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用于預防或治療血脂異常的化合物和包含這類化合物的組合物.pdf

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用于 預防 治療 血脂 異常 化合物 包含 這類 組合
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摘要
申請專利號:

CN201480055631.1

申請日:

20141008

公開號:

CN105744934A

公開日:

20160706

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A61K31/231,A61K31/23,A61K31/34,A61K31/164,A61K31/357,A61K31/201,A23L33/00,A61P3/00,A61P3/06,A61P3/10,A61P11/00,A61P11/12 主分類號: A61K31/231,A61K31/23,A61K31/34,A61K31/164,A61K31/357,A61K31/201,A23L33/00,A61P3/00,A61P3/06,A61P3/10,A61P11/00,A61P11/12
申請人: 法國國家科學研究中心,普瓦捷大學,埃克塞特大學
發明人: 米羅斯拉娃·什潘諾娃,蒂里·費雷拉,羅曼·克萊芒,沙林尼·達耶爾,諾埃爾·摩根
地址: 法國,巴黎
優先權: 13/02334
專利代理機構: 中原信達知識產權代理有限責任公司 代理人: 金海霞;楊青
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201480055631.1

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及醫學領域。更具體來說,本發明涉及化合物在預防和/或治療對象中的血脂異常中的用途,所述血脂異常通常與脂肪酸、尤其是飽和長鏈脂肪酸和/或固醇在生物膜中、包括在非脂肪細胞的生物膜中的過量存在相關聯。本發明還涉及包含這類化合物的組合物、特別是藥物組合物和食品增補劑或補充劑,以及所述組合物在預防和/或治療血脂異常中的用途。本發明的化合物和組合物尤其可以被有利地用于預防和/或治療選自代謝綜合征和/或代謝綜合征特有的癥狀或異常的病理狀態,優選被用于預防或治療2型糖尿病或脂肪肝。

權利要求書

1.一種用于預防或治療對象中的血脂異常的化合物,所述血脂異常與脂肪酸、尤其是飽和長鏈脂肪酸和/或固醇在生物膜、包括在非脂肪細胞的生物膜中的過量存在相關聯,所述化合物包含具有至少一個羥基基團的極性頭部,所述極性頭部上接枝有包含16至24個之間的碳原子并具有1至6個處于順式構型的不飽和鍵的單個不飽和脂肪酸,其特征在于所述化合物i)不允許在被治療細胞的膜中產生雙不飽和磷脂,ii)對于被治療細胞來說不構成油酸的來源,并且優選地iii)不誘導細胞內鈣動員和/或不被脂肪酶降解。2.權利要求1的化合物,其特征在于血脂異常通過降低或抑制非脂肪細胞的質膜和/或其細胞器膜的流動性,在所述非脂肪細胞的功能障礙或凋亡的源頭處造成非脂肪細胞的中毒(脂中毒)。3.權利要求1或2的化合物,其特征在于它對不能合成中性脂類、通常為甘油三酯和/或酯化的固醇的細胞、尤其是腎臟、肝臟、胰腺、心臟和肌肉細胞無毒。4.權利要求1至3任一項的化合物,其特征在于所述極性頭部是式(I)的結構:其中:-A是氧原子或NR基團,其中R=H或任選用OH取代的C–C烷基,優選地A是氧原子,-n=2或3,優選地n=2,并且-R是任何化學基團,并且在不同(CHR)基團之間可以不同。5.權利要求1至4任一項的化合物,其特征在于它選自二縮甘露醇單油酸酯、3–羥基–2,2–雙(羥甲基)丙基油酸酯和N,N–二乙醇油酰胺。6.權利要求1至3任一項的化合物,其特征在于它通過恢復生物膜的流動性來預防或治療血脂異常。7.權利要求1至6任一項的化合物,其中血脂異常與所述對象中代謝綜合征、通常為選自胰島素抗性、胰島素缺乏、高血糖癥、高膽固醇血癥、高血壓、心力衰竭和脂肪肝的代謝綜合征癥狀的存在相關。8.權利要求1至7任一項的化合物,其用于預防或治療代謝綜合征,通常為選自胰島素抗性、高血糖癥、高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥、高血壓、心力衰竭和脂肪肝的至少一種代謝綜合征癥狀。9.權利要求1至8任一項的化合物,其用于預防或治療2型糖尿病。10.權利要求9的化合物,其與經典用于2型糖尿病的預防或治療的不同化合物相結合用于預防或治療2型糖尿病,所述不同化合物優選地選自雙胍、格列酮、基于磺胺的降血糖藥、格列奈、DDP–4抑制劑、腸降血糖素模擬物和α–葡萄糖苷酶抑制劑。11.權利要求1至10任一項的化合物,其中所述對象是動物,通常為哺乳動物,優選為人類。12.一種包含權利要求1至11任一項的化合物的組合物,所述組合物選自藥物組合物和功能食品或食品增補劑。

說明書

技術領域

本發明涉及醫學領域。更具體來說,本發明涉及化合物在預防和/或治療對象中的血脂異常中的用途,無論所述血脂異常是食物來源的還是與細胞缺氧相關的,所述血脂異常通常與脂肪酸、尤其是飽和長鏈脂肪酸和/或固醇在生物膜中、包括在非脂肪細胞的生物膜中的過量存在相關聯。本發明還涉及包含這類化合物的組合物、特別是藥物組合物和食品增補劑或補充劑,以及所述組合物在預防和/或治療血脂異常中的用途。本發明的化合物和組合物尤其可以被有利地用于預防和/或治療選自代謝綜合征和/或代謝綜合征特有的癥狀或異常的病理狀態,優選被用于預防和/或治療2型糖尿病(T2DM)或脂肪肝。

背景技術

胰島素抗性、胰島素缺乏、高血糖癥、高膽固醇血癥、特別是以低HDL膽固醇濃度為特征的高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥、高血壓、心力衰竭和脂肪肝屬于代謝綜合征特有的癥狀或異常。

代謝綜合征(在不存在治療的情況下)被具體并典型地定義為出現下述5種異常中的至少3種:腹部肥胖,高甘油三酯血癥(TG≥約1.7mM),低HDL膽固醇濃度(對男性來說HDLc<約1mM,對女性來說<約1.3mM),高血壓(BP≥約130/85mmHg)和禁食血糖≥約5.5mM(參見“Syndromemétaboliqueetdiabètechezl’homme.Compositionlipidiqueetoxidationdeslipoprotéinesdebassedensité(DL)plasmatiquesenrelationavecl’activationdesplaquettessanguine”-RomainColas的論文稿件-2010年12月10日答辯)。血脂異常參與代謝綜合征的發生,這已經知道幾十年了。

血脂異常通常被定義為脂類、通常為游離或非酯化脂肪酸、固醇(例如膽固醇)、甘油三酯或磷脂的異常高或低的血液濃度。大多數血脂異常表現為這些要素的水平提高,降低要罕見得多。

非酯化脂肪酸(NEFA)或游離脂肪酸(FFA)是生物體的重要能量組分。它們由雙鍵數目和構成烴鏈的碳原子數目不同的脂肪酸的復雜混合物構成。內源起源的這些脂肪酸通過細胞質內的生物合成來形成,并在脂肪組織和肝臟中以乙酰CoA的形式用于甘油三酯的合成,或者被細胞氧化。它們也進入構成生物膜的結構性脂類例如磷脂和鞘脂的組成。在細胞質中發現了占NEFA的85%的主要4種脂肪酸:油酸,棕櫚酸,亞油酸和硬脂酸。大多數NEFA結合于白蛋白。它們來自于脂肪組織的甘油三酯,所述甘油三酯在禁食期間,在組織和血液中的脂蛋白脂肪酶的作用下被水解成甘油和脂肪酸。它們的濃度隨著年齡、食物攝入和體育鍛煉而以大比例變化。一般來說,在餐后時間段,它們的釋放被抑制。

