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穩定表達粘蛋白MGFP5的轉基因煙草愈傷組織的培養方法.pdf

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穩定 表達 蛋白 MGFP5 轉基因 煙草 組織 培養 方法
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摘要
申請專利號:

CN201610430063.X

申請日:

20160616

公開號:

CN106165646B

公開日:

20180918

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A01H4/00 主分類號: A01H4/00
申請人: 西北大學
發明人: 王英娟,王睿劼,呂亞維,張雨靖,楊澤熵
地址: 710069 陜西省西安市太白北路229號
優先權: CN201610430063A
專利代理機構: 陜西增瑞律師事務所 代理人: 劉艷霞
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201610430063.X

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了穩定表達粘蛋白Mgfp?5的轉基因煙草愈傷組織的培養方法,(1)選取轉基因煙草種子,接種于MS固體培養基上培養,得到T1代轉基因煙草無菌苗;(2)將步驟(1)中的T1代轉基因煙草無菌苗繼代培養20d,選取繼代培養后的葉片在愈傷組織誘導培養基中誘導培養,得到愈傷組織;(3)切取步驟(2)中所得的愈傷組織在繼代培養基中固體或者懸浮繼代培養,得繼代愈傷組織。本發明穩定表達粘蛋白Mgfp?5的轉基因煙草愈傷組織的培養方法,可以為獲得重組蛋白Mgfp?5的原材料提供新途徑,可以拓寬基因工程解決重組蛋白的研究領域,為研究植物表達貽貝粘蛋白提供參考,促進以植物源的重組蛋白Mgfp?5的生物轉化進程。

權利要求書

1.穩定表達粘蛋白Mgfp-5的轉基因煙草愈傷組織的培養方法,其特征在于,該方法如下:(1)選取轉基因煙草種子,接種于MS固體培養基上培養,得到T1代轉基因煙草無菌苗;轉基因煙草種子為轉mgfp-5基因的煙草種子;所述步驟(1)中的MS固體培養基上僅附加有20mg/LKan,且無激素;(2)將步驟(1)中所述的T1代轉基因煙草無菌苗繼代培養20d,選取繼代培養后的無菌苗葉片在愈傷組織誘導培養基中誘導培養,得到愈傷組織;愈傷組織誘導培養基為:20mg/LKan、3w/v%蔗糖、0.7w/v%瓊脂的MS固體培養基,該MS固體培養基的pH為6.0;(3)切取步驟(2)中所得的愈傷組織在繼代培養基中固體或者懸浮繼代培養,得繼代愈傷組織;當固體繼代培養愈傷組織時,所述繼代培養基為:固體培養基MS、2,4-D0.5~1.5mg/L、6-BA0.1~0.5mg/L、NAA0.1~0.3mg/L、Kan20mg/L和蔗糖3%,pH為5.8~6.2;當懸浮繼代培養愈傷組織時,所述繼代培養基為:液體培養基MS、2,4-D0.5~1.5mg/L、6-BA0.1~0.5mg/L、NAA0.1~0.3mg/Lmg/L、Kan20mg/L和蔗糖3%;所述煙草種子培養的條件為25±2℃,光照強度為30~50μmol·m·s,每天16h/8h光/暗培養;所述誘導培養的條件為在25±2℃的溫度下,黑暗培養20d;所述繼代培養的條件為:當固體繼代培養愈傷組織時,切取疏松愈傷組織,在固體繼代培養基中培養30~33d;當懸浮繼代培養愈傷組織時,選取疏松愈傷組織,以接種5%于液體培養基中,25±2℃,100rpm振蕩培養20~21d。2.按照權利要求1所述的穩定表達粘蛋白Mgfp-5的轉基因煙草愈傷組織的培養方法,其特征在于,當固體繼代培養愈傷組織時,所述繼代培養基為:固體培養基MS、2,4-D1.0mg/L、6-BA0.5mg/L、NAA0.1mg/L、20mg/LKan和蔗糖3%,pH為5.8~6.2;當液體繼代培養愈傷組織時,所述繼代培養基為:液體培養基MS、2,4-D1.0mg/L、6-BA0.5mg/L、NAA0.1mg/L、20mg/LKan和蔗糖3%。3.按照權利要求2所述的穩定表達粘蛋白Mgfp-5的轉基因煙草愈傷組織的培養方法,其特征在于,所述轉基因煙草種子接種前需預處理,預處理過程如下:用75%酒精浸泡轉基因煙草種子30s,然后用0.1%升汞滅菌8min,無菌水沖洗5次。

說明書

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域,具體涉及穩定表達粘蛋白Mgfp-5的轉基因煙草愈傷組織的培養方法。

