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一種冬蓀液體菌種快繁方法.pdf

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一種 液體 菌種 方法
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摘要
申請專利號:

CN201810728752.8

申請日:

20180705

公開號:

CN108541513A

公開日:

20180918

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01G18/40,A01G18/20 主分類號: A01G18/40,A01G18/20
申請人: 貴州省農作物品種資源研究所,貴州利康農科技有限公司
發明人: 黃萬兵,朱國勝,桂陽,盧穎穎,張麗娜,龔光祿,楊通靜,陳婭婭,郎柳錄
地址: 550006 貴州省貴陽市花溪區金欣社區貴州省農業科學院貴州省農作物品種資源研究所
優先權: CN201810728752A
專利代理機構: 代理人:
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201810728752.8

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種冬蓀液體菌種快繁方法,該方法接種點制備簡單、萌發快、分兩個階段液體搖瓶;二級液體菌種5天結束搖瓶,其中冬蓀菌絲球大小均勻,菌絲球密度大、菌絲鮮重能達27g/L。同時產生的冬蓀液體菌種適宜作為工廠化發酵的液體種子,液體搖瓶培養參數能為冬蓀菌種高效、質優的工廠化生產奠定基礎。

權利要求書

1.一種冬蓀液體菌種快繁方法,其特征在于:接種點制備簡單、萌發快、分兩個階段液體搖瓶;二級液體菌種5天結束搖瓶,其中冬蓀菌絲球大小均勻,菌絲球密度大、菌絲鮮重能達27g/L。2.根據權利要求1所述的分兩個階段液體搖瓶是指,第一階段搖瓶所得為一級液體菌種,利用一級液體菌種傳代培養二級液體菌種。3.兩個階段培養參數均為23℃暗培養、180r/min,二級液體菌接種量1:30(體積比)。4.根據權利要求4所述的一級液體搖瓶的培養基參數具體是指,葡萄糖10g/L、磷酸二氫鉀1g/L、蛋白胨2.5g/L、硫酸鎂1.5g/L、馬鈴薯100g/L(煮汁過濾)、酵母粉1.5g/L、VB10.01g/L、瓊脂粉1.5g/L,各成分充分溶解后裝液量為150ml、封瓶滅菌。5.根據權利要求4所述的二級液體菌種的培養基成分參數是指,葡萄糖25g/L、磷酸二氫鉀1g/L、蛋白胨2.5g/L、硫酸鎂2g/L、馬鈴薯280g/L(煮汁過濾)、酵母粉0.5g/L、VB10.03g/L、瓊脂粉1.5g/L,各成分充分溶解后裝液量為150ml、封瓶滅菌。6.根據權利要求5、7所述的裝液量,具體指體積為250ml的玻璃三角瓶,裝150ml液體培養基。7.根據權利要求5、7所述的封瓶滅菌,具體指用透氣封瓶膜封口、121℃滅菌30min。

說明書

技術領域

本發明涉及農業科技種子生產技術領域,尤其是一種冬蓀液體菌種快繁方法。

背景技術

冬蓀,又稱竹下菌、男蓀、無裙蓀等,為擔子菌亞門、腹菌綱、鬼筆目、鬼筆科、鬼筆屬真菌,包含白鬼筆、香筆菌、重脈鬼筆三個生物種。冬蓀為人工馴化的新食用菌,目前在貴州畢節市已有較大面積的人工栽培,林下腐殖質層中單生或群生,其出菇溫度較低,子實體開傘在秋冬季節,因此當地菇農又稱其為冬蓀,分布于貴州、四川、云南、安徽、廣東等地。

冬蓀是一種極佳的營養滋品,菌體潔白,久煮不糊,味道鮮美,口感松脆、細嫩、爽口,營養豐富。冬蓀子實體中含有豐富的營養成分,有21種氨基酸,8種為人體所必須,約占氨基酸總量的1/3,其中谷氨酸含量尤其豐富,占氨基酸總量17%以上,為蔬菜與水果所不及,冬蓀富含多種維生素和多種微量元素以及多糖等活動物質。同時冬蓀菌柄可入藥,藥性為甘,淡,性溫,有活血止痛,祛風除濕的功效。中世紀時,白鬼筆曾用于治療痛風。因此,冬蓀具有較高的營養和保健價值。

冬蓀人工栽培起源于貴州省大方縣,在上世紀80年代,就有收山貨的商販收購野生白鬼筆銷往四川、江浙一帶。在上世紀90年代初期大方縣就出現自行分離菌種栽培白鬼筆,但20多年來,冬蓀制種還是停留在固體菌種生產工藝上,即從竹蛋分離母種—母種擴大—原種擴繁—栽培種生產。同時冬蓀菌絲生長速度緩慢,木屑培養基中長滿瓶(體積500ml)需要4個月之久。傳統的冬蓀固體母種到栽培種的生產過程一般要經過大半年的時間,菌種生產周期較長,培養成本較高,不易量產;且長時間培養瓶/袋口菌絲極易吐黃水,造成同批次栽培種的菌齡與活力常常參差不齊,嚴重影響了冬蓀的產量與品質。

