亡,至第54天時已全部死亡,(NH4)4EDTA-鹽酸表阿霉素脂質體組小鼠第40天死亡2只,第56和第60天分別死亡1只和2只,(MetH)4EDTA-鹽酸表阿霉素脂質體組小鼠在65天內均未出現死亡。

實施例11?停藥20天后荷瘤小鼠生存狀態

以實施例3中的小鼠作為研究對象,停藥20天后對小鼠生存狀態進行評價。停藥20天后觀察發現:NS組小鼠右前肢已萎縮,皮毛光澤度差,已無法行走,生存狀態差;鹽酸表阿霉素溶液組小鼠右前肢已無法活動,身體消瘦,皮毛光澤度差,生存狀態差;(MetH)4EDTA-梯度脂質體組小鼠前肢已無法活動,皮毛光澤度較差,生存狀態較差;(NH4)4EDTA-鹽酸表阿霉素脂質體組小鼠腫瘤得到了一定的抑制,小鼠行動自如,皮毛光澤度較好,生存狀態較好;(MetH)4EDTA-鹽酸表阿霉素脂質體組小鼠腫瘤已接近消失,小鼠行動自如,皮毛光澤度好,生存狀態好。

實施例12????(MetH)3CA(枸櫞酸二甲雙胍)阿霉素脂質體

處方???????????HSPC?????????????????????3.0?g

CH???????????????????????1.0?g

PEG2000-DSPE?????????????1.0?g

300?mmol·L-1?(MetH)3CA水化介質加至50mL

脂質體制備方法:稱取處方量膜材于60?℃用10%乙醇(v/v)溶解,得脂質相,以中速注入預熱至相同溫度的水化介質,孵育20?min,制得脂質體初品,經微射流處理(壓力為14000?psi),將粒徑減小至100?nm,依次通過0.8、0.45和0.22?μm的微孔濾膜,即得平均粒徑約100?nm,粒度分布窄的空白脂質體。

梯度建立:取空白脂質體,與混合纖維(ZB-1Na+型陽離子交換纖維與ZB-2Cl-型陰離子交換纖維的混合比例為濕視體積1:2)混合放置5?min后,在2000?rpm下離心4?min,建立梯度。

載藥:將除鹽后的空白脂質體(梯度脂質體)與4?mg/ml?鹽酸阿霉素溶液按照藥脂比1:10(w/w)混合,60?℃下載藥30?min,得(MetH)3CA阿霉素脂質體,包封率大于95%。

實施例13??(MetH)3CA阿霉素脂質體同其它外加二甲雙胍的制劑藥效學比較

將70只接種H22腫瘤的小鼠進行隨機分組(7組、10只/組),即生理鹽水對照組(NS)、阿霉素溶液組(5?mg/kg,靜脈注射)、口服二甲雙胍溶液組(30?mg/kg)、阿霉素-二甲雙胍混合溶液組(5?mg/kg,2.5?mg/kg,靜脈注射)、(MetH)3CA阿霉素脂質體組(5?mg/kg,2.5?mg/kg,靜脈注射)、(NH4)3CA阿霉素脂質體與二甲雙胍混合溶液組(5?mg/kg,2.5?mg/kg,靜脈注射)、(MetH)3CA梯度制劑組(2.5?mg/kg,靜脈注射)。第0天接種,接種后灌胃組每日給藥一次,連續10天;含有阿霉素組,分別于第3、6、9天尾靜脈注射給藥。給藥后動物正常飼養,每日稱量小鼠體重,同時觀察小鼠的生長狀態。接種后第12天,處死動物,完整剝離皮下腫瘤稱重,計算抑瘤率,平均腫瘤重及抑瘤率見表9。

表9?不同阿霉素脂質體抑瘤效果

注:口服二甲雙胍溶液組給藥方案如下:接瘤后第三天起每天給予鹽酸二甲雙胍濃度為60?μg/mL的蒸餾水作為小鼠的飲用水,同時接瘤后第3、6、9天按阿霉素濃度為4?mg/kg的劑量尾靜脈注射(NH4)3CA阿霉素脂質體。