背景技術

隨著生物技術的發展,植物組織培養生產次生代謝物,可以用于植物次生代謝產物的工廠化生產。自從NicKell(1956)第一次證明植物細胞可以象微生物一樣進行培養而不斷生長一來,以植物培養細胞或者組織為材料生產次生代謝物就迅速發展起來。植物組織培養具有細胞增殖快、培養周期短、材料均一、重復性好、不受季節與環境限制等優點,在煙草組織和細胞培養、基因轉化和次生物質生產等已有不少成功報道。

貽貝粘蛋白(Mussel Adhesive Protein,MAP)是海洋軟體動物貽貝(Mytilidae)足部的足絲腺分泌的一類具有粘性的蛋白質,也稱貽貝足絲蛋白(Mussel Foot Protein,Mfp),其粘性、防水性及耐腐蝕性強,而且無毒害、無免疫原性且生物相容性好,是一種優質的醫學粘附材料。目前足絲盤中的6種貽貝粘蛋白類型中,Mfp-5粘性最強。

現用的貽貝粘蛋白主要是天然獲取,但是其易固化且含量低,難獲得、成本高,制約了其應用。已有用原核表達(大腸桿菌)及真核表達(巴斯德酵母)系統獲得基因工程重組的貽貝粘蛋白,但是表達量或者粘附性能均不如意。前期我們將地中海貽貝蛋白Mgfp-5(Mytilus galloprovincialis foot protein type 5)基因在模式植物煙草中順利表達,這為重組粘蛋白的研究準備了材料。然而未見到借助煙草組織研究重組蛋白Mgfp-5的報道,并以此為材料關注優質醫用粘合劑的研究。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于針對上述現有技術的不足,提供一種穩定表達粘蛋白Mgfp-5的轉基因煙草愈傷組織的培養方法,為獲得重組蛋白Mgfp-5的原材料提供了新途徑,可以拓寬基因工程解決重組蛋白的研究領域,為研究植物表達貽貝粘蛋白提供參考,促進以植物源的重組蛋白Mgfp-5的生物轉化進程。

為解決上述技術問題,本發明采用的技術方案是,穩定表達粘蛋白Mgfp-5的轉基因煙草愈傷組織的培養方法,該方法如下:(1)選取轉基因煙草種子,接種于MS固體培養基上培養,得到T1代轉基因煙草無菌苗;轉基因煙草種子為轉mgfp-5基因的煙草種子;

(2)將步驟(1)中所得的T1代轉基因煙草無菌苗繼代培養20d,選取繼代培養后的無菌苗葉片在愈傷組織誘導培養基中誘導培養,得到愈傷組織;

(3)切取步驟(2)中所得的愈傷組織在繼代培養基中固體或者懸浮繼代培養,得繼代愈傷組織。

進一步地,步驟(1)中的MS固體培養基上附加有20mg/L Kan,且無激素;

該愈傷組織誘導培養基包括如下:20mg/L Kan、3%蔗糖(w/v)和0.7%瓊脂(w/v)的MS固體培養基(pH 6.0)組成;

當固體繼代培養愈傷組織時,所述繼代培養基包括:固體培養基MS、2,4-D 0.5~1.5mg/L、6-BA 0.1~0.5mg/L、NAA 0.1~0.3mg/L、Kan 20mg/L和蔗糖3%,pH5.8~6.2組成;當懸浮繼代培養愈傷組織時,所述繼代培養基包括:液體培養基MS、2,4-D 0.5~1.5mg/L、6-BA 0.1~0.5mg/L、NAA 0.1~0.3mg/L、Kan 20mg/L和蔗糖3%組成。

進一步地,當固體繼代培養愈傷組織時,繼代培養基包括:固體培養基MS、2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.5mg/L、NAA 0.1mg/L、20mg/L Kan和蔗糖3%,pH5.8~6.2組成;當懸浮繼代培養愈傷組織時,該繼代培養基包括:液體培養基MS、2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.5mg/L、NAA0.1mg/L、Kan 20mg/L和蔗糖3%組成。

進一步地,該煙草種子培養的條件為25±2℃,光照強度為30~50μmol·m-2·s-1,每天16h/8h光/暗培養;

該誘導培養的條件為在25±2℃的溫度下,黑暗培養20d。

該繼代培養的條件為:當固體繼代培養愈傷組織時,切取疏松愈傷組織,在固體繼代培養基中培養30~33d;當懸浮繼代培養愈傷組織時,選取疏松愈傷組織,以接種量5%(m/v)于液體培養基中,25±2℃,100rpm振蕩培養20~21d。