固醇是具有甾烷核的脂類,所述甾烷核的3位碳帶有羥基。固醇被視為甾類化合物的一個亞類。膽固醇,最常見和廣泛的固醇之一,對細胞功能來說是至關重要的,并且是維生素和脂溶性甾類激素的前體。

通常,血液中異常高的脂類濃度對應于生物膜中異常高的脂類濃度(“細胞性血脂異常”)。例如,血液中異常高的飽和游離脂肪酸(NEFA)濃度對應于生物膜的磷脂中異常高的飽和酯化脂肪酸(EFA)濃度。這些脂類總是與特定蛋白質相結合存在,以便形成脂蛋白。血脂異常起因于脂類動態平衡的調節障礙。

已確立,過度富含動物脂肪的飲食尤其導致飽和脂肪酸(SFA)在生物膜中的積累(脂中毒),并且這在細胞水平上引起膜的可塑性的整體破壞,然后引起細胞的代謝失活,并從長遠來看引起細胞凋亡(圖1)。

迄今為止,已知只有不飽和脂肪酸(UFA)、特別是油酸(橄欖油)能夠反擊與SFA積累相關的毒性的有害效果(Cunha等,2008;Diakogiannaki等,2008;Katsoulieris等,2009;Pineau等,2009;Stein等,1997;Wei等,2006;Deguil等,2011)。然而,它們作為功能食品和/或藥物的用途遇到兩個主要限制。首先,UFA具有本質上預防性特性,因此在治療已確立的脂中毒、即造成所有膜機制的破壞(可以在蛋白質分泌途徑的每一步中檢測到)的脂中毒的背景中重要性有限。事實上,UFA通過在攝入食物時與SFA在膜磷脂(PL)的合成中直接競爭而起作用。第二,對于不能轉化(緩沖)過量游離脂肪酸、尤其是UFA并在之后將其儲存在中性脂類、通常為甘油三酯(TG)和/或酯化的固醇中的細胞來說,顯示出UFA毒性。對于例如由于不存在4個乙酰基轉移酶Lro1p、Dga1p、Are1p和Are2p而在其中觀察到中性脂類合成的調節障礙的酵母菌株來說,情況正是如此。當將這種突變菌株暴露于外源UFA源時,脂類調節障礙表現為細胞內膜的大量增生,并最終表現為通過不依賴于未折疊蛋白質響應(UPR;參見下文)的過程而出現的細胞死亡(Kohlwein&Petschnigg,2007;Petschnigg等,2011)。有趣的是,在哺乳動物細胞中可以觀察到一致的現象(Listenberger等,2003)。這解釋了為何不飽和脂肪酸在脂中毒條件下,在細胞將不飽和脂肪酸作為中性脂類儲存的能力被超過這樣一種狀態(所謂的“代謝失活的”脂中毒的細胞)之前變得對所述細胞有毒,或者在正常條件下對具有非常弱的合成TG的能力的細胞例如胰腺非β細胞變得有毒(CnopM等,2001)。因此,在人類中,除了脂肪細胞(單獨地能夠合成并儲存中性脂類)之外的所有細胞類型都可能被脂中毒光顧。尤其是,已知與SFA積累相關聯的破壞導致負責胰島素合成的胰腺β–細胞(Butler等,2003)或肝細胞(Egnatchik等,2014)的凋亡。

在2型糖尿病(T2DM)的情形中,SFA積累的影響出現在各種不同器官中,并且尤其表現為胰腺中的胰島素缺乏(與上面描述的胰腺β–細胞凋亡相關),但是也表現為肝臟和肌肉中的胰島素抗性。

目前,據估計全世界有3億8千2百萬糖尿病個體。盡管幾十年前就已確立脂類動態平衡調節障礙的參與,但大多數當前療法聚焦于胰島素分泌水平或血糖水平。具體來說,幾種分子被用于治療2型糖尿病。對每位患者測試這些分子,然后如果它們被證明無效,依次用新的分子(根據它們對體重的影響和其他潛在副作用)代替。按照法國藥物安全管理局(Frenchdrugsafetyagency)AFSSAPS2006年的推薦,首先和首要地使用甲福明(一種雙胍)以便降低胰島素抗性而不引起低血糖癥。其次,可以使用胰島素分泌藥劑例如基于磺胺的降血糖藥或美格替奈類藥物。此外,自從2008年起,DPP–4抑制劑(gliptins)和其他GLP–1類似物(腸降血糖素模擬物)也已出現在可用于校正血糖而在血脂異常的背景中沒有利益的產品的范圍內。最后,作為最終手段,開出胰島素注射劑處方。

所提到的策略都不能從根本上恢復脂中毒的細胞和器官的功能性,因此不能干預在代謝綜合征或2型糖尿病中遇到的一系列有害效應中通常在由現有治療所靶向的每個步驟上游的早期步驟。旨在刺激“患病”器官的生理功能的當代治療方法甚至可能事與愿違地造成它們的弱化,并且解釋了在許多患者中使用的藥物的無效性和抗性現象隨時間的出現。

本發明人現在描述了通過作用于在所有脂中毒的組織中常常改變的現象——膜的可塑性而用于預防在生物膜中出現血脂異常、通常為脂肪酸、尤其是飽和脂肪酸和/或固醇的細胞積累,或用于治療已確立的血脂異常的分子或化合物,以及包含這類分子或化合物的組合物。

發明內容

本發明涉及用于預防或治療與由脂肪酸、通常為飽和脂肪酸(SFA)和/或固醇、尤其是飽和長鏈脂肪酸和/或反式脂肪酸引起的脂中毒相關的疾病的一類新的分子。長鏈脂肪酸通常是指碳鏈包含至少14個碳原子,通常為14至24個之間的碳原子,例如至少16或至少18個碳原子,通常為14至22個之間或14至18個之間的碳原子的脂肪酸。

脂中毒可以顯示為生物膜中存在的磷脂(PL)中飽和脂肪酸/不飽和脂肪酸(SFA/UFA)的比例倒轉,SFA變得占優勢,甚至完全代替UFA。因此,本發明的分子通常用于預防或治療血脂異常、代謝綜合征、代謝綜合征特有的癥狀或異常,優選地用于預防或治療2型糖尿病或脂肪肝。

與現有技術中用于補償飽和脂肪酸(SFA)過量的不飽和脂肪酸(UFA)、特別是油酸相比,本發明的分子(或化合物)的相當大的優點在于與前者不同,它們不引起任何細胞毒性,特別是對不能合成中性脂類的細胞、通常為非脂肪細胞例如胰腺細胞的任何毒性。本發明的分子的另一個主要優點在于,與在現有技術中預防性使用的UFA不同,由于它們通過例如作用于膜的可塑性而恢復細胞功能性的能力,它們也可以治療性使用。因此,它們可以有利地用于治療已確立的血脂異常,即造成可檢測的細胞功能障礙、通常為細胞執行其天然功能的能力的改變、甚至是失能(代謝失活)的血脂異常。

因此,本發明的特定目的涉及一種用于預防或治療對象中的血脂異常的化合物,所述化合物包含具有至少一個羥基基團的極性頭部,所述極性頭部上接枝有包含16至24個之間、例如16至22或16至20個之間的碳原子并具有1至6個、例如3個處于順式構型的不飽和鍵的單個不飽和脂肪酸。血脂異常通常影響生物膜,包括非脂肪細胞的生物膜。它通常與飽和脂肪酸、更具體為飽和長鏈脂肪酸和/或固醇在所述生物膜中的過量存在有關聯。當例如飽和脂肪酸和/或固醇通過降低膜的可塑性而引起細胞功能障礙時,它的量尤其被視為過量。在本發明的優選實施方式中,所述化合物i)不允許在被治療細胞的膜中產生雙不飽和磷脂,尤其是不造成在所述膜中引入雙不飽和磷脂,通常不在被治療細胞中恢復與相應的未脂中毒的細胞的膜磷脂的脂肪酸組成可比的膜磷脂脂肪酸組成,ii)對于被治療細胞來說不是油酸的來源,通常不是能夠恢復被治療細胞的膜的可塑性的油酸的來源,并且優選地iii)不誘導細胞內鈣動員和/或不被脂肪酶降解。

