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一種玉屏風藥渣發酵的工藝方法.pdf

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一種 屏風 藥渣 發酵 工藝 方法
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摘要
申請專利號:

CN201710523576.X

申請日:

20170630

公開號:

CN107125432A

公開日:

20170905

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A23K10/12,A23K10/37,A23K10/18 主分類號: A23K10/12,A23K10/37,A23K10/18
申請人: 北京農學院
發明人: 董虹,穆祥,胡格,孫向婉,王蕓,趙正午,李春曉
地址: 102206 北京市昌平區回龍觀北農路7號
優先權: CN201710523576A
專利代理機構: 北京和信華成知識產權代理事務所(普通合伙) 代理人: 胡劍輝
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法律狀態
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CN201710523576.X

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種玉屏風藥渣發酵的工藝方法,先對菌種進行活化和培養,然后將菌液接種到藥渣中,進行發酵。本發明利用固態發酵技術,采用黑曲霉發酵玉屏風口服液藥渣實現降解粗纖維的目的,對藥渣進行生物轉化,技術簡單,節約能源,保護環境。

權利要求書

1.一種玉屏風藥渣發酵的工藝方法,其特征在于:先對菌種進行活化和培養,然后將菌液接種到藥渣中,進行發酵。2.如權利要求1所述的藥渣發酵工藝方法,其特征在于:所述的菌種為黑曲霉。3.如權利要求1所述的藥渣發酵工藝方法,其特征在于:所述的發酵為固態發酵。4.如權利要求1或2所述的藥渣發酵工藝方法,其特征在于:所述的菌種活化和培養為將菌種接種在固體培養基上,于恒溫培養箱28—32℃培養2-4d,然后將活化后的菌種用無菌水洗脫,制成孢子懸液,轉接于液體培養基中,于恒溫震蕩培養箱28—32℃,120—170r/min振蕩培養20-26h,即可用于接種發酵。5.如權利要求4所述的藥渣發酵工藝方法,其特征在于:所述的菌種活化和培養為將菌種接種在固體培養基上,于恒溫培養箱30℃培養3d,然后將活化后的菌種用無菌水洗脫,制成孢子懸液,轉接于液體培養基中,于恒溫震蕩培養箱30℃,150r/min振蕩培養27h,即可用于接種發酵。6.如權利要求4或5所述的藥渣發酵工藝方法,其特征在于:所述的固定培養基為馬鈴薯固體培養基;所述的無菌水為無菌超純水。7.如權利要求4所述的藥渣發酵工藝方法,其特征在于:將活化后的菌種用無菌超純水洗脫,制成孢子懸液,濃度調為1×10個/mL,轉接于100mL液體培養基中。8.如權利要求1所述的藥渣發酵工藝方法,其特征在于:菌液接種到藥渣中的時間60—85h,接種量8—18%,含水量30—50%。9.如權利要求1所述的藥渣發酵工藝方法,其特征在于:菌液接種到藥渣中的時間68—75h,接種量10—15%,含水量35—45%。10.如權利要求1所述的藥渣發酵工藝方法,其特征在于:菌液接種到藥渣中的時間72h,接種量12%,含水量40%。

說明書

技術領域

本發明涉及藥渣發酵技術領域,特別是涉及一種玉屏風藥渣發酵的工藝方法。

背景技術

隨著中醫藥事業的不斷發展,中藥制劑的需求量也越來越大,中藥渣的排放量也隨之增加。調查統計顯示,目前我國約有1500家中醫藥企業,中藥渣每年排放量已達1200萬噸。中藥渣主要來源于中藥加工與炮制,中成藥以及其他中藥相關產品的加工過程,其中中成藥所產生的藥渣最多,約占藥渣總量的70%。在過去的中藥產業發展過程中剩余藥渣大多數通過堆放,填埋焚燒等方式進行廢棄處理,然而中藥渣一般含水量較高,極易腐敗,對周圍的環境(尤其是水質或土壤)會造成嚴重污染,同時企業也會投入一定資金作為排污處理費,因此藥渣排放和處理問題成為目前困擾廣大中藥制藥企業的難題之一。