進一步地,該轉基因煙草種子接種前需預處理,預處理過程如下:用75%酒精浸泡轉基因煙草種子30s,然后用0.1%升汞(含吐溫-80)滅菌8min,無菌水沖洗5次。

本發明穩定表達粘蛋白Mgfp-5的轉基因煙草愈傷組織的培養方法具有如下優點:本發明所提供的轉mgfp-5基因煙草愈傷組織誘導及培養方法,可以穩定表達粘蛋白Mgfp-5,并且具有細胞增殖快、培養周期短、材料均一、重復性好、不受季節與環境限制等優點,可以為獲得重組蛋Mgfp-5的原材料提供新途徑,含有Mgfp-5蛋白的愈傷組織的研究可以為植物中的貽貝粘蛋白表達提供參考,促進以植物源的重組蛋白Mgfp-5的生物轉化進程,助力突破重組蛋白Mgfp-5的臨床應用的瓶頸。

附圖說明

圖1是本發明穩定表達粘蛋白Mgfp-5的轉基因煙草愈傷組織的培養方法流程示意圖;

圖2是本發明中轉mgfp-5基因的煙草T1代圖;

a-b.抗性無菌小苗;

c-d.愈傷組織;

圖3是本發明中煙草愈傷組織固體培養生長曲線;

圖4是本發明中煙草愈傷組織懸浮培養倍增曲線;

圖5是本發明中mgfp-5的PCR(A)與RT-PCR(B)分析;

圖6是本發明中mgfp-5蛋白Western blot分析;

CK:野生煙草;1-3依次為轉基因煙草T1幼葉、固體培養組織和液體培養組織。

具體實施方式

本發明中使用的質粒提取、純化與膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司,cDNA反轉錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司DNA聚合酶、引物由上海生工生物工程有限公司提供和合成,卡那霉素(Kanamycin,Kan)購自Sigma公司(美國),其他試劑均為分析純。

本發明中使用的MS基本培養基按手冊通用方法配制,組成與含量為:NH4NO31650mg/L,KNO3 1900mg/L,CaCl2·2H2O 440mg/L,MgSO4·7H2O 370mg/L,KH2PO4 1700mg/L,KI 0.83mg/L,H3BO3 6.2mg/L,MnSO4·4H2O 22.3mg/L,ZnSO4·7H2O 8.6mg/L,Na2MnO4·2H2O 0.25mg/L,CuSO4·5H2O 0.025mg/L,CoCl2·6H2O 0.025mg/L,FeSO4·7H2O 27.8mg/L,Na2-EDTA·2H2O 27.3mg/L,肌醇100mg/L,煙酸0.5mg/L,鹽酸吡哆醇0.5mg/L,鹽酸硫胺素0.5mg/L,甘氨酸2mg/L。

在本發明中,實驗材料轉mgfp-5基因煙草T1代種子為西部資源生物與現代生物技術教育部重點實驗室和西北大學生物技術省級重點實驗室鑒定并保存。

實施例1

本發明穩定表達粘蛋白Mgfp-5的轉基因煙草愈傷組織的培養方法,如圖1所示:

(1)選取轉mgfp-5基因的煙草種子,用75%酒精浸泡30s,用0.1%升汞(含吐溫-80)滅菌8min,無菌水沖洗5次,在附加20g/L Kan(Kanamycin,Kan,卡那霉素)無激素的MS固體培養基,25±2℃,光照強度為30~50μmol·m-2·s-1,每天16h/8h光/暗培養,萌發T1代轉基因煙草無菌苗;

(2)將步驟(1)中所述的T1代轉基因煙草無菌苗繼代培養20d,選取無菌苗葉片為外植體,在愈傷組織誘導培養基中誘導培養,得到愈傷組織;愈傷組織誘導培養基包括如下:20mg/L Kan、3%蔗糖(w/v)和0.7%瓊脂(w/v)的MS固體培養基(Ph 6.0)組成;誘導培養的條件為在25±2℃的溫度下,黑暗培養20d;

(3)切取步驟(2)中所得的愈傷組織在繼代培養基中固體或者懸浮繼代培養,得繼代愈傷組織;固體培養基MS、2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.5mg/L、NAA 0.1mg/L、20mg/L Kan和蔗糖3%,pH5.8~6.2組成;當懸浮繼代培養愈傷組織時,繼代培養基包括:液體培養基MS、2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.5mg/L、NAA0.1mg/L、Kan20mg/L和蔗糖3%組成。繼代培養的條件為:當固體繼代培養愈傷組織時,切取疏松愈傷組織,在固體繼代培養基中培養30~33d;當懸浮繼代培養愈傷組織時,選取疏松愈傷組織,以接種量5%(m/v)于液體培養基中,25±2℃,100rpm振蕩培養20d或21d。

