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抗RSPO2和/或抗RSPO3抗體及其用途.pdf

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RSPO2 RSPO3 抗體 及其 用途
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摘要
申請專利號:

CN201480062590.9

申請日:

20141017

公開號:

CN105744954A

公開日:

20160706

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A61K39/395,C07K16/18,C07K16/28,C07K16/30,G01N33/574,A61K39/00 主分類號: A61K39/395,C07K16/18,C07K16/28,C07K16/30,G01N33/574,A61K39/00
申請人: 豪夫邁·羅氏有限公司
發明人: E·斯托姆,F·J·德索瓦熱,J·M·默里,C·L·諾蘭,Y·吳,C·譚,J-A·弘戈,Y·陳
地址: 瑞士巴塞爾
優先權: 61/893,141,62/056,324
專利代理機構: 北京坤瑞律師事務所 代理人: 岑曉東
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201480062590.9

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本文中提供的是抗RSPO抗體(特別是抗RSPO2抗體和/或抗RSPO3抗體)及其使用方法。

權利要求書

1.一種結合RSPO2的分離的抗體,其中該抗體抑制RSPO2與跨膜E3遍在蛋白酶(ubiquitinase)的相互作用。2.權利要求1的分離的抗體,其中該抗體不抑制RSPO2與LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的相互作用(例如增強RSPO2與LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的相互作用)。3.一種結合RSPO2的分離的抗體,其中該抗體包含(a)輕鏈可變域(VL),該VL包含(i)包含SEQIDNO:53的氨基酸序列的高變區-L1(HVR-L1),(ii)包含SEQIDNO:54的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L3,和(b)重鏈可變域(VH),該VH包含(i)包含SEQIDNO:56的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:57的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:58的氨基酸序列的HVR-H3。4.權利要求3的分離的抗體,其中該抗體包含(a)SEQIDNO:105的VL序列和SEQIDNO:106的VH序列。5.權利要求1的分離的抗體,其中該抗體抑制RSPO2與LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的相互作用。6.一種結合RSPO2的分離的抗體,其中該抗體包含:(a)VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:59的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:61的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:62的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:63的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:64的氨基酸序列的HVR-H3;(b)VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:65的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:66的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:67的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:68的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:69的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:70的氨基酸序列的HVR-H3;或(c)VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:71的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:72的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:73的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:74的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:75的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:76的氨基酸序列的HVR-H3。7.權利要求6的分離的抗體,其中該抗體包含(a)SEQIDNO:107的VL序列和SEQIDNO:108的VH序列;(b)SEQIDNO:109的VL序列和SEQIDNO:110的VH序列;或(c)SEQIDNO:111的VL序列和SEQIDNO:112的VH序列。8.一種結合RSPO3的分離的抗體,其中該抗體抑制RSPO3與跨膜E3遍在蛋白酶的相互作用。9.權利要求8的分離的抗體,其中該抗體抑制RSPO3與LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的相互作用。10.一種結合RSPO3的分離的抗體,其中該抗體包含:(a)VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:9的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:10的氨基酸序列的HVR-H3;(b)VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:11的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-H3;(c)VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:19的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:20的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:21的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H3;(d)VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:27的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:28的氨基酸序列的HVR-H3;(e)VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:29的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:30的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:31的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:32的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:33的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:34的氨基酸序列的HVR-H3;(f)VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:35的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:36的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:37的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:38的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:39的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:40的氨基酸序列的HVR-H3;(g)VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:41的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:42的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:43的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:44的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:45的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:46的氨基酸序列的HVR-H3;(h)VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:27的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:188的氨基酸序列的HVR-H3;或(i)VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:27的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:189的氨基酸序列的HVR-H3。11.權利要求10的分離的抗體,其中該抗體包含(a)SEQIDNO:89的VL序列和SEQIDNO:90的VH序列;(b)SEQIDNO:91的VL序列和SEQIDNO:92的VH序列;(c)SEQIDNO:93的VL序列和SEQIDNO:94的VH序列;(d)SEQIDNO:95的VL序列和SEQIDNO:96的VH序列;(e)SEQIDNO:97的VL序列和SEQIDNO:98的VH序列;(f)SEQIDNO:99的VL序列和SEQIDNO:100的VH序列;(g)SEQIDNO:101的VL序列和SEQIDNO:102的VH序列;(h)SEQIDNO:190的VL序列和SEQIDNO:191的VH序列;(i)SEQIDNO:192的VL序列和SEQIDNO:193的VH序列;(j)SEQIDNO:194的VL序列和SEQIDNO:195的VH序列;(k)SEQIDNO:196的VL序列和SEQIDNO:197的VH序列;(l)SEQIDNO:198的VL序列和SEQIDNO:199的VH序列;(m)SEQIDNO:200的VL序列和SEQIDNO:201的VH序列;(n)SEQIDNO:202的VL序列和SEQIDNO:203的VH序列;(o)SEQIDNO:204的VL序列和SEQIDNO:205的VH序列;(p)SEQIDNO:206的VL序列和SEQIDNO:207的VH序列;(q)SEQIDNO:208的VL序列和SEQIDNO:209的VH序列;(r)SEQIDNO:210的VL序列和SEQIDNO:211的VH序列;(w)SEQIDNO:212的VL序列和SEQIDNO:213的VH序列;或(x)SEQIDNO:214的VL序列和SEQIDNO:215的VH序列。12.一種結合RSPO2和RSPO3的分離的抗體。13.權利要求12的分離的抗體,其中該抗體抑制RSPO2和RSPO3與跨膜E3遍在蛋白酶的相互作用。14.權利要求12-13任一項的分離的抗體,其中該抗體抑制RSPO3與LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的相互作用。15.權利要求12-14任一項的分離的抗體,其中該抗體抑制RSPO2與LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的相互作用。16.權利要求12-14任一項的分離的抗體,其中該抗體不抑制RSPO2與LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的相互作用(例如增強RSPO2對LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的結合)。17.權利要求12-16任一項的分離的抗體,其中該抗體包含第一可變域和第二可變域,其中該第一可變域包含第一套6種HVR且該第二可變域包含第二套6種HVR,且其中該第一套和第二套6種HVR是相同的。18.一種結合RSPO2和RSPO3的分離的抗體,其中該抗體包含:(a)VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:47的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:48的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:49的氨基酸序列的HVR-L3;和(b)VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:50的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:51的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:52的氨基酸序列的HVR-H3。19.權利要求18的分離的抗體,其中該抗體包含(a)SEQIDNO:103的VL序列和SEQIDNO:104的VH序列。20.權利要求12-19任一項的分離的抗體,其中該抗體包含第一可變域和第二可變域,其中該第一可變域包含第一套6種HVR且該第二可變域包含第二套6種HVR,且其中該第一套和第二套6種HVR是不同的。21.權利要求12-16和20任一項的分離的抗體,其中所述第一套6種HVR是4H1,4D4,5C2,5D6,5E11,6E9,和21C2中任一項的6種HVR且所述第二套6種HVR是1A1,11F11,36D2,和49G5中任一項的6種HVR。22.權利要求21的分離的抗體,其中所述第一套6種HVR是4H1,4D4,5C2,5D6,5E11,6E9,和21C2中任一項的6種HVR且所述第二套6種HVR是1A1的6種HVR。23.權利要求1-2,5,8-9,13-17,和20-22任一項的分離的抗體,其中所述跨膜E3遍在蛋白酶為ZNRF3和/或RNF43。24.一種結合RSPO3的分離的抗體,其中該抗體包含:(a)VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:78的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:79的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:80的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:81的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:82的氨基酸序列的HVR-H3;(b)VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:83的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:84的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:85的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:86的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:87的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:88的氨基酸序列的HVR-H3;或(c)VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:78的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:79的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:80的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:81的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:216的氨基酸序列的HVR-H3。25.一種結合RSPO3的分離的抗體,其中該抗體結合RSPO3的氨基酸47-108內的一個區域(例如49-108)。26.一種結合RSPO3表位的分離的抗體,其中該RSPO3表位包含RSPO3的氨基酸殘基:Gln72,Pro90,Asp91,和Lys94。27.權利要求26的分離的抗體,其中所述RSPO3表位包含RSPO3的氨基酸:Asn52,Leu55,Phe63,Gln72,Tyr89,Pro90,Asp91,Lys94,和Lys97。28.權利要求27的分離的抗體,其中所述RSPO3表位包含RSPO3的氨基酸殘基:Ser49,Asn52,Cys54,Leu55,Ser56,Phe63,Leu65,Gln72,Ile73,Gly74,Tyr84,Tyr89,Pro90,Asp91,Ile92,Lys94,Lys97,和Lys108。29.一種結合RSPO3表位的分離的抗體,其中該RSPO3表位包含RSPO3的氨基酸:Thr47,Leu55,Gln72,Pro90,Asp91,和Lys94。30.權利要求29的抗體,其中所述RSPO3表位包含RSPO3的氨基酸:Thr47,Asn52,Leu55,Phe63,Gln72,Tyr89,Pro90,Asp91,Ile92,Lys94,和Lys97。31.權利要求30的分離的抗體,其中所述RSPO3表位包含RSPO3的氨基酸殘基:Thr47,Asn52,Cys54,Leu55,Ser56,Phe63,Leu65,Gln72,Tyr84,Tyr89,Pro90,Asp91,Ile92,Asn93,Lys94,Lys97,和Lys108。32.權利要求1-31任一項的分離的抗體,其中該抗體抑制RSPO2和/或RSPO3介導的wnt信號傳導。33.權利要求32的抗體,其為結合RSPO2和/或RSPO3的抗體片段。34.權利要求1-33任一項的抗體,其為單克隆抗體。35.權利要求1-34任一項的抗體,其為人抗體,人源化抗體,或嵌合抗體。36.權利要求1-35任一項的抗體,其為全長IgG1或IgG2a抗體。37.分離的核酸,其編碼權利要求1-36任一項的抗體。38.一種宿主細胞,其包含權利要求37的核酸。39.一種生產抗體的方法,其包括培養權利要求38的宿主細胞使得該抗體生成。40.權利要求39的方法,其進一步包括自該宿主細胞回收該抗體。41.一種免疫綴合物,其包含權利要求1-36任一項的抗體和細胞毒劑。42.一種藥物配制劑,其包含權利要求1-36任一項的抗體和藥學可接受載劑。43.權利要求42的藥物配制劑,其進一步包含別的治療劑。44.權利要求1-36任一項的抗體,其用作藥物。45.權利要求1-36任一項的抗體,其用于治療癌癥。46.權利要求45的抗體,其中所述癌癥為胃腸癌,胃癌,結腸癌,結直腸癌,肺癌,或直腸癌。47.權利要求1-36任一項的抗體,其用于抑制wnt信號傳導,抑制血管發生(angiogenesis)和/或血管形成(vasculogenesis),和/或抑制細胞增殖。48.權利要求1-36任一項的抗體在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。49.權利要求1-36任一項的抗體的用途,其中所述癌癥為胃腸癌,胃癌,結腸癌,結直腸癌,肺癌,或直腸癌。50.權利要求1-36任一項的抗體在制備用于抑制wnt信號傳導,抑制血管發生和/或血管形成,和/或抑制細胞增殖的藥物中的用途。51.一種治療具有癌癥的個體的方法,其包括對該個體施用有效量的權利要求1-36任一項的抗體。52.權利要求51的方法,其中所述癌癥為胃腸癌,胃癌,結腸癌,結直腸癌,肺癌,或直腸癌。53.權利要求51-52任一項的方法,其進一步包括對該個體施用別的治療劑。54.一種在個體中抑制wnt信號傳導,抑制血管發生和/或血管形成,和/或抑制細胞增殖的方法,其包括對該個體施用有效量的權利要求1-36任一項的抗體以抑制wnt信號傳導,抑制血管發生和/或血管形成,和/或抑制細胞增殖。55.權利要求45-46,48-49,和51-53任一項的抗體,用途或方法,其中所述癌癥特征在于一種或多種RSPO(例如RSPO2和/或RSPO3)與參照相比升高的表達。56.權利要求45-46,48-49,和51-53任一項的抗體,用途或方法,其中所述癌癥特征在于RSPO易位(例如RSPO2易位和/或RSPO3易位)。

說明書

對相關申請的交叉引用

本申請依據35U.S.C.§119要求2013年10月18日提交的美國臨時申請No.61/893,141和2014年9月26日提交的美國臨時申請No.62/056,324的權益,據此通過述及完整收錄其內容。

序列表

本申請含有序列表,已經經EFS-Web提交且據此通過述及將其完整收錄。所述ASCII拷貝(在2014年10月14日創建)命名為P5719R1-WO_SequenceListing.txt,并且大小為124950字節。

發明領域

本文中提供了抗RSPO抗體(特別是抗RSPO2抗體和/或抗RSPO3抗體)及其使用方法。

發明背景

R-spondin(RSPO)家族是一小組,四種分泌型蛋白質(RSPO1至RSPO4),在脊椎動物胚胎和成體中廣泛表達。通過強烈增強Wnt途徑激活,RSPO具有發育和干細胞生長中的多效功能(Kazanskayaetal.,Dev.Cell7:525-534(2004);Kimetal.,CellCycle5:23-26(2006);WO2005/040418)。哺乳動物RSPO1至RSPO4分享40%-60%氨基酸序列同一性,而且由一個信號肽,兩個相鄰的弗林蛋白酶樣富半胱氨酸域(FU-CRD),接著是一個血小板反應蛋白型I重復(TSR)域,和一個帶正電荷的C端區組成。兩個FU-CRD對于促進Wnt/β-聯蛋白信號傳導是必要且充分的(Kazanskayaetal.,Dev.Cell7:525-534(2004);WO2005/040418)。

LGR4(含富亮氨酸重復[LRR]的G蛋白偶聯受體[GPCR]4),LGR5,和LGR6(Hsuetal.,Mol.Endocrinol.12:1830-1845(1998);Hsuetal.,Mol.Endocinol.14:1257-1271(2000))是RSPO的受體。LGR4/5/6受體的一項共同特征是它們在獨特類型的成體干細胞中的表達。LGR5早已描述為Wnt依賴性隔室(包括小腸,結腸,胃,和毛囊)中的駐留干細胞的一種標志物(BarkerandClevers,Gastroenterology138:1681-1696(2010);Seshagirietal.,Nature488:660-664(2012))。LGR6還充當表皮中的多效干細胞的一種標志物(Snippertetal.,Science327:1385-1389(2010))。LGR4在正在增殖的細胞中廣泛表達(VanSchooreetal.,HistochemCellBiol.124:35-50(2005)),而且它的敲除小鼠顯示許多器官(包括骨,腎,睪丸,皮膚,和膽囊)中的發育缺陷(Mustataetal.,EMBORep12:558-564(2011))。LGR4/5/6受體具有胞外域中17個LRR的中央排列,N和C端二者側翼為富半胱氨酸序列,之后是7個跨膜螺旋,而且胞外域對于與RSPO的高親和力結合是必要且充分的(deLauetal.,GenomeBiol.13:242(2011);Wangetal.,Genes&Dev.27:1339-1344(2013))。

LGR4/5/6受體可以在RSPO識別后在物理上與低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6(LRP5/6)相互作用,并且由此RSPO和Wnt配體一起作用來激活Wnt/β-聯蛋白信號傳導(deLauetal.,GenomeBiol.13:242(2011);Carmonetal.,ProcNatlAcadSci108:11452-11457(2012))。通過穩定Frizzled和LRP5/6受體,RSPO還有能力促進Wnt/β-聯蛋白信號傳導(Haoetal.,Nature485:195-200(2012))。鋅和RING指3(ZNRF3)及其同系物RING指43(RNF43)是跨膜E3遍在蛋白連接酶,它促進細胞表面上的Frizzled和LRP6受體周轉(Haoetal.,Nature485:195-200(2012);Kooetal.,Nature488:665-669(2012))。通過與LGR4/5/6和ZNRF3/RNF43的胞外域相互作用,RSPO可誘導自膜清除ZNRF3,這穩定Frizzled和LRP6受體以增強Wnt/β-聯蛋白信號傳導(Haoetal.,Nature485:195-200(2012))。

通過述及而完整收錄本文中引用的所有參考文獻,包括專利申請和出版物。

發明概述

本發明提供抗RSPO抗體(特別是結合RSPO2,RSPO3,和/或RSPO2和RSPO3二者的抗體)及其使用方法。

本文中提供的是結合RSPO2的分離的抗體,其中該抗體抑制RSPO2與跨膜E3遍在蛋白酶的相互作用。在一些實施方案中,該跨膜E3遍在蛋白酶為ZNRF3和/或RNF43。

在一些實施方案中,該抗體不抑制RSPO2與LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的相互作用(例如增強RSPO2與LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的相互作用)。例如,本文中提供的是結合RSPO2的分離的抗體,其中該抗體包含(a)輕鏈可變域(VL),該VL包含(i)包含SEQIDNO:53的氨基酸序列的高變區-L1(HVR-L1),(ii)包含SEQIDNO:54的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L3,和(b)重鏈可變域(VH),該VH包含(i)包含SEQIDNO:56的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:57的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:58的氨基酸序列的HVR-H3。在一些實施方案中,該抗體包含(a)SEQIDNO:105的VL序列和SEQIDNO:106的VH序列。

在一些實施方案中,該抗體抑制RSPO2與LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的相互作用。例如,本文中提供的是結合RSPO2的分離的抗體,其中該抗體包含:(a)VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:59的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:61的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:62的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:63的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:64的氨基酸序列的HVR-H3;(b)VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:65的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:66的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:67的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:68的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:69的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:70的氨基酸序列的HVR-H3;或(c)VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:71的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:72的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:73的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:74的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:75的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:76的氨基酸序列的HVR-H3。在一些實施方案中,該分離的抗體包含(a)SEQIDNO:107的VL序列和SEQIDNO:108的VH序列;(b)SEQIDNO:109的VL序列和SEQIDNO:110的VH序列;或(c)SEQIDNO:111的VL序列和SEQIDNO:112的VH序列。

本文中還提供的是結合RSPO3的分離的抗體,其中該抗體抑制RSPO3與跨膜E3遍在蛋白酶的相互作用。在一些實施方案中,該跨膜E3遍在蛋白酶為ZNRF3和/或RNF43。

在一些實施方案中,該抗體不抑制RSPO3與LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的相互作用(例如增強RSPO3對LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的結合)。

在一些實施方案中,該抗體抑制RSPO3與LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的相互作用。例如,本文中提供的是結合RSPO3的分離的抗體,其中該抗體包含:(a)VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:9的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:10的氨基酸序列的HVR-H3;(b)VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:11的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-H3;(c)VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:19的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:20的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:21的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H3;(d)VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:27的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:28的氨基酸序列的HVR-H3;(e)VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:29的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:30的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:31的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:32的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:33的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:34的氨基酸序列的HVR-H3;(f)VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:35的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:36的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:37的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:38的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:39的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:40的氨基酸序列的HVR-H3;或(g)VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:41的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:42的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:43的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:44的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:45的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:46的氨基酸序列的HVR-H3。在一些實施方案中,該抗體包含VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:27的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:28的氨基酸序列的HVR-H3。在一些實施方案中,該抗體包含VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:29的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:30的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:31的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:32的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:33的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:34的氨基酸序列的HVR-H3。進一步地,本文中提供的是結合RSPO3的分離的抗體,其中該抗體包含(a)VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:27的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:188的氨基酸序列的HVR-H3;或(b)VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:27的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:189的氨基酸序列的HVR-H3。在一些實施方案中,該結合RSPO的分離的抗體包含VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:27的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:28的氨基酸序列的HVR-H3。在一些實施方案中,該結合RSPO的分離的抗體包含VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:27的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:188的氨基酸序列的HVR-H3。在一些實施方案中,該結合RSPO的分離的抗體包含VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:27的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:189的氨基酸序列的HVR-H3。

在一些實施方案中,該抗體包含(a)SEQIDNO:89的VL序列和SEQIDNO:90的VH序列;(b)SEQIDNO:91的VL序列和SEQIDNO:92的VH序列;(c)SEQIDNO:93的VL序列和SEQIDNO:94的VH序列;(d)SEQIDNO:95的VL序列和SEQIDNO:96的VH序列;(e)SEQIDNO:97的VL序列和SEQIDNO:98的VH序列;(f)SEQIDNO:99的VL序列和SEQIDNO:100的VH序列;或(g)SEQIDNO:101的VL序列和SEQIDNO:102的VH序列。在一些實施方案中,該結合RSPO3的分離的抗體包含(a)SEQIDNO:208的VL序列和SEQIDNO:209的VH序列,(b)SEQIDNO:212的VL序列和SEQIDNO:213的VH序列,或(c)SEQIDNO:214的VL序列和SEQIDNO:205的VH序列。在一些實施方案中,該結合RSPO3的分離的抗體包含(a)SEQIDNO:208的VL序列和SEQIDNO:209的VH序列。在一些實施方案中,該結合RSPO3的分離的抗體包含(a)SEQIDNO:212的VL序列和SEQIDNO:213的VH序列。在一些實施方案中,該結合RSPO3的分離的抗體包含(a)SEQIDNO:214的VL序列和SEQIDNO:215的VH序列。

本文中提供的是結合RSPO2和RSPO3的分離的抗體(抗RSPO2/3抗體)。在一些實施方案中,該抗體抑制RSPO2和RSPO3與跨膜E3遍在蛋白酶的相互作用。在一些實施方案中,該跨膜E3遍在蛋白酶為ZNRF3和/或RNF43。在一些實施方案中,該抗體抑制RSPO3與LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的相互作用。在一些實施方案中,該抗體不抑制RSPO3與LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的相互作用(例如增強RSPO3對LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的結合)。在一些實施方案中,該抗體抑制RSPO2與LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的相互作用。在一些實施方案中,該抗體不抑制RSPO2與LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的相互作用(例如增強RSPO2對LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的結合)。

例如,本文中提供的是結合RSPO2和RSPO3的抗體,其中該抗體包含:(a)VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:47的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:48的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:49的氨基酸序列的HVR-L3;和(b)VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:50的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:51的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:52的氨基酸序列的HVR-H3。在一些實施方案中,該抗體包含(a)SEQIDNO:103的VL序列和SEQIDNO:104的VH序列。

在任何抗RSPO2/3抗體的一些實施方案中,該抗體包含第一可變域和第二可變域,其中該第一可變域包含第一套6種HVR且該第二可變域包含第二套6種HVR,且其中該第一套和第二套6種HVR是相同的。在一些實施方案中,該第一套6種HVR和該第二套6種HVR是26E11的6種HVR。

在任何抗RSPO2/3抗體的一些實施方案中,該抗體包含第一可變域和第二可變域,其中該第一可變域包含第一套6種HVR且該第二可變域包含第二套6種HVR,且其中該第一套和第二套6種HVR是不同的。在一些實施方案中,該第一套6種HVR是4H1,4D4,5C2,5D6,5E11,6E9,和21C2中任一項的6種HVR且該第二套6種HVR是1A1,11F11,36D2,和49G5中任一項的6種HVR。在一些實施方案中,該第一套6種HVR是4H1,4D4,5C2,5D6,5E11,6E9,和21C2中任一項的6種HVR且該第二套6種HVR是1A1的6種HVR。