為了避免中藥渣直接廢棄造成的環境污染問題,同時有效利用中藥渣資源,目前對中藥渣直接利用主要有以下幾種方式:(1)中藥渣作為有機肥料用于果蔬種植;(2)利用一些中藥渣的吸附能力進行污水處理和凈化;(3)中藥渣制成動物飼料應用于養殖中。其中將中藥渣直接作為飼料添加劑使用也是目前較為廣泛的利用方式。

由于中藥渣被提取后雖然存在一定的營養價值和藥用成分,但是含量不是很高,卻富含粗纖維,目前有研究者也提出直接將藥渣作為飼料添加劑可能會不利于動物吸收其有效成分,從而造成過大的添加量來達到藥效目的,這將導致飼料配比不當,藥渣質量方面也無法得到控制。

中藥提取后會剩余很多藥渣,而藥渣處理不當會造成環境污染。在中藥渣成分分析利用研究中表明,中藥渣尚存在部分活性物質及營養物質。玉屏風藥渣是中成藥玉屏風口服液、顆粒、膠囊等提取后剩余的藥渣,玉屏風口服液是1990版藥典收載的新劑型,由于療效好因此年產量大,然而產生的藥渣尚未被有效利用。藥渣粗纖維含量高,直接使用會使植物細胞壁阻礙機體對活性成分的吸收和利用。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足,提供一種玉屏風藥渣發酵的工藝方法。

本發明的技術方案為:

一種玉屏風藥渣發酵的工藝方法,先對菌種進行活化和培養,然后將菌液接種到藥渣中,進行發酵。

優選的,所述的菌種為黑曲霉。

優選的,所述的發酵為固態發酵。

所述的玉屏風藥渣發酵工藝方法,所述的菌種活化和培養為將菌種接種在固體培養基上,于恒溫培養箱28—32℃培養2-4d,然后將活化后的菌種用無菌水洗脫,制成孢子懸液,轉接于液體培養基中,于恒溫震蕩培養箱28—32℃,120—170r/min振蕩培養20-26h,即可用于接種發酵。

優選的,所述的玉屏風藥渣發酵工藝方法,所述的菌種活化和培養為將菌種接種在固體培養基上,于恒溫培養箱30℃培養3d,然后將活化后的菌種用無菌水洗脫,制成孢子懸液,轉接于液體培養基中,于恒溫震蕩培養箱30℃,150r/min振蕩培養27h,即可用于接種發酵。

優選的,所述的固定培養基為馬鈴薯固體培養基;所述的無菌水為無菌超純水。

優選的,將活化后的菌種用無菌超純水洗脫,制成孢子懸液,濃度調為1×107個/mL,轉接于100mL液體培養基中。

菌液接種到藥渣中的時間60—85h,接種量8—18%,含水量30—50%。

優選的,菌液接種到藥渣中的時間68—75h,接種量10—15%,含水量35—45%。

優選的,菌液接種到藥渣中的時間72h,接種量12%,含水量40%。

本發明的有益效果為:

1、本發明利用固態發酵技術,采用黑曲霉發酵玉屏風口服液藥渣實現降解粗纖維的目的,對藥渣進行生物轉化,技術簡單,節約能源,保護環境。

2、本發明以纖維素酶活為指標,采用單因素和正交試驗研究黑曲霉發酵玉屏風口服液藥渣的最佳發酵條件,結果顯示最佳發酵條件為時間72h,接種量12%,含水量40%,纖維素酶活為3.94IU/g。

3、本發明采用高效液相色譜分析水提和醇提方式提取于最佳發酵條件下發酵玉屏風藥渣前后成分的變化。結果顯示未發酵藥渣水提物和醇提物幾乎沒有含量高的成分。發酵藥渣水提物出現了比未發酵含量高的相似保留時間峰,差異倍數約為5倍,但整體峰高低于口服液。發酵醇提物水溶后出現了兩個含量較高的峰,峰面積約為未發酵相似保留時間兩處峰的20倍和50倍。

