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作為免疫調節劑的環肽類化合物.pdf

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作為 免疫 調節劑 環肽 化合物
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摘要
申請專利號:

CN201480060344.X

申請日:

20140905

公開號:

CN105813640A

公開日:

20160727

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A61K31/38,A61K31/395,C07D273/00,C07D285/00 主分類號: A61K31/38,A61K31/395,C07D273/00,C07D285/00
申請人: 奧瑞基尼探索技術有限公司
發明人: 帕塔伊爾·戈文丹·奈爾·薩西庫瑪,穆拉里哈拉·拉馬錢德拉,西塔拉馬伊阿·塞提·蘇達山·納里馬德帕里
地址: 印度卡納塔克邦
優先權: 4010/CHE/2013
專利代理機構: 中科專利商標代理有限責任公司 代理人: 李新紅
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201480060344.X

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及作為治療劑的環肽類化合物,其能夠抑制程序性細胞死亡1(PD1)信號傳導通路。本發明還涉及治療劑的衍生物。本發明還包括所述治療劑和衍生物用于經由包括抑制由PD?1、PD?L1或PD?L2誘發的免疫抑制信號在內的免疫增強作用治療病癥的用途和使用它們的療法。

權利要求書

1.式(I)的化合物或其藥用鹽或立體異構體;其中,R是Ala、Ser、Thr或Leu的側鏈;R是Asp、Glu、Gln或Asn的側鏈;[Aaa]是選自Ser、Asp、Ala、Ile、Phe、Trp、Lys、Glu或Thr的氨基酸殘基;R是氫或烷基;R和R’各自獨立地表示氫或烷基;R和R’二者都表示氫;或一起表示氧代(=O)基團;R和R’二者都表示氫;或一起表示氧代(=O)基團;L是X選自CH、O或S;R是氫或烷基;m是選自1至3的整數;n是選自2至20的整數。2.根據權利要求1所述的化合物,其中式(I)的化合物是式(IA)的化合物:或其藥用鹽或立體異構體;其中,R是Ala、Ser、Thr或Leu的側鏈;R是Asp、Glu、Gln或Asn的側鏈;[Aaa]是選自Ser、Asp、Ala、Ile、Phe、Trp、Lys、Glu或Thr的氨基酸殘基;R是氫或烷基;R和R’各自獨立地表示氫或烷基;R和R’二者都表示氫;或一起表示氧代(=O)基團;R和R’二者都表示氫;或一起表示氧代(=O)基團。3.根據權利要求1至2中任一項所述的化合物,其中式(I)的化合物是式(IB)的化合物:或其藥用鹽或立體異構體;其中,R是Ala、Ser、Thr或Leu的側鏈;R是Asp、Glu、Gln或Asn的側鏈;[Aaa]是選自Ser、Asp、Ala、Ile、Phe、Trp、Lys、Glu或Thr的氨基酸殘基。4.根據權利要求1所述的化合物,其中式(I)的化合物是式(IC)的化合物:或其藥用鹽或立體異構體;其中,R是Ala、Ser、Thr或Leu的側鏈;R是Asp、Glu、Gln或Asn的側鏈;[Aaa]是選自Ser、Asp、Ala、Ile、Phe、Trp、Lys、Glu或Thr的氨基酸殘基。5.根據權利要求1所述的化合物,其中,R是Ser或Thr的側鏈;R是Asp、Asn或Glu的側鏈;[Aaa]是選自Ser或Thr的氨基酸殘基;R、R和R’獨立地是氫;R和R’二者一起表示氧代(=O)基團;R和R’二者一起表示氧代(=O)基團;L是-C(O)-(CH)-(X-CH-CH)-NH-;X是CH或O;m是選自1至3的整數;n是選自2至20的整數;或其藥用鹽或立體異構體。6.根據權利要求1至2中任一項所述的化合物,其中R是C烷基。7.根據權利要求1、2或7中任一項所述的化合物,其中R’是C烷基。8.一種化合物,其選自由以下各項組成的組:或其藥用鹽或立體異構體。9.一種藥物組合物,其包含根據權利要求1至8中任一項所述的至少一種化合物或其藥用鹽或立體異構體、以及藥用載體或賦形劑。10.根據權利要求9所述的藥物組合物,其還包含至少一種抗癌劑、化療劑或抗增殖化合物。11.根據權利要求1至8中任一項所述的化合物、或其藥用鹽或立體異構體,其被用作藥物。12.根據權利要求1至8中任一項所述的化合物或其藥用鹽或立體異構體,其被用作用于治療癌癥或感染性疾病的藥物。13.根據權利要求12所述的用于所述用途的化合物,其中所述癌癥選自由以下各項組成的組:乳腺癌、結腸癌、肺癌、黑素瘤、前列腺癌和腎癌、骨癌、頭或頸癌、胰腺癌、皮膚癌、皮膚或眼內惡性黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區域癌、胃癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌癥、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病、包括急性髓細胞白血病、慢性髓細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、兒童實體瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)腫瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊柱腫瘤、腦干膠質瘤、垂體腺瘤、卡波濟氏肉瘤、表皮樣癌、鱗狀上皮細胞癌、T細胞淋巴瘤、環境誘發的癌癥、包括石棉誘發的癌癥、和所述癌癥的組合。14.根據權利要求12所述的用于所述用途的化合物,其中所述癌癥是乳腺癌、結腸癌、肺癌、黑素瘤、前列腺癌或腎癌。15.根據權利要求12所述的用于所述用途的化合物,其中所述感染性疾病是細菌感染性疾病、病毒感染性疾病或真菌感染性疾病。

說明書

本申請要求2013年9月6日提交的印度臨時申請號4010/CHE/2013的權益;其通過引用結合到此。

技術領域

本發明涉及環肽類化合物,其在治療上用作免疫調節劑。本發明還涉及包含作為治療劑的所述環肽類化合物的藥物組合物。

發明背景

程序性細胞死亡-1(PD-1)是CD28超家族的成員,其與它的兩種配體,PD-L1或PD-L2相互作用時遞送負性信號。PD-1和其配體廣泛表達并且與其他CD28成員相比,在T細胞活化和耐受方面發揮更寬范圍的免疫調節作用。PD-1和其配體參與減弱感染性免疫和腫瘤免疫,并且促進慢性感染和腫瘤進展。PD-1和其配體的生物學重要性提示了PD-1通路的操作對各種人類疾病的治療可能性(ArielPedoeem等人,CurrTopMicrobiolImmunol.(2011);350:17-37)。

T細胞活化和功能失調依賴于直接和調節的受體。基于它們的功能結果,共信號轉導分子可以分為共刺激劑和共抑制劑,其正面和負面控制T細胞應答的啟動、生長、分化和功能成熟(LiShi,等人,JournalofHematology&Oncology2013,6:74)。

阻斷程序性細胞死亡蛋白-1(PD-1)免疫檢查點通路的治療性抗體阻止T細胞下調并且促進針對癌癥的免疫應答。多種PD-1通路抑制劑在進行中的臨床實驗的各個階段顯示出強烈的活性(RDHarvey,ClinicalPharmacology&Therapeutics(2014);962,214-223)。