從表9結果可知:與(MetH)3CA梯度制劑組相比,阿霉素的各種劑型均有顯著的抑瘤效果(P?<?0.05),其中(MetH)3CA阿霉素脂質體組具有極其顯著的抑瘤效果(P?<?0.01)。(MetH)3CA梯度脂質體組抑瘤效果最低(抑瘤率為18.58%),(MetH)3CA阿霉素脂質體組抑瘤效果最高(抑瘤率為75.25%);比較口服二甲雙胍溶液組與(MetH)3CA阿霉素脂質體組可以發現:相等的二甲雙胍給藥劑量下口服二甲雙胍并不能有效抑制腫瘤生長;與阿霉素溶液組、口服二甲雙胍溶液組、阿霉素-二甲雙胍混合溶液組以及(NH4)3CA阿霉素脂質體與二甲雙胍混合溶液組相比,?(MetH)3CA阿霉素脂質體組具有極其顯著性的抑瘤效果(P<?0.01),說明發揮藥效的二甲雙胍是脂質體內水相的二甲雙胍。

實施例14????長春瑞濱脂質體

處方???????????HSPC?????????????????????3.0?g

CH???????????????????????1.0?g

PEG2000-DSPE?????????????1.0?g

300?mmol·L-1?(MetH)3CA水化介質加至50?mL

脂質體制備方法:稱取處方量膜材于60?℃用10%乙醇(v/v)溶解,得脂質相,以中速注入預熱至相同溫度的水化介質,孵育20?min,制得脂質體初品,經微射流處理(壓力為14000?psi),將粒徑減小至100?nm,依次通過0.8、0.45和0.22μm的微孔濾膜,即得平均粒徑約100?nm,粒度分布窄的空白脂質體。

梯度建立:取空白脂質體,與混合纖維(ZB-1Na+型陽離子交換纖維與ZB-2Cl-型陰離子交換纖維的混合比例為濕視體積1:2)混合放置5?min后,在2000?rpm下離心4?min,建立梯度。

載藥:將除鹽后的空白脂質體(梯度脂質體)與5?mg/ml?長春瑞濱溶液按照藥脂比1:10(w/w)混合,60?℃下載藥30?min,得長春瑞濱脂質體,包封率大于95%。

實施例15????長春瑞濱脂質體藥效學研究

將40只接種H22腫瘤的小鼠隨機分為4組,即生理鹽水對照組(NS)、長春瑞濱溶液組、(NH4)3CA-長春瑞濱脂質體組和(MetH)3CA-長春瑞濱脂質體組,每組10只。第0天接種,接種后分別于第3、6、9天按4?mg/kg的劑量尾靜脈注射給藥。給藥后動物正常飼養,每日稱量小鼠體重,同時觀察小鼠的生長狀態。接種后第14天,處死動物,完整剝離皮下腫瘤稱重,計算抑瘤率,結果見表10。

表10不同長春瑞濱制劑的抑瘤效果

從表10可知,(MetH)3CA-長春瑞濱脂質體的抑瘤效果要遠高于(NH4)3CA-長春瑞濱脂質體的抑瘤效果,且抑瘤率可高達91.2%。

實施例16????柔紅霉素脂質體

處方?????????DPPC???????????????????????3?g

300?mmol·L-1?(MetH)3CA?(pH7.0)?加至100?mL

制備方法如下:取處方量的DPPC?(二棕櫚酸磷脂酰膽堿),以氯仿溶解,制備DPPC?氯仿溶液。減壓除去氯仿,制備脂質膜;于60℃?加入水化介質(MetH)3CA溶液,攪拌分散30?min,制得脂質體初品,高壓均質處理,并依次通過0.8、0.45、0.22?μm的微孔濾膜,即得空白脂質體。以10%蔗糖為透析介質,采用透析法去建立脂質體跨膜梯度(內水相的EDTA?濃度為外水相的46?倍)。將所得梯度脂質體與柔紅霉素藥物溶液(10mg/ml?)按照藥脂比1:10?(w/w)混勻,于60°C孵育60?min,即得柔紅霉素脂質體。包封率大于90%。

實施例17???咪托蒽醌脂質體

處方?????????EPC????????????????????????2.5?g

CH?????????????????????????1.0?g

300?mmol·L-1?(MetH)3CA?(pH7.0)?加至100?mL

制備方法如下:取處方量的EPC(蛋黃卵磷脂),CH(膽固醇)以氯仿溶解,制備EPC,CH?氯仿溶液。減壓除去氯仿,制備脂質膜;于50?℃?加入水化介質(MetH)3CA溶液,攪拌分散30?min,制得脂質體初品,高壓均質處理,并依次通過0.8、0.45、0.22?μm的微孔濾膜,即得空白脂質體。取Na+型陽離子交換樹脂與Cl-型陰離子交換樹脂適量以體積(視濕體積)比1:2混合,制備離子交換樹脂柱,處理脂質體并洗脫即得梯度脂質體。將所得梯度脂質體與咪托蒽醌藥物溶液(10?mg/ml?)按照藥脂比1:10?(w/w)混勻,于50°C孵育60?min,即得咪托蒽醌脂質體,包封率大于95%。