4、本發明初步評價發酵玉屏風藥渣醇提物對小鼠的免疫效果,即對免疫抑制小鼠免疫器官指數恢復作用和對H9N2滅活流感病毒免疫小鼠血清抗體效價的提高作用。另一方面考察發酵玉屏風藥渣醇提物對小鼠的促生長作用。結果顯示發酵藥渣醇提物與未發酵對免疫器官指數和抗體效價均無影響。發酵玉屏風藥渣醇提物與未發酵和空白組相比可顯著提高小鼠增重,且料肉比低于未發酵和空白組,差值在1~2之間;發酵藥渣醇提物對小鼠臟器沒有毒性作用。

5、本發明采用高效液相色譜考察發酵藥渣醇提物兩個特征性成分色譜方法學可靠性,成分可能來源因素以及不同批次發酵物的穩定性。色譜方法學考察結果顯示成分1和成分2線性關系,重復性,穩定性均良好;由成分來源的可能因素(黑曲霉菌液,纖維素酶以及黑曲霉常用發酵基質麥麩發酵產物)指紋圖譜得知,通過保留時間對比發現三個因素均沒有這兩個成分;對不同批次的發酵藥渣醇提物進行兩個成分比較,發現兩個成分保留時間基本一致,但是含量有所差異。

結論:黑曲霉固態發酵玉屏風口服液藥渣醇提物與未發酵相比出現了兩個含量較高的成分;發酵藥渣醇提物可提高小鼠增重,降低料肉比,初步說明發酵藥渣醇提物對小鼠有一定的促生長的作用。

附圖說明:

圖1:玉屏風口服液藥渣固體發酵工藝路線;

圖2:葡萄糖標準曲線;

圖3:時間對產纖維素酶活的影響;

圖4:接種量對產纖維素酶活的影響;

圖5:初始含水量對產纖維素酶活的影響;

圖6:為正交試驗酶活變化趨勢圖;

具體實施方式

以下實施例和實驗例用于說明本發明,但不用來限制本發明的范圍。

實施例1

一種玉屏風藥渣發酵的工藝方法,先對菌種進行活化和培養,然后將菌液接種到藥渣中,進行發酵;所述的菌種為黑曲霉;所述的發酵為固態發酵;所述的菌種活化和培養為將菌種接種在固體培養基上,于恒溫培養箱28—32℃培養2-4d,然后將活化后的菌種用無菌水洗脫,制成孢子懸液,轉接于液體培養基中,于恒溫震蕩培養箱28—32℃,120—170r/min振蕩培養20-26h,即可用于接種發酵;菌液接種到藥渣中的時間60—85h,接種量8—18%,含水量30—50%。

實施例2

一種玉屏風藥渣發酵的工藝方法,先對菌種進行活化和培養,然后將菌液接種到藥渣中,進行發酵;所述的菌種為黑曲霉;所述的發酵為固態發酵;所述的菌種活化和培養為將菌種接種在馬鈴薯固體培養基上,于恒溫培養箱30℃培養3d,然后將活化后的菌種用無菌超純水洗脫,制成孢子懸液,濃度調為1×107個/mL,轉接于100mL液體培養基中,于恒溫震蕩培養箱30℃,150r/min振蕩培養27h,即可用于接種發酵;菌液接種到藥渣中的時間60—85h,接種量8—18%,含水量30—50%;

固體培養基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar,PDA)培養基:馬鈴薯200g,葡萄糖20g,水1000mL,瓊脂15g,121℃高壓蒸汽滅菌20min,分裝倒板,4℃保存備用;