程序性死亡-1(PD-1)是T細胞主要表達的共受體。PD-1與其配體,PD-L1或PD-L2的結合,對于免疫系統的生理調節至關重要。PD-1信號傳導通路的主要功能作用是抑制自反應性T細胞,其用于保護免于自身免疫性疾病。因此PD-1通路的消除可以導致免疫耐受的破壞,其可以最終導致發展出病理性自身免疫。相反,腫瘤細胞有時可以指定PD-1通路逃脫免疫監督機制。因此,阻斷PD-1通路已經變為癌癥治療的有吸引力的靶點。目前的方法包括六種藥劑,其是靶向PD-1和PD-L1的中和抗體或融合蛋白。多于四十個臨床試驗在進行中,以更好地定義PD-1阻斷在多種腫瘤類型中的作用(Hyun-TakJin等人,ClinicalImmunology(Amsterdam,Netherlands)(2014),153(1),145-152)。

國際申請WO01/14557、WO02/079499、WO2002/086083、WO03/042402、WO2004/004771、WO2004/056875、WO2006121168、WO2008156712、WO2010077634、WO2011066389、WO2014055897、WO2014059173、WO2014100079和美國專利US08735553報道了PD-1或PD-L1抑制性抗體或融合蛋白。

此外,國際申請WO2011161699、WO2012/168944、WO2013144704和WO2013132317報道了能夠壓制和/或抑制程序性細胞死亡1(PD1)信號傳導通路的肽或肽類化合物。

然而,對PD-1通路的更有效、更好和/或選擇性的免疫調節劑,仍然存在需要。本發明提供環肽類化合物,這些化合物能夠壓制和/或抑制程序性細胞死亡1(PD1)信號傳導通路。

發明概述

根據本發明,提供環肽類化合物或其立體異構體或其藥用鹽,其能夠壓制和/或抑制程序性細胞死亡1(PD1)信號傳導通路。

在一個方面,本發明提供式(I)的環肽類化合物:

或其藥用鹽或立體異構體;

其中,

R1是Ala、Ser、Thr或Leu的側鏈;

R2是Asp、Glu、Gln或Asn的側鏈;

[Aaa]是選自Ser、Asp、Ala、Ile、Phe、Trp、Lys、Glu或Thr的氨基酸殘基;

R3是氫或烷基;

R4和R4’各自獨立地表示氫或烷基;

Ra和Ra’二者都表示氫;或一起表示氧代(=O)基團;

Rb和Rb’二者都表示氫;或一起表示氧代(=O)基團;

L是

X選自CH2、O或S;

R5是氫或烷基;

m是選自1至3的整數;

n是選自2至20的整數。

在本發明的進一步方面,其涉及包含式(I)的化合物或藥用鹽或立體異構體的藥物組合物和用于制備其的方法。

在本發明的再其他方面,其提供式(I)的環肽類化合物和它們的鹽及其立體異構體的用途,它們能夠壓制和/或抑制程序性細胞死亡1(PD1)信號傳導通路。

發明詳述

本發明提供作為治療劑的環肽類化合物,用于經由包括抑制由PD-1、PD-L1或PD-L2誘發的免疫抑制信號的免疫增強作用治療,并且提供使用它們的療法。

通過解釋本發明的方式,并且不是通過限制本發明的方式,提供各個實施方案。實際上,對于本領域技術人員而言將顯而易見的是,在本發明中,在不偏離本發明的范圍和精神的情況下,可以進行各種改進和變化。例如,作為一個實施方案的部分說明或描述的特征可以用于另一實施方案以獲得更進一步的實施方案。因此,意在本發明覆蓋這樣的改進和變化,如在所附權利要求和其對等物的范圍內。本發明的其他目標、特征和方面在以下詳述中公開,或從以下詳述顯而易見。本領域技術人員要理解,本討論僅是示例性實施方案的描述,并且不理解為限制本發明的較寬范圍。

在一實施方案中,本發明涉及式(I)的化合物

或其立體異構體或藥用鹽;

其中;

R1是Ala、Ser、Thr或Leu的側鏈;

R2是Asp、Glu、Gln或Asn的側鏈;

[Aaa]是選自Ser、Asp、Ala、Ile、Phe、Trp、Lys、Glu或Thr的氨基酸殘基;

R3是氫或烷基;

R4和R4’各自獨立地表示氫或烷基;

Ra和Ra’二者都表示氫;或一起表示氧代(=O)基團;

Rb和Rb’二者都表示氫;或一起表示氧代(=O)基團;

L是

X選自CH2、O或S;

R5是氫或烷基;

m是選自1至3的整數;

n是選自2至20的整數。

在式(I)的化合物的一個特定實施方案中,本發明包含特定系列的式(IA)的化合物:

其中,

R1是Ala、Ser、Thr或Leu的側鏈;

R2是Asp、Glu、Gln或Asn的側鏈;

[Aaa]是選自Ser、Asp、Ala、Ile、Phe、Trp、Lys、Glu或Thr的氨基酸殘基;

R3是氫或烷基;

R4和R4’各自獨立地表示氫或烷基;

Ra和Ra’二者都表示氫;或一起表示氧代(=O)基團;

Rb和Rb’二者都表示氫;或一起表示氧代(=O)基團。

在式(I)的化合物的一個特定實施方案中,本發明包含特定系列的式(IB)的化合物:

其中,

R1是Ala、Ser、Thr或Leu的側鏈;

R2是Asp、Glu、Gln或Asn的側鏈;

[Aaa]是選自Ser、Asp、Ala、Ile、Phe、Trp、Lys、Glu或Thr的氨基酸殘基。

在式(I)的化合物的另一實施方案中,本發明包含特定系列的式(IC)的化合物:

其中,

R1是Ala、Ser、Thr或Leu的側鏈;

R2是Asp、Glu、Gln或Asn的側鏈;

[Aaa]是選自Ser、Asp、Ala、Ile、Phe、Trp、Lys、Glu或Thr的氨基酸殘基。

在另一實施方案中,本發明提供式(I)的化合物,其中,

R1是Ser或Thr的側鏈;

R2是Asp、Asn或Glu的側鏈;

[Aaa]是選自Ser或Thr的氨基酸殘基;

R3、R4和R4’獨立地是氫;

Ra和Ra’二者一起表示氧代(=O)基團;

Rb和Rb’二者一起表示氧代(=O)基團;

L是-c(o)-(CH2)m-(X-CH2-CH2)n-NH-;

X是CH2或O;

m是選自1至3的整數;

n是選自2至20的整數;