鞘磷脂更換EPC也可得到同樣結果。

實施例18???拓撲替康脂質體

處方??HSPC??????????????????1.0?g

??????CH????????????????????0.5?g

??????PEG1000-DSPE??????????0.1?g

??????PEG2000-DSPE??????????0.2?g

??????水化介質:250?mmol·L-1的pH7.5的硫酸二甲雙胍溶液20?mL

空白脂質體的制備:稱取處方量膜材,于65?℃用5%乙醇(v/v)溶解,以中速注入預熱至相同溫度的水化介質,孵育20?min,制得脂質體初品,經探頭超聲后(工作3?s,間歇3?s),依次通過0.80、0.45、0.22?μm的微孔濾膜,即得空白脂質體。?

梯度脂質體的制備:取ZB-1型Na+型陽離子交換纖維與ZB-2型Cl-型陰離子交換纖維適量以體積(視濕體積)比1:2混合,制備離子交換纖維柱,處理脂質體并洗脫即得梯度脂質體。載藥:將得到的梯度脂質體與鹽酸拓撲替康溶液混合(藥脂比1:10),60?℃載藥40?min即得拓撲替康脂質體,包封率大于90%。

實施例19????凍干型拓撲替康脂質體

處方??HSPC??????????????????1.5?g

??????CH????????????????????0.5?g

??????PEG2000-DSPE?????????0.5?g

??????海藻糖????????????????0.25?g

??????麥芽糖????????????????0.25?g

??????水化介質:200?mmol·L-1的乙二胺四乙酸二甲雙胍溶液30?mL

空白脂質體的制備:稱取處方量的HSPC、CH、PEG2000-DSPE,于60?℃用5%乙醇(v/v)溶解,以中速注入預熱至相同溫度的水化介質,孵育20?min,制得脂質體初品,經微射流處理(壓力為14000?psi),將粒徑減小至100?nm,依次通過0.8、0.45和0.22μm的微孔濾膜,即得空白脂質體。?

梯度脂質體的制備:取ZB-1型Na+型陽離子交換纖維與ZB-2型Cl-型陰離子交換纖維適量以體積(視濕體積)比1:2混合,制備離子交換纖維柱,處理脂質體并洗脫即得梯度脂質體,梯度脂質體中加入處方量的海藻糖與麥芽糖,進行冷凍干燥,制備凍干梯度脂質體。

載藥:將得到的凍干梯度脂質體用滅菌注射用水或5%的葡萄糖注射液或0.9%的氯化鈉注射液復溶,與阿糖胞苷藥物溶液混合(藥脂質量比1:5),55?℃載藥30?min即得阿糖胞苷脂質體,包封率大于95%。

說明:采用本實施例可以制備兩瓶裝脂質體藥物制劑,其中一瓶為凍干梯度脂質體,另一瓶為藥物粉末,臨用時采用滅菌注射用水或5%的葡萄糖注射液或0.9%的氯化鈉注射液等分別將凍干梯度脂質體復溶,將藥物粉末溶解,然后將二者混合,一定溫度孵育,即得含藥脂質體。兩瓶裝脂質體一方面為制備和運輸帶來了方便,更為重要的是脂質體采用凍干形式,有利于制劑的長期穩定性及梯度的維持,并且現用現配,將藥物的泄漏降至最低。

實施例20????伊立替康脂質體

處方???????????HSPC?????????????????????3.0?g

CH???????????????????????1.0?g

PEG2000-DSPE?????????????1.0?g,

200?mmol·L-1?(MetH)4EDTA(乙二胺四乙酸二甲雙胍鹽)(pH7.0)?加至50?mL

稱取處方量的HSPC(氫化大豆磷脂)、CH(膽固醇)、PEG2000-DSPE,于60?℃用5%乙醇(v/v)溶解,以中速注入預熱至相同溫度的水化介質,孵育20?min,制得脂質體初品,經微射流處理(壓力為14000?psi),將粒徑減小至100?nm,依次通過0.8、0.45和0.22?μm的微孔濾膜,即得空白脂質體。采用Sephadex?G-50除去外水相的(MetH)4EDTA(洗脫介質為10?mmol·L-1的PBS緩沖液),制備梯度脂質體,將所得梯度脂質體與伊立替康藥物溶液(10?mg/ml?)按藥脂比1:8?(w/w)混勻,于60°C孵育40?min,即得伊立替康脂質體,包封率大于90%。