馬鈴薯液體培養基:上述培養基不加瓊脂,滅菌冷卻后4℃保存備用。

實施例3

一種玉屏風藥渣發酵的工藝方法,先對菌種進行活化和培養,然后將菌液接種到藥渣中,進行發酵;所述的菌種為黑曲霉;所述的發酵為固態發酵;所述的菌種活化和培養為將菌種接種在馬鈴薯固體培養基上,于恒溫培養箱30℃培養3d,然后將活化后的菌種用無菌超純水洗脫,制成孢子懸液,濃度調為1×107個/mL,轉接于100mL液體培養基中,于恒溫震蕩培養箱30℃,150r/min振蕩培養27h,即可用于接種發酵;菌液接種到藥渣中的時間68—75h,接種量10—15%,含水量35—45%;

固體培養基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar,PDA)培養基:馬鈴薯200g,葡萄糖20g,水1000mL,瓊脂15g,121℃高壓蒸汽滅菌20min,分裝倒板,4℃保存備用;

馬鈴薯液體培養基:上述培養基不加瓊脂,滅菌冷卻后4℃保存備用。

實施例4

一種玉屏風藥渣發酵的工藝方法,先對菌種進行活化和培養,然后將菌液接種到藥渣中,進行發酵;所述的菌種為黑曲霉;所述的發酵為固態發酵;所述的菌種活化和培養為將菌種接種在馬鈴薯固體培養基上,于恒溫培養箱30℃培養3d,然后將活化后的菌種用無菌超純水洗脫,制成孢子懸液,濃度調為1×107個/mL,轉接于100mL液體培養基中,于恒溫震蕩培養箱30℃,150r/min振蕩培養27h,即可用于接種發酵;菌液接種到藥渣中的時間72h,接種量12%,含水量40%;

固體培養基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar,PDA)培養基:馬鈴薯200g,葡萄糖20g,水1000mL,瓊脂15g,121℃高壓蒸汽滅菌20min,分裝倒板,4℃保存備用;

馬鈴薯液體培養基:上述培養基不加瓊脂,滅菌冷卻后4℃保存備用。

實施例5

一種玉屏風藥渣發酵的工藝方法,先對菌種進行活化和培養,然后將菌液接種到藥渣中,進行發酵;所述的菌種為黑曲霉;所述的發酵為固態發酵;所述的菌種活化和培養為將菌種接種在馬鈴薯固體培養基上,于恒溫培養箱30℃培養3d,然后將活化后的菌種用無菌超純水洗脫,制成孢子懸液,濃度調為1×107個/mL,轉接于100mL液體培養基中,于恒溫震蕩培養箱30℃,150r/min振蕩培養27h,即可用于接種發酵;菌液接種到藥渣中的時間72h,接種量12%,含水量40%;

固體培養基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar,PDA)培養基:馬鈴薯200g,葡萄糖20g,水1000mL,瓊脂15g,121℃高壓蒸汽滅菌20min,分裝倒板,4℃保存備用;

馬鈴薯液體培養基:上述培養基不加瓊脂,滅菌冷卻后4℃保存備用。

實驗例1玉屏風口服液藥渣發酵單因素的研究

1菌種及材料

1.1菌種

黑曲霉(ATCC16404)購于上海復祥生物有限公司。

1.2材料

玉屏風口服液藥渣(Yupingfeng Oral Liquid residues,YOLRs):保定冀中藥業有限公司提供。

1.2培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar,PDA)培養基:馬鈴薯200g,葡萄糖20g,水1000mL,瓊脂15g,121℃高壓蒸汽滅菌20min,分裝倒板,4℃保存備用。

馬鈴薯液體培養基:上述培養基不加瓊脂,滅菌冷卻后4℃保存備用。

1.3化學試劑

1.4儀器設備

2試驗方法

2.1菌種活化和培養

將黑曲霉標準菌種接種在馬鈴薯固體培養基上,于恒溫培養箱30℃培養3d,然后將活化后的黑曲霉用適量無菌超純水洗脫,制成孢子懸液,濃度調為1×107個/mL,轉接于100mL液體培養基中,于恒溫震蕩培養箱30℃,150r/min振蕩培養24h,即可用于接種發酵。