或其藥用鹽或立體異構體。

以下實施方案說明本發明并且不意在將權利要求限制于所舉例說明的具體實施方案。

在一個實施方案中,具體提供的是式(I)的化合物,其中L是其中X、n和R5與式(I)中所定義的相同。

還在另一實施方案中,具體提供的是式(I)的化合物,其中L是其中m、n和R5與式(I)中所定義的相同。

還在另一實施方案中,具體提供的是式(I)的化合物,其中L是-C(O)-(CH2)m-(X-CH2-CH2)n-NH-;其中m、n和X與式(I)中所定義的相同。

還在另一實施方案中,具體提供的是式(I)的化合物,其中L是其中m、X和R5與式(I)中所定義的相同。

還在另一實施方案中,具體提供的是式(I)的化合物,其中L是-C(O)-CH2-(OCH2CH2)2-NH-。

在另一實施方案中,具體提供的是式(I)、(IA)、(IB)和(IC)的化合物,其中R1是Ser的側鏈。

還在另一實施方案中,具體提供的是式(I)、(IA)、(IB)和(IC)的化合物,其中R1是Thr的側鏈。

還在另一實施方案中,具體提供的是式(I)、(IA)和(IB)的化合物,其中R2是Asp的側鏈。

還在另一實施方案中,具體提供的是式(I)、(IA)、(IB)和(IC)的化合物,其中R2是Asn的側鏈。

還在另一實施方案中,具體提供的是式(I)、(IA)、(IB)和(IC)的化合物,其中R2是Glu的側鏈。

還在另一實施方案中,具體提供的是式(I)、(IA)、(IB)和(IC)的化合物,其中[Aaa]是Ser。

還在另一實施方案中,具體提供的是式(I)、(IA)、(IB)和(IC)的化合物,其中[Aaa]是Thr。

還在另一實施方案中,具體提供的是式(I)、(IA)和(IB)的化合物,其中[Aaa]是Asp。

還在另一實施方案中,具體提供的是式(I)、(IA)和(IB)的化合物,其中[Aaa]是Lys或Ile。

還在另一實施方案中,具體提供的是式(I)、(IA)和(IB)的化合物,其中一個、多個或全部氨基酸是D氨基酸。

還在另一實施方案中,具體提供的是式(I)和(IA)的化合物,其中R4’是C1-5烷基如甲基。

還在另一實施方案中,具體提供的是式(I)和(IA)的化合物,其中R4是C1-5烷基如甲基。

還在另一實施方案中,具體提供的是式(I)和(IA)的化合物,其中Ra和Ra’二者都是氫。

還在另一實施方案中,具體提供的是式(I)和(IA)的化合物,其中Rb和Rb’二者都是氫。

還在另一實施方案中,具體提供的是式(I)和(IA)的化合物,其中Ra和Ra’二者一起表示氧代(=O)基團。

還在另一實施方案中,具體提供的是式(I)和(IA)的化合物,其中Rb和Rb’二者一起表示氧代(=O)基團。

還在另一實施方案中,具體提供的是式(I)和(IA)的化合物,其中R4和R4’二者都是氫。

還在另一實施方案中,具體提供的是式(I)和(IA)的化合物,其中R3是氫。

在一個實施方案中,式(I)的具體化合物非任何限制性地列舉在表(1)中:

表1

或其藥用鹽或其立體異構體。

配制本發明中公開的化合物用于藥學施用。

在一實施方案中,本發明提供藥物組合物,其包含根據權利要求1至8中任一項所述的至少一種化合物或其藥用鹽或立體異構體,和藥用載體或賦形劑。

在一實施方案中,所述藥物組合物還包含抗癌劑、化療劑、或抗增殖化合物中的至少一種。

在一實施方案中,本發明提供本發明所公開的化合物,其用作藥物。

在一實施方案中,本發明提供本發明所公開的化合物,其用作治療癌癥的藥物。

在一實施方案中,本發明提供本發明所公開的化合物,其用作用于治療細菌感染性疾病、病毒感染性疾病或真菌感染性疾病的藥物。

在一實施方案中,本發明提供本發明所公開的化合物,其用于制備藥物,所述藥物用于治療乳腺癌、結腸癌、肺癌、黑素瘤、前列腺癌和腎癌、骨癌、頭或頸癌、胰腺癌、皮膚癌、皮膚或眼內惡性黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區域癌、胃癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金病(Hodgkin’sDisease)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’slymphoma)、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌癥、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病(包括急性髓細胞白血病、慢性髓細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病)、兒童實體瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)腫瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊柱腫瘤、腦干膠質瘤、垂體腺瘤、卡波濟氏肉瘤、表皮樣癌、鱗狀上皮細胞癌、T細胞淋巴瘤、環境誘發的癌癥(包括石棉誘發的癌癥)、和所述癌癥的組合。

在一實施方案中,本發明提供本發明所公開的化合物,其用于治療癌癥。

在一實施方案中,本發明提供本發明所公開的化合物,其用于治療細菌感染性疾病、病毒感染性疾病或真菌感染性疾病。

在一實施方案中,本發明提供治療癌癥的方法,其中所述方法包括向需要其的受治療者施用有效量的本發明的化合物。

在一實施方案中,本發明提供抑制腫瘤細胞生長和/或轉移的方法,其通過向需要其的受治療者施用有效量的本發明的化合物進行。

所述腫瘤細胞包括癌癥比如但不限于黑素瘤、腎癌、前列腺癌、乳腺癌、結腸癌和肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭或頸癌、皮膚或眼內惡性黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區域癌、胃癌、睪丸癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌癥、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病(包括急性髓細胞白血病、慢性髓細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病)、兒童實體瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)腫瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊柱腫瘤、腦干膠質瘤、垂體腺瘤、卡波濟氏肉瘤、表皮樣癌、鱗狀上皮細胞癌、T細胞淋巴瘤、環境誘發的癌癥(包括石棉誘發的癌癥)、和所述癌癥的組合。

本發明的進一步另一實施方案提供治療感染的方法,所述感染經由抑制PD-1、PD-L1或PD-L2所誘發的免疫抑制信號引起的免疫增強作用,其中所述方法包括向需要其的受治療者施用有效量的本發明的化合物。

感染性疾病包括但不限于HIV、流感、皰疹、賈第蟲、瘧疾、利什曼原蟲、由肝炎病毒(A、B、&C)導致的致病感染、皰疹病毒(例如,VZV、HSV-I、HAV-6、HSV-II、和CMV、EB(EpsteinBarr)病毒)、腺病毒、流感病毒、蟲媒病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞體病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風疹病毒、細小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革熱病毒、乳頭瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰質炎病毒、狂犬病毒、JC病毒和蟲媒病毒腦炎病毒、細菌衣原體導致的致病感染、立克次體細菌、分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌(pneumonococci)、腦膜炎球菌和conococci、克雷白氏桿菌、變形桿菌、沙雷氏菌、假單胞菌、大腸桿菌、軍團桿菌、白喉、沙門氏菌、桿菌、霍亂、破傷風、肉毒中毒、炭疽、鼠疫、細螺旋體病、和萊姆病細菌,以下真菌引起的致病感染:假絲酵母(白色假絲酵母、克魯斯假絲酵母(krusei)、光滑假絲酵母(glabrata)、熱帶假絲酵母(tropicalis)等)、新型隱球菌、曲霉屬(煙曲霉(fumigatus)、黑曲霉(niger)等)、毛霉屬(毛霉菌、腐化米霉菌、根霉(rhizophus))、申克孢子絲菌、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis)和莢膜組織胞漿菌(Histoplasmacapsulatum),和由以下寄生蟲導致的致病感染:痢疾內變形蟲(Entamoebahistolytica)、結腸小袋蟲(Balantidiumcoli)、福納氏蟲(Naegleriafowleri)、棘變形蟲(Acanthamoebasp.)、吸吮賈第蟲(Girdialambia)、隱孢子蟲(Cryptosporidiumsp.)、卡氏肺囊蟲(Pneumocystiscarinii)、間日瘧原蟲(Plasmodiumvivax)、果氏巴貝蟲(Babesiamicroti)、布魯斯錐蟲(Trypanosomabrucei)、克魯斯錐蟲(Trypanosomacruzi)、多氏利什曼原蟲(Leishmaniadonovani)、鼠弓漿蟲(Toxoplasmagondi)、巴西日圓線蟲(Nippostrongylusbrasiliensis)。