本發明的另一個目的涉及一種用于預防或治療對象中的血脂異常、通常為如上所定義的血脂異常的化合物,所述化合物的極性頭部是式(I)的結構:

其中:

-A是氮或氧原子,優選為氧原子,

-n等于2或3,優選地n等于2,并且

-R是任何化學基團。

本發明的i)不允許在被治療細胞的膜中產生雙不飽和磷脂或不造成在所述膜中引入這類磷脂,通常不在被治療細胞中恢復與相應的未脂中毒的細胞的膜磷脂的脂肪酸組成可比的膜磷脂脂肪酸組成,以及ii)對于被治療細胞來說不構成油酸的來源,通常不構成能夠恢復被治療細胞的膜的可塑性的油酸的來源的優選化合物的實例,選自二縮甘露醇單油酸酯、3–羥基–2,2–雙(羥甲基)丙基油酸酯和N,N–二乙醇油酰胺(與例如1–油酰基溶血磷脂酸或LPA不同)。

本發明的不誘導細胞內鈣動員的優選化合物的實例是二縮甘露醇單油酸酯和3–羥基–2,2–雙(羥甲基)丙基油酸酯。與用于誘導細胞鈣動員的參比分子OAG(Marin&Cooper,2006)或1–油酰基甘油和2–油酰基甘油(Iwasaki等,2008)不同,這些化合物的特別有利之處在于它們具有由細胞內鈣依賴性有害過程例如增殖或凋亡引起的毒性的較低風險(StutzmannGE等,2011)。

本發明的抵抗脂肪酶的降解作用的優選化合物的實例是N,N–二乙醇油酰胺。

本發明還涉及本文中所描述的化合物,其用于預防或治療代謝綜合征,通常為代謝綜合征特有的至少一種癥狀或異常,優選地至少兩種或三種癥狀,所述癥狀選自胰島素抗性、胰島素缺乏、高血糖癥(通常禁食血糖≥約5.5mM)、高膽固醇血癥、尤其是以低HDL膽固醇濃度(通常對于男性來說<約1mM,對于女性來說<約1.3mM)為特征的高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥(通常TG≥約1.7mM)、高血壓(通常血壓(BP)≥約130/820mmHg)、心力衰竭和脂肪肝,優選地選自胰島素抗性、高血糖癥(通常禁食血糖≥約5.5mM)、高膽固醇血癥、尤其是以低HDL膽固醇濃度(通常對于男性來說<約1mM,對于女性來說<約1.3mM)為特征的高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥(通常TG≥約1.7mM)、高血壓(通常血壓(BP)≥約130/820mmHg)、心力衰竭和脂肪肝。具體目的涉及本發明的用于預防或治療2型糖尿病的化合物。

本發明的特別優選的化合物是二縮甘露醇單油酸酯,其發明人已使用通過飽和脂肪酸進行脂中毒的哺乳動物胰腺β–細胞顯示,所述化合物通過在患有脂中毒和/或2型糖尿病的對象中促進胰島素原向胰島素的成熟,能夠有利地提高所述對象中的胰島素分泌。

本發明還涉及包含至少一種本發明的化合物的組合物,其為藥物組合物、功能食品或食品增補劑的形式。具體目的通常涉及一種藥物組合物,其除了包含所述至少一種本發明的化合物之外,還包含至少一種具有治療活性(并且被本領域技術人員公認如此)的其他化合物(不同于本發明的化合物)。

本發明還涉及這類組合物在預防或治療對象中的血脂異常中的用途,所述血脂異常通常為生物膜、包括非脂肪細胞的生物膜中的血脂異常,尤其是與脂肪酸、更具體為飽和長鏈和/或反式脂肪酸和/或固醇在所述生物膜中的過量存在相關聯的血脂異常。本發明還涉及這類組合物在預防或治療對象中的代謝綜合征、優選地在預防或治療2型糖尿病中的用途,所述代謝綜合征通常為代謝綜合征特有的至少一種癥狀或異常,優選為幾種癥狀(例如2、3、4或5種)。所描述的用途也可以有利地與至少一種其他治療活性化合物(被本領域技術人員公認為具有治療活性并且不同于本發明的化合物)相組合來執行,特別是用于治療代謝綜合征,通常為代謝綜合征特有的至少一種癥狀或異常和/或2型糖尿病。

詳細描述

本發明人顯示,來自于外源來源(飲食)或內源來源(缺氧或由突變引起的脂肪酸去飽和步驟的改變)的SFA積累在構成細胞膜的磷脂中,因此通過改變介入蛋白質分泌途徑的細胞內細胞器的功能性而破壞大量過程(參見圖1)。

為了提供這個證明,本發明人開發了一種簡單的單細胞模型(從baker的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)精心設計的hem1Δ菌株),其重現了在哺乳動物細胞中觀察到的SFA和膽固醇的所有效應,尤其是參與代謝綜合征的發生的所有異常(Pineau等,2008和Pineau等,2009)。

在YPG培養基(即既不含麥角固醇(Erg)也不含油酸(Ole)的培養基)中,hem1Δ菌株在其磷脂、尤其是磷脂酰膽堿(PC)中積累飽和脂肪酸(尤其是棕櫚酸,C16:0)。應該指出,麥角固醇是酵母中存在的主要固醇,因此它在酵母中等同于人類中的膽固醇。

其中負責甘油三酯和固醇酯合成的酶的編碼基因被缺失的四倍體突變(QM)菌株(Petschnigg等,2009)進而不能將外源供應的油酸C18:1類型的游離脂肪酸轉化成中性酯類,使得這種供應由于它所產生的膜可塑性平衡的破壞而引起有害脅迫。特別是,QM菌株的使用能夠使本發明人執行清楚地顯示出油酸在這種環境中的毒性的毒性試驗(參見圖4)。

更確切來說,本發明人在hem1Δ菌株上觀察到細胞內細胞器膜中帶有飽和鏈的磷脂(飽和PL)和膽固醇的積累對分泌囊泡形成的負面影響。這種脂中毒(內源性的,因為hem1Δ菌株的細胞體系僅僅合成SFA)破壞內質網(ER)膜的脂類環境,在所述ER中改變蛋白質折疊過程(錯誤折疊),然后引發復雜的響應,這種響應被稱為未折疊蛋白質響應(UPR)。這種后備系統的飽和引起凋亡性細胞死亡。并行地,本發明人能夠觀察到高爾基體囊泡化的破壞和參比蛋白(ex.:Fur4p)在高爾基體與質膜之間的運輸的改變。具體來說,本發明人觀察到由脂中毒造成的整個分泌途徑的改變。換句話說,hem1Δ酵母菌株使他們能夠證實SFA對ER脅迫和蛋白質向質膜的運輸的影響兩者。

內質網(ER)參與幾種基本細胞過程,包括脂類合成、鈣動態平衡的調節以及旨在用于各種不同細胞器和細胞表面的蛋白質(例如膜蛋白例如離子通道和轉運蛋白)的合成。ER也是膜或分泌蛋白被組裝和折疊的位點。因此,UPR通過使ER能夠管控錯誤折疊的蛋白質的積累,在維持該細胞器的完整性和功能性方面發揮必不可少的作用(Kincaid&Cooper,2007;Zhang&Kaufman,2006)。應該指出,在胰腺β–細胞(在哺乳動物中負責胰島素合成)中,SFA毒性與未折疊蛋白質響應的誘導相關(Cunha等,2008;Diakogiannaki&Morgan,2008;Laybutt等,2007)。Alkhateeb等(2007)和Kato等(2008)進一步觀察到SFA積累改變胰島素受體和葡萄糖轉運蛋白Glut4在肌肉細胞表面上的尋址。