實施例21????舒尼替尼脂質體

處方???????????DOPC?????????????????????2.4?g

CH???????????????????????0.8?g

PEG2000-DSPE?????????????0.8?g,

水化介質加至50?mL

水化介質的配制:取20ml?pH7.0的300?mmol·L-1的(NH4)3CA溶液(亦可以采用枸櫞酸的二乙胺、三乙胺或者乙醇胺等鹽溶液以縮短載藥時間增加Met在脂質體內水相的滯留)和20?ml?pH7.0的300?mmol·L-1的(MetH)3CA溶液,將兩者加入到50?ml容量瓶內,以蒸餾水稀釋至刻度,混勻,得水化介質。

脂質體制備方法:稱取處方量膜材于60?℃用10%乙醇(v/v)溶解,得脂質相,以中速注入預熱至相同溫度的水化介質,孵育20?min,制得脂質體初品,經微射流處理(壓力為14000?psi),將粒徑減小至100?nm,依次通過0.8、0.45和0.22?μm的微孔濾膜,即得平均粒徑約100?nm,粒度分布窄的空白脂質體。

梯度建立:取空白脂質體,以5%木糖醇為透析介質,采用透析法建立脂質體跨膜梯度。

載藥:將除鹽后的空白脂質體(梯度脂質體)與5?mg/ml?舒尼替尼溶液按藥脂比1:10(w/w)混合,60℃下載藥15?min,得舒尼替尼脂質體,包封率大于98%。

實施例22????舒尼替尼脂質體

處方???????????DPPC?????????????????????2.4?g

CH???????????????????????0.8?g

PEG2000-DSPE?????????????0.8?g,

水化介質加至50?mL

水化介質的配制:稱取硫酸銨2.6?g?,鹽酸二甲雙胍3.3?g置100?ml燒杯中,加入蒸餾水80?ml,攪拌溶解,將上述溶液轉移至100?ml容量瓶中,用蒸餾水稀釋至刻度,搖勻,即得。

脂質體制備方法:稱取處方量膜材于60?℃用10%乙醇(v/v)溶解,得脂質相,以中速注入預熱至相同溫度的水化介質,孵育20?min,制得脂質體初品,經微射流處理(壓力為14000?psi),將粒徑減小至100?nm,依次通過0.8、0.45和0.22μm的微孔濾膜,即得平均粒徑約100?nm,粒度分布窄的空白脂質體。

梯度建立:取空白脂質體,以5%木糖醇為透析介質,采用透析法建立脂質體跨膜梯度。

載藥:將除鹽后的空白脂質體(梯度脂質體)與5?mg/ml?舒尼替尼溶液按藥脂比1:10(w/w)混合,60℃下載藥15?min,得舒尼替尼脂質體,包封率大于96%。

采用同樣的方法可以制備吉非替尼脂質體。

實施例23????表阿霉素脂質體1

處方???????????HSPC?????????????????????3.0?g

???????????????CH???????????????????????0.05?g

???????????????PEG2000-CHS?????????????1.0?g

水化介質加至50?mL

水化介質的配制:取20?ml?pH7.0的200?mmol·L-1的(NH4)4EDTA溶液和20?ml?pH7.0的300?mmol·L-1的(MetH)4EDTA溶液,將兩者加入到50?ml容量瓶內,蒸餾水稀釋至刻度,混勻,得到水化介質。

脂質體制備方法:稱取處方量膜材于60?℃用5%乙醇(v/v)溶解,以中速注入預熱至相同溫度的水化介質,孵育20?min,制得脂質體初品,初品依次通過0.8、0.45和0.22?μm的微孔濾膜連續循環擠出,最后通過0.1?μm的濾膜連續循環5-8次,即得平均粒徑約120?nm,粒度分布窄的空白脂質體。?