本文中還提供的是結合RSPO3的分離的抗體,其中該抗體包含:(a)VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:78的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:79的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:80的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:81的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:82的氨基酸序列的HVR-H3;或(b)VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:83的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:84的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:85的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:86的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:87的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:88的氨基酸序列的HVR-H3。本文中還提供的是結合RSPO3的分離的抗體,其中該抗體包含:(a)VL,該VL包含(i)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:78的氨基酸序列的HVR-L2,和(iii)包含SEQIDNO:79的氨基酸序列的HVR-L3;和VH,該VH包含(i)包含SEQIDNO:80的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:81的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:216的氨基酸序列的HVR-H3。

本文中還提供的是結合RSPO3的分離的抗體,其中該抗體結合RSPO3的氨基酸47-108內的一個區域(例如49-108)。

本文中還提供的是結合RSPO3表位的分離的抗體,而且在任何抗體的一些實施方案中,其中該RSPO3表位包含RSPO3的氨基酸殘基:Gln72,Pro90,Asp91,和Lys94。在一些實施方案中,該RSPO3表位包含RSPO3的氨基酸:Asn52,Leu55,Phe63,Gln72,Tyr89,Pro90,Asp91,Lys94,和Lys97。在一些實施方案中,該RSPO3表位包含RSPO3的氨基酸殘基:Ser49,Asn52,Cys54,Leu55,Ser56,Phe63,Leu65,Gln72,Ile73,Gly74,Tyr84,Tyr89,Pro90,Asp91,Ile92,Lys94,Lys97,和Lys108。

本文中還提供的是結合RSPO3表位的分離的抗體,而且在任何抗體的一些實施方案中,其中該RSPO3表位包含RSPO3的氨基酸:Thr47,Leu55,Gln72,Pro90,Asp91,和Lys94。在一些實施方案中,該RSPO3表位包含RSPO3的氨基酸:Thr47,Asn52,Leu55,Phe63,Gln72,Tyr89,Pro90,Asp91,Ile92,Lys94,和Lys97。在一些實施方案中,該RSPO3表位包含RSPO3的氨基酸殘基:Thr47,Asn52,Cys54,Leu55,Ser56,Phe63,Leu65,Gln72,Tyr84,Tyr89,Pro90,Asp91,Ile92,Asn93,Lys94,Lys97,和Lys108。

本文中還提供的是結合RSPO3表位的分離的抗體,而且在任何抗體的一些實施方案中,其中該RSPO3表位包含選自RSPO3的Ser49,Asn52,Cys54,Leu55,Ser56,Phe63,Leu65,Gln72,Ile73,Gly74,Tyr84,Tyr89,Pro90,Asp91,Ile92,Lys94,和Lys108的一個或多個氨基酸。在一些實施方案中,該RSPO3表位包含RSPO3的氨基酸殘基:Ser49,Asn52,Cys54,Leu55,Ser56,Phe63,Leu65,Gln72,Ile73,Gly74,Tyr84,Tyr89,Pro90,Asp91,Ile92,Lys94,和Lys108。

本文中還提供的是結合RSPO3表位的分離的抗體,而且在任何抗體的一些實施方案中,其中該RSPO3表位包含選自RSPO3的Ser49,Asn52,Cys54,Leu55,Ser56,Phe63,Leu65,Gln72,Ile73,Gly74,Tyr84,Tyr89,Pro90,Asp91,Ile92,Lys94,Lys97,和Lys108的一個或多個氨基酸。在一些實施方案中,該RSPO3表位包含RSPO3的氨基酸殘基:Ser49,Asn52,Cys54,Leu55,Ser56,Phe63,Leu65,Gln72,Ile73,Gly74,Tyr84,Tyr89,Pro90,Asp91,Ile92,Lys94,Lys97,和Lys108。

本文中還提供的是結合RSPO3表位的分離的抗體,其中該RSPO3表位包含選自RSPO3的Thr47,Asn52,Cys54,Leu55,Ser56,Phe63,Leu65,Gln72,Tyr84,Tyr89,Pro90,Asp91,Ile92,Asn93,Lys94,Lys97,和Lys108的一個或多個氨基酸。在一些實施方案中,該RSPO3表位包含RSPO3的氨基酸殘基:Thr47,Asn52,Cys54,Leu55,Ser56,Phe63,Leu65,Gln72,Tyr84,Tyr89,Pro90,Asp91,Ile92,Asn93,Lys94,Lys97,和Lys108。

在任何抗體的一些實施方案中,該抗體抑制RSPO2和RSPO3與跨膜E3遍在蛋白酶的相互作用。在一些實施方案中,該跨膜E3遍在蛋白酶為ZNRF3和/或RNF43。在一些實施方案中,該抗體抑制RSPO3與LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的相互作用。

在任何抗RSPO抗體的一些實施方案中,該抗體抑制RSPO2和/或RSPO3介導的wnt信號傳導。在任何抗RSPO抗體的一些實施方案中,該抗體為結合RSPO2和/或RSPO3的抗體片段。在任何抗RSPO抗體的一些實施方案中,該抗體片段抑制RSPO2和/或RSPO3介導的wnt信號傳導。在任何抗RSPO抗體的一些實施方案中,該抗體抑制癌干細胞生長。在任何抗RSPO抗體的一些實施方案中,該抗體誘導和/或促進癌細胞(例如癌干細胞)分化(例如終末分化和/或分化成祖細胞)。

在任何抗RSPO抗體的一些實施方案中,該抗體為單克隆抗體。在任何抗RSPO抗體的一些實施方案中,該抗體為人,人源化,或嵌合抗體。在任何抗RSPO抗體的一些實施方案中,該抗體為全長IgG1抗體。在任何抗RSPO抗體的一些實施方案中,該抗體具有降低的或消減的效應器功能。在任何抗RSPO抗體的一些實施方案中,該抗RSPO抗體在依照EU編號規則的氨基酸位置297處包含工程化改造的丙氨酸。在任何抗RSPO抗體的一些實施方案中,該抗RSPO抗體在依照EU編號規則的氨基酸位置265處包含工程化改造的丙氨酸。

在任何抗RSPO抗體的一些實施方案中,該抗體用作藥物。在任何抗RSPO抗體的一些實施方案中,該抗體用于治療癌癥。在一些實施方案中,該癌癥為胃腸癌,胃癌,結腸癌,結直腸癌,或直腸癌。在一些實施方案中,該癌癥特征在于一種或多種RSPO(例如RSPO2和/或RSPO3)與參照相比升高的表達。在一些實施方案中,該癌癥特征在于RSPO易位(例如RSPO2易位和/或RSPO3易位)。在任何抗RSPO抗體的一些實施方案中,該抗體用于抑制wnt信號傳導,抑制血管發生和/或血管形成,和/或抑制細胞增殖。

本文中還提供的是編碼本文所述抗體的分離的核酸。本文中進一步提供的是包含本文所述抗體的核酸的宿主細胞。本文中提供的是生產本文所述抗體的方法,其包括培養包含本文所述抗體的核酸的宿主細胞,使得該抗體生成。在一些實施方案中,該生產方法進一步包括自該宿主細胞回收該抗體。

本文中提供的是包含本文所述抗體和細胞毒劑的免疫綴合物。

本文中進一步提供的是包含本文所述抗體和藥學可接受載劑的藥物配制劑。在一些實施方案中,該藥物配制劑進一步包含別的治療劑。在一些實施方案中,該別的治療劑為紫杉烷。在一些實施方案中,該紫杉烷為帕利他賽或多西他賽。在一些實施方案中,該別的治療劑為鉑劑。在一些實施方案中,該鉑劑為卡鉑,奧沙利鉑,和/或順鉑。在一些實施方案中,該別的治療劑為拓撲異構酶抑制劑。在一些實施方案中,該拓撲異構酶抑制劑為伊立替康(irinotecan),托泊替康(topotecan),依托泊苷(etoposide),和/或米托蒽醌(mitoxantrone)。在一些實施方案中,該別的治療劑為亞葉酸(folinicacid)(例如Leucovorin)。在一些實施方案中,該別的治療劑為核苷代謝抑制劑。在一些實施方案中,該核苷代謝抑制劑為氟尿嘧啶(fluorouracil),卡培他濱(capecitabine),和/或吉西他濱(gemcitabine)。在一些實施方案中,該別的治療劑為亞葉酸,5-氟尿嘧啶,和/或奧沙利鉑。在一些實施方案中,該別的治療劑為5-氟尿嘧啶和伊立替康。在一些實施方案中,該別的治療劑為紫杉烷和鉑劑。在一些實施方案中,該別的治療劑為帕利他賽和卡鉑。在一些實施方案中,該別的治療劑為培美曲塞(pemetrexate)。在一些實施方案中,該別的治療劑為hedgehog抑制劑(例如維莫德吉(vismodegib))。

本文中提供的是本文所述抗體在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。在一些實施方案中,該癌癥為胃腸癌,胃癌,結腸癌,結直腸癌,或直腸癌。在一些實施方案中,該癌癥為肺癌。在一些實施方案中,該癌癥特征在于一種或多種RSPO(例如RSPO2和/或RSPO3)與參照相比升高的表達。在一些實施方案中,該癌癥特征在于RSPO易位(例如RSPO2易位和/或RSPO3易位)。進一步,本文中提供的是本文所述抗體在制備用于抑制wnt信號傳導,抑制血管發生和/或血管形成,和/或抑制細胞增殖的藥物中的用途。在一些實施方案中,該抗RSPO抗體與別的治療劑組合使用(例如順序或并行施用)。在一些實施方案中,該別的治療劑為紫杉烷。在一些實施方案中,該紫杉烷為帕利他賽或多西他賽。在一些實施方案中,該別的治療劑為鉑劑。在一些實施方案中,該鉑劑為卡鉑,奧沙利鉑,和/或順鉑。在一些實施方案中,該別的治療劑為拓撲異構酶抑制劑。在一些實施方案中,該拓撲異構酶抑制劑為伊立替康,托泊替康,依托泊苷,和/或米托蒽醌。在一些實施方案中,該別的治療劑為亞葉酸(例如Leucovorin)。在一些實施方案中,該別的治療劑為核苷代謝抑制劑。在一些實施方案中,該核苷代謝抑制劑為氟尿嘧啶,卡培他濱,和/或吉西他濱。在一些實施方案中,該別的治療劑為亞葉酸,5-氟尿嘧啶,和/或奧沙利鉑。在一些實施方案中,該別的治療劑為5-氟尿嘧啶和伊立替康。在一些實施方案中,該別的治療劑為紫杉烷和鉑劑。在一些實施方案中,該別的治療劑為帕利他賽和卡鉑。在一些實施方案中,該別的治療劑為培美曲塞。在一些實施方案中,該別的治療劑為hedgehog抑制劑(例如維莫德吉)。

本文中提供的是治療具有癌癥的個體的方法,其包括對該個體施用有效量的本文所述抗體。在一些實施方案中,該癌癥為胃腸癌,胃癌,結腸癌,結直腸癌,或直腸癌。在一些實施方案中,該癌癥為肺癌。在一些實施方案中,該方法進一步包括對該個體施用別的治療劑。在一些實施方案中,該癌癥特征在于一種或多種RSPO(例如RSPO2和/或RSPO3)與參照相比升高的表達。在一些實施方案中,該癌癥特征在于RSPO易位(例如RSPO2易位和/或RSPO3易位)。本文中還提供的是在個體中抑制wnt信號傳導,抑制血管發生和/或血管形成,和/或抑制細胞增殖的方法,其包括對該個體施用有效量的本文所述抗體以抑制wnt信號傳導,抑制血管發生和/或血管形成,和/或抑制細胞增殖。在一些實施方案中,該方法包括施用別的治療劑。在一些實施方案中,該別的治療劑為紫杉烷。在一些實施方案中,該紫杉烷為帕利他賽或多西他賽。在一些實施方案中,該別的治療劑為鉑劑。在一些實施方案中,該鉑劑為卡鉑,奧沙利鉑,和/或順鉑。在一些實施方案中,該別的治療劑為拓撲異構酶抑制劑。在一些實施方案中,該拓撲異構酶抑制劑為伊立替康,托泊替康,依托泊苷,和/或米托蒽醌。在一些實施方案中,該別的治療劑為亞葉酸(例如Leucovorin)。在一些實施方案中,該別的治療劑為核苷代謝抑制劑。在一些實施方案中,該核苷代謝抑制劑為氟尿嘧啶,卡培他濱,和/或吉西他濱。在一些實施方案中,該別的治療劑為亞葉酸,5-氟尿嘧啶,和/或奧沙利鉑。在一些實施方案中,該別的治療劑為5-氟尿嘧啶和伊立替康。在一些實施方案中,該別的治療劑為紫杉烷和鉑劑。在一些實施方案中,該別的治療劑為帕利他賽和卡鉑。在一些實施方案中,該別的治療劑為培美曲塞。在一些實施方案中,該別的治療劑為hedgehog抑制劑(例如維莫德吉)。

附圖簡述

圖1A-B。對一組抗RSPO2和抗RSPO3抗體測試阻斷重組人(rh)RSPO2刺激的(A)和/或rhRSPO3刺激的(B)WNT報告物活性的能力。一個子集的抗體阻斷rhRSPO2和/或rhRSPO3刺激的WNT報告物活性。用10ng/ml重組小鼠(rm)Wnt3a,50pMrhRSPO2(A)或rhRSPO3(B),和漸增濃度的所示抗體克隆刺激WNT報告細胞。將數據針對在抗體缺失下存在的刺激的量標準化。

圖2A-I。對一組抗RSPO2和抗RSPO3抗體測試對表達RSPO3的細胞團粒(A-C),表達RSPO2的細胞團粒(D-F),表達RSPO1的細胞團粒(G),表達RSPO4的細胞團粒(H),和不表達RSPO1-4的細胞(293細胞)(I)的IHC反應性。如圖2所示,如通過IHC反應性測定的,抗體49G5識別表達RSPO2的細胞團粒,但不識別表達RSPO3的,表達RSPO1的,表達RSPO4的,和不表達RSPO1-4的細胞團粒。表4顯示了測試IHC反應性的抗體的完整列表。如通過IHC反應性測定的,表4中測試的所有抗體均不識別表達RSPO1的,表達RSPO4的,和不表達RSPO1-4的細胞團粒。

圖3A-D。對一組抗RSPO2和抗RSPO3抗體測試抑制rhRSPO2(A),重組食蟹猴(rcyno)RSPO2(B),小鼠(m)RSPO2(C),和rhRSPO2L186P變體(D)刺激wnt報告物活性的能力。用10ng/mlrmWnt3a,50pMrhRSPO2(A),8pMrcynoRSPO2(Genentech)(B),90pMmRSPO2(R&DSystems)(C),或38pMrhRSPO2L186P(Genentech)(D)任一和漸增濃度的所示抗體克隆刺激WNT報告細胞。

圖4A-D。對一組抗RSPO2和抗RSPO3抗體測試抑制由rhRSPO3(A),rcynoRSPO3(B),mRSPO3(C),和PTPRK融合-RSPO3(D)刺激的WNT報告物活性的能力。用10ng/mlrmWnt3a,50pMrhRSPO3(A),13pMcynoRSPO3(Genentech)(B),或17pMmRSPO3(R&DSystems)(C)任一和漸增濃度的所示抗體克隆刺激WNT報告細胞。在圖4D中,在5ug/ml抗RSPO3缺失或存在下用10ng/mlrmWNT3a,自經所示DNA轉染的293T細胞制備的條件化培養基刺激WNT報告細胞。

圖5。9個抗RSPO2和抗RSPO3克隆的親和力和IC50測量。所示克隆的Fab對所示重組(r)RSPO2和rRSPO3的親和力是通過表面等離振子共振測定的。所示克隆的IC50測量是通過用EC50的所示rRSPO和漸增濃度的每一種抗體刺激WNT報告物測定法而測定的。H,人;C,食蟹猴;M,小鼠;-,無結合或IC50>500nM。

圖6A-B。對一組抗RSPO2和抗RSPO3抗體測試它們抑制LGR4結合rhRSPO2(A)和rhRSPO3(B)的能力。通過競爭性結合ELISA對抗體克隆個體測試抑制LGR4-ECD結合rhRSPO2(A)或rhRSPO3(B)的能力。對LGR5看到相似的結果(未顯示的數據)。結果的匯總見表5。

圖7A-B。對一組抗RSPO2和抗RSPO3抗體測試它們抑制RNF43結合rhRSPO2(A)和rhRSPO3(B)的能力。通過競爭性結合ELISA對抗體克隆個體測試抑制RNF43-ECD結合rhRSPO2(A)或rhRSPO3(B)的能力。對LGR5看到相似的結果(未顯示的數據)。結果的匯總見表5。

圖8A-B。結晶的與Fab26E11復合的RSPO3(33-210)的模型(A)。(B)中顯示Fab26E11/RSPO3相互作用的放大。

圖9A-B。5D6,26E11,4H1,5C2,5E11,4D4,6E9和21C2的可變輕鏈區序列(A)和可變重鏈區序列(B)的比對。依照Kabat定義的CDR序列標有下劃線。

圖10A-B。11F11,1A1,36D2,和49G5的可變輕鏈區序列(A)和可變重鏈區序列(B)的比對。依照Kabat定義的CDR序列標有下劃線。

圖11A-D。用30mg/kg抗RSPO3抗體(5D6)或抗豚草抗體(對照)處理后4種結直腸癌患者衍生的模型(A-D)中均值腫瘤體積(mm3)的變化。圖11D還顯示用抗RSPO3抗體(5D6)與伊立替康(100mg/kg,第0天和第3天)的組合或抗豚草抗體(對照)和伊立替康(100mg/kg,第0天和第3天)處理后CRCD結直腸癌患者衍生的模型中均值腫瘤體積(mm3)的變化。

圖12A-D。用抗豚草抗體(對照)或抗RSPO3抗體(5D6)(30mg/kg)處理的結直腸癌患者衍生的模型腫瘤在最后一劑后2-3周用蘇木精和曙紅染劑(H&E染劑)(A和C)和AlcianBlue染劑(B和D)進行的染色。用抗RSPO3處理的腫瘤具有獨特的組織病理學,特別是粘液與抗豚草抗體對照相比顯著增多,如通過AlcianBlue染色所示的。

圖13A-C。(A)顯示用(i)抗RSPO3抗體(5D6),(ii)抗豚草抗體(對照),(iii)抗RSPO3抗體(5D6)與伊立替康(100mg/kg,第0天)的組合,或抗豚草抗體(對照)和伊立替康(100mg/kg,第0天)處理后CRCC結直腸癌患者衍生的模型的均值腫瘤體積(mm3)。(B-C)顯示連續移植實驗,其中結直腸癌患者衍生的模型(a)用抗RSPO3抗體(5D6)或抗豚草抗體(對照;30mg/kg)處理,(b)移植并用抗RSPO3抗體(5D6)或抗豚草抗體(對照)處理。(B)顯示最初或在連續移植時用抗RSPO3抗體(5D6)處理后連續移植的腫瘤的百分比腫瘤(移植物)植入率的實質性降低。(C)顯示最初或在連續移植時用抗RSPO3抗體(5D6)處理后連續移植的腫瘤的變化均值腫瘤體積的顯著降低。

圖14A-B。5D6,5D6v1,5D6v2.1,5D6v2.2,5D6v2.3,5D6v2.4,5D6v2.8,5D6v2.10,5D6v3.2,5D6v3.3,5D6v4.1,5D6v4.3,5D6v5.1,和5D6v5.2的可變輕鏈區序列(A)和可變重鏈區序列(B)的比對。依照Kabat定義的CDR序列標有下劃線。

發明詳述

I.定義

如本文中使用的,術語“R-spondin”和“RSPO”指來自任何脊椎動物來源,包括哺乳動物諸如靈長類(例如人)和嚙齒類(例如小鼠和大鼠)的任何天然RSPO(例如RSPO1,RSPO2,RSPO3,和/或RSPO4),除非另有說明。該術語涵蓋“全長”,未加工的RSPO以及因細胞中的加工所致的任何形式的RSPO。該術語還涵蓋RSPO的天然存在變體,例如剪接變體或等位變體。在一些實施方案中,一種例示性人RSPO的氨基酸序列為RSPO1,例如顯示于SEQIDNO:3。在一些實施方案中,一種例示性人RSPO的氨基酸序列為RSPO2,例如顯示于SEQIDNO:1。在一些實施方案中,一種例示性人RSPO的氨基酸序列為RSPO3,例如顯示于SEQIDNO:2。在一些實施方案中,一種例示性人RSPO的氨基酸序列為RSPO4,例如顯示于SEQIDNO:4。

如本文中使用的,術語“R-spondin2”和“RSPO2”指來自任何脊椎動物來源,包括哺乳動物諸如靈長類(例如人)和嚙齒類(例如小鼠和大鼠)的任何天然RSPO2,除非另有說明。該術語涵蓋“全長”,未加工的RSPO2以及因細胞中的加工所致的任何形式的RSPO2。該術語還涵蓋RSPO2的天然存在變體,例如剪接變體或等位變體。在一些實施方案中,一種例示性人RSPO2的氨基酸序列為截止2013年10月18日的UNIPROTQ6UXX9-1。在一些實施方案中,一種例示性人RSPO2的氨基酸序列為截止2013年10月18日的UNIPROTQ6UXX9-2。在一些實施方案中,一種例示性人RSPO2的氨基酸序列為截止2013年10月18日的UNIPROTQ6UXX9-3。在一些實施方案中,一種例示性人RSPO2的氨基酸序列顯示于SEQIDNO:1。

如本文中使用的,術語“R-spondin3”和“RSPO3”指來自任何脊椎動物來源,包括哺乳動物諸如靈長類(例如人)和嚙齒類(例如小鼠和大鼠)的任何天然RSPO3,除非另有說明。該術語涵蓋“全長”,未加工的RSPO3以及因細胞中的加工所致的任何形式的RSPO3。該術語還涵蓋RSPO3的天然存在變體,例如剪接變體或等位變體。在一些實施方案中,一種例示性人RSPO2的氨基酸序列為截止2013年10月18日的UNIPROTQ9BXY4-1。在一些實施方案中,一種例示性人RSPO2的氨基酸序列為截止2013年10月18日的UNIPROTQ9BXY4-2。在一些實施方案中,一種例示性人RSPO3的氨基酸序列顯示于SEQIDNO:2。

出于本文中的目的,“受體人框架”指包含自人免疫球蛋白框架或如下文定義的人共有框架衍生的輕鏈可變域(VL)框架或重鏈可變域(VH)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受體人框架可以包含其相同的氨基酸序列,或者它可以含有氨基酸序列變化。在一些實施方案中,氨基酸變化的數目是10或更少,9或更少,8或更少,7或更少,6或更少,5或更少,4或更少,3或更少,或2或更少。在一些實施方案中,VL受體人框架與VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。