本發明的化合物可以用作單個藥物或作為藥物組合物,其中將所述化合物與不同藥用材料混合。

藥物組合物通常通過口服或吸入途徑施用,但可以通過腸胃外施用途徑施用。在本發明的實踐中,組合物可以例如通過口服、靜脈輸注、外用、腹膜內、膀胱內或鞘內施用。腸胃外施用的實例包括但不限于關節內(在關節中)、靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內、和皮下途徑,包括水性和非水性的等滲無菌注射液,其可以含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使得制劑與預期接受者的血液等滲的溶質,以及水性和非水性無菌懸浮液(其可以包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑、和防腐劑)。口服施用、腸胃外施用、皮下施用和靜脈施用是優選的施用方法。

本發明的化合物的劑量根據年齡、重量、癥狀、療效、劑量給藥方案和/或治療次數而變化。通常,在成人的情況下,它們可以通過口服或吸入途徑,以1mg至100mg/次的量,數天一次、3天一次、2天一次、一天一次、一天多次施用,或通過口服或吸入的途徑一天連續施用1至24小時。因為劑量受各種條件影響,小于上述劑量的量有時可以足夠好地起作用,或在一些情況下可以需要較高劑量。

本發明的化合物可以與其他藥物聯合施用,以用于(1)本發明的預防性和/或治療性藥物的預防和/或治療功效的補充和/或增強,(2)本發明的預防性和/或治療性藥物的動力學、吸收改善、劑量減少,和/或(3)本發明的預防性和/或治療性藥物的副作用的減少。

包含本發明的化合物和其他藥物的伴隨藥物(concomitantmedicine)可以作為其中在單個制劑中含有兩種成分的組合制劑施用,或以分開的制劑施用。通過分開的制劑施用包括同時施用和間隔一些時間施用。在間隔一些時間施用的情況下,可以首先施用本發明的化合物,接著施用另一藥物,或可以首先施用另一藥物,然后施用本發明的化合物。各個藥物的施用方法可以相同或不同。

基于已經在臨床使用的劑量,可以適當選擇其他藥物的劑量。可以根據要施用的受治療者的年齡和體重、施用方法、施用時間、要治療的病癥、癥狀和其組合適當選擇本發明的化合物和其他藥物的復合比例。例如,基于1質量份的本發明的化合物,其他藥物可以以0.01至100質量份的量使用。其他藥物可以是適當比例的兩種或更多種任意藥物的組合。基于上述機制,補充和/或增強本發明的化合物的預防性和/或治療性功效的其他藥物不僅包括已經發現的那些,而且包括未來將要發現的那些。

該伴隨使用發揮預防性和/或治療性作用所針對的疾病不特別限制。伴隨藥物可以用于任何疾病,只要其補充和/或增強本發明的化合物的預防性和/或治療性功效即可。

本發明的化合物可以與現有化療劑同時使用或以混合形式使用。化療劑的實例包括烷基化劑、亞硝基脲劑、抗代謝物、抗癌抗體、植物來源的生物堿、拓撲異構酶抑制劑、激素藥物、激素拮抗劑、芳香酶抑制劑、P-糖蛋白抑制劑、鉑配合物衍生物、其他免疫治療性藥物和其他抗癌藥物。此外,其可以與癌癥治療輔助劑,如白細胞減少癥(嗜中性白血球減少癥)治療藥物、血小板減少癥治療藥物、止吐和癌癥疼痛干預藥物,同時使用或以混合形式一起使用。

在一實施方案中,本發明的一種或多種化合物可以與其他免疫調節劑和/或增效劑同時或以混合形式一起使用。免疫調節劑的實例包括各種細胞因子、疫苗和佐劑。刺激免疫應答的這些細胞因子、疫苗和佐劑的實例包括但不限于GM-CSF,M-CSF,G-CSF,干擾素-α、β或γ,IL-1,IL-2,IL-3,IL-12,Poly(I:C)和CpG。

在另一個實施方案中,增效劑包括環磷酰胺和環磷酰胺的類似物,抗-TGFβ和伊馬替尼(Imatinib)(Gleevac),有絲分裂抑制劑,如紫杉醇,舒尼替尼(Sunitinib)(Sutent)或其他抗血管生成劑,芳香酶抑制劑,如來曲唑,A2a腺苷受體(A2AR)拮抗劑,血管生成抑制劑,蒽環類抗生素,奧沙利鉑(oxaliplatin),阿霉素(doxorubicin),TLR4拮抗劑,和IL-18拮抗劑。

除非另有限定,本文使用的所有技術和科學術語具有與本文中的主題術語的領域中的通常所理解的相同的意義。如本文中所使用的,提供以下定義以幫助理解本發明。

如本文中所使用的術語″烷基″是指在骨架中包括單獨碳和氫原子,不含有不飽和性,具有一至二十個碳原子(即,C1-20烷基)或一至十個碳原子(即,C1-10烷基)或一至五個碳原子(即,C1-5烷基),并且其通過單鍵連接于分子的其余部分的烴鏈基,例如,包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、異戊基或新戊基。除非有相反陳述或列舉,本文所描述和要求的所有烷基可以是直鏈或支鏈、取代或未取代的。

如本文中所使用的,術語“氨基酸”是指在α碳具有L或D立體化學的氨基酸。

如本文中所使用的,術語‘一種或多種化合物’是指本發明中公開的化合物。

如本文中所使用的,術語“包含(comprise)”或“包含(comprising)”通常以包括的意義使用,即允許存在一個或多個特征或成分。

如本文中所使用的,術語“包括(including)”以及其他形式,如“包括(include)”,“包括(includes)”,和“包括(included)”不受限制。

采用“藥用鹽”意為包括式(I)的化合物的其一種鹽的形式的活性成分,尤其是如果與之前使用的活性成分的游離形式或活性成分的任何其他鹽形式相比,該鹽形式賦予該活性成分改善的藥物代謝動力學性質。活性成分藥用鹽形式還可以首次為該活性成分提供其之前不具有的所需的藥物代謝動力學性質,并且可以甚至就其在體內的治療功效而言對該活性成分的藥物代謝動力學具有積極影響。

″藥用″意為其可以用于制備通常安全、無毒的、并且既不是生物學上不希望的也不是其他方面不希望的藥物組合物,并且包括其適于獸用以及人藥用。

術語“立體異構體”是指式(I)的化合物的任何對映異構體、非對映異構體或幾何異構體(不論它們在何處具有手性或它們何時帶有一個或多個雙鍵)。當式(I)的化合物和相關分子式是手性時,它們可以以外消旋或以光學活性形式存在。因為根據本發明的化合物的外消旋物或立體異構體的藥學活性可能不同,所以可能希望使用對映異構體。在這些情況下,可以通過本領域技術人員已知的化學或物理方法將終產物或甚至中間體分離為對映異構化合物或甚至以原樣在合成中使用。在外消旋胺的情況下,非對映異構體通過與光學活性拆分劑反應從所述混合物形成。適當的拆分劑的實例是光學活性酸如R和S形式的酒石酸、二乙酰基酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、扁桃酸、蘋果酸、乳酸、合適的N-保護的氨基酸(例如N-苯甲酰基脯氨酸或N-苯磺酰基脯氨酸),或各種光學活性樟腦磺酸。此外有利的是在光學活性拆分劑(例如固定在硅膠上的二硝基苯甲酰基苯基甘氨酸,三乙酸纖維素或碳水化合物的其他衍生物或手性衍生的甲基丙烯酸聚合物)的幫助下的色譜對映異構體拆分。