Schneider等(1999)觀察到內質網(ER)和高爾基體的膜絕大部分由不飽和磷脂(PL)構成,但是在分泌途徑中最遠端的區室中飽和PL的水平逐漸增加,并在質膜中達到其最大值。高的不飽和PL水平表現為高的膜流動性,這對召集某些對囊泡形成來說必不可少的蛋白質而言是關鍵參數。典型實例由Arf–GAP1家族的蛋白質提供,一種是酵母中的Gcs1p。已顯示,Gcs1p是高爾基體與ER之間以及ER與質膜之間的囊泡轉運兩者的介導物(Robinson等,2006)。有趣的是,GCS1基因的缺失引起高爾基體的破碎和后高爾基體囊泡運輸的破壞(Poon等,2001),本發明人自身在hem1Δ酵母模型中,即在SFA積累條件下能夠觀察到同樣多的這些現象(參見Payet等,2013)。

Arf–GAP1家族的蛋白質通過經由被稱為ArfGAP1脂質堆積傳感器(ALPS;(Bigay等,2005))的特定基序被吸附在膜表面上,而對膜的曲度做出響應。具體來說,ALPS基序不識別膜曲度本身,即彎曲的幾何形狀,而是識別作為膜曲度的結果的磷脂極性頭部的松散堆積(松散脂質堆積)(Bigay等,2005)。本發明人成功地顯示,在脂中毒條件下高的飽和PL水平與膜脂質堆積的提高有關(Deguil等,2011),并且這種提高改變了Gcs1p被高爾基體從細胞質的召集(Payet等,2013)。更通常地,他們顯示,脂肪酸、尤其是SFA在生物膜中的積累引起細胞內細胞器(包括高爾基體和內質網(ER))的功能性調節障礙,尤其是較低的囊泡化程度,所述較低的囊泡化程度造成某些膜轉運蛋白和受體在細胞表面上的易位減少。

由本發明人引起的細胞脂中毒起因于在體外暴露于專一地采取飽和形式的脂肪酸的外源來源(“外源”脂中毒),或起因于細胞固有地不能產生不飽和形式的脂肪酸(“內源”脂中毒)。

使用他們的hem1Δ酵母模型,本發明人顯示,油酸(Ole)通過被代謝成磷脂(PL)(參見圖1,屬于SFA的PL的減少,有利于屬于UFA的PL),恢復了事先被SFA脂中毒的膜的可塑性。他們還使用QM酵母菌株顯示,觀察到的有益效應限于能夠緩沖中性脂類形式的過量外源UFA的細胞。在不具有這種能力的細胞中,過剩的外源油酸最終引起細胞內膜的異常增生,其通過脅迫細胞而觸發細胞的凋亡。

本發明人使用他們的hem1Δ酵母模型和QM菌株來篩選可能阻止或限制這種現象,理想地對抗過量存在和/或代謝(即酯化)不良的脂肪酸的有毒效應并校正所有被破壞的現象的目標分子。因此,他們發現了具體來說能夠將細胞功能恢復(例如通過恢復膜的流動性)到與非病理狀態下所遇到的相當的水平的分子。

然后,本發明人在哺乳動物胰腺β–細胞、特別是大鼠胰腺β–細胞(BRIN–BD11細胞系)中測試并顯示了由本發明人預先選擇的分子的有效性,即它們即使在已確立的血脂異常的情況下將細胞功能恢復到與非病理狀態下所遇到的相當的水平的能力。此外,本發明人能夠證實,目標化合物對負責誘導細胞增殖和凋亡的細胞現象例如鈣動員具有非常有限的影響。因此,它們與相反地誘導或促進這種細胞鈣動員的化合物例如OAG相比毒性更低。同樣地,某些化合物顯示出在哺乳動物胰腺β–細胞、尤其是小鼠胰腺β–細胞(MIN6細胞系)中,在恢復胰島素原向胰島素的轉化方面特別有效。

因此,本發明涉及一種用于預防或治療對象中的血脂異常的化合物,所述化合物包含具有至少一個羥基基團的極性頭部,所述極性頭部上接枝有包含16至24個之間、例如16至20個之間、通常為18個碳原子并具有1至6個、例如3個處于順式構型的不飽和鍵的單個不飽和脂肪酸(在本文中被鑒定為“目標化合物”)。

所關注的對象是動物,通常為哺乳動物,例如選自小鼠、大鼠、豬和人類的哺乳動物。所關注的對象優選為人類。

在本說明書的上下文中,尋求預防或治療的血脂異常通常影響生物膜,尤其是非脂肪細胞的生物膜。它通常與脂肪酸、更具體為飽和長鏈和/或反式脂肪酸和/或固醇在所述生物膜中的過量存在相關聯。血脂異常通常通過降低甚至抑制非脂肪細胞的質膜和/或其細胞器膜的流動性,在所述細胞的功能障礙或凋亡的源頭處造成所述細胞的中毒(脂中毒)。

在本發明的特定實施方式中,血脂異常與所述對象中代謝綜合征、通常為代謝綜合征的至少一種癥狀、優選為至少兩種或三種癥狀的存在相關,所述癥狀選自胰島素抗性、胰島素缺乏、高血糖癥(通常禁食血糖≥約5.5mM)、高膽固醇血癥、尤其是以低的HDL膽固醇濃度(通常對于男性來說<約1mM,對于女性來說<約1.3mM)為特征的高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥(通常TG≥約1.7mM)、高血壓(通常血壓(BP)≥約130/820mmHg)、心力衰竭和脂肪肝,優選地選自胰島素抗性、高血糖癥(通常禁食血糖≥約5.5mM)、高膽固醇血癥、尤其是以低的HDL膽固醇濃度(通常對于男性來說<約1mM,對于女性來說<約1.3mM)為特征的高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥(通常TG≥約1.7mM)、高血壓(通常血壓(BP)≥約130/820mmHg)、心力衰竭和脂肪肝。

正如可以從本說明書看到的,脂肪酸、尤其是SFA和/或固醇的“過量存在”的表述,與“脂中毒”例如外源脂中毒或內源脂中毒(例如缺氧)同義,并且是指非脂肪細胞中存在的尤其是飽和和/或反式脂肪酸和/或固醇的量足以破壞上面描述的分泌途徑,并因此改變細胞功能(通常為蛋白質分泌途徑以及因此所述蛋白質的功能),或者作為結果在更高水平上改變相應器官的功能。

例如,當飽和脂肪酸、尤其是飽和長鏈脂肪酸儲存在腎臟和近曲小管的細胞中時,出現腎臟脂中毒。這種儲存引起小管間質炎癥和纖維化,甚至引起腎衰竭,并且在最嚴重的病例中引起所關注對象的死亡。作為另一個實例,胰腺的脂中毒通常通過飽和脂肪酸、尤其是飽和長鏈脂肪酸在胰腺β–細胞的膜磷脂中的儲存來診斷。

在細胞尺度上,脂中毒通常通過檢測生物膜的磷脂(PL)(特別是磷脂酰膽堿(PC)的磷脂物質)的脂肪酸含量變化來診斷,具體來說,通過屬于UFA的PL形式的消耗以有利于屬于SFA的PL來診斷。在本說明書的實驗部分中所描述的程序的圖片中,在提取總細胞脂類,純化它們的磷脂并對后者進行質譜分析后,可以顯示出這種脂類組學特征(Deguil等,2011)。