實施例2—9與實施例1的不同之處在于步驟(3),步驟(3)中的2,4-D、6-BA和NAA的濃度不同,各實施例如表1所示,

表1不同生長調節劑水平對愈傷組織誘導的影響

注:“+”為少量出愈;“++”為重量出愈;“+++”為大量出愈。

取繼代培養20d后的無菌苗葉片外植體(),在附加20mg/L Kan,3%蔗糖(w/v)、0.7%瓊脂(w/v)和不同激素的MS基本培養基上,25±2℃,暗培養20d后誘導產生愈傷組織(圖2b)。40d后統計不同生長調節劑水平對愈傷組織誘導的影響(表1),2,4-D、6-BA和NAA的存在可以順利誘導得到胚性愈傷,3種激素對愈傷組織誘導的影響程度依次為2,4-D、6-BA、NAA。較高濃度的2,4-D和6-BA更易形成胚性愈傷組織,顏色黃綠為主,相反高濃度的NAA可以愈傷化程度增高,誘導形成黃綠色的愈傷組織呈現致密型,隨著培養時間的延長,生長緩慢,組織塊易褐化。綜合愈傷誘導率以及組織形態和生長狀況,在附加2,4-D1.0mg/L、6-BA0.5mg/L、NAA0.1mg/L和20mg/L Kan的MS固體培養基上,出愈率100%,淺黃綠色的胚性愈傷組織疏松,組織活性高易存活,狀態最好。

1.固體培養愈傷組織生長曲線的繪制:

取長勢較好的疏松愈傷組織,切成0.5cm2均勻小塊于MS、2,4-D1.0mg/L、6-BA0.5mg/L、NAA0.1mg/L和20mg/L Kan固體培養,每3d統計愈傷組織的增長率,結果表明呈現“S”型生長曲線,如圖3所示,分為三個階段,延遲期在愈傷組織轉接后的培養前期,持續大約9d,適應轉接后的新生長環境;培養12d左右進入對數生長期,愈傷組織在此期間生長迅速,12~27d內鮮質量約增加率為3.73;生長減緩期出現在培養27d左右,之后愈傷組織逐漸褐化衰老。

2.懸浮培養愈傷組織生長曲線:

碾碎長勢較好的疏松愈傷組織,按照接種量5%(m/v)在附加2,4-D1.0mg/L、6-BA 0.5mg/L、NAA0.1mg/L和20mg/L Kan的MS液體培養基中,25±2℃,100rpm,可以迅速生長成小組織團,如圖2c所示。選取一致的胚性懸浮組織團碾碎,5%(m/v)接種于30mL液體培養基繼代培養,每3d收獲3瓶細胞,統計鮮重(平均值)與干重(總值)的倍增值,對應培養時間,呈現繪制“S”型,如圖4所示生長曲線。懸浮培養胚性組織的需要6d的培養延遲期適應新鮮培養液環境;之后進入對數長期,迅速生長呈現愈傷組織團,9天內可以增加鮮質量8.56-8.63倍,干重增加7.94-8.10倍,持續到15d進入生長減緩期,提示需要更替培養液。

3.愈傷組織中外源基因mgfp-5鑒定:

用改良的CTAB法和Trizol法分別提取新鮮固/液培養愈傷組織及野生對照(CK)植株幼葉基因組DNA和RNA,用特異性PCR引物(5’

-CCAGGCAATACTTACCACTA-3’,

5’-CAGGAAACAGCTATGACCATGATTA CG-3’)和RT-PCR引物(5’-GGAATTCCATATGAGTTCTGAAGAA-3’,

5’-GG GGTACCCTAATGGTGATGGTG-3’),在20μL反應體系(含Taq酶0.5μL,PCR Buffer 2μL,引物10μmol/L,1和2各1.0μL,模板1.0μL,ddH2O 14.5μL)中,分別進行程序性:95℃預變性5min;94℃變性40s,55℃退火40s,72℃延伸40s,循環34次;72℃延伸10min)擴增分析。結果在DNA水平如圖5和RNA水平如圖6所示,野生型對照均不能擴增出相應條帶,陽性質粒、新鮮固/液培養愈傷組織均可以分別擴增到預期的600bp與260bp條帶,說明在轉基因煙草T1代的愈傷組織中,無論固體還是液體培養,外源基因mgfp-5均能夠穩定存在。

4.愈傷組織中重組蛋白Mgfp-5鑒定:

取新鮮固/液培養愈傷組織、轉基因煙草幼葉及野生對照(CK)植株幼葉,提取植物總蛋白,以牛血清白蛋白(BSA)為標準,Bradford方法分析總可溶性蛋白的含量,再根據目的基因上游位點串聯的6個His-tag,用Ni-NTA柱(Qiagen)純化Mgfp-5融合蛋白,SDS-PAGE電泳,電轉印至PVDF膜,以抗His一抗(1:2000,鼠單抗)及二抗(1:5000)進行Western blot圖6檢測,顯色條帶的位置與轉基因煙草幼葉中Mgfp-5蛋白預期的大小一致,顯示重組蛋白Mgfp-5可以在穩定表達在轉基因煙草的固/液培養愈傷組織里。

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