“親和力”指分子(例如抗體)的單一結合位點與其結合配偶(例如抗原)之間全部非共價相互作用總和的強度。除非另有指示,如本文中使用的,“結合親和力”指反映結合對的成員(例如抗體和抗原)之間1:1相互作用的內在結合親和力。分子X對其配偶Y的親和力通常可以用解離常數(Kd)來表述。親和力可以通過本領域知道的常用方法來測量,包括本文中所描述的方法。下文描述了用于測量結合親和力的具體的說明性和例示性的實施方案。

“親和力成熟的”抗體指在一個或多個高變區(HVR)中具有一處或多處改變的抗體,與不擁有此類改變的親本抗體相比,此類改變導致該抗體對抗原的親和力改善。

術語“抗RSPO2抗體”和“結合RSPO2的抗體”指能夠以足夠親和力結合RSPO2,使得該抗體可作為診斷劑和/或治療劑用于靶向RSPO2的抗體。在一個實施方案中,根據例如通過放射免疫測定法(RIA)的測量,抗RSPO2抗體結合非RSPO2的蛋白質的程度小于該抗體對RSPO2的結合的約10%。在某些實施方案中,結合RSPO2的抗體具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM,或≤0.001nM(例如10-8M或更少,例如10-8M到10-13M,例如10-9M到10-13M)的解離常數(Kd)。在某些實施方案中,抗RSPO2抗體結合在來自不同物種的RSPO2中保守的RSPO2表位。

術語“抗RSPO3抗體”和“結合RSPO3的抗體”指能夠以足夠親和力結合RSPO3,使得該抗體可作為診斷劑和/或治療劑用于靶向RSPO3的抗體。在一個實施方案中,根據例如通過放射免疫測定法(RIA)的測量,抗RSPO3抗體結合非RSPO3的蛋白質的程度小于該抗體對RSPO3的結合的約10%。在某些實施方案中,結合RSPO3的抗體具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM,或≤0.001nM(例如10-8M或更少,例如10-8M至10-13M,例如10-9M至10-13M)的解離常數(Kd)。在某些實施方案中,抗RSPO3抗體結合在來自不同物種的RSPO3中保守的RSPO3表位。

術語“抗RSPO2/3抗體”和“結合RSPO2和RSPO3的抗體”指能夠以足夠親和力結合RSPO2和RSPO3,使得該抗體可作為診斷劑和/或治療劑用于靶向RSPO2和RSPO3的抗體。在一個實施方案中,根據例如通過放射免疫測定法(RIA)的測量,抗RSPO2/3抗體結合非RSPO2或非RSPO3的蛋白質的程度小于該抗體對RSPO2和RSPO3的結合的約10%。在某些實施方案中,結合RSPO2和RSPO3的抗體具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM,或≤0.001nM(例如10-8M或更少,例如10-8M至10-13M,例如10-9M至10-13M)的解離常數(Kd)。在某些實施方案中,抗RSPO2/3抗體結合在來自不同物種的RSPO2和/或RSPO3中保守的RSPO2和/或RSPO3表位。

本文中的術語“抗體”以最廣義使用,并且涵蓋各種抗體結構,包括但不限于單克隆抗體,多克隆抗體,多特異性抗體(例如雙特異性抗體),和抗體片段,只要它們展現出期望的抗原結合活性。

“抗體片段”指與完整抗體不同的分子,其包含完整抗體中結合完整抗體所結合的抗原的部分。抗體片段的例子包括但不限于Fv,Fab,Fab’,Fab’-SH,F(ab’)2;雙抗體;線性抗體;單鏈抗體分子(例如scFv);和自抗體片段形成的多特異性抗體。

與參照抗體“競爭結合的抗體”指在競爭測定法中將參照抗體對其抗原的結合阻斷50%或更多的抗體,且相反,參照抗體在競爭測定法中將該抗體對其抗原的結合阻斷50%或更多。本文中提供了例示性的競爭測定法。

術語“嵌合”抗體指其中的重和/或輕鏈的一部分自特定的來源或物種衍生,而重和/或輕鏈的剩余部分自不同來源或物種衍生的抗體。

抗體的“類”指其重鏈擁有的恒定域或恒定區的類型。抗體有5大類:IgA,IgD,IgE,IgG,和IgM,并且這些中的幾種可以進一步分成亞類(同種型),例如,IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1,和IgA2。與不同類免疫球蛋白對應的重鏈恒定域分別稱作α,δ,ε,γ,和μ。

“效應器功能”指那些可歸于抗體Fc區且隨抗體同種型而變化的生物學活性。抗體效應器功能的例子包括:C1q結合和補體依賴性細胞毒性(CDC);Fc受體結合;抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC);吞噬作用;細胞表面受體(例如B細胞受體)下調;和B細胞活化。

本文中的術語“Fc區”用于定義免疫球蛋白重鏈中至少含有恒定區一部分的C端區。該術語包括天然序列Fc區和變體Fc區。在一個實施方案中,人IgG重鏈Fc區自Cys226,或自Pro230延伸至重鏈的羧基端。然而,Fc區的C端賴氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有規定,Fc區或恒定區中的氨基酸殘基的編號方式依照EU編號系統,也稱作EU索引,如記載于Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD,1991。

“框架”或“FR”指除高變區(HVR)殘基以外的可變域殘基。可變域的FR一般由4個FR域組成:FR1,FR2,FR3,和FR4。因而,HVR和FR序列在VH(或VL)中一般以如下的順序出現:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

術語“全長抗體”,“完整抗體”,和“全抗體”在本文中可互換使用,指與天然抗體結構具有基本上類似的結構或者具有含有如本文中定義的Fc區的重鏈的抗體。

術語“宿主細胞”,“宿主細胞系”,和“宿主細胞培養物”可互換使用,并且指已經導入有外源核酸的細胞,包括此類細胞的后代。宿主細胞包括“轉化體”和“經轉化的細胞”,其包括原代的經轉化的細胞及自其衍生的后代而不考慮傳代的次數。后代在核酸內容物上可以與親本細胞不完全相同,而是可以含有突變。本文中包括具有與在初始轉化細胞中篩選或選擇的相同功能或生物學活性的突變體后代。

“人抗體”指擁有與由人或人細胞生成的或利用人抗體全集或其它人抗體編碼序列自非人來源衍生的抗體的氨基酸序列對應的氨基酸序列的抗體。人抗體的此定義明確排除包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。

“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列選集中最常存在的氨基酸殘基的框架。通常,人免疫球蛋白VL或VH序列選集來自可變域序列亞組。通常,序列亞組是如Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版,NIHPublication91-3242,BethesdaMD(1991),第1-3卷中的亞組。在一個實施方案中,對于VL,亞組是如Kabat等,見上文中的亞組κI。在一個實施方案中,對于VH,亞組是如Kabat等,見上文中的亞組III。

“人源化”抗體指包含來自非人HVR的氨基酸殘基和來自人FR的氨基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施方案中,人源化抗體會包含至少一個,通常兩個基本上整個如下可變域,其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)對應于非人抗體的那些,且所有或基本上所有FR對應于人抗體的那些。任選地,人源化抗體可以至少包含自人抗體衍生的抗體恒定區的一部分。抗體(例如非人抗體)的“人源化形式”指已經經歷人源化的抗體。

如本文中使用的,術語“高變區”或“HVR”指抗體可變域中在序列上高變的(“互補決定區”或“CDR”)和/或形成結構上定義的環(“高變環”)和/或含有抗原接觸殘基(“抗原接觸”)的每個區。通常,抗體包含6個HVR:三個在VH中(H1,H2,H3),且三個在VL中(L1,L2,L3)。本文中的例示性HVR包括:

(a)高變環,存在于氨基酸殘基26-32(L1),50-52(L2),91-96(L3),26-32(H1),53-55(H2),和96-101(H3)(ChothiaandLesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987));

(b)CDR,存在于氨基酸殘基24-34(L1),50-56(L2),89-97(L3),31-35b(H1),50-65(H2),和95-102(H3)(Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991));

(c)抗原接觸,存在于氨基酸殘基27c-36(L1),46-55(L2),89-96(L3),30-35b(H1),47-58(H2),和93-101(H3)(MacCallum等,J.Mol.Biol.262:732-745(1996));和

(d)(a),(b),和/或(c)的組合,包括HVR氨基酸殘基46-56(L2),47-56(L2),48-56(L2),49-56(L2),26-35(H1),26-35b(H1),49-65(H2),93-102(H3),和94-102(H3)。

在一個實施方案中,HVR殘基包含圖9A-B和/或圖10A-B或說明書中其它部分中鑒定的那些。

除非另有說明,HVR殘基及可變域中的其它殘基(例如FR殘基)在本文中是依照Kabat等,見上文編號的。

術語“可變區”或“可變域”指抗體重或輕鏈中牽涉抗體結合抗原的域。天然抗體的重鏈和輕鏈可變域(分別為VH和VL)一般具有類似的結構,其中每個域包含4個保守的框架區(FR)和3個高變區(HVR)(見例如Kindt等,KubyImmunology,第6版,W.H.FreemanandCo.,第91頁(2007))。單個VH或VL域可以足以賦予抗原結合特異性。此外,可以分別使用來自結合抗原的抗體的VH或VL域篩選互補VL或VH域的文庫來分離結合特定抗原的抗體。見例如,Portolano等,J.Immunol.150:880-887(1993);Clarkson等,Nature352:624-628(1991)。

如本文中使用的,術語“載體”指能夠增殖與其連接的另一種核酸的核酸分子。該術語包括作為自身復制型核酸結構的載體及整合入接受其導入的宿主細胞的基因組中的載體。某些載體能夠指導與其可操作連接的核酸的表達。此類載體在本文中稱為“表達載體”。

“免疫綴合物”指與一種或多種異源分子(包括但不限于細胞毒劑)綴合的抗體。

“分離的”抗體指已經與其天然環境的一種成分分開的抗體。在一些實施方案中,抗體純化至大于95%或99%的純度,如通過例如電泳(例如,SDS-PAGE,等電聚焦(IEF),毛細管電泳)或層析(例如,離子交換或反相HPLC)測定的。關于用于評估抗體純度的方法的綜述,見例如Flatman等,J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。

“分離的”核酸指已經與其天然環境的一種成分分開的核酸分子。分離的核酸包括通常含有核酸分子的細胞中含有的核酸分子,但是核酸分子在染色體外或在與其天然染色體位置不同的染色體位置處存在。

“編碼抗RSPO2抗體的分離的核酸”指編碼抗體重和輕鏈(或其片段)的一種或多種核酸分子,包括單一載體或不同載體中的此類核酸分子,和存在于宿主細胞中的一個或多個位置的此類核酸分子。

“編碼抗RSPO3抗體的分離的核酸”指編碼抗體重和輕鏈(或其片段)的一種或多種核酸分子,包括單一載體或不同載體中的此類核酸分子,和存在于宿主細胞中的一個或多個位置的此類核酸分子。

如本文中使用的,術語“單克隆抗體”指從一群基本上同質的抗體獲得的抗體,即構成群體的各個抗體是相同的和/或結合相同表位,除了例如含有天然存在的突變或在單克隆抗體制備物的生成期間發生的可能的變體抗體外,此類變體一般以極小量存在。與通常包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同,單克隆抗體制備物的每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。如此,修飾語“單克隆”指示抗體自一群基本上同質的抗體獲得的特性,而不應解釋為要求通過任何特定方法來生成抗體。例如,可以通過多種技術來生成要依照本發明使用的單克隆抗體,包括但不限于雜交瘤方法,重組DNA方法,噬菌體展示方法,和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的轉基因動物的方法,本文中描述了用于生成單克隆抗體的此類方法和其它例示性方法。

“裸抗體”指未與異源模塊(例如細胞毒性模塊)或放射性標記物綴合的抗體。裸抗體可以存在于藥物配制劑中。

“天然抗體”指具有不同結構的天然存在的免疫球蛋白分子。例如,天然IgG抗體是約150,000道爾頓的異四聚糖蛋白,由二硫化物鍵合的兩條相同輕鏈和兩條相同重鏈構成。從N至C端,每條重鏈具有一個可變區(VH),也稱作可變重域或重鏈可變域,接著是三個恒定域(CH1,CH2,和CH3)。類似地,從N至C端,每條輕鏈具有一個可變區(VL),也稱作可變輕域或輕鏈可變域,接著是一個恒定輕(CL)域。根據其恒定域氨基酸序列,抗體輕鏈可歸入兩種型中的一種,稱作卡帕(κ)和拉姆達(λ)。

術語“包裝插頁”用于指治療產品的商業包裝中通常包含的用法說明書,其含有關于涉及此類治療產品應用的適應癥,用法,劑量,施用,聯合療法,禁忌癥和/或警告的信息。

關于參照多肽序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”定義為比對序列并在必要時引入缺口以獲取最大百分比序列同一性后,且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時,候選序列中與參照多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。為測定百分比氨基酸序列同一性目的的比對可以以本領域技術范圍內的多種方式進行,例如使用公眾可得到的計算機軟件,諸如BLAST,BLAST-2,ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。本領域技術人員能決定用于比對序列的合適參數,包括對所比較序列全長獲得最大比對所需的任何算法。然而,為了本發明的目的,%氨基酸序列同一性值是使用序列比較計算機程序ALIGN-2產生的。ALIGN-2序列比較計算機程序由Genentech,Inc.編寫,并且源代碼已經連同用戶文檔一起提交給美國版權局(USCopyrightOffice,WashingtonD.C.,20559),其中其以美國版權注冊號TXU510087注冊。公眾自Genentech,Inc.(SouthSanFrancisco,California)可獲得ALIGN-2程序,或者可以從源代碼編譯。ALIGN-2程序應當編譯成在UNIX操作系統(包括數碼UNIXV4.0D)上使用。所有序列比較參數由ALIGN-2程序設定且不變。

在采用ALIGN-2來比較氨基酸序列的情況中,給定氨基酸序列A相對于(to),與(with),或針對(against)給定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性(或者可表述為具有或包含相對于,與,或針對給定氨基酸序列B的某一%氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A)如下計算:

分數X/Y乘100

其中X是由序列比對程序ALIGN-2在該程序的A和B比對中評分為相同匹配的氨基酸殘基數,且其中Y是B中的氨基酸殘基總數。應當領會,若氨基酸序列A的長度與氨基酸序列B的長度不相等,則A相對于B的%氨基酸序列同一性將不等于B相對于A的%氨基酸序列同一性。除非另有明確說明,本文中所使用的所有%氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述,使用ALIGN-2計算機程序獲得的。

術語“R-spondin易位”和“RSPO易位”在本文中指如下的R-spondin,其中斷裂染色體包括例如R-spondin,其變體,或片段或第二基因,其變體,或片段的一部分重附著于不同的染色體位置,例如與R-spondin天然位置不同的染色體位置或R-spondin天然位置之中和/或周圍與第二基因天然位置不同的染色體位置。R-spondin易位可以是RSPO1易位,RSPO2易位,RSPO3易位,和/或RSPO4易位。

術語“R-spondin易位融合多核苷酸”和“RSPO易位融合多核苷酸”在本文中指R-spondin易位基因產物或融合多核苷酸的核酸序列。R-spondin易位融合多核苷酸可以是RSPO1易位融合多核苷酸,RSPO2易位融合多核苷酸,RSPO3易位融合多核苷酸,和/或RSPO4易位融合多核苷酸。術語“R-spondin易位融合多肽”和“RSPO易位融合多肽”在本文中指R-spondin易位基因產物或融合多核苷酸的氨基酸序列。R-spondin易位融合多肽可以是RSPO1易位融合多肽,RSPO2易位融合多肽,RSPO3易位融合多肽,和/或RSPO4易位融合多肽。

術語“檢測”包括任何檢測手段,包括直接和間接檢測。

如本文中使用的,術語“生物標志物”指可在樣品中檢測的指示物,例如預測性,診斷性和/或預后性的指示物。生物標志物可以充當由特定的分子,病理學,組織學和/或臨床特征表征的特定疾病或病癥(例如癌癥)亞型的指示物。在一些實施方案中,生物標志物是一種基因。在一些實施方案中,生物標志物是基因的一種變異(例如突變和/或多態性)。在一些實施方案中,生物標志物是易位。生物標志物包括但不限于多核苷酸(例如DNA和/或RNA),多肽,多肽和多核苷酸修飾(例如翻譯后修飾),碳水化合物和/或基于糖脂的分子標志物。

生物標志物與個體增加的臨床益處有關的“存在”,“量”或“水平”是樣品中的可檢測水平。這些可通過本領域技術人員已知的及本文中公開的方法來測量。所評估的生物標志物的表達水平或量可用于確定對治療的響應。

術語“表達的水平”或“表達水平”一般可互換使用,一般指樣品中生物標志物的量。“表達”一般指信息(例如基因編碼的和/或表觀遺傳的)轉化成細胞中存在并運行的結構的過程。因此,如本文中使用的,“表達”可以指轉錄成多核苷酸,翻譯成多肽,或甚至多核苷酸和/或多肽修飾(例如多肽的翻譯后修飾)。轉錄的多核苷酸的,翻譯的多肽的,或多核苷酸和/或多肽修飾(例如多肽的翻譯后修飾)的片段也應視為表達的,無論它們是源自通過可變剪接生成的轉錄物或經過降解的轉錄物,或者是源自多肽的翻譯后加工(例如通過蛋白水解)。“表達的基因”包括轉錄成多核苷酸(如mRNA),然后翻譯成多肽的基因,還有轉錄成RNA但不翻譯成多肽的基因(例如轉運和核糖體RNA)。

“升高的表達”,“升高的表達水平”或“升高的水平”指相對于對照諸如沒有罹患疾病或病癥(例如癌癥)的個體或內部對照(例如持家型生物標志物),個體中生物標志物的增加的表達或增加的水平。

“降低的表達”,“降低的表達水平”或“降低的水平”指相對于對照諸如沒有罹患疾病或病癥(例如癌癥)的個體或內部對照(例如持家型生物標志物),個體中生物標志物的降低的表達或降低的水平。

術語“持家型生物標志物”指通常相似地存在于所有細胞類型中的一種生物標志物或一組生物標志物(例如多核苷酸和/或多肽)。在一些實施方案中,持家型生物標志物是“持家基因”。“持家基因”在本文中指一種基因或一組基因,其編碼活性對于細胞功能維持而言必要的蛋白質,且通常相似地存在于所有細胞類型中。

如本文中使用的,“擴增”一般指生成多拷貝的期望序列的過程。“多拷貝”指至少2個拷貝。“拷貝”不必然意味著與模板序列有完全的序列互補性或同一性。例如,拷貝可以包含核苷酸類似物諸如脫氧肌苷,有意的序列變化(諸如經由包含與模板可雜交但不互補的序列的引物引入的序列變化)和/或擴增期間發生的序列錯誤。

術語“診斷”在本文中用于指對分子或病理學狀態,疾病或疾患(例如癌癥)的鑒定或分類。例如,“診斷”可以指特定癌癥類型的鑒定。“診斷”還可以指特定癌癥亞型的分類,例如通過組織病理學標準或分子特征(例如由一種或一組生物標志物(例如特定基因或由所述基因編碼的蛋白質)的表達表征的亞型)。

樣品包括但不限于原代或培養的細胞或細胞系,細胞上清液,細胞裂解物,血小板,血清,血漿,玻璃體液,淋巴液,滑液,濾泡液(follicularfluid),精液,羊水,乳,全血,血液衍生的細胞,尿液,腦脊髓液,唾液,痰,淚,汗液,粘液,腫瘤裂解物,和組織培養液(tissueculturemedium),組織提取物諸如勻漿化的組織,腫瘤組織,細胞提取物,及其組合。

如本文中使用的,“參照樣品”,“參照細胞”,“參照組織”,“對照樣品”,“對照細胞”或“對照組織”指用于比較目的的樣品,細胞,組織,標準品,或水平。在一個實施方案中,參照樣品,參照細胞,參照組織,對照樣品,對照細胞或對照組織自同一受試者或個體的健康和/或無疾病身體部位(例如組織或細胞)獲得。例如,臨近于患病細胞或組織的健康和/或無疾病細胞或組織(例如臨近腫瘤的細胞或組織)。在另一個實施方案中,參照樣品自同一受試者或個體的身體的未治療組織和/或細胞獲得。在還有另一個實施方案中,參照樣品,參照細胞,參照組織,對照樣品,對照細胞或對照組織自不是該受試者或個體的個體的健康和/或無疾病身體部位(例如組織或細胞)獲得。在甚至另一個實施方案中,參照樣品,參照細胞,參照組織,對照樣品,對照細胞或對照組織自不是該受試者或個體的個體的身體的未治療組織和/或細胞獲得。

如本文中使用的,短語“基本上相似”表示兩個數值之間足夠高的相似程度(通常一個與分子有關,另一個與參照/比較分子有關),以致本領域技術人員會認為在用所述數值(例如Kd值)測量的生物學特征背景內兩個數值之間的差異沒有統計學顯著性。作為參照/比較值的函數,所述兩個數值之間的差異可以例如小于約20%,小于約10%,和/或小于約5%。

如本文中使用的,短語“實質性不同”表示兩個數值之間足夠高的差異程度(通常一個與分子有關,另一個與參照/比較分子有關),以致本領域技術人員會認為在用所述數值(例如Kd值)測量的生物學特征背景內兩個數值之間的差異具有統計學顯著性。作為參照/比較分子值的函數,所述兩個數值之間的差異可以例如大于約10%,大于約20%,大于約30%,大于約40%,和/或大于約50%。

如本文中使用的,術語“細胞毒劑”指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞死亡或破壞的物質。細胞毒劑包括但不限于:放射性同位素(例如At211,I131,I125,Y90,Re186,Re188,Sm153,Bi212,P32,Pb212和Lu的放射性同位素);化療劑或化療藥物(例如甲氨蝶呤(methotrexate),阿霉素(adriamycin),長春花生物堿類(vincaalkaloids)(長春新堿(vincristine),長春堿(vinblastine),依托泊苷(etoposide)),多柔比星(doxorubicin),美法侖(melphalan),絲裂霉素(mitomycin)C,苯丁酸氮芥(chlorambucil),柔紅霉素(daunorubicin)或其它嵌入劑);生長抑制劑;酶及其片段,諸如溶核酶;抗生素;毒素,諸如小分子毒素或者細菌,真菌,植物或動物起源的酶活性毒素,包括其片段和/或變體;及下文公開的各種抗腫瘤劑或抗癌劑。