此外,這種細胞脂中毒可以因未折疊蛋白質響應(UPR)的誘導而出現。如實驗部分中所示,通過分析在啟動子序列中含有特異性針對在所述響應觸發期間特征性誘導的基因、例如選自CHOP、BiP、GRP78和ATF4的基因(Laybutt等,2007)的一個或多個、例如4個UPR元件(UPRE)的報告基因(例如編碼酶活性可以被定量的β–半乳糖苷酶的lacZ基因)的表達,可以在體外檢測和測量該UPR。或者,UPR對脂中毒做出響應的觸發,可以通過定量該細胞事件級聯中某些關鍵蛋白質的活性形式的比例來檢測和測量。eIF2α蛋白的情況就是如此,其磷酸化的活性形式的豐度與UPR活化狀態成比例。正如在實驗部分中解釋的,磷酸化活性形式的量可以通過在western印跡后獲得的圖像的密度測量來評估(Dhayal&Morgan,2011)。

在本發明的情形中,可以通過檢測或測量如上解釋的參與UPR的基因的表達或蛋白質的活性,有利地檢測或測量UPR。

特定目標化合物是如上所定義的化合物,其極性頭部是式(I)的結構:

其中:

A通常是氧原子或NR1基團,其中R1=H或任選被OH取代的C1–C6烷基,并且A優選為氧原子或NH或NCH3或NCH2CH2OH,更優選地A是氧原子,

n=2或3,優選地n=2,并且

R是任何化學基團,并且在不同(CHR)基團之間可以不同。

在式(I)中,由鋸齒線打斷的鍵代表極性頭部與不飽和脂肪酸的碳鏈之間的鍵,式(I)的C=O基團是不飽和脂肪酸的C=O。

優選地,R是只包含碳、氫和氧原子的基團。

優選地,R是只包含碳、氫和氧原子的飽和基團。

優選地,(CHR)n-OH基團是甘油、赤蘚糖醇或單糖例如甘露糖的衍生物。

在本發明中,每個羥基基團可以被獨立地磷酸化。

可以在本發明的背景中用于預防或治療血脂異常的目標化合物的實例被鑒定如下:

1–油酰基–2–乙酰基–sn–甘油(OAG),

1–油酰基–sn–甘油–3–磷酸酯(1–油酰基溶血磷脂酸或LPA),

2–花生四烯酰甘油(2–AG),

二縮甘露醇單油酸酯,

3–羥基–2,2–雙(羥甲基)丙基油酸酯,

N,N–二乙醇油酰胺,

丙二醇單油酸酯,

1–油酰基甘油,

2–油酰基甘油,

與三甘油的油酸單酯,

(Z)–9–十八烯酸–(2,2–二甲基–1,3–二氧戊環–4–基)甲基酯,

二乙二醇單油酸酯。

可以在本發明的背景中用于預防或治療血脂異常的目標化合物選自例如1–油酰基–2–乙酰基–sn–甘油(OAG)、1–油酰基–sn–甘油–3–磷酸酯(1–油酰基溶血磷脂酸或LPA)、2–花生四烯酰甘油(2–AG)、二縮甘露醇單油酸酯、3–羥基–2,2–雙(羥甲基)丙基油酸酯、N,N–二乙醇油酰胺、丙二醇單油酸酯、與三甘油的油酸單酯和(Z)–9–十八烯酸–(2,2–二甲基–1,3–二氧戊環–4–基)甲基酯。

優選地,可以在本發明的背景中用于預防或治療血脂異常、特別是與代謝疾病例如2型糖尿病相關的脂中毒和/或缺氧性脂中毒的目標化合物,選自二縮甘露醇單油酸酯、3–羥基–2,2–雙(羥甲基)丙基油酸酯和N,N–二乙醇油酰胺。

用于預防或治療血脂異常、尤其是在代謝疾病和/或代謝綜合征特有的癥狀或異常、優選為2型糖尿病的預防和/或治療的背景中,特別優選的目標化合物是二縮甘露醇單油酸酯。

在本發明的背景中,目標化合物通常通過恢復生物膜的流動性,用于預防或治療血脂異常。這些化合物的有利特點在于,與在現有技術中使用的不飽和脂肪酸不同,它們對不能合成中性脂類、通常為甘油三酯和/或酯化的固醇的細胞無毒。特別是,這些化合物對胰腺細胞(胰腺β–細胞和胰腺α–細胞)無毒。優選地,它們也對腎臟、肝臟、心臟和肌肉細胞無毒。此外,優選地,它們有利地能夠恢復脂中毒的細胞以及如果需要、相關器官的功能。

本發明的典型目標化合物具有下述特性:

(i)它恢復釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的脂中毒的hem1Δ突變株的生長,

(ii)它降低或抑制未折疊蛋白質響應(UPR),

(iii)它對釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的四倍體突變株(QM)無毒性,和/或

(iv)它減少或抑制脂中毒的哺乳動物細胞的凋亡性死亡。

在本發明的背景中使用的特定化合物能夠恢復釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的脂中毒的hem1Δ突變株的生長和/或降低或抑制未折疊蛋白質響應(UPR),通常為由脂中毒誘導的UPR(不論所述脂中毒在本質上是內源還是外源的)。

在本發明的背景中使用的特定化合物對QM株酵母無毒性。

在本發明的背景中使用的特定化合物能夠減少或抑制脂中毒的哺乳動物細胞的凋亡性死亡。

在所描述的可以在本發明的背景中使用的化合物中,一些化合物直接作用于脂類內含物,即作用于細胞膜中存在的磷脂的脂肪酸組成。這樣的化合物的實例是1–油酰基–sn–甘油–3–磷酸酯(1–油酰基溶血磷脂酸或LPA)和丙二醇單油酸酯。

可以在本發明的背景中使用的其他化合物恢復膜的流動性并因此恢復膜的功能,而不恢復細胞膜中正常的雙不飽和磷脂的組成。這類化合物的優選實例是1–油酰基–2–乙酰基–sn–甘油(OAG)。更優選的實例是二縮甘露醇單油酸酯、3–羥基–2,2–雙(羥甲基)丙基油酸酯和N,N–二乙醇油酰胺。

在本發明的優選實施方式中,目標化合物被用于預防和/或治療選自代謝綜合征和/或代謝綜合征特有的癥狀或異常的病理狀態,優選地用于預防或治療2型糖尿病。

在本發明的特定實施方式中,目標化合物被用于預防和/或治療代謝綜合征,通常為代謝綜合征的至少一種癥狀,優選為至少兩種或三種癥狀,所述癥狀選自胰島素抗性、胰島素缺乏、高血糖癥(通常禁食血糖≥約5.5mM)、高膽固醇血癥、尤其是以低的HDL膽固醇濃度(通常對于男性來說<約1mM,對于女性來說<約1.3mM)為特征的高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥(通常TG≥約1.7mM)、高血壓(通常血壓(BP)≥約130/820mmHg)、心力衰竭和脂肪肝,優選地選自胰島素抗性、高血糖癥(通常禁食血糖≥約5.5mM)、高膽固醇血癥、尤其是以低的HDL膽固醇濃度(通常對于男性來說<約1mM,對于女性來說<約1.3mM)為特征的高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥(通常TG≥約1.7mM)、高血壓(通常血壓(BP)≥約130/820mmHg)、心力衰竭和脂肪肝。

正如上面解釋的,對于2型糖尿病來說,當前的治療方法靶向在最初的血脂異常下游介入的參數。盡管在實驗室中在生理背景中得到驗證,但這些治療苦于缺乏有效性,這是由于在已確立的脂中毒的情況下提到的膜機制的整體破壞,特別是表現為改變或無效的膜流動性(其中所涉及的細胞不再有功能)。具體來說,目前不存在用于治療影響不能合成中性脂類的細胞、尤其是非脂肪細胞的血脂異常的分子或化合物。