術語″受治療者″包括哺乳動物(特別是人)和其他動物,如馴養動物(例如,家庭寵物,包括貓和狗)和非馴養動物(如野生動物)。

“治療有效量”或“有效量”是指本發明的一種或多種化合物(i)治療或預防特定疾病、病癥或綜合征(ii)減輕、改善或消除特定疾病、病癥或綜合征的一個或多個癥狀或(iii)阻止或延遲本文所述的特定疾病、病癥或綜合征的一個或多個癥狀的開始的足夠量。在癌癥的情況下,治療有效量的藥物可以減少癌細胞的數量;降低癌尺寸;抑制(即,減慢到一定程度或備選地終止)癌細胞浸潤入周圍器官;壓制(即,減慢到一定程度或備選地終止)腫瘤轉移;一定程度上抑制腫瘤生長;和/或一定程度上緩解與癌癥相關的一個或多個癥狀。在感染性疾病狀態的情況下,治療有效量是足以降低或緩解感染性疾病(由細菌、病毒和真菌引起的感染癥狀)的量。

天然存在氨基酸在全文中均由下表2中指出的常規三字母縮寫標識:

表2

名稱 3-字母編碼 名稱 3-字母編碼 丙氨酸 Ala 亮氨酸 Leu 天冬酰胺 Asn 賴氨酸 Lys 天冬氨酸 Asp 苯丙氨酸 Phe 谷氨酸 Glu 絲氨酸 Ser 谷氨酰胺 Gln 蘇氨酸 Thr 異亮氨酸 Ile 色氨酸 Trp

整個說明書中使用的縮寫可以歸納在下文中,其具有其特定意義。

℃(攝氏度);δ(delta);%(百分數);鹽水(NaCl溶液);bs或brs(寬單重峰);Bzl(芐基);Cbz(羧基芐基);Cbz-Cl(氯甲酸芐酯);CH2Cl2/DCM(二氯甲烷);Cs2CO3(碳酸銫);DMF(二甲基甲酰胺);DMSO(二甲亞砜);DIPEA/DIEA(N,N-二異丙基乙胺);DMSO-d6(氘化DMSO);d(雙重峰);EtOAc(乙酸乙酯);Et2NH(二乙胺);Fmoc(芴基甲氧基羰基);Fmoc-Cl(芴基甲氧基碳酰氯)g或gr(克);H或H2(氫);H2O(水);HOBt/HOBT(1-羥基苯丙三唑);HCl(鹽酸);h或hr(小時);HATU(2-(1H-7-氮雜苯并三唑-1-y1)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸甲銨);Hz(赫茲);HPLC(高效液相色譜);LCMS(液相色譜質譜);MeOH/CH3OH(甲醇);mmol(毫摩);M(Molar);μl/μL(微升);mL(毫升);mg(毫克);min(分鐘);m(多重峰);mm(毫米);MHz(兆赫);MS(ES)(質譜-電噴霧);min(分鐘);Na(鈉);NaOBut(叔丁醇鈉);NH2NH2.H2O(水合肼);Na2SO4(硫酸鈉);N2(氮);NMR(核磁共振譜);NaHCO3(碳酸氫鈉);Pd-C(披鈀碳);10%Pd/C(10%鈀活化的碳);Pd(OH)2(氫氧化鈀);PD-L1(程序性死亡-配體1);PD-L2(程序性細胞死亡1配體2);制備型HPLC/制備型HPLC(制備型高效液相色譜);PyBOP(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基六氟磷酸鹽);RT/rt(室溫);S(單重峰);tBu/tBu(叔丁基)TEA/Et3N(三乙胺);TFA(三氟乙酸);TLC(薄層色譜);THF(四氫呋喃);TFA/CF3COOH(三氟乙酸);t(三重峰);tR=(保留時間),等。

實驗

本發明的一個實施方案提供使用適當材料的根據以下實施例的式(I)的化合物的制備。本領域技術人員將理解,以下制備程序的條件和方法的已知改變可以用于制備這些化合物。此外,通過詳細描述的步驟,本領域技術人員可以制備本發明的其他化合物。

起始材料通常從商業來源,比如從美國或德國的Sigma-Aldrich;美國的Chem-Impex;中國的G.L.Biochem和印度的Spectrochem獲得。

化合物的純化和表征

分析型HPLC方法:使用ZICHILIC200A°柱(4.6mm×250mm,5μm)進行分析型HPLC,流速:1.0mL/min。使用的洗脫條件是:緩沖液A:5mmol乙酸氨,緩沖液B:乙腈,用90%緩沖液B平衡柱,并且在30min期間內用90%至40%緩沖液B梯度洗脫。

制備型HPLC方法A:使用ZICHILIC200A°柱(21.2mm×150mm,5μm)通過制備型HPLC純化粗制材料。使用的洗脫條件是洗脫劑:A:5mmol乙酸氨B:乙腈,流速:18mL/分鐘。化合物通過以20mL/min流速的梯度洗脫0-3min=90%緩沖液B,3-20min=90-40%緩沖液B進行洗脫。

制備型HPLC方法B:使用ZICHILIC200A°柱(10mm×250mm,5μm),流速:5.0mL/min進行制備型HPLC。使用的洗脫條件是:緩沖液A:5mmol乙酸銨,緩沖液B:乙腈,用90%緩沖液B平衡柱并且在20min內用90%至40%緩沖液B梯度洗脫。

利用具有G1315BDAD的Agilent1100系列HPLC,使用MercuryMS柱或利用具有G1315BDAD的Agilent1100系列HPLC的AgilentLC/MSDVL單四極(singlequad),使用MercuryMS柱或使用具有SPD-20ADAD的ProminenceUFLC系統的ShimadzuLCMS2020單四極,在AP12000LC/MS/MS三聯四極(triplequad)(應用生物系統(Appliedbiosystems))進行LCMS。

實施例1:化合物1的合成

步驟1a:

將氫氧化鈉(12.2g,305mmol)和Cbz-Cl(12.5g,73mmol)加入至化合物1a(10.0g,61mmol)在水(100mL)中的溶液中,并且在室溫攪拌3h。反應的完成通過TLC分析確認。將反應物料在檸檬酸溶液和乙酸乙酯之間分開。將有機層用水、鹽水洗滌,經Na2SO4干燥并且在減壓下蒸發,獲得11g的化合物1b(收率:61.1%)。LCMS:298.0(M+H)+。

步驟1b:

將DIPEA(3.5g,26.8mmol)加入至化合物1b(4.0g,13.4mmol)和HATU(5.6g,14.7mmol)在DMF(50mL)中的攪拌溶液中并將其在室溫另外攪拌5分鐘。向上述反應混合物中緩慢加入L-Ser(tBu)-OMe·HCl(3.5g,20.1mmol)并且在室溫攪拌12h。反應的完成通過TLC分析確認。將反應混合物用冰猝滅,將沉淀的固體過濾并用CH2Cl2重結晶,獲得6g的化合物1c,LCMS:454.8(M+H)+。

步驟1c:

將99%水合肼溶液(10mL)緩慢加入至化合物1c(6g)在甲醇(50mL)中的攪拌溶液中,并且在室溫攪拌2h。反應的完成通過TLC確認。在減壓下蒸發反應混合物,得到5.8g的化合物1d。LCMS:455.0(M+H)+。