“化療劑”指可用于治療癌癥的化學化合物。化療劑的實例包括烷化劑類(alkylatingagents),諸如塞替派(thiotepa)和環磷酰胺(cyclophosphamide)磺酸烷基酯類(alkylsulfonates),諸如白消安(busulfan),英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙啶類(aziridines),諸如苯佐替派(benzodepa),卡波醌(carboquone),美妥替派(meturedepa)和烏瑞替派(uredepa);乙撐亞胺類(ethylenimines)和甲基蜜胺類(methylamelamines),包括六甲蜜胺(altretamine),三乙撐蜜胺(triethylenemelamine),三乙撐磷酰胺(triethylenephosphoramide),三乙撐硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine);番荔枝內酯類(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone));δ-9-四氫大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol),);β-拉帕醌(lapachone);拉帕醇(lapachol);秋水仙素類(colchicines);白樺脂酸(betulinicacid);喜樹堿(camptothecin)(包括合成類似物托泊替康(topotecan)CPT-11(伊立替康(irinotecan),),乙酰喜樹堿,東莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜樹堿);苔蘚抑素(bryostatin);callystatin;CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin),卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物);鬼臼毒素(podophyllotoxin);鬼臼酸(podophyllinicacid);替尼泊苷(teniposide);隱藻素類(cryptophycins)(特別是隱藻素1和隱藻素8);多拉司他汀(dolastatin);duocarmycin(包括合成類似物,KW-2189和CB1-TM1);艾榴塞洛素(eleutherobin);pancratistatin;sarcodictyin;海綿抑素(spongistatin);氮芥類(nitrogenmustards),諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil),萘氮芥(chlornaphazine),膽磷酰胺(cholophosphamide),雌莫司汀(estramustine),異環磷酰胺(ifosfamide),雙氯乙基甲胺(mechlorethamine),鹽酸氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride),美法侖(melphalan),新氮芥(novembichin),苯芥膽甾醇(phenesterine),潑尼莫司汀(prednimustine),曲磷胺(trofosfamide),尿嘧啶氮芥(uracilmustard);亞硝脲類(nitrosoureas),諸如卡莫司汀(carmustine),氯脲菌素(chlorozotocin),福莫司汀(fotemustine),洛莫司汀(lomustine),尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine);抗生素類,諸如烯二炔類抗生素(enediyne)(例如加利車霉素(calicheamicin),尤其是加利車霉素γ1I和加利車霉素ωI1(參見例如Nicolaou等,Angew.ChemIntl.Ed.Engl.,33:183-186(1994));CDP323,一種口服α-4整聯蛋白抑制劑;蒽環類抗生素(dynemicin),包括dynemicinA;埃斯波霉素(esperamicin);以及新制癌素(neocarzinostatin)發色團和相關色蛋白烯二炔類抗生素發色團),阿克拉霉素(aclacinomycin),放線菌素(actinomycin),氨茴霉素(anthramycin),偶氮絲氨酸(azaserine),博來霉素(bleomycin),放線菌素C(cactinomycin),carabicin,洋紅霉素(carminomycin),嗜癌霉素(carzinophilin),色霉素(chromomycin),放線菌素D(dactinomycin),柔紅霉素(daunorubicin),地托比星(detorubicin),6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸,多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉代多柔比星,氰基嗎啉代多柔比星,2-吡咯代多柔比星,鹽酸多柔比星脂質體注射劑脂質體多柔比星TLCD-99PEG化脂質體多柔比星和脫氧多柔比星),表柔比星(epirubicin),依索比星(esorubicin),伊達比星(idarubicin),麻西羅霉素(marcellomycin),絲裂霉素類(mitomycins)諸如絲裂霉素C,霉酚酸(mycophenolicacid),諾拉霉素(nogalamycin),橄欖霉素(olivomycin),培洛霉素(peplomycin),泊非霉素(potfiromycin),嘌呤霉素(puromycin),三鐵阿霉素(quelamycin),羅多比星(rodorubicin),鏈黑菌素(streptonigrin),鏈佐星(streptozocin),殺結核菌素(tubercidin),烏苯美司(ubenimex),凈司他丁(zinostatin),佐柔比星(zorubicin);抗代謝物類,諸如甲氨蝶呤,吉西他濱(gemcitabine)替加氟(tegafur)卡培他濱(capecitabine)埃坡霉素(epothilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU);葉酸類似物,諸如二甲葉酸(denopterin),甲氨蝶呤,蝶酰三谷氨酸(pteropterin),三甲曲沙(trimetrexate);嘌呤類似物,諸如氟達拉濱(fludarabine),6-巰基嘌呤(mercaptopurine),硫咪嘌呤(thiamiprine),硫鳥嘌呤(thioguanine);嘧啶類似物,諸如安西他濱(ancitabine),阿扎胞苷(azacitidine),6-氮尿苷,卡莫氟(carmofur),阿糖胞苷(cytarabine),雙脫氧尿苷(dideoxyuridine),去氧氟尿苷(doxifluridine),依諾他濱(enocitabine),氟尿苷(floxuridine);雄激素類,諸如卡魯睪酮(calusterone),丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate),表硫雄醇(epitiostanol),美雄烷(mepitiostane),睪內酯(testolactone);抗腎上腺類,諸如氨魯米特(aminoglutethimide),米托坦(mitotane),曲洛司坦(trilostane);葉酸補充劑,諸如亞葉酸(folinicacid);醋葡醛內酯(aceglatone);醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氨基乙酰丙酸(aminolevulinicacid);恩尿嘧啶(eniluracil);安吖啶(amsacrine);bestrabucil;比生群(bisantrene);依達曲沙(edatraxate);地磷酰胺(defosfamide);地美可辛(demecolcine);地吖醌(diaziquone);elfornithine;依利醋銨(elliptiniumacetate);epothilone;依托格魯(etoglucid);硝酸鎵;羥脲(hydroxyurea);香菇多糖(lentinan);氯尼達明(lonidamine);美登木素生物堿類(maytansinoids),諸如美登素(maytansine)和安絲菌素(ansamitocin);米托胍腙(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone);莫哌達醇(mopidamol);二胺硝吖啶(nitracrine);噴司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);吡柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(losoxantrone);2-乙基酰肼(ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine);多糖復合物(JHSNaturalProducts,Eugene,OR);雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西索菲蘭(sizofiran);螺旋鍺(spirogermanium);細交鏈孢菌酮酸(tenuazonicacid);三亞胺醌(triaziquone);2,2′,2′-三氯三乙胺;單端孢菌素類(trichothecenes)(尤其是T-2毒素,疣孢菌素(verrucarin)A,桿孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin));烏拉坦(urethan);長春地辛(vindesine)達卡巴嗪(dacarbazine);甘露醇氮芥(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴衛矛醇(mitolactol);哌泊溴烷(pipobroman);gacytosine;阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”);塞替派(thiotepa);類紫杉醇(taxoids),例如帕利他塞(paclitaxel)清蛋白改造的納米顆粒劑型帕利他塞(ABRAXANETM)和多西他塞(doxetaxel)苯丁酸氮芥(chlorambucil);6-硫鳥嘌呤(thioguanine);巰基嘌呤(mercaptopurine);甲氨蝶呤(methotrexate);鉑類似物,諸如順鉑(cisplatin),奧沙利鉑(oxaliplatin)(例如)和卡鉑(carboplatin);長春藥類(vincas),其阻止微管蛋白聚合形成微管,包括長春堿(vinblastine)長春新堿(vincristine)長春地辛(vindesine)和長春瑞濱(vinorelbine)依托泊苷(etoposide)(VP-16);異環磷酰胺(ifosfamide);米托蒽醌(mitoxantrone);亞葉酸(leucovorin);能滅瘤(novantrone);依達曲沙(edatrexate);道諾霉素(daunomycin);氨基蝶呤(aminopterin);伊本膦酸鹽(ibandronate);拓撲異構酶抑制劑RFS2000;二氟甲基鳥氨酸(DMFO);類視黃酸(retinoids),諸如視黃酸(retinoicacid),包括貝沙羅汀(bexarotene)二膦酸鹽類(bisphosphonates),諸如氯膦酸鹽(clodronate)(例如或),依替膦酸鈉(etidronate)NE-58095,唑來膦酸/唑來膦酸鹽(zoledronicacid/zoledronate)阿倫膦酸鹽(alendronate)帕米膦酸鹽(pamidronate)替魯膦酸鹽(tiludronate)或利塞膦酸鹽(risedronate)以及曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物);反義寡核苷酸,特別是抑制牽涉異常細胞增殖的信號途經中的基因表達的反義寡核苷酸,諸如例如PKC-α,Raf,H-Ras和表皮生長因子受體(EGF-R);疫苗,諸如疫苗和基因療法疫苗,例如疫苗,疫苗和疫苗;拓撲異構酶1抑制劑(例如);rmRH(例如);BAY439006(sorafenib;Bayer);SU-11248(sunitinib,Pfizer);哌立福辛(perifosine),COX-2抑制劑(例如塞來考昔(celecoxib)或艾托考昔(etoricoxib)),蛋白體抑制劑(例如PS341);bortezomibCCI-779;tipifarnib(R11577);orafenib,ABT510;Bcl-2抑制劑,諸如oblimersensodiumpixantrone;EGFR抑制劑(見下文定義);酪氨酸激酶抑制劑(見下文定義);絲氨酸-蘇氨酸激酶抑制劑,諸如雷帕霉素(rapamycin)(sirolimus,);法尼基轉移酶抑制劑,諸如lonafarnib(SCH6636,SARASARTM);及任何上述各項的藥學可接受鹽,酸或衍生物;以及兩種或更多種上述各項的組合,諸如CHOP(環磷酰胺,多柔比星,長春新堿和潑尼松龍聯合療法的縮寫)和FOLFOX(奧沙利鉑(ELOXATINTM)聯合5-FU和亞葉酸的治療方案的縮寫)。

如本文中定義的化療劑包括起調節,降低,阻斷或抑制可促進癌生長的激素效果作用的“抗激素劑”或“內分泌治療劑”類。它們自身可以是激素,包括但不限于:具有混合的激動劑/拮抗劑特性的抗雌激素類,包括他莫昔芬(tamoxifen)(NOLVADEX),4-羥基他莫昔芬,托瑞米芬(toremifene)艾多昔芬(idoxifene),屈洛昔芬(droloxifene),雷洛昔芬(raloxifene)曲沃昔芬(trioxifene),那洛昔芬(keoxifene),和選擇性雌激素受體調節劑類(SERM),諸如SERM3;沒有激動劑特性的純的抗雌激素類,諸如氟維司群(fulvestrant)和EM800(此類藥劑可阻斷雌激素受體(ER)二聚化,抑制DNA結合,提高ER周轉,和/或遏制ER水平);芳香酶抑制劑類,包括類固醇芳香酶抑制劑類,諸如福美坦(formestane)和依西美坦(exemestane)和非類固醇芳香酶抑制劑類,諸如阿那曲唑(anastrozole)來曲唑(letrozole)和氨魯米特(aminoglutethimide),和其它芳香酶抑制劑類,包括伏氯唑(vorozole)醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)法倔唑(fadrozole)和4(5)-咪唑;促黃體生成激素釋放激素激動劑類,包括亮丙瑞林(leuprolide)(和),戈舍瑞林(goserelin),布舍瑞林(buserelin)和曲普瑞林(triptorelin);性類固醇類(sexsteroids),包括妊娠素類(progestine),諸如醋酸甲地孕酮和醋酸甲羥孕酮(medroxyprogesteroneacetate),雌激素類,諸如二乙基己烯雌酚(diethylstilbestrol)和普雷馬林(premarin),和雄激素類/類視黃酸類,諸如氟甲睪酮(fluoxymesterone),全反式視黃酸(alltransretionicacid)和芬維A胺(fenretinide);奧那司酮(onapristone);抗孕酮類;雌激素受體下調劑類(ERD);抗雄激素類,諸如氟他米特(flutamide),尼魯米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide);及任何上述各項的藥學可接受鹽,酸或衍生物;以及兩種或更多種上述各項的組合。

術語“細胞抑制劑”指在體外或在體內阻滯細胞生長的化合物或組合物。如此,細胞抑制劑可以是顯著降低處于S期的細胞百分比的藥劑。細胞抑制劑的其它的例子包括通過誘導G0/G1停滯或M期停滯來阻斷細胞周期行進的藥劑。人源化抗Her2抗體曲妥珠單抗是誘導G0/G1阻滯的細胞抑制劑的一個例子。經典的M期阻斷劑包括長春藥類(vincas)(長春新堿(vincristine)和長春堿(vinblastine)),紫杉烷類(taxanes),和拓撲異構酶II抑制劑諸如多柔比星(doxorubicin),表柔比星(epirubicin),柔紅霉素(daunorubicin),依托泊苷(etoposide)和博來霉素(bleomycin)。某些阻滯G1的藥劑也溢出進入S期停滯,例如DNA烷化劑類諸如他莫昔芬(tamoxifen),潑尼松(prednisone),達卡巴嗪(dacarbazine),雙氯乙基甲胺(mechlorethamine),順鉑(cisplatin),甲氨蝶呤(methotrexate),5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可參見Mendelsohn和Israel編,《TheMolecularBasisofCancer》,第1章,題為“Cellcycleregulation,oncogenes,andantieioplasticdrugs”,Murakaini等,W.B.Saunders,Philadelphia,1995,例如第13頁。紫杉烷類(帕利他塞(paclitaxel)和多西他賽(docetaxel))是衍生自紫杉樹的抗癌藥。衍生自歐洲紫杉的多西他賽(Rhone-PoulencRorer)是帕利他塞(Bristol-MyersSquibb)的半合成類似物。帕利他塞和多西他賽促進由微管蛋白二聚體裝配成微管并通過防止解聚使微管穩定,導致對細胞中有絲分裂的抑制。

如本文中所使用的,術語“EGFR抑制劑”指結合EGFR或以其它方式與EGFR直接相互作用,并且阻止或降低其信號傳導活性的化合物,并且或者稱為“EGFR拮抗劑”。此類藥劑的例子包括結合EGFR的抗體和小分子。結合EGFR的抗體的例子包括單抗579(ATCCCRLHB8506),單抗455(ATCCCRLHB8507),單抗225(ATCCCRL8508),單抗528(ATCCCRL8509)(見美國專利No.4,943,533,Mendelsohn等)及其變體,諸如嵌合化的225(C225或西妥昔單抗(Cetuximab);)和重構人225(H225)(見WO96/40210,ImcloneSystemsInc.);IMC-11F8,即一種完全人的,EGFR靶向性抗體(Imclone);結合II型突變體EGFR的抗體(美國專利No.5,212,290);結合EGFR的人源化的和嵌合的抗體,如記載于美國專利No.5,891,996的;和結合EGFR的人抗體,諸如ABX-EGF或帕尼單抗(Panitumumab)(見WO98/50433,Abgenix/Amgen);EMD55900(Stragliotto等,Eur.J.Cancer32A:636-640(1996));EMD7200(馬妥珠單抗(matuzumab)),即一種針對EGFR的人源化EGFR抗體,其與EGF和TGF-α兩者競爭EGFR結合(EMD/Merck);人EGFR抗體HuMax-EGFR(GenMab);稱為E1.1,E2.4,E2.5,E6.2,E6.4,E2.11,E6.3和E7.6.3并記載于US6,235,883的完全人抗體;MDX-447(MedarexInc);及單抗806或人源化單抗806(Johns等,J.Biol.Chem.279(29):30375-30384(2004))。可以將抗EGFR抗體與細胞毒劑綴合,如此生成免疫綴合物(見例如EP659,439A2,MerckPatentGmbH)。EGFR拮抗劑包括小分子諸如記載于美國專利No:5,616,582,5,457,105,5,475,001,5,654,307,5,679,683,6,084,095,6,265,410,6,455,534,6,521,620,6,596,726,6,713,484,5,770,599,6,140,332,5,866,572,6,399,602,6,344,459,6,602,863,6,391,874,6,344,455,5,760,041,6,002,008和5,747,498,及下列PCT公開文本:WO98/14451,WO98/50038,WO99/09016和WO99/24037的化合物。具體的小分子EGFR拮抗劑包括OSI-774(CP-358774,厄洛替尼,Genentech/OSIPharmaceuticals);PD183805(CI1033,2-丙烯酰胺,N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-嗎啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-,二氫氯化物,PfizerInc.);ZD1839,吉非替尼(gefitinib)(IRESSATM,4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-嗎啉代丙氧基)喹唑啉,AstraZeneca);ZM105180(6-氨基-4-(3-甲基苯基-氨基)-喹唑啉,Zeneca);BIBX-1382(N8-(3-氯-4-氟-苯基)-N2-(1-甲基-哌啶-4-基)-嘧啶并[5,4-d]嘧啶-2,8-二胺,BoehringerIngelheim);PKI-166((R)-4-[4-[(1-苯基乙基)氨基]-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-酚);(R)-6-(4-羥基苯基)-4-[(1-苯基乙基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶;CL-387785(N-[4-[(3-溴苯基)氨基]-6-喹唑啉基]-2-丁炔酰胺);EKB-569(N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺)(Wyeth);AG1478(Pfizer);AG1571(SU5271;Pfizer);雙重EGFR/HER2酪氨酸激酶抑制劑諸如拉帕替尼(GSK572016或N-[3-氯-4-[(3-氟苯基)甲氧基]苯基]6[5[[[2-甲基磺酰基)乙基]氨基]甲基]-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺;Glaxo-SmithKline)。

術語“腫瘤”指所有贅生性(neoplastic)細胞生長和增殖,無論是惡性的還是良性的,及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細胞和組織。術語“癌癥”,“癌性”,“細胞增殖性病癥”,“增殖性病癥”和“腫瘤”在本文中提到時并不互相排斥。

術語“細胞增殖性病癥”和“增殖性病癥”指與一定程度的異常細胞增殖有關的病癥。在一個實施方案中,細胞增殖性病癥指癌癥。

術語“癌癥”和“癌性”指向或描述哺乳動物中典型特征為細胞生長/增殖不受調控的生理疾患。癌癥的例子包括但不限于癌瘤,淋巴瘤(例如何杰金(Hodgkin)氏和非何杰金氏淋巴瘤),母細胞瘤,肉瘤,和白血病。此類癌癥的更具體例子包括鱗狀細胞癌,小細胞肺癌,非小細胞肺癌,肺的腺癌,肺的鱗癌,腹膜癌,肝細胞癌,胃腸癌,胰腺癌,膠質瘤,宮頸癌,卵巢癌,肝癌(livercancer),膀胱癌,肝瘤(hepatoma),乳腺癌,結腸癌,結直腸癌,子宮內膜癌或子宮癌,唾液腺癌,腎癌,肝癌(livercancer),前列腺癌,外陰癌,甲狀腺癌,肝癌(hepaticcarcinoma),白血病和其它淋巴增殖性病癥,及各種類型的頭和頸癌。

術語“結腸腫瘤”或“結腸癌”指結腸(自盲腸至直腸的大腸)的任何腫瘤或癌癥。

術語“結直腸腫瘤”或“結直腸癌”指大腸(包括結腸(自盲腸至直腸的大腸)和直腸)的任何腫瘤或癌癥,包括例如腺癌和不太普遍的形式,諸如淋巴瘤和鱗狀細胞癌。

藥劑(例如藥物配制劑)的“有效量”指在必需的劑量和時段上有效實現期望的治療或預防結果的量。

術語“藥物配制劑”指處于如下的形式,使得允許其中含有的活性組分的生物學活性是有效的,且不含對會接受配制劑施用的受試者具有不可接受的毒性的其它成分的制劑。

“藥學可接受載劑”指藥物配制劑中除活性組分以外,且對受試者無毒的組分。藥學可接受載劑包括但不限于緩沖劑,賦形劑,穩定劑,或防腐劑。

“個體”或“受試者”是哺乳動物。哺乳動物包括但不限于馴養的動物(例如,牛,綿羊,貓,犬,和馬),靈長類(例如,人和非人靈長類諸如猴),家兔,和嚙齒類(例如,小鼠和大鼠)。在某些實施方案中,個體或受試者是人。

如本文中使用的,“治療/處理”(及其語法變型)指試圖改變所治療個體的天然過程的臨床干預,并且可以為了預防或者在臨床病理學的過程期間實施。治療的期望效果包括但不限于預防疾病的發生或復發,減輕癥狀,減輕/減少疾病的任何直接或間接病理后果,預防轉移,降低疾病進展速率,改善或減輕疾病狀態,和消退或改善的預后。在一些實施方案中,使用本發明的抗體來延遲疾病的形成或減緩疾病的進展。

“降低”或“抑制”指引起20%,30%,40%,50%,60%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,或更大的總體降低的能力。在一些實施方案中,降低或抑制可以指與參照(生物學活性(例如wnt信號傳導)或結合的參照水平)相比的相對降低。在一些實施方案中,降低或抑制可以指所治療的病癥的癥狀,轉移的存在或大小,或原發性腫瘤的大小。

如本領域技術人員理解的,本文中提述“約”某值或參數包括(且描述)針對該值或參數本身的實施方案。例如,提述“約X”的描述包括對“X”的描述。

理解的是,本文所述發明的方面和實施方案包括“由......組成”和/或“基本上由.....組成”的方面和實施方案。如本文中使用的,單數形式“一個”,“一種”和“所述/該”包括復數提及物,除非另有指示。

II.組合物和方法

本文中提供的是抗RSPO抗體及其用途。在某些實施方案中,提供結合RSPO2和/或RSPO3的抗體。所提供的抗體例如對于癌癥(諸如結直腸癌)的診斷或治療是有用的。

在一些方面,本文中提供的是一組抗RSPO抗體。該組抗體特征在于多種特性,其(包括但不限于)基于結合RSPO2和/或RSPO3的能力,通過IHC檢測RSPO2和/或RSPO3的能力,抑制RSPO2和/或RSPO3和LGR多肽(例如LGR4和/或LGR5)的相互作用的能力,抑制RSPO2和/或RSPO3和E3遍在蛋白酶多肽(例如RNF43和/或ZNRF3)的相互作用的能力,和抑制由RSPO2,RSPO3,RSPO2多態性,和/或RSPO2易位產物刺激的wnt信號傳導的能力,并鑒定了子集。

在一個方面,本文中提供的是結合RSPO2和/或RSPO3的分離的抗體。在一些實施方案中,該抗體結合RSPO2。在一些實施方案中,該抗體結合RSPO2且并非顯著結合RSPO3。在一些實施方案中,該抗體結合RSPO3。在一些實施方案中,該抗體結合RSPO3且并非顯著結合RSPO2。在一些實施方案中,該抗體結合RSPO2和RSPO3二者。在一些實施方案中,該抗體為多特異性抗體。在一些實施方案中,該多特異性抗體為雙特異性抗體。在一些實施方案中,該雙特異性抗體包含結合RSPO2的第一可變域和結合RSPO3的第二可變域。