在本發明的優選實施方式中,本文中所描述的至少一種目標化合物被用于預防和/或治療2型糖尿病。二縮甘露醇單油酸酯是優選地用于預防和/或治療2型糖尿病的目標化合物的實例。

在本發明的特定實施方式中,該至少一種目標化合物可以與本領域技術人員已知且傳統上用于2型糖尿病的預防或治療的不同化合物相組合使用,所述不同化合物優選地選自雙胍、格列酮、基于磺胺的降血糖藥、格列奈、DDP–4抑制劑、腸降血糖素模擬物和α–葡萄糖苷酶抑制劑。

本發明的另一個目的還涉及一種藥物組合物、功能食品、食品增補劑或補充劑形式的組合物,其包含至少一種本發明的目標化合物(在本文中被鑒定為“目標組合物”)。

特定目標通常涉及一種藥物組合物,其除了包含所述至少一種本發明的目標化合物之外,還包含具有治療活性(并被本領域技術人員公認如此)的至少一種其他化合物(不同于在本發明的背景中用于預防或治療血脂異常而不在非脂肪細胞中引起毒性的目標化合物),尤其是在代謝綜合征特有的癥狀或異常和/或2型糖尿病的預防或治療中有活性的化合物(例如,如本文中所描述的)。

本發明還涉及一種本文中所描述的組合物,其用于預防或治療血脂異常,通常為選自代謝綜合征和/或代謝綜合征特有的癥狀或異常的病理狀態,優選地用于預防或治療2型糖尿病。

術語“治療”是指治愈性、癥狀性或預防性治療。因此,本發明的化合物可用于患有所宣稱的疾病的對象(例如哺乳動物,尤其是人類)。本發明的化合物也可用于延遲或減緩所述疾病的發展或阻止所述疾病的進一步發展,因此改善對象的狀況。最后,本發明的化合物可以被預防性給藥到尚未患病但通常情況下可能發生疾病或處于發生疾病的高風險中的對象。

本發明的目標化合物或組合物可以以各種不同方式和各種不同形式給藥。

因此,在典型的實施方式中,將目標化合物一起或分開地給藥到對象,并且本發明的目標化合物或組合物在整個治療期間,即在被治療的疾病的癥狀改善、優選地所有或一部分所述癥狀消失之前,被連續或順序給藥,每日一次或多次(每日給藥),每周一次或多次(每周給藥)或每月一次或多次(每月給藥)給藥。

如有必要,每日劑量可以例如以每日2、3、4、5、6或更多劑給藥,或者在一日中經適合的間隔以多個子劑量給藥。

所述化合物或組合物可以例如被全身性、經口、腸胃外、通過吸入或通過注射例如靜脈內、腹膜內、肌內、皮下、透皮、動脈內注射等給藥。作為長期治療,優選的給藥途徑是舌下、經口、腹膜內或經皮。

所述組合物可以被配制成可注射懸液、油、栓劑、硬殼膠囊、軟殼膠囊、氣溶膠等,任選地利用蓋倫形式或裝置提供延長和/或延遲釋放。對于注射劑來說,所述化合物一般被包裝成液體懸液,其可以利用例如注射器或灌注來注射。

應該理解,流速和/或注射劑量可以由專業技術人員根據患者、疾病、給藥方式等改變。一般來說,化合物的每日劑量是獲得治療效果所需的最小量。治療性組合物中存在的所述化合物的量可以被調整,以便獲得對于特定患者、組合物、給藥方式來說獲得所需治療效果并且優選地對患者無毒性所需的活性成分循環水平。所選的量取決于多種因素,尤其是給藥途徑、給藥持續時間、給藥時間點、化合物的消除速率、與化合物組合使用的各種不同產品、患者的年齡、體重、身體狀況和醫療史,以及醫學中已知的任何其他信息。

通常,被給藥的化合物的劑量在每次給藥1μg至2g之間,優選地在每次給藥0.1mg至1g之間變化。此外,本發明的組合物可以進一步包含如上解釋的其他藥劑或活性成分。本發明的組合物也可以包含一種或多種可藥用賦形劑或載體。可以提到的是例如與制藥用途相容并且為專業技術人員所知的鹽水、生理溶液、等滲溶液和緩沖溶液等。所述組合物可以含有選自分散劑、增溶劑、穩定劑、防腐劑等的一種或多種藥劑或載體。

本發明還涉及用于預防或治療對象中的血脂異常的方法,所述方法包括向患有血脂異常或可能發生血脂異常的對象給藥本文中所描述的用于預防或治療所述血脂異常的目標化合物或組合物。

本發明還涉及用于在對象中預防或在患病對象中治療選自代謝綜合征、代謝綜合征特有的癥狀或異常和2型糖尿病的病理狀態的方法。這些方法都包括向患有這類病理狀態或可能發生這類病理狀態的對象給藥本文中所描述的用于預防或治療所述疾病的目標化合物或組合物的步驟。

下面的圖和實施例說明本發明但不限制其范圍。

附圖說明

圖1:分泌途徑和膜的可塑性

在合成后,膜或分泌的蛋白質(細胞的分子“工具”)必須在細胞內部經歷成熟步驟。這個被稱為“分泌途徑”的過程的每個步驟發生在特定的亞細胞區室(尤其是內質網(ER)和高爾基體)中。因此,為了獲得成熟蛋白質,需要各種不同內膜系統之間的功能性細胞內轉運。除了其他方面之外,這種流通受到細胞內區室膜的可塑性影響,所述膜的可塑性本身直接與構成膜的磷脂(PL)的本性相關。特別是,已確認PL中飽和脂肪酸(SFA)的存在降低膜的流動性,而帶有不飽和脂肪酸(UFA)的PL形成流動性更高的膜。

在具有緩沖中性脂類(以脂類小滴(LD)形式儲存的甘油三酯(TG)或酯化的固醇(ES))形式的過量外源UFA的能力的細胞中,觀察帶油酸(Ole)的有益效果。在不具有這種能力的細胞中,過剩的外源油酸酯最終導致細胞內膜的增生,其通過引起細胞脅迫而觸發凋亡。

圖2:高等真核生物中的UPR途徑(Pineau&Ferreira,2010)。

圖3:油酸、OAG和LPA恢復脂中毒的酵母的生長。

A)油酸、OAG和LPA的分子結構。B)在濃度逐漸增加的油酸、OAG和LPA存在下,在SFA積累條件下生長的hem1Δ酵母的生長的恢復(3天后)。

圖4:OAG和LPA對不合成甘油三酯的細胞無毒。

將OAG、LPA或油酸的液滴(5μl)從所指明濃度的儲用溶液沉積在事先鋪有QM菌株的瓊脂培養基的表面上。3天后,在油酸的情況下可以觀察到生長抑制暈圈(不存在菌落)。然而,在LPA或OAG存在下沒有觀察到這些暈圈。

圖5:OAG和LPA在脂中毒的酵母中降低未折疊蛋白質響應(UPR)。

如Pineau等,(2009)所述,將帶有融合基因的質粒構建物導入到hem1Δ酵母菌株中,所述融合基因對應于置于含有4個UPR元件(UPRE)的人工啟動子控制之下的lacZ基因的編碼序列。在UPR誘導期間,轉錄因子Hac1p/XBP1p被激活并結合于融合基因的UPRE,導致lacZ基因的轉錄。由于lacZ編碼β–半乳糖苷酶,因此UPR誘導水平通過檢測相應的酶活性來測量。hem1Δ酵母菌株生長在誘導SFA積累并且沒有其他添加物的液體培養基或如所示增補有200μM油酸、OAG或LPA的同樣培養基中。