2.2玉屏風口服液藥渣固體發酵工藝路線,見圖1

2.2.1時間對玉屏風口服液藥渣發酵產纖維素酶活影響的研究

將菌液按照藥渣發酵工藝的流程接種到10g藥渣中,接種量為10%,含水量為50%,置于電熱恒溫振蕩培養箱中30℃,150r/min分別在24h、48h、72h、96h、120h、144h條件下進行發酵,按照設定條件取藥渣測定纖維素酶活,研究時間對藥渣發酵產纖維素酶活的影響。

2.2.2接種量對玉屏風口服液藥渣發酵產纖維素酶活影響的研究

將菌液按照藥渣發酵工藝的流程接種到10g藥渣中,發酵時間為2.2.1篩選出的最佳時間,含水量為50%,分別在接種量6%、8%、10%、12%、14%、16%條件下進行發酵,按照設定條件取藥渣測定纖維素酶活,研究接種量對藥渣發酵產纖維素酶活的影響。

2.2.3含水量對玉屏風口服液藥渣發酵產纖維素酶活影響的研究

將菌液按照藥渣發酵工藝的流程接種到10g藥渣中,發酵時間為2.2.1篩選出的最佳時間,接種量為2.2.3.2篩選的最佳接種量,分別在含水量30%、40%、50%、60%、70%、80%條件下進行發酵,按照設定條件取藥渣測定纖維素酶活,研究含水量對藥渣發酵產纖維素酶活的影響。

2.2.4發酵玉屏風口服液藥渣最佳發酵條件的確定

根據單因素試驗的結果,選取時間、接種量和含水量三個因素作為試驗因子,每個因素三個水平作正交發酵試驗,通過產纖維素酶活來確定藥渣接種發酵的最佳工藝參數。

2.2.5粗酶液的制取

按上述設置的試驗條件發酵結束后,取1g發酵物,溶于10mL醋酸緩沖溶液,置于搖床中,50℃,150r/min,2h提取,6000r/min離心10min,取上清液作為粗酶液備用。

2.2.6纖維素酶活檢測方法

2.2.6.1溶液配制

(1)pH5.0醋酸緩沖溶液配制:50g NaCH3COOH.3H2O溶于適量水,6moL CH3COOH 34mL,定容至500mL。

(2)葡萄糖標準溶液(10mg/mL):稱取105℃烘干至恒重無水葡萄糖約200mg,加檸檬酸鹽緩沖溶液溶解,定容至20mL

(3)檸檬酸鹽緩沖溶液配置:稱取檸檬酸1.05g,加入氫氧化鈉0.5g,再加80mL水溶解,用檸檬酸溶液(0.1mol/L)調節pH至5.5,再用水定容至100mL。

(4)檸檬酸溶液配置:稱取檸檬酸(C6H8O7·H2O)2.1g,加水溶解定容至100mL。

(5)NaOH溶液(200g/L)配制:10g,50mL水溶解。

(6)DNS試劑配置:稱3,5-二硝基水楊酸1.575g,加水250mL,攪拌溶解,水浴至45℃,然后逐步加入NaOH(200g/L)50mL,不斷攪拌,直至完全溶解,在逐步加入酒石酸鈉鉀45.5g,苯酚1.25g,亞硫酸鈉1.25g,攪拌至溶解,冷卻至室溫后,定容至500mL,過濾,取濾液儲存于棕色瓶中,避光保存,室溫下存放7d,可以使用,有效期為6個月。

(7)0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液:0.5g,100mL醋酸緩沖溶液定容。

2.2.6.2葡萄糖標準曲線的繪制

稱取105℃烘干至恒重無水葡萄糖約100mg,加檸檬酸鹽緩沖溶液溶解,定容至10mL,利用檸檬酸鹽緩沖液再稀釋至1mg/mL。取1mg/mL葡萄糖溶液0.4,0.8,1.2,1.6,2.0mL,分別加檸檬酸緩沖溶液定容至2mL。取配制的不同濃度的葡萄糖溶液各1mL于試管中,分別加2mL水,2mLDNS試劑,沸水浴5min。冷卻至室溫,用水定容至10mL,在540nm波長下比色測定OD值,繪制標準曲線,如圖2。