在某些實施方案中,該結合RSPO2和/或RSPO3的抗體為結合RSPO2的抗體。在一些實施方案中,該抗RSPO2抗體結合RSPO2,其中該RSPO2具有SEQIDNO:1所列序列。在一些實施方案中,該抗RSPO2抗體結合RSPO2,其中該RSPO2缺乏信號傳導肽序列(例如結合SEQIDNO:1的氨基酸22-243內的氨基酸)。在一些實施方案中,該抗RSPO2抗體結合RSPO2的一個或多個弗林蛋白酶樣富半胱氨酸域。在一些實施方案中,該抗RSPO2抗體結合SEQIDNO:1的氨基酸34至134內的一個區域。在一些實施方案中,該抗RSPO2抗體結合SEQIDNO:1的氨基酸39至134內的一個區域。在一些實施方案中,該抗RSPO2抗體結合SEQIDNO:1的氨基酸34至84內的一個區域。在一些實施方案中,該抗RSPO2抗體結合SEQIDNO:1的氨基酸90至134內的一個區域。在一些實施方案中,該抗RSPO2抗體不結合RSPO2的血小板反應蛋白(thrombospondin)1型域(例如不結合SEQIDNO:1的氨基酸144-204內的一個區域)。在一些實施方案中,該抗RSPO2抗體結合RSPO2的血小板反應蛋白1型域。在一些實施方案中,該抗RSPO2抗體結合SEQIDNO:1的氨基酸144-204內的一個區域。在一些實施方案中,該抗RSPO2抗體抑制wnt信號傳導。在一些實施方案中,該抗RSPO2抗體在具有RSPO2多態性(例如RSPO2L186P多態性)的個體和/或癌癥中抑制wnt信號傳導。在一些實施方案中,該抗RSPO2抗體抑制RSPO2和LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的相互作用。在一些實施方案中,該抗RSPO2抗體不抑制RSPO2和LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的相互作用(例如增強RSPO2對LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的結合)。在一些實施方案中,該抗RSPO2抗體抑制RSPO2和跨膜E3遍在蛋白酶(例如ZNRF3和/或RNF43中一項或多項)的相互作用。在一些實施方案中,該抗RSPO2抗體抑制RSPO2與黏結蛋白聚糖(syndecan)(例如Sdc4)的相互作用。在一些實施方案中,該抗RSPO2抗體抑制RSPO2和LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的相互作用且抑制RSPO2和跨膜E3遍在蛋白酶(例如ZNRF3和/或RNF43中一項或多項)的相互作用(例如11F11,36D2,49G5,和/或26E11)。在一些實施方案中,該抗RSPO2抗體抑制RSPO2和跨膜E3遍在蛋白酶(例如ZNRF3和/或RNF43中一項或多項)的相互作用且不抑制RSPO2和LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的相互作用(例如增強RSPO2對LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的結合)(例如1A1)。在一些實施方案中,該抗RSPO2抗體抑制癌干細胞生長。在一些實施方案中,該抗RSPO2抗體誘導和/或促進癌細胞(例如癌干細胞)分化(例如終末分化和/或分化成祖細胞)。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體誘導和/或促進癌細胞(例如癌干細胞)分化成腸細胞,杯形細胞,和/或腸內分泌細胞。

在某些實施方案中,該結合RSPO2和/或RSPO3的抗體為結合RSPO3的抗體。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體結合RSPO3,其中該RSPO3具有SEQIDNO:2所列序列。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體結合RSPO3,其中該RSPO3缺乏信號傳導肽序列(例如結合SEQIDNO:2的氨基酸22-272內的氨基酸)。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體結合RSPO3的一個或多個弗林蛋白酶樣富半胱氨酸域。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體結合SEQIDNO:2的氨基酸35至135內的一個區域。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體結合SEQIDNO:2的氨基酸35至86內的一個區域。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體結合SEQIDNO:2的氨基酸92至135內的一個區域。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體不結合RSPO3的血小板反應蛋白1型域(例如不結合SEQIDNO:2的氨基酸147-207內的氨基酸)。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體結合RSPO3的血小板反應蛋白1型域。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體結合SEQIDNO:2的氨基酸147-207內的一個區域。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體抑制wnt信號傳導。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體抑制RSPO3和LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的相互作用。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體不抑制RSPO3和LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的相互作用(例如增強RSPO3對LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的結合)。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體抑制RSPO3和跨膜E3遍在蛋白酶(例如ZNRF3和/或RNF43中一項或多項)的相互作用。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體抑制RSPO3與黏結蛋白聚糖(例如Sdc4)的相互作用。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體抑制RSPO3和LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的相互作用且抑制RSPO3和跨膜E3遍在蛋白酶(例如ZNRF3和/或RNF43中一項或多項)的相互作用。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體抑制癌干細胞生長。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體誘導和/或促進癌細胞(例如癌干細胞)分化(例如終末分化和/或分化成祖細胞)。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體誘導和/或促進癌細胞(例如癌干細胞)分化成過渡擴增細胞(transit-amplifyingcell)。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體誘導和/或促進癌細胞(例如癌干細胞)分化成腸細胞,杯形細胞,和/或腸內分泌細胞。

在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體結合SEQIDNO:2的氨基酸49至108內的一個區域。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體結合包含一個或多個選自RSPO3(例如SEQIDNO:2)的Ser49,Asn52,Cys54,Leu55,Ser56,Phe63,Leu65,Gln72,Ile73,Gly74,Tyr84,Tyr89,Pro90,Asp91,Ile92,Lys94,和Lysl08的氨基酸的表位。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體結合包含RSPO3(例如SEQIDNO:2)的氨基酸Ser49,Asn52,Cys54,Leu55,Ser56,Phe63,Leu65,Gln72,Ile73,Gly74,Tyr84,Tyr89,Pro90,Asp91,Ile92,Lys94,和Lys108的表位。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體結合包含RSPO3(例如SEQIDNO:2)的氨基酸殘基:Ser49,Asn52,Cys54,Leu55,Ser56,Phe63,Leu65,Gln72,Ile73,Gly74,Tyr84,Tyr89,Pro90,Asp91,Ile92,Lys94,和Lys108的表位。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體結合包含一個或多個選自RSPO3(例如SEQIDNO:2)的Ser49,Asn52,Cys54,Leu55,Ser56,Phe63,Leu65,Gln72,Ile73,Gly74,Tyr84,Tyr89,Pro90,Asp91,Ile92,Lys94,Lys97,和Lys108的氨基酸的表位。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體結合包含RSPO3(例如SEQIDNO:2)的氨基酸Ser49,Asn52,Cys54,Leu55,Ser56,Phe63,Leu65,Gln72,Ile73,Gly74,Tyr84,Tyr89,Pro90,Asp91,Ile92,Lys94,Lys97,和Lys108的表位。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體在結合RSPO3時距離RSPO3(例如SEQIDNO:2)的一個或多個氨基酸Ser49,Asn52,Cys54,Leu55,Ser56,Phe63,Leu65,Gln72,Ile73,Gly74,Tyr84,Tyr89,Pro90,Asp91,Ile92,Lys94,和Lys108為4埃或更少。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體在結合RSPO3時距離RSPO3(例如SEQIDNO:2)的氨基酸殘基:Ser49,Asn52,Cys54,Leu55,Ser56,Phe63,Leu65,Gln72,Ile73,Gly74,Tyr84,Tyr89,Pro90,Asp91,Ile92,Lys94,和Lys108為4埃或更少。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體在結合RSPO3時距離RSPO3(例如SEQIDNO:2)的一個或多個氨基酸Ser49,Asn52,Cys54,Leu55,Ser56,Phe63,Leu65,Gln72,Ile73,Gly74,Tyr84,Tyr89,Pro90,Asp91,Ile92,Lys94,Lys97,和Lys108為4埃或更少。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體在結合RSPO3時距離RSPO3(例如SEQIDNO:2)的氨基酸殘基:Ser49,Asn52,Cys54,Leu55,Ser56,Phe63,Leu65,Gln72,Ile73,Gly74,Tyr84,Tyr89,Pro90,Asp91,Ile92,Lys94,Lys97,和Lys108為4埃或更少。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體在結合RSPO3時距離RSPO3(例如SEQIDNO:2)的一個或多個氨基酸Asn52,Leu55,Phe63,Gln72,Tyr89,Pro90,Asp91,Lys94,和Lys97為3.5埃或更少。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體在結合RSPO3時距離RSPO3(例如SEQIDNO:2)的Asn52,Leu55,Phe63,Gln72,Tyr89,Pro90,Asp91,Lys94,和Lys97為3.5埃或更少。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體在結合RSPO3時距離RSPO3(例如SEQIDNO:2)的一個或多個氨基酸Gln72,Pro90,Asp91,和Lys94為3埃或更少。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體在結合RSPO3時距離RSPO3(例如SEQIDNO:2)的Gln72,Pro90,Asp91,和Lys94為3埃或更少。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體在結合RSPO3時距離上文提供的一個或多個氨基酸為約4,3.75,3.5,3.25,或3埃任一。在一些實施方案中,該一個或多個氨基酸和/或該一個或多個氨基酸殘基為約1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,和/或12個氨基酸和/或氨基酸殘基任一。在一些實施方案中,該表位是通過結晶學(例如實施例中描述的結晶學方法)測定的。

在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體結合SEQIDNO:2的氨基酸47至108內的氨基酸。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體結合包含選自RSPO3(例如SEQIDNO:2)的Thr47,Asn52,Cys54,Leu55,Ser56,Phe63,Leu65,Gln72,Tyr84,Tyr89,Pro90,Asp91,Ile92,Asn93,Lys94,Lys97,和Lys108的一個或多個氨基酸的表位。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體結合包含RSPO3(例如SEQIDNO:2)的氨基酸Thr47,Asn52,Cys54,Leu55,Ser56,Phe63,Leu65,Gln72,Tyr84,Tyr89,Pro90,Asp91,Ile92,Asn93,Lys94,Lys97,和Lys108的表位。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體結合包含RSPO3(例如SEQIDNO:2)的氨基酸殘基:Thr47,Asn52,Cys54,Leu55,Ser56,Phe63,Leu65,Gln72,Tyr84,Tyr89,Pro90,Asp91,Ile92,Asn93,Lys94,Lys97,和Lys108的表位。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體在結合RSPO3時距離RSPO3(例如SEQIDNO:2)的一個或多個氨基酸Thr47,Asn52,Cys54,Leu55,Ser56,Phe63,Leu65,Gln72,Tyr84,Tyr89,Pro90,Asp91,Ile92,Asn93,Lys94,Lys97,和Lys108為4埃或更少。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體在結合RSPO3時距離RSPO3(例如SEQIDNO:2)的氨基酸殘基:Thr47,Asn52,Cys54,Leu55,Ser56,Phe63,Leu65,Gln72,Tyr84,Tyr89,Pro90,Asp91,Ile92,Asn93,Lys94,Lys97,和Lys108為4埃或更少。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體在結合RSPO3時距離RSPO3(例如SEQIDNO:2)的一個或多個氨基酸Thr47,Asn52,Leu55,Phe63,Gln72,Tyr89,Pro90,Asp91,Ile92,Lys94,和Lys97為3.5埃或更少。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體在結合RSPO3時距離RSPO3(例如SEQIDNO:2)的氨基酸Thr47,Asn52,Leu55,Phe63,Gln72,Tyr89,Pro90,Asp91,Ile92,Lys94,和Lys97為3.5埃或更少。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體在結合RSPO3時距離RSPO3(例如SEQIDNO:2)的一個或多個氨基酸Thr47,Leu55,Gln72,Pro90,Asp91,和Lys94為3埃或更少。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體在結合RSPO3時距離RSPO3(例如SEQIDNO:2)的氨基酸Thr47,Leu55,Gln72,Pro90,Asp91,和Lys94為3埃或更少。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體在結合RSPO3時距離上文提供的一個或多個氨基酸為約4,3.75,3.5,3.25,或3埃任一。在一些實施方案中,該一個或多個氨基酸和/或該一個或多個氨基酸殘基為約1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,和/或12個氨基酸和/或氨基酸殘基任一。在一些實施方案中,該抗RSPO3抗體還結合RSPO2。在一些實施方案中,該表位是通過結晶學(例如實施例中描述的結晶學方法)測定的。

在一些實施方案中,該通過結晶學測定的表位是使用RSPO3的氨基酸M33-E210測定的。在一些實施方案中,該通過結晶學測定的表位是如下實施的,即使用LabcyteEcho液體操作器使用100nL坐滴(sittingdrop)設置數個稀疏矩陣晶體篩。將篩保存于18℃。在一些實施方案中,可以在含有100mMMIBpH9和25%PEG1500作為母液的一滴中獲得晶體。在一些實施方案中,可以在含有200mM甲酸鈉和20%(w/y)PEG3,350作為母液的一滴中獲得晶體。在一些實施方案中,可以收獲晶體,在防凍劑溶液中浸泡10秒,并在液氮中閃凍。在一些實施方案中,該防凍劑溶液可以通過混合1μL70%甘油與1.8μL儲備溶液來生成。在一些實施方案中,該晶體可以在基于PEG的條件中生長,例如約20-25%PEG3,350。在一些實施方案中,該晶體可以在約20%PEG6,000,約20-25%PEG4,000,和約25%PEG1,500中生長。在一些實施方案中,該pH的范圍可以是約3.5-9,例如介于約7和約8之間。在一些實施方案中,該鹽濃度為約200mM。

在某些實施方案中,該結合RSPO2和/或RSPO3的抗體為結合RSPO2和RSPO3的抗體(例如抗RSPO2/3抗體)。在一些實施方案中,該抗RSPO2/3抗體結合RSPO2(其中該RSPO2具有SEQIDNO:1所列序列)且結合RSPO3(其中該RSPO3具有SEQIDNO:2所列序列)。在一些實施方案中,該抗RSPO2/3抗體抑制wnt信號傳導。

在一些方面,抗體鑒定為有能力與RSPO2和RSPO3二者交叉反應。這些抗RSPO2/3抗體的活性的一種非限制性例子可以包括結合RSPO2和RSPO3,通過IHC檢測RSPO2和RSPO3,抑制RSPO2和RSPO3和LGR多肽(例如LGR4和/或LGR5)的相互作用,抑制RSPO2和RSPO3和E3遍在蛋白酶多肽(例如RNF43和/或ZNRF3)的相互作用,和/或抑制由RSPO2,RSPO3,RSPO2多態性,和RSPO2易位產物刺激的wnt信號傳導的能力。

本領域技術人員會進一步領會,在一些實施方案中,可以將任何抗RSPO2抗體和/或抗RSPO3抗體工程化改造成某種抗體型式,特別是雙特異性型式,其會容許與RSPO2和RSPO3二者的反應性。這些有能力的抗RSPO2/3雙特異性抗體可以包括結合RSPO2和RSPO3,通過IHC檢測RSPO2和RSPO3,抑制RSPO2和RSPO3和LGR多肽(例如LGR4和/或LGR5)的相互作用,抑制RSPO2和RSPO3和E3遍在蛋白酶多肽(例如RNF43和/或ZNRF3)的相互作用,和/或抑制由RSPO2,RSPO3,RSPO2多態性,和RSPO2易位產物刺激的wnt信號傳導的能力。

在任何抗RSPO2/3抗體的一些實施方案中,該抗RSPO2/3抗體抑制RSPO2和RSPO3與LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的相互作用。在一些實施方案中,該抗體為雙臂抗體。在一些實施方案中,該抗RSPO2/3抗體包含第一和第二可變域,在每個可變域上包含26E11的6種HVR。在一些實施方案中,該抗體為雙特異性抗體。在一些實施方案中,該抗RSPO2/3抗體包含包含5D6或5E11的6種HVR的第一可變域和包含36D2的6種HVR的第二可變域。

在任何抗RSPO2/3抗體的一些實施方案中,該抗RSPO2/3抗體抑制RSPO3和LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的相互作用且不抑制RSPO2和LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的相互作用(例如增強RSPO2對LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的結合)。在一些實施方案中,該抗體為雙特異性抗體。在一些實施方案中,該抗RSPO2/3抗體包含包含5D6或5E11的6種HVR的第一可變域和包含1A1的6種HVR的第二可變域。

在任何抗RSPO2/3抗體的一些實施方案中,該抗RSPO2/3抗體抑制RSPO2和RSPO3與跨膜E3遍在蛋白酶(例如ZNRF3和/或RNF43中一項或多項)的相互作用。在一些實施方案中,該抗體為雙臂抗體。在一些實施方案中,該抗RSPO2/3抗體包含第一和第二可變域,在每個可變域上包含26E11的6種HVR。在一些實施方案中,該抗體為雙特異性抗體。在一些實施方案中,該抗RSPO2/3抗體包含包含5D6或5E11的6種HVR的第一可變域和包含36D2或1A1的6種HVR的第二可變域。

在任何抗RSPO2/3抗體的一些實施方案中,該抗RSPO2/3抗體抑制RSPO2和RSPO3與LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項和RSPO2的相互作用且抑制RSPO2和RSPO3與跨膜E3遍在蛋白酶(例如ZNRF3和/或RNF43中一項或多項)的相互作用。在一些實施方案中,該抗體為雙臂抗體。在一些實施方案中,該抗RSPO2/3抗體包含第一和第二可變域,在每個可變域上包含26E11的6種HVR。在一些實施方案中,該抗體為雙特異性抗體。在一些實施方案中,該抗RSPO2/3抗體包含包含5D6或5E11的6種HVR的第一可變域和包含36D2的6種HVR的第二可變域。

在任何抗RSPO2/3抗體的一些實施方案中,該抗RSPO2/3抗體抑制RSPO3和LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項和RSPO2的相互作用且抑制RSPO2和RSPO3與跨膜E3遍在蛋白酶(例如ZNRF3和/或RNF43中一項或多項)的相互作用且不抑制RSPO2和LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的相互作用(例如增強RSPO2對LGR4,LGR5,和/或LGR6中一項或多項的結合)。在一些實施方案中,該抗體為雙特異性抗體。在一些實施方案中,該抗RSPO2/3抗體包含包含5D6或5E11的6種HVR的第一可變域和包含1A1的6種HVR的第二可變域。

在一個方面,本文中提供的是與抗體4H1,4D4,5C2,5D6,5E11,6E9,21C2,和/或26E11中一項或多項結合相同或交疊表位的抗RSPO3抗體。進一步地,在一個方面,本文中提供的是與抗體4H1,4D4,5C2,5D6,5E11,6E9,21C2,和/或26E11中一項或多項競爭結合RSPO3的抗RSPO3抗體。在一個方面,本文中提供的是與抗體IA1,11F11,26E11,36D2,和/或49G5中一項或多項結合相同或交疊表位的抗RSPO2抗體。進一步地,在一個方面,本文中提供的是與抗體IA1,11F11,26E11,36D2,和/或49G5中一項或多項競爭結合RSPO2的抗RSPO2抗體。在一個方面,本文中提供的是與1A1結合相同或交疊表位的抗RSPO2抗體。進一步地,在一個方面,本文中提供的是與IA1競爭結合RSPO2的抗RSPO2抗體。在一些實施方案中,根據BIACORE,競爭性ELISA,和/或本文所述和本領域已知的任何其它方法,該抗體與另一種抗體競爭結合。測定表位的方法是本領域已知的且本文中有描述。在一些實施方案中,該表位為線性表位。在一些實施方案中,該表位為構象表位。在一些實施方案中,該表位是通過抗體結合肽片段而測定的。在一些實施方案中,該表位是通過質譜術測定的。在一些實施方案中,該表位是通過結晶學(例如晶體結構分析)測定的。

單克隆抗體4H1和某些其它抗體實施方案

在一個方面,本發明提供一種抗RSPO3抗體,其包含至少1,2,3,4,5,或6種選自下述的HVR:(a)包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:9的氨基酸序列的HVR-H2;(c)包含SEQIDNO:10的氨基酸序列的HVR-H3;(d)包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的HVR-L1;(e)包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-L2;和(f)包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的HVR-L3。

在一個方面,本發明提供一種抗體,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VHHVR序列:(a)包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:9的氨基酸序列的HVR-H2;和(c)包含SEQIDNO:10的氨基酸序列的HVR-H3。在一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:10的氨基酸序列的HVR-H3。在另一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:10的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的HVR-L3。在又一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:10的氨基酸序列的HVR-H3,包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的HVR-L3,和包含SEQIDNO:9的氨基酸序列的HVR-H2。在又一個實施方案中,該抗體包含(a)包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:9的氨基酸序列的HVR-H2;和(c)包含SEQIDNO:10的氨基酸序列的HVR-H3。

在另一個方面,本發明提供一種抗體,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VLHVR序列:(a)包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-L2;和(c)包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的HVR-L3。在一個實施方案中,該抗體包含(a)包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-L2;和(c)包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,本發明的抗體包含(a)VH域,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VHHVR序列:(i)包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:9的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:10的氨基酸序列的HVR-H3;和(b)VL域,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VLHVR序列:(i)包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-L2,和(c)包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,本發明提供一種抗體,其包含(a)包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:9的氨基酸序列的HVR-H2;(c)包含SEQIDNO:10的氨基酸序列的HVR-H3;(d)包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的HVR-L1;(e)包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-L2;和(f)包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,提供一種抗RSPO3抗體,其中該抗體包含上文提供的任何實施方案中的VH和上文提供的任何實施方案中的VL。在一個實施方案中,該抗體包含分別在SEQIDNO:89和SEQIDNO:90中的VH和VL序列,包括那些序列的翻譯后修飾。

單克隆抗體4D4和某些其它抗體實施方案

在一個方面,本發明提供一種抗RSPO3抗體,其包含至少1,2,3,4,5,或6種選自下述的HVR:(a)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-H2;(c)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-H3;(d)包含SEQIDNO:11的氨基酸序列的HVR-L1;(e)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-L2;和(f)包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的HVR-L3。

在一個方面,本發明提供一種抗體,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VHHVR序列:(a)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-H2;和(c)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-H3。在一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-H3。在另一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的HVR-L3。在又一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-H3,包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的HVR-L3,和包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-H2。在又一個實施方案中,該抗體包含(a)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-H2;和(c)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-H3。

在另一個方面,本發明提供一種抗體,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VLHVR序列:(a)包含SEQIDNO:11的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-L2;和(c)包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的HVR-L3。在一個實施方案中,該抗體包含(a)包含SEQIDNO:11的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-L2;和(c)包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,本發明的抗體包含(a)VH域,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VHHVR序列:(i)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-H3;和(b)VL域,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VLHVR序列:(i)包含SEQIDNO:11的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-L2,和(c)包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,本發明提供一種抗體,其包含(a)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-H2;(c)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-H3;(d)包含SEQIDNO:11的氨基酸序列的HVR-L1;(e)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-L2;和(f)包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,提供一種抗RSPO3抗體,其中該抗體包含上文提供的任何實施方案中的VH和上文提供的任何實施方案中的VL。在一個實施方案中,該抗體包含分別在SEQIDNO:91和SEQIDNO:92中的VH和VL序列,包括那些序列的翻譯后修飾。

單克隆抗體5C2和某些其它抗體實施方案

在一個方面,本發明提供一種抗RSPO3抗體,其包含至少1,2,3,4,5,或6種選自下述的HVR:(a)包含SEQIDNO:20的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:21的氨基酸序列的HVR-H2;(c)包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H3;(d)包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L1;(e)包含SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-L2;和(f)包含SEQIDNO:19的氨基酸序列的HVR-L3。