圖6:在飽和脂肪酸存在下,OAG通過降低UPR誘導水平來阻止胰腺β–細胞的凋亡。

如Dhayal&Morgan(2011)所述,在對照條件下或在飽和脂肪酸的外源來源(200μM棕櫚酸)存在下生長胰腺β–細胞BRIN–BD11,以便在添加或不添加OAG情況下產生脂中毒狀況。A)對于濃度逐漸提高的OAG,在不存在(對照)或存在棕櫚酸的情況下估算死細胞的比例。B)在存在或不存在OAG的情況下,還通過western印跡在各種不同條件下分析了eIF2α的磷酸化水平,并將其歸一化到總eIF2α。由于磷酸化水平與UPR強度相關,因此這個實驗顯示OAG降低由棕櫚酸積累誘導的UPR。

圖7:3–羥基–2,2–雙(羥甲基)丙基油酸酯和二縮甘露醇單油酸酯不誘導鈣動員。

將人上皮細胞CFBE用熒光鈣探針進行裝載,然后暴露于100μMOAG、3–羥基–2,2–雙(羥甲基)丙基油酸酯、二縮甘露醇單油酸酯或N,N–二乙醇油酰胺。然后記錄與細胞內鈣移動相關的熒光強度的變化(參見Vachel等,2013)。獲得的結果表明,3–羥基–2,2–雙(羥甲基)丙基油酸酯和二縮甘露醇單油酸酯與OAG相比對細胞鈣儲存的消耗具有非常弱的影響(即它們不誘導細胞的鈣動員),因此這些化合物具有非常有限的細胞毒性的風險。

圖8:在飽和脂肪酸存在下,3–羥基–2,2–雙(羥甲基)丙基油酸酯、二縮甘露醇單油酸酯和N,N–二乙醇油酰胺阻止胰腺β–細胞的凋亡。

如Dhayal&Morgan(2011)所述,在飽和脂肪酸的外源來源(200μM棕櫚酸)存在下生長胰腺β–細胞BRIN–BD11,以便產生脂中毒狀況,然后添加3–羥基–2,2–雙(羥甲基)丙基油酸酯、二縮甘露醇單油酸酯或N,N–二乙醇油酰胺。與圖6的數據合在一起,這些結果表明三種目標化合物阻止脂中毒誘導的胰腺β–細胞的死亡。

圖9:在哺乳動物胰腺β–細胞中,在脂中毒狀況下二縮甘露醇單油酸酯恢復胰島素原的成熟。

如Boslem等(2011)所述,在對照條件下或在400μM棕櫚酸的外源來源存在下(P)將胰腺β–細胞MIN6生長48小時,以便產生脂中毒狀況。在生長的最后24小時期間,如所述添加或不添加200μMOAG、LPA或二縮甘露醇單油酸酯。在這些條件下,對蛋白質樣品進行western印跡,得到的結果表明在脂中毒狀況下,只有二縮甘露醇單油酸酯恢復胰島素原向胰島素的成熟。

圖10:N,N–二乙醇油酰胺抵抗脂肪酶的水解活性。

將OAG(15μmol)和N,N–二乙醇油酰胺進行(+)或不進行(–)在37℃下暴露于10U脂肪酶30分鐘。在溫育后,從樣品提取脂類物質,然后通過薄層層析進行分離。目標分子物質被注明,并且結果表明與OAG不同,N,N–二乙醇油酰胺抵抗脂肪酶的水解。

實施例

A/酵母菌株和哺乳動物細胞系

表1中列出的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株被用于生長恢復的各個不同試驗,用于證實毒性,用于細胞磷脂的脂肪酸含量分析,并用于未折疊蛋白質響應(UPR)觸發的試驗。

也在大鼠胰腺β–細胞系BRIN–BD11中分析UPR的活化狀態和脂中毒誘導的細胞死亡。

此外,鈣動員試驗在人上皮細胞CFBE上進行,胰島素成熟實驗在小鼠胰腺β–細胞系MIN6上進行。

表1:所使用的酵母菌株

B/hem1Δ酵母的脂中毒

將帶有hem1Δ突變的菌株在好氧條件下,在振搖和28℃下生長在液體YPGA培養基(增補有80μg/mlδ–氨基乙酰丙酸(ALA)的YPG(1%酵母提取物(w/v),1%蛋白胨(w/v)和2%葡萄糖(w/v)))中。通過轉移到YPG+培養基(增補有80μg/ml麥角固醇的YPG,以補償在這種條件下獲得的固醇消耗),通過其合成依賴于血紅素(特別是Ole1p酶的輔基)的存在的不飽和脂肪酸(UFA)的消耗,造成由飽和脂肪酸(SFA)引起的脂中毒。脂中毒可以在固體YPG+培養基+2%瓊脂(w/v)上通過每cm2轉移3500個細胞(來自于YPGA中的預培養物的hem1Δ),或在液體培養基中通過接種2·106個細胞/mlYPG+來誘導。典型情況下,在轉移到YPG+培養基后7小時分析SFA脂中毒的效應。進而在用細胞接種后,在YPG+轉移培養基上(或其中)添加化合物后,相繼評估該化合物對抗SFA脂中毒的有害效應的能力。

C/由棕櫚酸引起的大鼠胰腺β–細胞的脂中毒

1)脂類試劑的制備:

將脂類物質制備在乙醇中,然后與牛血清白蛋白(BSA,首先剝除脂肪酸)通過在37℃溫育1小時進行復合。通過添加一倍體積乙醇,然后將整體加熱至70℃進行均質化,獲得棕櫚酸儲用溶液。在室溫下在100%乙醇中制備OAG和LPA溶液。對于哺乳動物細胞的溫育來說,培養基中最終的BSA和乙醇濃度分別保持在1%和0.5%(w/v)。

2)細胞存活性試驗:

將大鼠胰腺β–細胞系(BRIN–BD11)生長在含有11mM葡萄糖并增補有10%(v/v)胎牛血清(FCS)、2mML–谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的完全RPMI–1640培養基中。對于每個實驗,首先將細胞以0.5·105個細胞/ml的密度接種在6孔板中24小時。然后,將完全培養基用缺少FCS但含有所需濃度的與BSA復合的目標脂類試劑的等同物替換。然后,在對照條件下,使用相同量的BSA和乙醇。在溫育結束時,將所有細胞(死的和活的)收集并以300g離心5分鐘。然后將細胞團塊重懸浮在200μl培養基中,然后通過添加200μl20μg/ml的碘化丙啶(PI)在FACS緩沖液(磷酸鹽緩沖鹽水(PBS),2%(v/v)FCS,10mM疊氮鈉)中的溶液,用PI對死細胞(已失去其質膜完整性)的DNA進行染色。在冰上溫育10分鐘后,通過流式細胞術分析由此獲得的樣品。使用BeckmanCoulterEPICSXLMCL進行定量,使用FL3通道檢測嵌入到DNA中的PI的發射,并且使用EXPO32ADC軟件(AppliedCytometrySystems,V1.1build207)來進行分析。

3)Western印跡分析:

將BRIN–BD11細胞以0.5·105個細胞/ml的密度接種在T25培養瓶中24小時。正如上面指明的,然后將完全培養基用缺少FCS但含有目標脂類試劑的等同物替換。在溫育6小時后,使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液(20mMTris,150mMNaCl,1mMEDTA和1%(v/v)Triton–X)提取總蛋白。然后將這些蛋白質在12%Bis–TrisGels(Invitrogen)丙烯酰胺凝膠上進行電泳,隨后轉移到PVDF膜,然后使用稀釋到1/1000的抗磷酸化eIF2α抗體(CellSignaling(NewEnglandBiolabs))探測。接下來,將膜用緩沖液Re–BlotPlus–Strong(Millipore)剝脫,然后用稀釋至1/1000的抗總eIF2α抗體(CellSignaling(NewEnglandBiolabs))第二次探測。使用與QuantifyOne軟件相組合的Fluor–SMultiImager分析系統(BioradUKLtd),進行磷酸化或未磷酸化形式的eIF2α蛋白的相對豐度的密度測量分析。