梯度建立:取空白脂質體,與混合樹脂(732陽離子交換樹脂?與?717陰離子交換樹脂的混合比例為濕視體積1:2)混合放置5?min后,在2000?rpm下離心4?min,建立梯度。

載藥:向除鹽后的空白脂質體(梯度脂質體)中加入一定量的組氨酸,溶解后按照藥脂比1:10(w/w)加入表阿霉素溶液,60℃下載藥20?min,得表阿霉素脂質體,包封率大于96%。

實施例24????表阿霉素脂質體2

處方???????????DSPC?????????????????????3.0?g

???????????????CH???????????????????????0.5?g

???????????????PEG2000-DSPE?????????????1.0?g

水化介質加至50?mL

水化介質的配制:稱取EDTA5.8?g?,硫酸二甲雙胍3.5?g置100?ml燒杯中,加入蒸餾水80?ml,在攪拌狀態下加入氨水約6?ml調節溶液pH值為7.0,將上述溶液轉移至100?ml容量瓶中,用蒸餾水稀釋至刻度,搖勻,即得。

脂質體制備方法:稱取處方量膜材于60?℃用5%乙醇(v/v)溶解,以中速注入預熱至相同溫度的水化介質,孵育20?min,制得脂質體初品,初品依次通過0.8、0.45和0.22?μm的微孔濾膜連續循環擠出,最后通過0.1?μm的濾膜連續循環5-8次,即得平均粒徑約120?nm,粒度分布窄的空白脂質體。?

梯度建立:取空白脂質體,與混合樹脂(732陽離子交換樹脂?與?717陰離子交換樹脂的混合比例為濕視體積1:2)混合放置5?min后,在2000?rpm下離心4?min,建立梯度。

載藥:向除鹽后的空白脂質體(梯度脂質體)中加入一定量的組氨酸,溶解后按照藥脂比1:10(w/w)加入表阿霉素溶液,60℃下載藥20?min,得表阿霉素脂質體,包封率大于96%。

實施例25

水化介質為10mmol·L-1鹽酸二甲雙胍與300?mmol·L-1硫酸銨(pH6.0),按照“實施例12”膜材制備空白脂質體,梯度裝載阿霉素,包封率大于95%。

實施例26

水化介質為50mmol·L-1鹽酸二甲雙胍與250?mmol·L-1檸檬酸銨(pH?9.0),按照“實施例12”膜材制備空白脂質體,梯度裝載鹽酸米托蒽醌,包封率大于95%。

實施例27

水化介質為100mmol·L-1鹽酸二甲雙胍與150?mmol·L-1硫酸銨及150?mmol·L-1植酸銨(pH?8.0),按照“實施例12”膜材制備空白脂質體,梯度裝載匹杉醇,包封率大于95%。

實施例28

水化介質為50mmol·L-1鹽酸二甲雙胍與250?mmol·L-1檸檬酸銨(pH?3.0),按照“實施例12”膜材制備空白脂質體,梯度裝載鹽酸拓撲替康,包封率大于95%。

實施例29

水化介質為100mmol·L-1鹽酸二甲雙胍與100?mmol·L-1硫酸銨及250?mmol·L-1檸檬酸銨(pH?4.0),按照“實施例12”膜材制備空白脂質體,梯度裝載鹽酸伊立替康,包封率大于95%。

實施例30

水化介質為100mmol·L-1硫酸二甲雙胍與300?mmol·L-1蔗糖八硫酸酯三乙胺鹽(pH6.6),按照“實施例12”膜材制備空白脂質體,梯度裝載長春新堿或者長春地辛,包封率均大于90%。

實施例31

水化介質為500mmol·L-1二甲雙胍水楊酸磺酸鹽(或者二羥基苯磺酸鹽)(pH5.0),按照“實施例12”膜材制備空白脂質體,梯度裝載長春瑞濱,包封率大于90%。

實施例32

水化介質為1000mmol·L-1二甲雙胍蔗糖八硫酸酯鹽(pH7.0),按照“實施例12”膜材制備空白脂質體,梯度裝載長春瑞濱,包封率大于90%。

實施例33?復方抗腫瘤藥物脂質體

水化介質為100mmol·L-1磷酸二甲雙胍與200?mmol·L-1EDTA二甲雙胍鹽(pH6.5),按照“實施例12”膜材制備空白脂質體,梯度裝載長春新堿與阿霉素(質量比1:2)(或者柔紅霉素、表柔比星、阿克拉霉素代替阿霉素),包封率均大于95%。

盡管發明人已經對本發明做了較為詳細地列舉,但是,本領域的技術人員根據發明內容部分和實施例所揭示的內容,能對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或/和補充或采用類似的方式來替代是顯然的,并能實現本發明的技術效果,因此,此處不再一一贅述。本發明中出現的術語用于對本發明技術方案的闡述和理解,并不構成對本發明的限制。

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