在一個方面,本發明提供一種抗體,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VHHVR序列:(a)包含SEQIDNO:20的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:21的氨基酸序列的HVR-H2;和(c)包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H3。在一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H3。在另一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQIDNO:19的氨基酸序列的HVR-L3。在又一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H3,包含SEQIDNO:19的氨基酸序列的HVR-L3,和包含SEQIDNO:21的氨基酸序列的HVR-H2。在又一個實施方案中,該抗體包含(a)包含SEQIDNO:20的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:21的氨基酸序列的HVR-H2;和(c)包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H3。

在另一個方面,本發明提供一種抗體,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VLHVR序列:(a)包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-L2;和(c)包含SEQIDNO:19的氨基酸序列的HVR-L3。在一個實施方案中,該抗體包含(a)包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-L2;和(c)包含SEQIDNO:19的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,本發明的抗體包含(a)VH域,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VHHVR序列:(i)包含SEQIDNO:20的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:21的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H3;和(b)VL域,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VLHVR序列:(i)包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-L2,和(c)包含SEQIDNO:19的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,本發明提供一種抗體,其包含(a)包含SEQIDNO:20的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:21的氨基酸序列的HVR-H2;(c)包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H3;(d)包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L1;(e)包含SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-L2;和(f)包含SEQIDNO:19的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,提供一種抗RSPO3抗體,其中該抗體包含上文提供的任何實施方案中的VH和上文提供的任何實施方案中的VL。在一個實施方案中,該抗體包含分別在SEQIDNO:93和SEQIDNO:94中的VH和VL序列,包括那些序列的翻譯后修飾。

單克隆抗體5D6和某些其它抗體實施方案

在一個方面,本發明提供一種抗RSPO3抗體,其包含至少1,2,3,4,5,或6種選自下述的HVR:(a)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:27的氨基酸序列的HVR-H2;(c)包含SEQIDNO:28的氨基酸序列的HVR-H3;(d)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-L1;(e)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L2;和(f)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3。

在一個方面,本發明提供一種抗體,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VHHVR序列:(a)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:27的氨基酸序列的HVR-H2;和(c)包含SEQIDNO:28的氨基酸序列的HVR-H3。在一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:28的氨基酸序列的HVR-H3。在另一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:28的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3。在又一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:28的氨基酸序列的HVR-H3,包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3,和包含SEQIDNO:27的氨基酸序列的HVR-H2。在又一個實施方案中,該抗體包含(a)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:27的氨基酸序列的HVR-H2;和(c)包含SEQIDNO:28的氨基酸序列的HVR-H3。

在另一個方面,本發明提供一種抗體,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VLHVR序列:(a)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L2;和(c)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3。在一個實施方案中,該抗體包含(a)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L2;和(c)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,本發明的抗體包含(a)VH域,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VHHVR序列:(i)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:27的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:28的氨基酸序列的HVR-H3;和(b)VL域,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VLHVR序列:(i)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L2,和(c)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,本發明提供一種抗體,其包含(a)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:27的氨基酸序列的HVR-H2;(c)包含SEQIDNO:28的氨基酸序列的HVR-H3;(d)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-L1;(e)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L2;和(f)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3。

在一個方面,本發明提供一種抗RSPO3抗體,其包含至少1,2,3,4,5,或6種選自下述的HVR:(a)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:27的氨基酸序列的HVR-H2;(c)包含SEQIDNO:188或SEQIDNO:189的氨基酸序列的HVR-H3;(d)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-L1;(e)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L2;和(f)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3。在一些實施方案中,HVR-H3包含SEQIDNO:188的氨基酸序列。在一些實施方案中,HVR-H3包含SEQIDNO:189的氨基酸序列。

在一個方面,本發明提供一種抗體,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VHHVR序列:(a)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:27的氨基酸序列的HVR-H2;和(c)包含SEQIDNO:188或SEQIDNO:189的氨基酸序列的HVR-H3。在一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:188或SEQIDNO:189的氨基酸序列的HVR-H3。在另一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:188或SEQIDNO:189的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3。在又一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:188或SEQIDNO:189的氨基酸序列的HVR-H3,包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3,和包含SEQIDNO:27的氨基酸序列的HVR-H2。在又一個實施方案中,該抗體包含(a)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:27的氨基酸序列的HVR-H2;和(c)包含SEQIDNO:188或SEQIDNO:189的氨基酸序列的HVR-H3。在一些實施方案中,HVR-H3包含SEQIDNO:188的氨基酸序列。在一些實施方案中,HVR-H3包含SEQIDNO:189的氨基酸序列。

在另一個方面,本發明提供一種抗體,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VLHVR序列:(a)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L2;和(c)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3。在一個實施方案中,該抗體包含(a)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L2;和(c)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,本發明的抗體包含(a)VH域,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VHHVR序列:(i)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:27的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:188或SEQIDNO:189的氨基酸序列的HVR-H3;和(b)VL域,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VLHVR序列:(i)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L2,和(c)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3。在一些實施方案中,HVR-H3包含SEQIDNO:188的氨基酸序列。在一些實施方案中,HVR-H3包含SEQIDNO:189的氨基酸序列。

在另一個方面,本發明提供一種抗體,其包含(a)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:27的氨基酸序列的HVR-H2;(c)包含SEQIDNO:188或SEQIDNO:189的氨基酸序列的HVR-H3;(d)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-L1;(e)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L2;和(f)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3。在一些實施方案中,HVR-H3包含SEQIDNO:188的氨基酸序列。在一些實施方案中,HVR-H3包含SEQIDNO:189的氨基酸序列。

在另一個方面,提供一種抗RSPO3抗體,其中該抗體包含上文提供的任何實施方案中的VH和上文提供的任何實施方案中的VL。在一個實施方案中,該抗體包含分別在SEQIDNO:95和SEQIDNO:96中的VH和VL序列,包括那些序列的翻譯后修飾。

在任何上述實施方案中,抗RSPO3抗體是人源化的。在一個實施方案中,抗RSPO3抗體包含任何上述實施方案中的HVR,且進一步包含人受體框架,例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在某些實施方案中,該人受體框架為人VL卡帕I共有(VLKI)框架和/或VH框架VH1。在某些實施方案中,該人受體框架為包含任一下述突變的人VL卡帕I共有(VLKI)框架和/或VH框架VH1。

在另一個方面,抗RSPO3抗體包含與SEQIDNO:191,193,195,197,199,201,203,205,207,209,211,213,或215的氨基酸序列具有至少90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,或100%序列同一性的重鏈可變域(VH)序列。在某些實施方案中,與SEQIDNO:191,193,195,197,199,201,203,205,207,209,211,213,或215的氨基酸序列具有至少90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,或99%同一性的VH序列相對于參照序列含有替代(例如保守替代),插入,或刪除,但是包含該序列的抗RSPO3抗體保留結合RSPO3的能力。在某些實施方案中,在SEQIDNO:191,193,195,197,199,201,203,205,207,209,211,213,或215中替代,插入和/或刪除了總共1至10個氨基酸。在某些實施方案中,在SEQIDNO:191,193,195,197,199,201,203,205,207,209,211,213,或215中替代,插入和/或刪除了總共1至5個氨基酸。在某些實施方案中,替代,插入,或刪除發生在HVR以外的區域(即在FR中)。任選地,該抗RSPO3抗體包含SEQIDNO:191,193,195,197,199,201,203,205,207,209,211,213,或215的VH序列,包括該序列的翻譯后修飾。在一個特定實施方案中,該VH包含一種,兩種或三種選自下述的HVR:(a)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-H1,(b)包含SEQIDNO:27的氨基酸序列的HVR-H2,和(c)包含SEQIDNO:28,SEQIDNO:188,或SEQIDNO:189的氨基酸序列的HVR-H3。

在另一個方面,提供一種抗RSPO3抗體,其中該抗體包含與SEQIDNO:190,192,194,196,198,200,202,204,206,208,210,212,或214的氨基酸序列具有至少90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,或100%序列同一性的輕鏈可變域(VL)。在某些實施方案中,與SEQIDNO:190,192,194,196,198,200,202,204,206,208,210,212,或214的氨基酸序列具有至少90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,或99%同一性的VL序列相對于參照序列含有替代(例如保守替代),插入,或刪除,但是包含該序列的抗RSPO3抗體保留結合RSPO3的能力。在某些實施方案中,在SEQIDNO:190,192,194,196,198,200,202,204,206,208,210,212,或214中替代,插入和/或刪除了總共1至10個氨基酸。在某些實施方案中,在SEQIDNO:190,192,194,196,198,200,202,204,206,208,210,212,或214中替代,插入和/或刪除了總共1至5個氨基酸。在某些實施方案中,替代,插入,或刪除發生在HVR以外的區域(即在FR中)。任選地,該抗RSPO3抗體包含SEQIDNO:190,192,194,196,198,200,202,204,206,208,210,212,或214的VL序列,包括該序列的翻譯后修飾。在一個特定實施方案中,該VL包含一種,兩種或三種選自下述的HVR:(a)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L2;和(c)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,提供一種抗RSPO3抗體,其中該抗體包含上文提供的任何實施方案中的VH和上文提供的任何實施方案中的VL。

在一個實施方案中,該抗體包含分別在SEQIDNO:190和SEQIDNO:191中的VH和VL序列,包括那些序列的翻譯后修飾。在一個實施方案中,該抗體包含分別在SEQIDNO:192和SEQIDNO:193中的VH和VL序列,包括那些序列的翻譯后修飾。在一個實施方案中,該抗體包含分別在SEQIDNO:194和SEQIDNO:195中的VH和VL序列,包括那些序列的翻譯后修飾。在一個實施方案中,該抗體包含分別在SEQIDNO:196和SEQIDNO:197中的VH和VL序列,包括那些序列的翻譯后修飾。在一個實施方案中,該抗體包含分別在SEQIDNO:198和SEQIDNO:199中的VH和VL序列,包括那些序列的翻譯后修飾。在一個實施方案中,該抗體包含分別在SEQIDNO:200和SEQIDNO:201中的VH和VL序列,包括那些序列的翻譯后修飾。在一個實施方案中,該抗體包含分別在SEQIDNO:202和SEQIDNO:203中的VH和VL序列,包括那些序列的翻譯后修飾。在一個實施方案中,該抗體包含分別在SEQIDNO:204和SEQIDNO:205中的VH和VL序列,包括那些序列的翻譯后修飾。在一個實施方案中,該抗體包含分別在SEQIDNO:206和SEQIDNO:207中的VH和VL序列,包括那些序列的翻譯后修飾。在一個實施方案中,該抗體包含分別在SEQIDNO:208和SEQIDNO:209中的VH和VL序列,包括那些序列的翻譯后修飾。在一個實施方案中,該抗體包含分別在SEQIDNO:210和SEQIDNO:211中的VH和VL序列,包括那些序列的翻譯后修飾。在一個實施方案中,該抗體包含分別在SEQIDNO:212和SEQIDNO:213中的VH和VL序列,包括那些序列的翻譯后修飾。在一個實施方案中,該抗體包含分別在SEQIDNO:214和SEQIDNO:215中的VH和VL序列,包括那些序列的翻譯后修飾。

在又一個方面,本文中提供的是與本文中提供的抗RSPO3抗體結合相同表位的抗體。例如,在某些實施方案中,提供與包含SEQIDNO:191,193,195,197,199,201,203,205,207,209,211,213,或215的VH序列和SEQIDNO:190,192,194,196,198,200,202,204,206,208,210,212,或214的VL序列的抗RSPO3抗體結合相同表位的抗體。在一些實施方案中,該表位是通過結晶學測定的。

在本發明的又一個方面,依照任何上述實施方案的抗RSPO3抗體是單克隆抗體,包括人抗體。在一個實施方案中,抗RSPO3抗體是抗體片段,例如Fv,Fab,Fab’,scFv,雙抗體,或F(ab’)2片段。在另一個實施方案中,抗體是基本上全長抗體,例如IgG1抗體,IgG2a抗體或其它抗體類或同種型,如本文中定義的。

單克隆抗體5E11和某些其它抗體實施方案

在一個方面,本發明提供一種抗RSPO3抗體,其包含至少1,2,3,4,5,或6種選自下述的HVR:(a)包含SEQIDNO:32的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:33的氨基酸序列的HVR-H2;(c)包含SEQIDNO:34的氨基酸序列的HVR-H3;(d)包含SEQIDNO:29的氨基酸序列的HVR-L1;(e)包含SEQIDNO:30的氨基酸序列的HVR-L2;和(f)包含SEQIDNO:31的氨基酸序列的HVR-L3。

在一個方面,本發明提供一種抗體,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VHHVR序列:(a)包含SEQIDNO:32的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:33的氨基酸序列的HVR-H2;和(c)包含SEQIDNO:34的氨基酸序列的HVR-H3。在一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:34的氨基酸序列的HVR-H3。在另一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:34的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQIDNO:31的氨基酸序列的HVR-L3。在又一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:34的氨基酸序列的HVR-H3,包含SEQIDNO:31的氨基酸序列的HVR-L3,和包含SEQIDNO:33的氨基酸序列的HVR-H2。在又一個實施方案中,該抗體包含(a)包含SEQIDNO:32的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:33的氨基酸序列的HVR-H2;和(c)包含SEQIDNO:34的氨基酸序列的HVR-H3。

在另一個方面,本發明提供一種抗體,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VLHVR序列:(a)包含SEQIDNO:29的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含SEQIDNO:30的氨基酸序列的HVR-L2;和(c)包含SEQIDNO:31的氨基酸序列的HVR-L3。在一個實施方案中,該抗體包含(a)包含SEQIDNO:29的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含SEQIDNO:30的氨基酸序列的HVR-L2;和(c)包含SEQIDNO:31的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,本發明的抗體包含(a)VH域,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VHHVR序列:(i)包含SEQIDNO:32的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:33的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:34的氨基酸序列的HVR-H3;和(b)VL域,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VLHVR序列:(i)包含SEQIDNO:29的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:30的氨基酸序列的HVR-L2,和(c)包含SEQIDNO:31的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,本發明提供一種抗體,其包含(a)包含SEQIDNO:32的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:33的氨基酸序列的HVR-H2;(c)包含SEQIDNO:34的氨基酸序列的HVR-H3;(d)包含SEQIDNO:29的氨基酸序列的HVR-L1;(e)包含SEQIDNO:30的氨基酸序列的HVR-L2;和(f)包含SEQIDNO:31的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,提供一種抗RSPO3抗體,其中該抗體包含上文提供的任何實施方案中的VH和上文提供的任何實施方案中的VL。在一個實施方案中,該抗體包含分別在SEQIDNO:97和SEQIDNO:98中的VH和VL序列,包括那些序列的翻譯后修飾。

單克隆抗體6E9和某些其它抗體實施方案

在一個方面,本發明提供一種抗RSPO3抗體,其包含至少1,2,3,4,5,或6種選自下述的HVR:(a)包含SEQIDNO:38的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:39的氨基酸序列的HVR-H2;(c)包含SEQIDNO:40的氨基酸序列的HVR-H3;(d)包含SEQIDNO:35的氨基酸序列的HVR-L1;(e)包含SEQIDNO:36的氨基酸序列的HVR-L2;和(f)包含SEQIDNO:37的氨基酸序列的HVR-L3。

在一個方面,本發明提供一種抗體,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VHHVR序列:(a)包含SEQIDNO:38的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:39的氨基酸序列的HVR-H2;和(c)包含SEQIDNO:40的氨基酸序列的HVR-H3。在一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:40的氨基酸序列的HVR-H3。在另一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:40的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQIDNO:37的氨基酸序列的HVR-L3。在又一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:40的氨基酸序列的HVR-H3,包含SEQIDNO:37的氨基酸序列的HVR-L3,和包含SEQIDNO:39的氨基酸序列的HVR-H2。在又一個實施方案中,該抗體包含(a)包含SEQIDNO:38的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:39的氨基酸序列的HVR-H2;和(c)包含SEQIDNO:40的氨基酸序列的HVR-H3。

在另一個方面,本發明提供一種抗體,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VLHVR序列:(a)包含SEQIDNO:35的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含SEQIDNO:36的氨基酸序列的HVR-L2;和(c)包含SEQIDNO:37的氨基酸序列的HVR-L3。在一個實施方案中,該抗體包含(a)包含SEQIDNO:35的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含SEQIDNO:36的氨基酸序列的HVR-L2;和(c)包含SEQIDNO:37的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,本發明的抗體包含(a)VH域,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VHHVR序列:(i)包含SEQIDNO:38的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:39的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:40的氨基酸序列的HVR-H3;和(b)VL域,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VLHVR序列:(i)包含SEQIDNO:35的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:36的氨基酸序列的HVR-L2,和(c)包含SEQIDNO:37的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,本發明提供一種抗體,其包含(a)包含SEQIDNO:38的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:39的氨基酸序列的HVR-H2;(c)包含SEQIDNO:40的氨基酸序列的HVR-H3;(d)包含SEQIDNO:35的氨基酸序列的HVR-L1;(e)包含SEQIDNO:36的氨基酸序列的HVR-L2;和(f)包含SEQIDNO:37的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,提供一種抗RSPO3抗體,其中該抗體包含上文提供的任何實施方案中的VH和上文提供的任何實施方案中的VL。在一個實施方案中,該抗體包含分別在SEQIDNO:99和SEQIDNO:100中的VH和VL序列,包括那些序列的翻譯后修飾。

單克隆抗體21C2和某些其它抗體實施方案

在一個方面,本發明提供一種抗RSPO3抗體,其包含至少1,2,3,4,5,或6種選自下述的HVR:(a)包含SEQIDNO:44的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:45的氨基酸序列的HVR-H2;(c)包含SEQIDNO:46的氨基酸序列的HVR-H3;(d)包含SEQIDNO:41的氨基酸序列的HVR-L1;(e)包含SEQIDNO:42的氨基酸序列的HVR-L2;和(f)包含SEQIDNO:43的氨基酸序列的HVR-L3。

在一個方面,本發明提供一種抗體,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VHHVR序列:(a)包含SEQIDNO:44的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:45的氨基酸序列的HVR-H2;和(c)包含SEQIDNO:46的氨基酸序列的HVR-H3。在一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:46的氨基酸序列的HVR-H3。在另一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:46的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQIDNO:43的氨基酸序列的HVR-L3。在又一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:46的氨基酸序列的HVR-H3,包含SEQIDNO:43的氨基酸序列的HVR-L3,和包含SEQIDNO:45的氨基酸序列的HVR-H2。在又一個實施方案中,該抗體包含(a)包含SEQIDNO:44的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:45的氨基酸序列的HVR-H2;和(c)包含SEQIDNO:46的氨基酸序列的HVR-H3。

在另一個方面,本發明提供一種抗體,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VLHVR序列:(a)包含SEQIDNO:41的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含SEQIDNO:42的氨基酸序列的HVR-L2;和(c)包含SEQIDNO:43的氨基酸序列的HVR-L3。在一個實施方案中,該抗體包含(a)包含SEQIDNO:41的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含SEQIDNO:42的氨基酸序列的HVR-L2;和(c)包含SEQIDNO:43的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,本發明的抗體包含(a)VH域,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VHHVR序列:(i)包含SEQIDNO:44的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:45的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:46的氨基酸序列的HVR-H3;和(b)VL域,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VLHVR序列:(i)包含SEQIDNO:41的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:42的氨基酸序列的HVR-L2,和(c)包含SEQIDNO:43的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,本發明提供一種抗體,其包含(a)包含SEQIDNO:44的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:45的氨基酸序列的HVR-H2;(c)包含SEQIDNO:46的氨基酸序列的HVR-H3;(d)包含SEQIDNO:41的氨基酸序列的HVR-L1;(e)包含SEQIDNO:42的氨基酸序列的HVR-L2;和(f)包含SEQIDNO:43的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,提供一種抗RSPO3抗體,其中該抗體包含上文提供的任何實施方案中的VH和上文提供的任何實施方案中的VL。在一個實施方案中,該抗體包含分別在SEQIDNO:101和SEQIDNO:102中的VH和VL序列,包括那些序列的翻譯后修飾。

單克隆抗體26E11和某些其它抗體實施方案

在一個方面,本發明提供一種抗RSPO2/3抗體,其包含至少1,2,3,4,5,或6種選自下述的HVR:(a)包含SEQIDNO:50的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:51的氨基酸序列的HVR-H2;(c)包含SEQIDNO:52的氨基酸序列的HVR-H3;(d)包含SEQIDNO:47的氨基酸序列的HVR-L1;(e)包含SEQIDNO:48的氨基酸序列的HVR-L2;和(f)包含SEQIDNO:49的氨基酸序列的HVR-L3。

在一個方面,本發明提供一種抗體,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VHHVR序列:(a)包含SEQIDNO:50的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:51的氨基酸序列的HVR-H2;和(c)包含SEQIDNO:52的氨基酸序列的HVR-H3。在一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:52的氨基酸序列的HVR-H3。在另一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:52的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQIDNO:49的氨基酸序列的HVR-L3。在又一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:52的氨基酸序列的HVR-H3,包含SEQIDNO:49的氨基酸序列的HVR-L3,和包含SEQIDNO:51的氨基酸序列的HVR-H2。在又一個實施方案中,該抗體包含(a)包含SEQIDNO:50的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:51的氨基酸序列的HVR-H2;和(c)包含SEQIDNO:52的氨基酸序列的HVR-H3。

在另一個方面,本發明提供一種抗體,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VLHVR序列:(a)包含SEQIDNO:47的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含SEQIDNO:48的氨基酸序列的HVR-L2;和(c)包含SEQIDNO:49的氨基酸序列的HVR-L3。在一個實施方案中,該抗體包含(a)包含SEQIDNO:47的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含SEQIDNO:48的氨基酸序列的HVR-L2;和(c)包含SEQIDNO:49的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,本發明的抗體包含(a)VH域,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VHHVR序列:(i)包含SEQIDNO:50的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:51的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:52的氨基酸序列的HVR-H3;和(b)VL域,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VLHVR序列:(i)包含SEQIDNO:47的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:48的氨基酸序列的HVR-L2,和(c)包含SEQIDNO:49的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,本發明提供一種抗體,其包含(a)包含SEQIDNO:50的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:51的氨基酸序列的HVR-H2;(c)包含SEQIDNO:52的氨基酸序列的HVR-H3;(d)包含SEQIDNO:47的氨基酸序列的HVR-L1;(e)包含SEQIDNO:48的氨基酸序列的HVR-L2;和(f)包含SEQIDNO:49的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,提供一種抗RSPO2/3抗體,其中該抗體包含上文提供的任何實施方案中的VH和上文提供的任何實施方案中的VL。在一個實施方案中,該抗體包含分別在SEQIDNO:103和SEQIDNO:104中的VH和VL序列,包括那些序列的翻譯后修飾。

抗RSPO3單克隆抗體和某些其它抗體實施方案

在一個方面,本發明提供一種抗RSPO3抗體,其包含至少1,2,3,4,5,或6種選自下述的HVR:(a)包含SEQIDNO:80的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:81的氨基酸序列的HVR-H2;(c)包含SEQIDNO:82的氨基酸序列的HVR-H3;(d)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-L1;(e)包含SEQIDNO:78的氨基酸序列的HVR-L2;和(f)包含SEQIDNO:79的氨基酸序列的HVR-L3。