2.2.6.3纖維素酶活性的測定

取粗酶液1mL,加0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液(pH=5的醋酸緩沖液配置)3mL,于50℃水浴30min,冷卻加2mL DNS,再沸水浴5min,冷卻至室溫,加水定容至25mL,在540nm波長下測OD值。

公式:

C=根據吸光度從標準曲線查得的葡萄糖濃度(mg/mL)

25=加入的l mL粗酶液到總溶液25mL為稀釋25倍(mL)

10=總的粗酶液量(mL)

5.56=l mg葡萄糖的摩爾質量為5.56(umoL)

m=發酵物質量(g)

30=反應時間(min)

3統計分析

數據分析采用SPSS17.0軟件進行,用方差齊性檢驗和單因素方差分析(One Way ANOVA)進行多組間比較分析,以P<0.05表示差異有統計學意義。

4結果

4.1時間對玉屏風口服液藥渣發酵產纖維素酶活影響

在溫度為30℃條件下恒溫發酵,接種量10%,含水量50%,時間范圍從24h至144h,每隔24h設一檢測點測定纖維素酶活,篩選出最佳發酵時間點。由圖3可見,隨發酵時間的增加,發酵后纖維素酶活先升高后降低,且發酵時間在72h時,藥渣發酵后纖維素酶活最高。

4.2接種量對玉屏風口服液藥渣發酵產纖維素酶活影響

在溫度為30℃條件下恒溫發酵,時間72h,含水量50%,接種量在6%至16%范圍內測定酶活,選取最佳接種量。由圖4可知,隨接種量的增加,發酵后纖維素酶活先升高后降低,且接種量在12%時,藥渣發酵后纖維素酶活最高。

4.3含水量對玉屏風口服液藥渣發酵產纖維素酶活影響

在溫度為30℃條件下恒溫發酵,時間72h,接種量12%,含水量在30%至80%范圍內測定酶活,選取最佳含水量。由圖5可知,隨含水量的增加,發酵后纖維素酶活先升高后降低,且含水量在50%時,藥渣發酵后纖維素酶活最高。

4.4正交優選玉屏風口服液藥渣的最佳發酵條件

為了得到藥渣發酵后纖維素酶活最高的的發酵條件,以單因素試驗為基礎,選取每個因素下纖維素酶活高的三個水平作為正交試驗條件組合,研究各因素及其水平組合對纖維素酶活的影響。按照藥渣發酵條件,以表1對應的因素水平進行發酵,表2正交結果表明,確定藥渣發酵后纖維素酶活最優發酵條件為A2B3C1,即時間72h,接種量12%,含水量40%,此條件下酶活最高。經極差分析,RA=1.22>RB=0.74>RC=0.35,影響因素大小順序為C(發酵時間)>B(接菌量)>A(含水量)。且由最佳發酵條件處理的纖維素酶活為3.94IU/g。圖6為正交試驗酶活變化趨勢圖。

表1正交因素水平表

表2正交試驗直觀分析表

采用正交試驗目的在于以較少的試驗,找到試驗因素的最佳水平,以得到試驗所需量的目標產物。本試驗為了得到藥渣發酵后纖維素酶活最高的的發酵條件,以單因素試驗為基礎,選取每個因素下纖維素酶活高的三個水平作為正交試驗條件組合,研究各因素及其水平組合對纖維素酶活的影響。確定藥渣發酵后纖維素酶活最優發酵條件為A2B3C1,即時間72h,接種量12%,含水量40%,此條件下酶活最高,為3.94IU/g。經極差分析,影響因素大小順序為C(發酵時間)>B(接菌量)>A(含水量)。

不同發酵時間、接種量、含水量影響黑曲霉作用藥渣產纖維素酶活的高低,通過篩選最佳發酵條件,使黑曲霉作用藥渣降解細胞壁纖維素能力達到最佳,從而有助于藥渣成分的析出和改變。同時,優化發酵工藝也利于得到安全有效的產物,對發酵產物在質量方面的評價具有重要意義。

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