D/胰島素成熟的監測(參見圖9)

以上面對BRIN–BD11細胞的脂中毒所描述的方式,將MIN6細胞系生長在增補有10%(v/v)胎牛血清(FCS)、15mMHEPES、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的完全DMEM–高葡萄糖培養基(6mM)中,并通過暴露于400μM與BSA(終濃度0.92%(w/v))偶聯的棕櫚酸48小時,在添加或不添加目標化合物的情況下誘導脂中毒(參見Boslem等,2011)。然后收集細胞并如上所述使用抗胰島素抗體進行western印跡,以便追蹤胰島素原向胰島素的成熟。

E/鈣動員試驗(參見圖7)

將人上皮細胞系CFBE在玻璃底培養皿上生長在增補有10%胎牛血清(FCS)、100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和0.5μg/ml嘌呤霉素的MEM+GlutaMAXTM–1培養基(αMEM;Invitrogen)中。首先將細胞用3μM熒光鈣探針Fluo–4–乙酰氧基甲基酯在室溫下裝載20分鐘。然后利用ZeissAxioObserverZ1倒置顯微鏡,使用250ms的激光刺激序列共4分鐘,通過獲取目標區域的熒光強度的變化來記錄鈣動員。然后使用CarlZeissAxioVisionRelease4.8.2軟件和相關的生理獲取模塊來解釋收集的數據。最后,通過用時間t時每個像素的強度(F)除以刺激之前所述像素的熒光強度(F0),將強度曲線歸一化。由此獲得的圖像((F–F0)/F0)使得可以獲得在整個記錄期間鈣強度/動員的曲線(參見Vachel等,2013)。

F/生長的恢復

1)化合物篩選:在誘導SFA脂中毒后(對于生長在固體培養基上的hem1Δ來說),將10mM的各種不同化合物在二甲基亞砜(DMSO)或乙醇(EtOH)中的溶液的5μl液滴沉積在瓊脂表面上。在28℃培養3天后,通過在所述化合物沉積位點處hem1Δ菌落暈圈的出現,來估算化合物對抗脂類誘導的細胞生長的停止的能力(參見Deguil等,2011)。

2)增殖動力學:與SFA脂中毒的誘導聯合(對于液體培養基中的hem1Δ來說),以200μM的初始濃度向培養物加入各種不同化合物。通過細胞密度的分光光度計測量,以定期的時間間隔(在觀察期間每小時)監測增殖。在600nm波長處,1個光密度單位(OD600nm)對應于2·107個細胞/ml。

G/毒性試驗

在好氧條件下,在振搖和28℃下,將野生型(WT)和四倍體突變(QM)菌株平行地生長在液體YPG培養基中,然后以每cm23500個細胞的密度接種YPG+2%瓊脂(w/v)。在如此轉移至固體培養基后,將1、10和100mM的各種不同化合物在DMSO或EtOH中的溶液的1μl液滴沉積在瓊脂表面上。也分開地沉積DMSO和EtOH以便評估這兩種溶劑的固有毒性。在28℃培養3天后,通過將沉積純溶劑所獲得的生長抑制暈圈直徑與沉積各種不同濃度的測試化合物獲得的生長抑制暈圈直徑進行比較,來評估測試的化合物的毒性。與WT菌株不同,QM菌株不能緩沖脂類小液滴中中性脂類(甘油三酯(TG)或酯化的固醇(ES))形式的過量外源油酸。因此,在對于WT菌株來說不存在毒性的情況下,對于QM菌株來說觀察到化合物的毒性表明該化合物被酵母視為游離脂肪酸的來源。

H/總脂類提取

從2·106個細胞/ml的初始細胞密度,將hem1Δ菌株在好氧條件下,在振搖和28℃下在液體培養基(YPGA、YPG+或YPG++200μM待測試化合物)中生長7小時。在培養結束時,收集108個細胞以便進行總脂類提取。在將細胞在4℃下懸浮在1ml蒸餾水中之后,加入500μl玻璃珠然后使整體在搖床中經歷3段20秒在5000rpm下的振搖(在3段中的每段之間將管保持在冰上)。向由此獲得的細胞裂解物補充珠子洗滌溶液(1ml),然后轉移到40ml玻璃管(CorexTM),隨后使用2:1(v/v)的甲醇:氯仿比例進行脂類提取。首先加入6ml甲醇,并將整體渦旋振蕩30秒,然后在65℃溫育15分鐘。一旦混合物冷卻至室溫,加入3ml氯仿,然后將整體再次渦旋振蕩30秒,隨后允許提取進行16小時。然后,將樣品以10000g離心12分鐘,隨后將上清液轉移到新的CorexTM管。在加入2ml氯仿、然后加入4ml蒸餾水后,將整體渦旋振蕩30秒,然后以3000g離心8分鐘。在除去得到的上層相后,將下層有機相收集在玻璃溶血管中。最后,在80℃和氮氣流下蒸發溶劑,以便獲得總細胞脂類樣品。

I/磷脂純化和質譜分析

將總細胞脂類樣品重懸浮在1ml二氯甲烷中,同時渦旋振蕩30秒。將整體沉積在用3ml甲醇、隨后用2ml二氯甲烷相繼預調制的二氧化硅柱(BONDELUT–SI,100mg1ml)上。然后,用2ml二氯甲烷,隨后用3ml丙酮相繼洗滌被柱保留的級分。最后,將2ml50:45:5(v/v/v)的氯仿/甲醇/水混合物沉積在柱上,并將由此洗脫的磷脂收集在玻璃溶血管中。在80℃和氮氣下蒸發溶劑,以便獲得細胞磷脂樣品。

在100μl混合物Mix-(2:1:1(v/v/v)的異丙醇/乙腈/水+1%(v/v)三乙胺)或混合物Mix+(2:1:1(v/v/v)的異丙醇/乙腈/水+1%(v/v)甲酸)中重懸浮后,通過電噴霧電離質譜術(ESI–MS)分別以負或正模式分析樣品,并使用得到的結果分析各種不同磷脂物質的脂肪酸含量。

J/UPR觸發試驗

從2·106個細胞/ml的初始細胞密度,將用質粒pPW344[2μURA34×UPRE–lacZ(Patil等,2004)]轉化的hem1Δ菌株在好氧條件下,在振搖和28℃下在液體培養基(YPGA、YPG或YPG+200μM待測試化合物)中生長7小時。在培養結束時,收集108個細胞以便定量由lacZ轉入基因的表達(在UPR激活的情況下)產生的β–半乳糖苷酶(β–gal)活性。首先,將細胞重懸浮在1.5mlZ–緩沖液(60mMNa2HPO4,40mMNaH2PO4,10mMKCl,1mMMgSO4和50mMβ–巰基乙醇;溶液處于pH7下)中,然后使用1/15的該懸液進行OD600nm測量。其次,向懸液增補100μl0.1%(v/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)和200μl氯仿,然后在兩個相繼的30秒時間段中進行渦旋振蕩。在傾析后,將400μl(體積V)由此獲得的溶液轉移到玻璃溶血管,然后增補600μlZ–緩沖液。然后加入200微升底物鄰硝基苯基–β–半乳糖苷(ONPG)在Z–緩沖液中的4mg/ml溶液,隨后將整體用渦旋振蕩器均質化,然后在30℃水浴中溫育以便起始反應。當整體具有淺黃色色彩時,在室溫下通過加入500μl1MNa2CO3將反應淬滅(在時間t時)。最后,在將樣品以800g離心5分鐘、然后將上清液收集在新的玻璃溶血管中之后,通過光譜測定法分別在420nm和550nm處測定反應產物(鄰硝基苯酚)和細胞碎片。對于每個樣品來說,使用公式U=(1000×[OD420nm–(1.75×OD550nm)])/(t×V×OD600nm)計算β–gal活性(U),其被表示為任意單位。

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