在一個方面,本發明提供一種抗體,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VHHVR序列:(a)包含SEQIDNO:80的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:81的氨基酸序列的HVR-H2;和(c)包含SEQIDNO:82的氨基酸序列的HVR-H3。在一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:82的氨基酸序列的HVR-H3。在另一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:82的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQIDNO:79的氨基酸序列的HVR-L3。在又一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:82的氨基酸序列的HVR-H3,包含SEQIDNO:79的氨基酸序列的HVR-L3,和包含SEQIDNO:81的氨基酸序列的HVR-H2。在又一個實施方案中,該抗體包含(a)包含SEQIDNO:80的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:81的氨基酸序列的HVR-H2;和(c)包含SEQIDNO:82的氨基酸序列的HVR-H3。

在另一個方面,本發明提供一種抗體,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VLHVR序列:(a)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含SEQIDNO:78的氨基酸序列的HVR-L2;和(c)包含SEQIDNO:79的氨基酸序列的HVR-L3。在一個實施方案中,該抗體包含(a)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含SEQIDNO:78的氨基酸序列的HVR-L2;和(c)包含SEQIDNO:79的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,本發明的抗體包含(a)VH域,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VHHVR序列:(i)包含SEQIDNO:80的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:81的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:82的氨基酸序列的HVR-H3;和(b)VL域,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VLHVR序列:(i)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:78的氨基酸序列的HVR-L2,和(c)包含SEQIDNO:79的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,本發明提供一種抗體,其包含(a)包含SEQIDNO:80的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:81的氨基酸序列的HVR-H2;(c)包含SEQIDNO:82的氨基酸序列的HVR-H3;(d)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-L1;(e)包含SEQIDNO:78的氨基酸序列的HVR-L2;和(f)包含SEQIDNO:79的氨基酸序列的HVR-L3。

在一個方面,本發明提供一種抗RSPO3抗體,其包含至少1,2,3,4,5,或6種選自下述的HVR:(a)包含SEQIDNO:86的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:87的氨基酸序列的HVR-H2;(c)包含SEQIDNO:88的氨基酸序列的HVR-H3;(d)包含SEQIDNO:83的氨基酸序列的HVR-L1;(e)包含SEQIDNO:84的氨基酸序列的HVR-L2;和(f)包含SEQIDNO:85的氨基酸序列的HVR-L3。

在一個方面,本發明提供一種抗體,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VHHVR序列:(a)包含SEQIDNO:86的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:87的氨基酸序列的HVR-H2;和(c)包含SEQIDNO:88的氨基酸序列的HVR-H3。在一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:88的氨基酸序列的HVR-H3。在另一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:88的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQIDNO:85的氨基酸序列的HVR-L3。在又一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:88的氨基酸序列的HVR-H3,包含SEQIDNO:85的氨基酸序列的HVR-L3,和包含SEQIDNO:87的氨基酸序列的HVR-H2。在又一個實施方案中,該抗體包含(a)包含SEQIDNO:86的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:87的氨基酸序列的HVR-H2;和(c)包含SEQIDNO:88的氨基酸序列的HVR-H3。

在另一個方面,本發明提供一種抗體,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VLHVR序列:(a)包含SEQIDNO:83的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含SEQIDNO:84的氨基酸序列的HVR-L2;和(c)包含SEQIDNO:85的氨基酸序列的HVR-L3。在一個實施方案中,該抗體包含(a)包含SEQIDNO:83的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含SEQIDNO:84的氨基酸序列的HVR-L2;和(c)包含SEQIDNO:85的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,本發明的抗體包含(a)VH域,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VHHVR序列:(i)包含SEQIDNO:86的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:87的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:88的氨基酸序列的HVR-H3;和(b)VL域,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VLHVR序列:(i)包含SEQIDNO:83的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:84的氨基酸序列的HVR-L2,和(c)包含SEQIDNO:85的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,本發明提供一種抗體,其包含(a)包含SEQIDNO:86的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:87的氨基酸序列的HVR-H2;(c)包含SEQIDNO:88的氨基酸序列的HVR-H3;(d)包含SEQIDNO:83的氨基酸序列的HVR-L1;(e)包含SEQIDNO:84的氨基酸序列的HVR-L2;和(f)包含SEQIDNO:85的氨基酸序列的HVR-L3。

單克隆抗體1A1和某些其它抗體實施方案

在一個方面,本發明提供一種抗RSPO2抗體,其包含至少1,2,3,4,5,或6種選自下述的HVR:(a)包含SEQIDNO:56的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:57的氨基酸序列的HVR-H2;(c)包含SEQIDNO:58的氨基酸序列的HVR-H3;(d)包含SEQIDNO:53的氨基酸序列的HVR-L1;(e)包含SEQIDNO:54的氨基酸序列的HVR-L2;和(f)包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L3。

在一個方面,本發明提供一種抗體,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VHHVR序列:(a)包含SEQIDNO:56的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:57的氨基酸序列的HVR-H2;和(c)包含SEQIDNO:58的氨基酸序列的HVR-H3。在一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:58的氨基酸序列的HVR-H3。在另一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:58的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L3。在又一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:58的氨基酸序列的HVR-H3,包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L3,和包含SEQIDNO:57的氨基酸序列的HVR-H2。在又一個實施方案中,該抗體包含(a)包含SEQIDNO:56的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:57的氨基酸序列的HVR-H2;和(c)包含SEQIDNO:58的氨基酸序列的HVR-H3。

在另一個方面,本發明提供一種抗體,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VLHVR序列:(a)包含SEQIDNO:53的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含SEQIDNO:54的氨基酸序列的HVR-L2;和(c)包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L3。在一個實施方案中,該抗體包含(a)包含SEQIDNO:53的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含SEQIDNO:54的氨基酸序列的HVR-L2;和(c)包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,本發明的抗體包含(a)VH域,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VHHVR序列:(i)包含SEQIDNO:56的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:57的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:58的氨基酸序列的HVR-H3;和(b)VL域,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VLHVR序列:(i)包含SEQIDNO:53的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:54的氨基酸序列的HVR-L2,和(c)包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,本發明提供一種抗體,其包含(a)包含SEQIDNO:56的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:57的氨基酸序列的HVR-H2;(c)包含SEQIDNO:58的氨基酸序列的HVR-H3;(d)包含SEQIDNO:53的氨基酸序列的HVR-L1;(e)包含SEQIDNO:54的氨基酸序列的HVR-L2;和(f)包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,提供一種抗RSPO2抗體,其中該抗體包含上文提供的任何實施方案中的VH和上文提供的任何實施方案中的VL。在一個實施方案中,該抗體包含分別在SEQIDNO:105和SEQIDNO:106中的VH和VL序列,包括那些序列的翻譯后修飾。

單克隆抗體11F11和某些其它抗體實施方案

在一個方面,本發明提供一種抗RSPO2抗體,其包含至少1,2,3,4,5,或6種選自下述的HVR:(a)包含SEQIDNO:62的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:63的氨基酸序列的HVR-H2;(c)包含SEQIDNO:64的氨基酸序列的HVR-H3;(d)包含SEQIDNO:59的氨基酸序列的HVR-L1;(e)包含SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-L2;和(f)包含SEQIDNO:61的氨基酸序列的HVR-L3。

在一個方面,本發明提供一種抗體,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VHHVR序列:(a)包含SEQIDNO:62的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:63的氨基酸序列的HVR-H2;和(c)包含SEQIDNO:64的氨基酸序列的HVR-H3。在一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:64的氨基酸序列的HVR-H3。在另一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:64的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQIDNO:61的氨基酸序列的HVR-L3。在又一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:64的氨基酸序列的HVR-H3,包含SEQIDNO:61的氨基酸序列的HVR-L3,和包含SEQIDNO:63的氨基酸序列的HVR-H2。在又一個實施方案中,該抗體包含(a)包含SEQIDNO:62的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:63的氨基酸序列的HVR-H2;和(c)包含SEQIDNO:64的氨基酸序列的HVR-H3。

在另一個方面,本發明提供一種抗體,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VLHVR序列:(a)包含SEQIDNO:59的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-L2;和(c)包含SEQIDNO:61的氨基酸序列的HVR-L3。在一個實施方案中,該抗體包含(a)包含SEQIDNO:59的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-L2;和(c)包含SEQIDNO:61的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,本發明的抗體包含(a)VH域,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VHHVR序列:(i)包含SEQIDNO:62的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:63的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:64的氨基酸序列的HVR-H3;和(b)VL域,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VLHVR序列:(i)包含SEQIDNO:59的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-L2,和(c)包含SEQIDNO:61的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,本發明提供一種抗體,其包含(a)包含SEQIDNO:62的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:63的氨基酸序列的HVR-H2;(c)包含SEQIDNO:64的氨基酸序列的HVR-H3;(d)包含SEQIDNO:59的氨基酸序列的HVR-L1;(e)包含SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-L2;和(f)包含SEQIDNO:61的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,提供一種抗RSPO2抗體,其中該抗體包含上文提供的任何實施方案中的VH和上文提供的任何實施方案中的VL。在一個實施方案中,該抗體包含分別在SEQIDNO:107和SEQIDNO:108中的VH和VL序列,包括那些序列的翻譯后修飾。

單克隆抗體36D2和某些其它抗體實施方案

在一個方面,本發明提供一種抗RSPO2抗體,其包含至少1,2,3,4,5,或6種選自下述的HVR:(a)包含SEQIDNO:68的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:69的氨基酸序列的HVR-H2;(c)包含SEQIDNO:70的氨基酸序列的HVR-H3;(d)包含SEQIDNO:65的氨基酸序列的HVR-L1;(e)包含SEQIDNO:66的氨基酸序列的HVR-L2;和(f)包含SEQIDNO:67的氨基酸序列的HVR-L3。

在一個方面,本發明提供一種抗體,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VHHVR序列:(a)包含SEQIDNO:68的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:69的氨基酸序列的HVR-H2;和(c)包含SEQIDNO:70的氨基酸序列的HVR-H3。在一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:70的氨基酸序列的HVR-H3。在另一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:70的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQIDNO:67的氨基酸序列的HVR-L3。在又一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:70的氨基酸序列的HVR-H3,包含SEQIDNO:67的氨基酸序列的HVR-L3,和包含SEQIDNO:69的氨基酸序列的HVR-H2。在又一個實施方案中,該抗體包含(a)包含SEQIDNO:68的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:69的氨基酸序列的HVR-H2;和(c)包含SEQIDNO:70的氨基酸序列的HVR-H3。

在另一個方面,本發明提供一種抗體,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VLHVR序列:(a)包含SEQIDNO:65的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含SEQIDNO:66的氨基酸序列的HVR-L2;和(c)包含SEQIDNO:67的氨基酸序列的HVR-L3。在一個實施方案中,該抗體包含(a)包含SEQIDNO:65的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含SEQIDNO:66的氨基酸序列的HVR-L2;和(c)包含SEQIDNO:67的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,本發明的抗體包含(a)VH域,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VHHVR序列:(i)包含SEQIDNO:68的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:69的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:70的氨基酸序列的HVR-H3;和(b)VL域,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VLHVR序列:(i)包含SEQIDNO:65的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:66的氨基酸序列的HVR-L2,和(c)包含SEQIDNO:67的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,本發明提供一種抗體,其包含(a)包含SEQIDNO:68的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:69的氨基酸序列的HVR-H2;(c)包含SEQIDNO:70的氨基酸序列的HVR-H3;(d)包含SEQIDNO:65的氨基酸序列的HVR-L1;(e)包含SEQIDNO:66的氨基酸序列的HVR-L2;和(f)包含SEQIDNO:67的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,提供一種抗RSPO2抗體,其中該抗體包含上文提供的任何實施方案中的VH和上文提供的任何實施方案中的VL。在一個實施方案中,該抗體包含分別在SEQIDNO:109和SEQIDNO:110中的VH和VL序列,包括那些序列的翻譯后修飾。

單克隆抗體49G5和某些其它抗體實施方案

在一個方面,本發明提供一種抗RSPO2抗體,其包含至少1,2,3,4,5,或6種選自下述的HVR:(a)包含SEQIDNO:74的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:75的氨基酸序列的HVR-H2;(c)包含SEQIDNO:76的氨基酸序列的HVR-H3;(d)包含SEQIDNO:71的氨基酸序列的HVR-L1;(e)包含SEQIDNO:72的氨基酸序列的HVR-L2;和(f)包含SEQIDNO:73的氨基酸序列的HVR-L3。

在一個方面,本發明提供一種抗體,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VHHVR序列:(a)包含SEQIDNO:74的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:75的氨基酸序列的HVR-H2;和(c)包含SEQIDNO:76的氨基酸序列的HVR-H3。在一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:76的氨基酸序列的HVR-H3。在另一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:76的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQIDNO:73的氨基酸序列的HVR-L3。在又一個實施方案中,該抗體包含包含SEQIDNO:76的氨基酸序列的HVR-H3,包含SEQIDNO:73的氨基酸序列的HVR-L3,和包含SEQIDNO:75的氨基酸序列的HVR-H2。在又一個實施方案中,該抗體包含(a)包含SEQIDNO:74的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:75的氨基酸序列的HVR-H2;和(c)包含SEQIDNO:76的氨基酸序列的HVR-H3。

在另一個方面,本發明提供一種抗體,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VLHVR序列:(a)包含SEQIDNO:71的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含SEQIDNO:72的氨基酸序列的HVR-L2;和(c)包含SEQIDNO:73的氨基酸序列的HVR-L3。在一個實施方案中,該抗體包含(a)包含SEQIDNO:71的氨基酸序列的HVR-L1;(b)包含SEQIDNO:72的氨基酸序列的HVR-L2;和(c)包含SEQIDNO:73的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,本發明的抗體包含(a)VH域,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VHHVR序列:(i)包含SEQIDNO:74的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQIDNO:75的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQIDNO:76的氨基酸序列的HVR-H3;和(b)VL域,其包含至少一種,至少兩種,或所有三種選自下述的VLHVR序列:(i)包含SEQIDNO:71的氨基酸序列的HVR-L1,(ii)包含SEQIDNO:72的氨基酸序列的HVR-L2,和(c)包含SEQIDNO:73的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,本發明提供一種抗體,其包含(a)包含SEQIDNO:74的氨基酸序列的HVR-H1;(b)包含SEQIDNO:75的氨基酸序列的HVR-H2;(c)包含SEQIDNO:76的氨基酸序列的HVR-H3;(d)包含SEQIDNO:71的氨基酸序列的HVR-L1;(e)包含SEQIDNO:72的氨基酸序列的HVR-L2;和(f)包含SEQIDNO:73的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一個方面,提供一種抗RSPO2抗體,其中該抗體包含上文提供的任何實施方案中的VH和上文提供的任何實施方案中的VL。在一個實施方案中,該抗體包含分別在SEQIDNO:111和SEQIDNO:112中的VH和VL序列,包括那些序列的翻譯后修飾。

在任何上述實施方案中,抗RSPO抗體是人源化的,例如任何上述抗RSPO抗體的人源化形式。在一個實施方案中,抗RSPO抗體包含任何上述實施方案中的HVR,且進一步包含受體人框架,例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。

在本發明的又一個方面,依照任何上述實施方案的抗RSPO抗體是單克隆抗體,包括嵌合抗體,人源化抗體或人抗體。在一個實施方案中,抗RSPO抗體是抗體片段,例如Fv,Fab,Fab’,scFv,雙抗體,或F(ab’)2片段。在另一個實施方案中,抗體是全長抗體,例如完整IgG1或IgG2a抗體或其它抗體類或同種型,如本文中定義的。

在又一個方面,依照任何上述實施方案的抗RSPO抗體可單一地或組合地摻入下文1-7節中描述的任何特征:

1.抗體親和力

在某些實施方案中,本文中提供的抗體具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM,或≤0.001nM(例如10-8M或更少,例如10-8M至10-13M,例如,10-9M至10-13M)的解離常數(Kd)。

在一個實施方案中,通過放射性標記抗原結合測定法(RIA)來測量Kd。在一個實施方案中,用Fab型式的感興趣抗體及其抗原實施RIA。例如,通過在存在未標記抗原的滴定系列的情況中用最小濃度的(125I)標記抗原平衡Fab,然后用抗Fab抗體包被板捕捉結合的抗原來測量Fab對抗原的溶液結合親和力(見例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。為了建立測定法的條件,將多孔板(ThermoScientific)用50mM碳酸鈉(pH9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗體(CappelLabs)包被過夜,隨后用PBS中的2%(w/v)牛血清清蛋白于室溫(約23℃)封閉2-5小時。在非吸附板(Nunc#269620)中,將100pM或26pM[125I]-抗原與連續稀釋的感興趣Fab(例如與Presta等,CancerRes.57:4593-4599(1997)中抗VEGF抗體,Fab-12的評估一致)混合。然后將感興趣的Fab溫育過夜;然而,溫育可持續更長時間(例如約65小時)以確保達到平衡。此后,將混合物轉移至捕捉板,于室溫溫育(例如1小時)。然后除去溶液,并用PBS中的0.1%聚山梨酯20洗板8次。平板干燥后,加入150μl/孔閃爍液(MICROSCINT-20TM;Packard),然后在TOPCOUNTTM伽馬計數器(Packard)上對平板計數10分鐘。選擇各Fab給出小于或等于最大結合之20%的濃度用于競爭性結合測定法。

依照另一個實施方案,使用表面等離振子共振測定法來測量Kd。例如,于25℃使用固定化抗原CM5芯片以約10個響應單位(RU)使用-2000或-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)實施測定法。在一個實施方案中,依照供應商的用法說明書用鹽酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物傳感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。將抗原用10mM乙酸鈉pH4.8稀釋至5μg/ml(約0.2μM),然后以5μl/分鐘的流速注射以獲得約10個響應單位(RU)的偶聯蛋白質。注入抗原后,注入1M乙醇胺以封閉未反應基團。為了進行動力學測量,于25℃以約25μl/分鐘的流速注入在含0.05%聚山梨酯20(TWEEN-20TM)表面活性劑的PBS(PBST)中兩倍連續稀釋的Fab(0.78nM至500nM)。使用簡單一對一朗格繆爾結合模型(EvaluationSoftwareversion3.2)通過同時擬合結合和解離傳感圖計算結合速率(kon)和解離速率(koff)。以比率koff/kon計算平衡解離常數(Kd)。見例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果根據上文表面等離振子共振測定法,結合速率超過106M-1s-1,那么結合速率可使用熒光淬滅技術來測定,即根據分光計諸如配備了斷流裝置的分光光度計(AvivInstruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度計(ThermoSpectronic)中用攪拌比色杯的測量,在存在濃度漸增的抗原的情況中,測量PBSpH7.2中20nM抗抗原抗體(Fab形式)于25℃的熒光發射強度(激發=295nm;發射=340nm,16nm帶通)的升高或降低。

2.抗體片段

在某些實施方案中,本文中提供的抗體是抗體片段。抗體片段包括但不限于Fab,Fab’,Fab’-SH,F(ab’)2,Fv,和scFv片段,及下文所描述的其它片段。關于某些抗體片段的綜述,見Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)。關于scFv片段的綜述,見例如Pluckthün,于ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,第113卷,Rosenburg和Moore編,(Springer-Verlag,NewYork),第269-315頁(1994);還可見WO93/16185;及美國專利No.5,571,894和5,587,458。關于包含補救受體結合表位殘基且具有延長的體內半衰期的Fab和F(ab’)2片段的討論,見美國專利No.5,869,046。

雙抗體是具有兩個抗原結合位點的抗體片段,其可以是二價的或雙特異性的。見例如EP404,097;WO1993/01161;Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003);及Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)。三抗體和四抗體也記載于Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)。

單域抗體是包含抗體的整個或部分重鏈可變域或整個或部分輕鏈可變域的抗體片段。在某些實施方案中,單域抗體是人單域抗體(Domantis,Inc.,Waltham,MA;見例如美國專利No.6,248,516)。

可以通過多種技術,包括但不限于對完整抗體的蛋白水解消化及重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)的生成來生成抗體片段,如本文中所描述的。

3.嵌合抗體和人源化抗體

在某些實施方案中,本文中提供的抗體是嵌合抗體。某些嵌合抗體記載于例如美國專利No.4,816,567;及Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。在一個例子中,嵌合抗體包含非人可變區(例如,自小鼠,大鼠,倉鼠,家兔,或非人靈長類,諸如猴衍生的可變區)和人恒定區。在又一個例子中,嵌合抗體是“類轉換的”抗體,其中類或亞類已經自親本抗體的類或亞類改變。嵌合抗體包括其抗原結合片段。

在某些實施方案中,嵌合抗體是人源化抗體。通常,將非人抗體人源化以降低對人的免疫原性,同時保留親本非人抗體的特異性和親和力。一般地,人源化抗體包含一個或多個可變域,其中HVR,例如CDR(或其部分)自非人抗體衍生,而FR(或其部分)自人抗體序列衍生。任選地,人源化抗體還會至少包含人恒定區的一部分。在一些實施方案中,將人源化抗體中的一些FR殘基用來自非人抗體(例如衍生HVR殘基的抗體)的相應殘基替代,例如以恢復或改善抗體特異性或親和力。

人源化抗體及其生成方法綜述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008),并且進一步記載于例如Riechmann等,Nature332:323-329(1988);Queen等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA86:10029-10033(1989);美國專利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409;Kashmiri等,Methods36:25-34(2005)(描述了特異性決定區(SDR)嫁接);Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“重修表面”);Dall’Acqua等,Methods36:43-60(2005)(描述了“FR改組”);及Osbourn等,Methods36:61-68(2005)和Klimka等,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了FR改組的“引導選擇”方法)。

可以用于人源化的人框架區包括但不限于:使用“最佳擬合(best-fit)”方法選擇的框架區(見例如Sims等,J.Immunol.151:2296(1993));自輕或重鏈可變區的特定亞組的人抗體的共有序列衍生的框架區(見例如Carter等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992);及Presta等,J.Immunol.,151:2623(1993));人成熟的(體細胞突變的)框架區或人種系框架區(見例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008));和通過篩選FR文庫衍生的框架區(見例如Baca等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)及Rosok等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。

4.人抗體

在某些實施方案中,本文中提供的抗體是人抗體。可以使用本領域中已知的多種技術來生成人抗體。一般地,人抗體記載于vanDiik和vandeWinkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。

可以通過對轉基因動物施用免疫原來制備人抗體,所述轉基因動物已經修飾為響應抗原性攻擊而生成完整人抗體或具有人可變區的完整抗體。此類動物通常含有所有或部分人免疫球蛋白基因座,其替換內源免疫球蛋白基因座,或者其在染色體外存在或隨機整合入動物的染色體中。在此類轉基因小鼠中,一般已經將內源免疫球蛋白基因座滅活。關于自轉基因動物獲得人抗體的方法的綜述,見Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。還可見例如美國專利No.6,075,181和6,150,584,其描述了XENOMOUSETM技術;美國專利No.5,770,429,其描述了技術;美國專利No.7,041,870,其描述了K-M技術,和美國專利申請公開文本No.US2007/0061900,其描述了技術)。可以例如通過與不同人恒定區組合進一步修飾來自由此類動物生成的完整抗體的人可變區。