目前冬蓀馴化成功且大面積人工種植的3個品種中,白鬼筆、香筆菌、重脈鬼筆均未有液體菌種的相關研究報道。本專利采用的接種點制備簡單、萌發快、分兩個階段液體搖瓶;二級液體菌種5天結束搖瓶,其中冬蓀菌絲球大小均勻,菌絲球密度大、菌絲鮮重能達27g/L;使冬蓀菌種的工廠化生產與應用真正成為可能,解決了冬蓀制種中速度慢與質量差的技術難題,具有很大菌種工廠化生產應用和推廣價值。

發明內容

本發明的目的是,提供一種冬蓀液體菌種快繁方法,實現5天結束液體搖瓶,產生的冬蓀菌絲球大小均勻、菌絲球密度大,適宜于工廠化液體發酵。為冬蓀菌種高效、質優的工廠化生產奠定基礎。

本發明是這樣實現的,包含以下步驟:

1)一級液體培養基制做:按葡萄糖10g/L、磷酸二氫鉀1g/L、蛋白胨2.5g/L、硫酸鎂1.5g/L、馬鈴薯100g/L(煮汁過濾)、酵母粉1.5g/L、VB1 0.01g/L、瓊脂粉1.5 g/L的配制比例準確稱取上述物質煮溶于自來水中,定容后按150ml的量分裝于三角瓶中(體積250ml),用透氣封瓶膜封口后進行高壓滅菌(121℃、20min)。

2)冬蓀一級液體菌種制備:75%酒精表面消毒長滿平皿的紅托竹蓀母種,置于超凈工作臺中;無菌條件下用解剖刀劃取蠶豆大小的母種5塊轉接于冷卻好的一級液體培養基中,完成接種后上搖床暗培養(23℃、180r/min)。接種點3天萌動,20天結束一級液體菌種的搖瓶培養。

3)二級液體培養基制做:按葡萄糖25g/L、磷酸二氫鉀1g/L、蛋白胨2.5g/L、硫酸鎂2g/L、馬鈴薯280g/L(煮汁過濾)、酵母粉0.5g/L、VB1 0.03g/L、瓊脂粉1.5 g/L的配制比例準確稱取上述物質煮溶于自來水中,定容后按150ml的量分裝于三角瓶中(體積250ml),用透氣封瓶膜封口后進行高壓滅菌(121℃、20min)。

4)冬蓀二級液體菌種制備:75%酒精表面消毒一級液體菌種;無菌條件下用無菌的5ml槍頭吸取勻質的一級液體菌種轉入二級液體培養基中培養(接種量體積比為1:30),完成接種后上搖床暗培養(23℃、180r/min),5天能結束二級液體菌種的搖瓶培養。

圖1 冬蓀液體菌種。

具體實施例。

2017年8-10月,在貴州省農作物品種資源研究所真菌室進行冬蓀的液體搖瓶培養,具體步驟如下:

1)2017年8月底進行一級液體培養基制做:按葡萄糖10g/L、磷酸二氫鉀1g/L、蛋白胨2.5g/L、硫酸鎂1.5g/L、馬鈴薯100g/L(煮汁過濾)、酵母粉1.5g/L、VB1 0.01g/L、瓊脂粉1.5 g/L的配制比例準確稱取上述物質煮溶于自來水中,定容后按150ml的量分裝于三角瓶中(體積250ml),用透氣封瓶膜封口后進行高壓滅菌(121℃、20min)、冷卻后備用。

2)2017年9月初進行冬蓀一級液體菌種制備:75%酒精表面消毒長滿平皿的紅托竹蓀母種,置于超凈工作臺中;無菌條件下用解剖刀劃取蠶豆大小的母種5塊轉接于冷卻好的一級液體培養基中,完成接種后上搖床暗培養(23℃、180r/min)。接種點3天萌動,20天結束一級液體菌種的搖瓶培養。

3)2017年9月下旬進行二級液體培養基制做:按葡萄糖25g/L、磷酸二氫鉀1g/L、蛋白胨2.5g/L、硫酸鎂2g/L、馬鈴薯280g/L(煮汁過濾)、酵母粉0.5g/L、VB1 0.03g/L、瓊脂粉1.5 g/L的配制比例準確稱取上述物質煮溶于自來水中,定容后按150ml的量分裝于三角瓶中(體積250ml),用透氣封瓶膜封口后進行高壓滅菌(121℃、20min)、冷卻后備用。

4)2017年9月底進行冬蓀二級液體菌種制備:75%酒精表面消毒一級液體菌種置于超凈工作臺滅菌;無菌條件下用無菌的5ml槍頭吸取勻質的一級液體菌種轉入二級液體培養基中培養(接種量體積比為1:30),完成傳代后上搖床暗培養(23℃、180r/min),5天結束二級液體菌種的搖瓶培養。

5)2017年10月初進行冬蓀二級液體菌種的驗證,包括菌種一致性鑒定、菌絲產量等。將發酵好的冬蓀二級液體菌種接種到PDA培養基中、25℃暗培養,同時提取菌絲球的DNA進行cDNA-ITS的擴增與GenBank比對鑒定;另外抽濾二級液體菌種直至不再滴水后,測定菌絲產量。結果表明:二級液體菌種轉接到PDA培養基中,3天后開始萌動、1個星期菌絲扭結成菌束,這符合冬蓀25℃暗培養的特征;同時GenBank中的cDNA-ITS比對的鑒定也為冬蓀的生物種;抽濾法得到冬蓀二級液體菌種菌絲鮮重為27.6g/L。

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