步驟1d:

將DIPEA(3.3g,25.4mmol)緩慢加入至化合物1d(5.8g,12.7mmol),HATU(5.8g,15.2mmol)在DMF(50mL)中的攪拌溶液中,并且將其在室溫攪拌5分鐘。進一步將Fmoc-L-Asn-OH(4.9g,14.0mmol)加入至反應混合物中并且在室溫攪拌12h。反應的完成通過TLC分析確認。然后將反應混合物用冰猝滅,過濾沉淀的固體并用CH2Cl2重結晶,獲得5.9g的化合物1e,LCMS:791.0(M+H)+。

步驟1e:

使用二乙胺(60mL)將化合物1e[(5.9g,在CH2Cl2(60mL)中]的Fmoc基團脫保護并且反應的完成通過TLC分析確認。在減壓下蒸發反應混合物,得到1.6g的化合物1f。LCMS:568.8(M+H)+。

步驟1f:

將化合物1l(1.3g,3.0mmol)和化合物1f(1.60g,2.8mmol)溶解在THF(10mL)中并在室溫攪拌。通過向上述反應混合物中加入三乙胺(0.57g,5.6mmol)引發偶聯并且讓反應在室溫攪拌12h。反應的完成通過TLC分析確認。將有機層用NaHCO3、檸檬酸溶液、鹽水洗滌,經Na2SO4干燥并且在減壓下蒸發,獲得0.45g的化合物1g。

步驟1g:

在室溫,使用氫氧化鈀(0.5g)在甲醇中對化合物1g(0.45g)進行1h的Cbz基團和芐酯脫保護。反應的完成通過TLC分析確認。通過床過濾去除氫氧化鈀并且將濾液在減壓下蒸發,獲得0.34g的化合物1h。LCMS:636.0(M+H)+。

步驟1h:

使用HOBT(0.06g,0.47mmol)和PyBOP(0.24g,0.47mmol)在THF(50mL)中進行化合物1h(0.1g,0.15mmol)的環化。通過緩慢加入DIPEA(0.06g,0.47mmol)引發反應并在室溫進一步攪拌12h。將反應混合物蒸發并用二乙醚洗滌,獲得0.05g的化合物1i.LCMS:617.9(M+H)+。

步驟1i:

使用TFA(0.9mL)去除化合物1i[(0.08g),在CH2Cl2(0.9mL)中]上的酸敏感性保護基團。將反應混合物在室溫攪拌4h,然后蒸發并用二乙醚洗滌,獲得0.05g的粗制化合物1。使用實驗條件下描述的制備型HPLC方法-A純化粗制固體材料(收率:9mg)。LCMS:506.4(M+H)+;HPLC:tR=12.3分鐘。

化合物1l(NO2-CaH4-OCO-Thr(tBu)-OBzl,)的合成:

向Fmoc-Thr(tBu)-OH(15.0g,37.7mmol)在100.0mLDMF中的溶液中加入Cs2CO3(14.8g,45.2mmol)并且將得到的混合物冷卻至0℃。向冷卻的反應混合物中加入芐基溴(7.74g,345.2mmol)并且將溶液在冰冷的溫度攪拌30min接著在室溫攪拌12h。將反應混合物進一步在減壓下濃縮并且用乙酸乙酯(150mL)稀釋。將有機層用水(2×100mL)、鹽水(1×100mL)洗滌并經Na2SO4干燥。將過濾的溶液濃縮并通過硅膠柱色譜(洗脫劑:己烷中0-30%乙酸乙酯)純化,得到18.5g的中間體1j,為白色固體。LCMS:433.1(M-OtBu+H)+。

通過將其與二乙胺(40.0mL)在室溫攪拌1h而將在CH2Cl2(40.0mL)中的化合物1j(10.0g,20.5mmol)上的Fmoc基團脫保護。將得到的溶液在真空中濃縮并且將稠的殘留物通過柱色譜經中性鋁土(洗脫劑:己烷中的0-50%乙酸乙酯,然后氯仿中的0-5%甲醇)純化,獲得3.5g的中間體1k(收率:70%)。LCMS:266.5(M+H)+。

將TEA(1.2g,12.0mmol)加入至中間體1k(1.6g,6.0mmol)在CH2Cl2(30mL)中的攪拌溶液中。將氯甲酸4-硝基苯酯(1.3g,6.6mmol)在CH2Cl2(10mL)中的溶液加入至上述攪拌溶液中并在室溫繼續反應12h。反應的完成通過TLC分析確認。反應完成后,將反應混合物用CH2Cl2(50mL)稀釋并且用1.0M的硫酸氫鈉(50mL×2)和1.0M碳酸鈉(50mL×2)洗滌,經Na2SO4干燥并且在減壓下蒸發,獲得粗制化合物1l,將其進一步通過硅膠柱色譜(洗脫劑:己烷中0-20%的乙酸乙酯)純化,獲得0.8g的化合物1l。1HNMR(DMSO-d6,300MHz):δ1.04(s,9H),1.16(d,3H),4.11(m,1H),5.11(m,3H),6.91(d,2H),7.40(m,5H),8.10(d,2H),8.26(brs,1H)。

實施例2:化合物2的合成

步驟2a:

DIPEA(2.71g,21mmol)緩慢加入至化合物1b(3.12g,10.5mmol),HATU(4.41g,11.6mmol)在DMF(30mL)中的攪拌溶液中并且讓其在室溫攪拌5分鐘。向上述反應混合物中緩慢加入D-Thr(tBu)-OMe·HCl(2.0g,10.5mmol)并且在室溫攪拌12h。反應的完成通過TLC分析確認。然后將反應混合物用冰猝滅,將沉淀過濾并用CH2Cl2重結晶,獲得4.2g的化合物2a。LCMS:491.2(M+Na)+。

步驟2b:

將99%水合肼溶液(5mL)緩慢加入至化合物2a(4.2g)在甲醇(40mL)中的攪拌溶液中,并且反應的完成通過TLC分析確認。在減壓下蒸發反應混合物,得到4.2g的化合物2b(收率:90%)。LCMS:469.4(M+H)+。

步驟2c:

將DIPEA(2.7mL,20.9mmol)緩慢加入至化合物2b(4.9g,10.5mmol),HATU(4.8g,12.5mmol)在DMF(50mL)中的攪拌溶液中。向上述攪拌溶液中加入Fmoc-D-Asn(Trt)-OH(6.2g,10.5mmol),并且進一步在室溫攪拌12h。反應的完成通過TLC分析確認。將反應混合物用EtOAc(30mL)稀釋并且用1.0M碳酸鈉(20mL×2)、10%檸檬酸(20mL×2)、水(20mL×2)洗滌,經Na2SO4干燥并且在減壓下蒸發,獲得10g的粗制中間體2c并且進一步通過硅膠柱色譜(洗脫劑:EtOAc中0-5%的MeOH)純化,獲得5g的化合物2c。LCMS:1047.7(M+H)+。

步驟2d:

化合物2c[(3.2g),在CH2Cl2(10mL)中]的Fmoc脫保護使用二乙胺(10mL)進行。反應的完成通過TLC分析確認。在減壓下蒸發得到的溶液,得到1.2g的化合物2d。

步驟2e:

將三乙胺(0.32g,3.2mmol)緩慢加入以引發化合物2d(1.3g,1.6mmol)和化合物2h(0.79g,1.9mmol)在THF(20mL)中的偶聯。將得到的溶液在室溫進一步攪拌12h并且反應的完成通過TLC分析確認。將有機層用NaHCO3、檸檬酸溶液、鹽水洗滌,經Na2SO4干燥并且在減壓下蒸發,獲得1.3g的化合物2e。

步驟2f:

在室溫使用氫氧化鈀(1.0g)在甲醇中對化合物2e(1.3g)進行1h的Cbz基團和芐酯脫保護。反應的完成通過TLC分析確認。通過床過濾去除氫氧化鈀并且將濾液在減壓下蒸發,獲得0.45g的化合物2f。LCMS:878.4(M+H)+。

步驟2g:

將DIPEA(0.2g,1.5mmol)緩慢加入至化合物2f(0.45g,0.51mmol),HOBT(0.21g,1.53mmol)和PyBOP(0.8g,1.53mmol)在THF(200mL)中的攪拌溶液。將反應混合物在室溫進一步攪拌12h。反應的完成通過TLC分析確認。將反應混合物蒸發并用二乙醚洗滌,獲得0.41g的中間體2g。LCMS:860.7(M+H)+。

步驟2h:

向化合物2g(0.4g)在CH2Cl2(5mL)中的溶液中,加入三氟乙酸(5mL)和催化量的三異丙基硅烷并且在室溫攪拌3h。將得到的溶液在真空中濃縮,獲得0.2g的粗制化合物2。使用實驗條件中所描述的制備型HPLC方法-B將粗制固體材料純化(收率:10mg)。LCMS:506.6(M+H)+;HPLC:tR=12.4分鐘。

2h(NO2-C6H4-OCO-D-Ser(tBu)-OBzl,)的合成:

如(實施例1,化合物1l)中舉例說明的,使用類似的步驟,使用Fmoc-D-Ser(tBu)-OH替代Fmoc-Thr(tBu)-OH合成化合物,獲得1g粗制材料2h。

實施例3:化合物3的合成

步驟3a:

向化合物1a(5.0g,30.6mmol)在1,4-二烷(50mL)中的攪拌溶液中,加入碳酸鈉(8.12g,76.5mmol,溶于10mL水)和(Boc)2O(9.98mL,45.7mmol)并且在室溫攪拌12h。反應過程通過TLC監測。將反應物料在二乙醚和水之間分開。然后將水層用3NHCl溶液變為酸性(pH=3)并用DCM(2×200mL)萃取。將有機層用水、鹽水洗滌,經Na2SO4干燥并且在減壓下蒸發,獲得50g純的3a(收率:62.1%)。LCMS:263.0(M+H)+。

步驟3b:

在0℃將DIPEA(6.5mL,37.8mmol)緩慢加入至化合物3b(5g,12.6mmol),化合物3c(2.72g,15mmol),HOBt(2.55g,18.9mmol)和EDC.HCl(3.62g,18.9mmol)在DMF(75mL)中的攪拌溶液中。將反應混合物在室溫進一步攪拌12h。反應過程通過TLC分析確認。將反應物料在乙酸乙酯和水之間分開。將有機層用水、鹽水洗滌,經Na2SO4干燥并且在減壓下蒸發,獲得粗產物。將粗制化合物通過硅膠(60-120目)柱色譜,使用己烷/乙酸乙酯(40∶60)作為洗脫劑純化,獲得5.2g的化合物3d,(收率:71.0%)。LCMS:560.6(M+H)+。

步驟3c:

在-10℃向化合物3d(5g,8.9mmol)在無水DCM中的攪拌溶液中逐滴加入二乙胺(50mL)并在室溫攪拌1h。反應完成后,將混合物在減壓下蒸發以得到粗制化合物。將粗產物用(1∶1)正戊烷/二乙醚洗液純化并且在高真空干燥,獲得3.5g的化合物3e。LCMS:338.58(M+H)+。

步驟3d:

在0℃將NMM(1.4mL,14.0mmol)緩慢加入至化合物3a(3g,11.3mmol),化合物3e(4.3g,12.9mmol)和HATU(6.5g,17.1mmol)在DMF(75mL)中的攪拌溶液中。將反應混合物進一步在室溫攪拌6h。反應過程通過TLC監測。完成后,將反應物料在乙酸乙酯和水之間分開。將有機層用水、鹽水洗滌,經Na2SO4干燥并且在減壓下蒸發,得到粗制化合物。將粗產物通過硅膠柱色譜(洗脫劑:乙酸乙酯中50%己烷)純化,獲得4.8g的化合物3f,LCMS:583.7(M+H)+。

步驟3e:

向化合物3f(4.5g,7.7mmol)在MeOH中的攪拌溶液中緩慢加入Pd/C(2.0g)并且在室溫在H2氣氛下攪拌4h。反應過程通過TLC監測。完成后,將反應物料經過濾并用MeOH(2×150mL)洗滌。將得到的濾液在減壓下蒸發,獲得3g的化合物3gLCMS:448.6(M+H)+。

步驟3f:

在0℃向Cbz-D-Asn-OH(1.78g,6.7mmol)和化合物3g(3.0g,6.8mmol)在DMF(75mL)中的攪拌溶液中緩慢加入DCC(4.12g,20.3mmol)和HOBT(1.8g,13.5mmol)。將反應混合物在室溫攪拌48h。反應過程通過TLC監測。完成后,將反應物料在乙酸乙酯和水之間分開。將有機層用水、鹽水洗滌,經Na2SO4干燥并且在減壓下蒸發,獲得粗產物。粗制化合物通過硅膠(60-120目)柱色譜(洗脫劑:DCM中4%MeOH)純化,獲得2.5g的化合物3h,LCMS:697.50(M+H)+。

步驟3g:

向化合物3h(2.5g,3.6mmol)在MeOH(50mL)中的攪拌溶液中加入Pd/C(1.2g)并且在室溫在H2氣氛下攪拌4h。反應過程通過TLC監測。完成后,將反應物料經過濾并用MeOH(2×150mL)洗滌。將得到的濾液在減壓下蒸發,獲得1.5g的化合物3i,LCMS:563.6(M+H)+。

步驟3h:

在-10℃將DMF(25mL)中的化合物3i(1.3g,2.3mmol),TEA(0.43mL,3.5mmol)逐滴緩慢加入至3j(1.1g,2.6mmol)的溶液中。將混合物在室溫進一步攪拌2h。反應過程通過TLC監測。完成后,將反應物料在乙酸乙酯和水之間分開。將有機層用NaHCO3、檸檬酸溶液、鹽水洗滌,然后將有機層經Na2SO4干燥并且在減壓下蒸發,得到粗產物。將粗產物通過硅膠(60-120目)柱色譜(己烷/乙酸乙酯(10∶90)為洗脫劑)純化,獲得1.2g的化合物3k。LCMS:840.6(M+H)+。

步驟3i:

向化合物3k(1.0g,1.2mmol)在CH2Cl2(10mL)中的溶液中加入三氟乙酸(10mL)和催化量的三異丙基硅烷,并且在室溫攪拌3h以移除酸敏感性保護基團。將得到的溶液在真空中濃縮并用二乙醚洗滌,獲得1.0g的粗制化合物3l,LCMS:628.65(M+H)+。

步驟3j:

向化合物3l(1.0g,1.5mmol)在THF中的攪拌溶液中,緩慢加入PyBOP(2.4g,4.7mmol),HOBT(0.6,4.7mmol)和DIPEA(0.8mL,4.7mmol)并且在室溫攪拌12h。將反應物料在水和乙酸乙酯之間分開。將有機層用水、鹽水洗滌,經Na2SO4干燥并且在減壓下蒸發,得到粗產物。將粗制化合物用二乙醚洗滌,獲得0.8g的化合物3m,LCMS:610.5(M+H)+。

步驟3k:

向化合物3m(0.8g,1.3mmol)在MeOH(30mL)中的攪拌溶液中,加入Pd(OH)2(0.4g)并且在室溫在H2氣氛下攪拌4h。反應過程通過TLC監測。完成后,將反應物料經過濾并用MeOH(2×150mL)洗滌。將得到的濾液在減壓下蒸發,獲得0.7g的化合物3。LCMS:520.5(M+H)+;HPLC:tR=9.9分鐘。

中間體3c的合成:

在-78℃向化合物3n(4g,88.3mmol)和化合物3o(10.2mL,71.2mmol)在DCM(150mL)中的攪拌溶液中,逐滴加入TEA(14.4mL,105mmol)。使反應混合物達到室溫并攪拌12h。反應過程通過TLC監測。完成后,將反應物料在水和DCM之間分開。將有機層用水、鹽水洗滌,經Na2SO4干燥并且在減壓下蒸發,獲得粗制化合物并通過硅膠(60-120目)柱色譜(洗脫劑:己烷中80%的乙酸乙酯)純化,獲得10g的化合物3c,LCMS:181.18(M+H)+。

3j(NO2-C6H4-OCO-D-Ser(Bzl)-OtBu)的合成:

如(實施例1,化合物1k)中舉例說明的,使用類似的步驟,使用Fmoc-D-Ser(Bzl)-OtBu替代Fmoc-Thr(tBu)-OH,合成化合物,獲得1.5g的化合物3j。

實施例4:化合物4的合成

使用與實施例2(化合物2)中所述類似的程序,使用7-氨基庚酸替代化合物1a合成化合物,獲得0.3g粗制的標題化合物材料。將粗制固體材料使用實驗條件中所描述的制備型HPLC純化。LCMS:488.2(M+H)+;HPLC:tR=11.9分鐘。

基于上文描述的實驗步驟制備下表3中的化合物。

表3

下表4中顯示的化合物(其可以通過以下與上述類似的步驟,以對于本領域技術人員而言已知的適當修飾制備)也包括在本申請的范圍內。

表4

實施例5:在重組PD-L1的存在下小鼠脾細胞增殖的挽救

使用重組小鼠PD-L1(rm-PDL-1,目錄號:1019-B7-100;R&D系統)作為PD-L1的來源。

必需品:

從6-8周齡C57BL6小鼠獲得的小鼠脾細胞;RPMI1640(GIBCO,Cat#11875);高葡萄糖的DMEM(GIBCO,Cat#D6429);胎牛血清[Hyclone,Cat#SH30071.03];青霉素(10000單位/ml)-鏈霉素(10,000μg/ml)液體(GIBCO,Cat#15140-122);MEM丙酮酸鈉溶液100mM(100x),液體(GIBCO,Cat#11360);非必需氨基酸(GIBCO,Cat#11140);L-谷氨酰胺(GIBCO,Cat#25030);抗-CD3抗體(eBiosciences-16-0032);抗-CD28抗體(eBiosciences-16-0281);ACK裂解緩沖液(1mL)(GIBCO,Cat#-A10492);Histopaque(密度-1.083gm/mL)(SIGMA10831);臺盼藍溶液(SIGMA-T8154);2mLNormJectLuerLock注射器-(Sigma2014-12);40μm尼龍細胞濾器(BDFALCON35230);血球計(Brightline-SIGMAZ359629);FACS緩沖液(PBS/0.1%BSA):具有0.1%牛血清白蛋白(BSA)(SIGMAA7050)和疊氮化鈉(SIGMA08591)的磷酸緩沖鹽水(PBS)pH7.2(HiMediaTS1006);5mM的CFSE儲存溶液:CFSE儲存溶液通過用180μL的二甲亞砜(DMSOC2H65O,SIGMA-D-5879)稀釋凍干的CFSE而制備并且等分到小管中用于進一步使用。將工作濃度從10μm滴定到1μm.(eBioscience-650850-85);0.05%胰蛋白酶和0.02%EDTA(SIGMA59417C);96-孔形式ELISA板(CorningCLS3390);BDFACS口徑(E6016);重組小鼠B7-H1/PDL1FcChimera,(rm-PD-L1目錄號:1019-B7-100)。

方案

脾細胞制備和培養:

將通過在40μm細胞濾器磨碎小鼠脾而獲得的在50mL離心管中的脾細胞進一步在室溫用1mlACK裂解緩沖液處理5min。在用9mLRPMI完全培養基洗滌后,將細胞重懸在15mL管中的3ml的1xPBS中。將3mLHistopaque小心加入至管底,不破壞上面覆蓋的脾細胞懸浮液。在室溫在800xg離心20min后,小心收集脾細胞的不透明層,但不使層破壞/混合。用冷的1xPBS洗滌脾細胞兩次,然后使用臺盼藍排除方法進行總細胞計數,并且進一步用于基于細胞的測定。

將脾細胞培養在RPMI完全培養基(RPMI+10%胎牛血清+1mM丙酮酸鈉+10,000單位/mL青霉素和10,000μg/mL鏈霉素)中,并且在37℃維持在具有5%CO2的CO2溫箱中

CFSE增殖測定:

CFSE是被動散布到細胞中并且結合于細胞內蛋白的染料。將1x106個細胞/ml的所獲得的脾細胞用預溫熱的1xPBS/0.1%BSA溶液中的5μm的CFSE在37C處理10min。將5體積的冰冷的培養基使用于細胞以將過量的CFSE猝滅并在冰上孵育5分鐘。將CFSE標記的脾細胞用冰冷的完全RPMI培養基進一步洗滌三次。將CFSE標記的1x105個脾細胞加入至含有MDA-MB231細胞(在高葡萄糖DMEM培養基中培養的1x105個細胞)或重組人PDL-1(100ng/mL)和測試化合物的孔中。用抗-小鼠CD3和抗-小鼠CD28抗體(各自1μg/mL)刺激脾細胞,并且將培養物(culture)進一步在37℃用5%CO2孵育72h。收獲細胞并且用冰冷的FACS緩沖液洗滌兩次并且通過流式細胞術用488nm激發和521nm發射濾波器分析增殖百分數。

數據匯編、加工和推斷:

使用細胞尋找FACS程序分析脾細胞增殖百分數,并且在減去背景增殖百分比值并且相對于作為100%的刺激的脾細胞增殖百分比(陽性對照)標準化后,評估化合物導致的脾細胞增殖的挽救百分比。

背景增殖:脾細胞+抗-CD3/CD28+PD-L1

刺激的脾細胞:脾細胞+抗-CD3/CD28刺激

化合物增殖:脾細胞+抗-CD3/CD28+PD-L1+化合物

通過在配體(PDL-1)的存在下向抗-CD3/CD28刺激的脾細胞中加入需要濃度的化合物來檢測化合物效應(表5)。

表:5使用基于CFSE的測定的通過重組小鼠PDL1來抑制小鼠脾細胞增殖的挽救:

表5

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