也可以通過基于雜交瘤的方法生成人抗體。已經描述了用于生成人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異骨髓瘤細胞系(見例如Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur等,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,第51-63頁(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987);及Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991))。經由人B細胞雜交瘤技術生成的人抗體也記載于Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。其它方法包括那些例如記載于美國專利No.7,189,826(其描述了自雜交瘤細胞系生成單克隆人IgM抗體)和Ni,XiandaiMianyixue,26(4):265-268(2006)(其描述了人-人雜交瘤)的。人雜交瘤技術(Trioma技術)也記載于Vollmers和Brandlein,HistologyandHistopathology,20(3):927-937(2005)及Vollmers和Brandlein,MethodsandFindingsinExperimentalandClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)。

也可以通過分離自人衍生的噬菌體展示文庫選擇的Fv克隆可變域序列生成人抗體。然后,可以將此類可變域序列與期望的人恒定域組合。下文描述了自抗體文庫選擇人抗體的技術。

5.文庫衍生的抗體

可以通過對組合文庫篩選具有期望的一種或多種活性的抗體來分離本發明的抗體。例如,用于生成噬菌體展示文庫并對此類文庫篩選擁有期望結合特征的抗體的多種方法是本領域中已知的。此類方法綜述于例如Hoogenboom等,于MethodsinMolecularBiology178:1-37(0’Brien等編,HumanPress,Totowa,NJ,2001),并且進一步記載于例如McCafferty等,Nature348:552-554;Clackson等,Nature352:624-628(1991);Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992);Marks和Bradbury,于MethodsinMolecularBiology248:161-175(Lo編,HumanPress,Totowa,NJ,2003);Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004);Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004);Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004);及Lee等,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)。

在某些噬菌體展示方法中,將VH和VL基因的全集分別通過聚合酶鏈式反應(PCR)克隆,并在噬菌體文庫中隨機重組,然后可以對所述噬菌體文庫篩選抗原結合噬菌體,如記載于Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)的。噬菌體通常以單鏈Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗體片段。來自經免疫的來源的文庫提供針對免疫原的高親和力抗體,而不需要構建雜交瘤。或者,可以(例如自人)克隆天然全集以在沒有任何免疫的情況中提供針對一大批非自身和還有自身抗原的抗體的單一來源,如由Griffiths等,EMBOJ,12:725-734(1993)描述的。最后,也可以通過自干細胞克隆未重排的V基因區段,并使用含有隨機序列的PCR引物編碼高度可變的CDR3區并在體外實現重排來合成生成未免疫文庫,如由Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所描述的。描述人抗體噬菌體文庫的專利公開文本包括例如:美國專利No.5,750,373,和美國專利公開文本No.2005/0079574,2005/0119455,2005/0266000,2007/0117126,2007/0160598,2007/0237764,2007/0292936和2009/0002360。

認為自人抗體文庫分離的抗體或抗體片段是本文中的人抗體或人抗體片段。

6.多特異性抗體

在某些實施方案中,本文中提供的抗體是多特異性抗體,例如雙特異性抗體。多特異性抗體是對至少兩個不同位點具有結合特異性的單克隆抗體。在某些實施方案中,結合特異性之一針對RSPO(例如RSPO2和/或RSPO3),而另一種針對任何其它抗原。在某些實施方案中,雙特異性抗體可以結合RSPO的兩個不同表位。也可以使用雙特異性抗體來將細胞毒劑定位于表達RSPO(例如RSPO2和/或RSPO3)的細胞。在一些實施方案中,多特異性抗體(例如雙特異性抗體)結合RSPO2和RSPO3。在一些實施方案中,多特異性抗體(例如雙特異性抗體)包含包含5E11的HVR的第一可變域和包含36D2的HVR的第二可變域。在一些實施方案中,多特異性抗體(例如雙特異性抗體)包含包含5D6的HVR的第一可變域和包含36D2的HVR的第二可變域。在一些實施方案中,多特異性抗體(例如雙特異性抗體)包含包含5E11的HVR的第一可變域和包含1A1的HVR的第二可變域。在一些實施方案中,多特異性抗體(例如雙特異性抗體)包含包含5D6的HVR的第一可變域和包含1A1的HVR的第二可變域。雙特異性抗體可以以全長抗體或抗體片段制備。

用于生成多特異性抗體的技術包括但不限于具有不同特異性的兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈的重組共表達(見Milstein和Cuello,Nature305:537(1983),WO93/08829,和Traunecker等,EMBOJ.10:3655(1991)),和“節-入-穴”工程化(見例如美國專利No.5,731,168)。也可以通過用于生成抗體Fc-異二聚體分子的工程化靜電操縱效應(WO2009/089004A1);交聯兩個或更多個抗體或片段(見例如美國專利No.4,676,980,及Brennan等,Science,229:81(1985));使用亮氨酸拉鏈來生成雙特異性抗體(見例如Kostelny等,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992));使用用于生成雙特異性抗體片段的“雙抗體”技術(見例如Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993));及使用單鏈Fv(sFv)二聚體(見例如Gruber等,J.Immunol.,152:5368(1994));及如例如Tutt等,J.Immunol.147:60(1991)中所描述的,制備三特異性抗體來生成多特異性抗體。

本文中還包括具有三個或更多個功能性抗原結合位點的工程化改造抗體,包括“章魚抗體”(見例如US2006/0025576)。

本文中的抗體或片段還包括包含結合多種RSPO(例如RSPO2和/或RSPO3)的抗原結合位點的“雙重作用FAb”或“DAF”(見例如US2008/0069820)。

7.抗體變體

在某些實施方案中,涵蓋本文中提供的抗體的氨基酸序列變體。例如,可以期望改善抗體的結合親和力和/或其它生物學特性。可以通過將合適的修飾引入編碼抗體的核苷酸序列中,或者通過肽合成來制備抗體的氨基酸序列變體。此類修飾包括例如對抗體的氨基酸序列內的殘基的刪除,和/或插入和/或替代。可以進行刪除,插入,和替代的任何組合以得到最終的構建體,只要最終的構建體擁有期望的特征,例如抗原結合。

a)替代,插入,和刪除變體

在某些實施方案中,提供了具有一處或多處氨基酸替代的抗體變體。替代誘變感興趣的位點包括HVR和FR。保守替代在表1中在“優選的替代”的標題下顯示。更多實質的變化在表1中在“例示性替代”的標題下提供,并且如下文參照氨基酸側鏈類別進一步描述的。可以將氨基酸替代引入感興趣的抗體中,并且對產物篩選期望的活性,例如保留/改善的抗原結合,降低的免疫原性,或改善的ADCC或CDC。

表1

依照共同的側鏈特性,氨基酸可以如下分組:

(1)疏水性的:正亮氨酸,Met,Ala,Val,Leu,Ile;

(2)中性,親水性的:Cys,Ser,Thr,Asn,Gln;

(3)酸性的:Asp,Glu;

(4)堿性的:His,Lys,Arg;

(5)影響鏈取向的殘基:Gly,Pro;

(6)芳香族的:Trp,Tyr,Phe。

非保守替代會需要用這些類別之一的成員替換另一個類別的。

一類替代變體牽涉替代親本抗體(例如人源化或人抗體)的一個或多個高變區殘基。一般地,為進一步研究選擇的所得變體相對于親本抗體會具有某些生物學特性的改變(例如改善)(例如升高的親和力,降低的免疫原性)和/或會基本上保留親本抗體的某些生物學特性。一種例示性的替代變體是親和力成熟的抗體,其可以例如使用基于噬菌體展示的親和力成熟技術(諸如本文中所描述的那些技術)來方便地生成。簡言之,將一個或多個HVR殘基突變,并將變體抗體在噬菌體上展示,并對其篩選特定的生物學活性(例如結合親和力)。

可以對HVR做出變化(例如替代),例如以改善抗體親和力。可以對HVR“熱點”,即由在體細胞成熟過程期間以高頻率經歷突變的密碼子編碼的殘基(見例如Chowdhury,MethodsMol.Biol.207:179-196(2008)),和/或接觸抗原的殘基做出此類變化,其中對所得的變體VH或VL測試結合親和力。通過次級文庫的構建和再選擇進行的親和力成熟已經記載于例如Hoogenboom等,于MethodsinMolecularBiology178:1-37(O’Brien等編,HumanPress,Totowa,NJ,(2001))。在親和力成熟的一些實施方案中,通過多種方法(例如,易錯PCR,鏈改組,或寡核苷酸指導的誘變)任一將多樣性引入為成熟選擇的可變基因。然后,創建次級文庫。然后,篩選文庫以鑒定具有期望的親和力的任何抗體變體。另一種引入多樣性的方法牽涉HVR指導的方法,其中將幾個HVR殘基(例如,一次4-6個殘基)隨機化。可以例如使用丙氨酸掃描誘變或建模來特異性鑒定牽涉抗原結合的HVR殘基。特別地,經常靶向CDR-H3和CDR-L3。

在某些實施方案中,可以在一個或多個HVR內發生替代,插入,或刪除,只要此類變化不實質性降低抗體結合抗原的能力。例如,可以對HVR做出保守變化(例如,保守替代,如本文中提供的),其不實質性降低結合親和力。例如,此類變化可以在HVR中的抗原接觸殘基以外。在上文提供的變體VH和VL序列的某些實施方案中,每個HVR是未改變的,或者含有不超過1,2或3處氨基酸替代。

一種可用于鑒定抗體中可以作為誘變靶位的殘基或區域的方法稱作“丙氨酸掃描誘變”,如由Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所描述的。在此方法中,鑒定一個殘基或一組靶殘基(例如帶電荷的殘基,諸如Arg,Asp,His,Lys,和Glu),并用中性或帶負電荷的氨基酸(例如丙氨酸或多丙氨酸)替換以測定抗體與抗原的相互作用是否受到影響。可以在對初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入進一步的替代。或者/另外,利用抗原-抗體復合物的晶體結構來鑒定抗體與抗原間的接觸點。作為替代的候選,可以靶向或消除此類接觸殘基和鄰近殘基。可以篩選變體以確定它們是否含有期望的特性。

氨基酸序列插入包括長度范圍為1個殘基至含有100或更多個殘基的多肽的氨基和/或羧基端融合,及單個或多個氨基酸殘基的序列內插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰基殘基的抗體。抗體分子的其它插入變體包括抗體的N或C端與酶(例如對于ADEPT)或延長抗體的血清半衰期的多肽的融合物。

b)糖基化變體

在某些實施方案中,改變本文中提供的抗體以提高或降低抗體糖基化的程度。可以通過改變氨基酸序列,使得創建或消除一個或多個糖基化位點來方便地實現對抗體的糖基化位點的添加或刪除。

在抗體包含Fc區的情況中,可以改變其附著的碳水化合物。由哺乳動物細胞生成的天然抗體通常包含分支的,雙觸角寡糖,其一般通過N連接附著于Fc區的CH2域的Asn297。見例如Wright等,TIBTECH15:26-32(1997)。寡糖可以包括各種碳水化合物,例如,甘露糖,N-乙酰葡糖胺(GlcNAc),半乳糖,和唾液酸,以及附著于雙觸角寡糖結構“主干”中的GlcNAc的巖藻糖。在一些實施方案中,可以對本發明抗體中的寡糖進行修飾以創建具有某些改善的特性的抗體變體。

在一個實施方案中,提供了抗體變體,其具有缺乏附著(直接或間接)于Fc區的巖藻糖的碳水化合物結構。例如,此類抗體中的巖藻糖量可以是1%至80%,1%至65%,5%至65%或20%至40%。通過相對于附著于Asn297的所有糖結構(例如,復合的,雜合的和高甘露糖的結構)的總和,計算Asn297處糖鏈內巖藻糖的平均量來測定巖藻糖量,如通過MALDI-TOF質譜術測量的,例如如記載于WO2008/077546的。Asn297指位于Fc區中的約第297位(Fc區殘基的Eu編號方式)的天冬酰胺殘基;然而,Asn297也可以由于抗體中的微小序列變異而位于第297位上游或下游約±3個氨基酸,即在第294位和第300位之間。此類巖藻糖基化變體可以具有改善的ADCC功能。見例如美國專利公開文本No.US2003/0157108(Presta,L.);US2004/0093621(KyowaHakkoKogyoCo.,Ltd)。涉及“脫巖藻糖基化的”或“巖藻糖缺乏的”抗體變體的出版物的例子包括:US2003/0157108;WO2000/61739;WO2001/29246;US2003/0115614;US2002/0164328;US2004/0093621;US2004/0132140;US2004/0110704;US2004/0110282;US2004/0109865;WO2003/085119;WO2003/084570;WO2005/035586;WO2005/035778;WO2005/053742;WO2002/031140;Okazaki等,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004);Yamane-Ohnuki等,Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能夠生成脫巖藻糖基化抗體的細胞系的例子包括蛋白質巖藻糖基化缺陷的Lec13CHO細胞(Ripka等,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986);美國專利申請NoUS2003/0157108A1,Presta,L;及WO2004/056312A1,Adams等,尤其在實施例11),和敲除細胞系,諸如α-1,6-巖藻糖基轉移酶基因FUT8敲除CHO細胞(見例如Yamane-Ohnuki等,Biotech.Bioeng.87:614(2004);Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006);及WO2003/085107)。

進一步提供了具有兩分型寡糖的抗體變體,例如其中附著于抗體Fc區的雙觸角寡糖是通過GlcNAc兩分的。此類抗體變體可以具有降低的巖藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此類抗體變體的例子記載于例如WO2003/011878(Jean-Mairet等);美國專利No.6,602,684(Umana等);及US2005/0123546(Umana等)。還提供了在附著于Fc區的寡糖中具有至少一個半乳糖殘基的抗體變體。此類抗體變體可以具有改善的CDC功能。此類抗體變體記載于例如WO1997/30087(Patel等);WO1998/58964(Raju,S.);及WO1999/22764(Raju,S.)。

c)Fc區變體

在某些實施方案中,可以將一處或多處氨基酸修飾引入本文中提供的抗體的Fc區中,由此生成Fc區變體。Fc區變體可以包含在一個或多個氨基酸位置包含氨基酸修飾(例如替代)的人Fc區序列(例如,人IgG1,IgG2,IgG3或IgG4Fc區)。

在某些實施方案中,本發明涵蓋擁有一些但不是所有效應器功能的抗體變體,所述效應器功能使其成為如下應用的期望候選物,其中抗體的體內半衰期是重要的,而某些效應器功能(諸如補體和ADCC)是不必要的或有害的。可以進行體外和/或體內細胞毒性測定法以確認CDC和/或ADCC活性的降低/消減。例如,可以進行Fc受體(FcR)結合測定法以確保抗體缺乏FcγR結合(因此很可能缺乏ADCC活性),但是保留FcRn結合能力。介導ADCC的主要細胞NK細胞僅表達Fc(RIII,而單核細胞表達Fc(RI,Fc(RII和Fc(RIII。在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464頁上的表3中匯總了造血細胞上的FcR表達。評估感興趣分子的ADCC活性的體外測定法的非限制性例子記載于美國專利No.5,500,362(見例如Hellstrom,I.等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA82:1499-1502(1985);5,821,337(見Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者,可以采用非放射性測定方法(見例如用于流式細胞術的ACTITM非放射性細胞毒性測定法(CellTechnology,Inc.MountainView,CA)和CytoTox非放射性細胞毒性測定法(Promega,Madison,WI))。對于此類測定法有用的效應細胞包括外周血單個核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細胞。或者/另外,可以在體內評估感興趣分子的ADCC活性,例如在動物模型中,諸如披露于Clynes等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA95:652-656(1998)的。也可以實施C1q結合測定法以確認抗體不能結合C1q,并且因此缺乏CDC活性。見例如WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c結合ELISA。為了評估補體激活,可以實施CDC測定法(見例如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods202:163(1996);Cragg,M.S.等,Blood101:1045-1052(2003);及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood103:2738-2743(2004))。也可以使用本領域中已知的方法來實施FcRn結合和體內清除/半衰期測定(見例如Petkova,S.B.等,Int’1.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。

具有降低的效應器功能的抗體包括那些具有Fc區殘基238,265,269,270,297,327和329中的一個或多個的替代的(美國專利No.6,737,056)。此類Fc突變體包括在氨基酸位置265,269,270,297和327中的兩處或更多處具有替代的Fc突變體,包括殘基265和297替代成丙氨酸的所謂的“DANA”Fc突變體(美國專利No.7,332,581)。在一些實施方案中,抗體在依照EU編號規則的氨基酸位置265處包含工程化改造的丙氨酸。在一些實施方案中,抗體在依照EU編號規則的氨基酸位置297處包含工程化改造的丙氨酸。

描述了具有改善的或降低的對FcR的結合的某些抗體變體(見例如美國專利No.6,737,056;WO2004/056312;及Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。

在某些實施方案中,抗體變體包含具有改善ADCC的一處或多處氨基酸替代,例如Fc區的位置298,333,和/或334(殘基的EU編號方式)的替代的Fc區。

在一些實施方案中,對Fc區做出改變,其導致改變的(即,改善的或降低的)C1q結合和/或補體依賴性細胞毒性(CDC),例如,如記載于美國專利No.6,194,551,WO99/51642,及Idusogie等,J.Immunol.164:4178-4184(2000)的。

具有延長的半衰期和改善的對新生兒Fc受體(FcRn)的結合的抗體記載于US2005/0014934(Hinton等),新生兒Fc受體(FcRn)負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等,J.Immunol.l17:587(1976)及Kim等,J.Immunol.24:249(1994))。那些抗體包含其中具有改善Fc區對FcRn結合的一處或多處替代的Fc區。此類Fc變體包括那些在Fc區殘基238,256,265,272,286,303,305,307,311,312,317,340,356,360,362,376,378,380,382,413,424或434中的一處或多處具有替代,例如,Fc區殘基434的替代的(美國專利No.7,371,826)。還可見Duncan和Winter,Nature322:738-40(1988);美國專利No.5,648,260;美國專利No.5,624,821;及WO94/29351,其關注Fc區變體的其它例子。

d)經半胱氨酸工程化改造的抗體變體

在某些實施方案中,可以期望創建經半胱氨酸工程化改造的抗體,例如,“thioMAb”,其中抗體的一個或多個殘基用半胱氨酸殘基替代。在具體的實施方案中,替代的殘基存在于抗體的可接近位點。通過用半胱氨酸替代那些殘基,反應性硫醇基團由此定位于抗體的可接近位點,并且可以用于將抗體與其它模塊,諸如藥物模塊或接頭-藥物模塊綴合,以創建免疫綴合物,如本文中進一步描述的。在某些實施方案中,可以用半胱氨酸替代下列殘基之任一個或多個:輕鏈的V205(Kabat編號方式);重鏈的A118(EU編號方式);和重鏈Fc區的S400(EU編號方式)。可以如例如美國專利No.7,521,541所述生成經半胱氨酸工程化改造的抗體。

e)抗體衍生物

在某些實施方案中,可以進一步修飾本文中提供的抗體以含有本領域知道的且易于獲得的額外非蛋白質性質模塊。適合于抗體衍生化的模塊包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG),乙二醇/丙二醇共聚物,羧甲基纖維素,右旋糖苷,聚乙烯醇,聚乙烯吡咯烷酮,聚-1,3-二氧雜環戊環,聚-1,3,6-三氧雜環己烷,乙烯/馬來酸酐共聚物,聚氨基酸(均聚物或隨機共聚物),和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇,丙二醇均聚物,聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物,聚氧乙烯化多元醇(例如甘油),聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的穩定性,聚乙二醇丙醛在生產中可能具有優勢。聚合物可以是任何分子量,而且可以是分支的或不分支的。附著到抗體上的聚合物數目可以變化,而且如果附著了超過一個聚合物,那么它們可以是相同或不同的分子。一般而言,可根據下列考慮來確定用于衍生化的聚合物的數目和/或類型,包括但不限于抗體要改進的具體特性或功能,抗體衍生物是否會用于指定條件下的治療等。

在另一個實施方案中,提供了抗體和可以通過暴露于輻射選擇性加熱的非蛋白質性質模塊的綴合物。在一個實施方案中,非蛋白質性質模塊是碳納米管(Kam等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:11600-11605(2005))。輻射可以是任何波長的,并且包括但不限于對普通細胞沒有損害,但是將非蛋白質性質模塊加熱至抗體-非蛋白質性質模塊附近的細胞被殺死的溫度的波長。

B.重組方法和組合物

可以使用重組方法和組合物來生成抗體,例如,如記載于美國專利No.4,816,567的。在一個實施方案中,提供了編碼本文中所描述的抗RSPO抗體的分離的核酸。此類核酸可以編碼包含抗體VL的氨基酸序列和/或包含VH的氨基酸序列(例如,抗體的輕和/或重鏈)。在又一個實施方案中,提供了包含此類核酸的一種或多種載體(例如,表達載體)。在又一個實施方案中,提供了包含此類核酸的宿主細胞。在一個此類實施方案中,宿主細胞包含(例如,已經用下列載體轉化):(1)包含核酸的載體,所述核酸編碼包含抗體的VL的氨基酸序列和包含抗體的VH的氨基酸序列,或(2)第一載體和第二載體,所述第一載體包含編碼包含抗體的VL的氨基酸序列的核酸,所述第二載體包含編碼包含抗體的VH的氨基酸序列的核酸。在一個實施方案中,宿主細胞是真核的,例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴樣細胞(例如,Y0,NS0,Sp20細胞)。在一個實施方案中,提供了生成抗RSPO抗體的方法,其中該方法包括在適合于表達抗體的條件下培養包含編碼抗體的核酸的宿主細胞,如上文提供的,并且任選地,自宿主細胞(或宿主細胞培養液)回收抗體。

對于抗RSPO抗體的重組生成,將編碼抗體的核酸(例如如上文所描述的)分離,并插入一種或多種載體中,以在宿主細胞中進一步克隆和/或表達。可以使用常規規程將此類核酸容易地分離并測序(例如,通過使用寡核苷酸探針來進行,所述寡核苷酸探針能夠特異性結合編碼抗體的重和輕鏈的基因)。

適合于克隆或表達抗體編碼載體的宿主細胞包括本文中所描述的原核或真核細胞。例如,可以在細菌中生成抗體,特別是在不需要糖基化和Fc效應器功能時。對于抗體片段和多肽在細菌中的表達,見例如美國專利No.5,648,237,5,789,199和5,840,523(還可見Charlton,MethodsinMolecularBiology,第248卷(B.K.C.Lo編,HumanaPress,Totowa,NJ,2003),第245-254頁,其描述了抗體片段在大腸桿菌(E.coli.)中的表達)。表達后,可以將抗體在可溶性級分中自細菌細胞團糊分離,并可以進一步純化。

在原核生物外,真核微生物諸如絲狀真菌或酵母是適合于抗體編碼載體的克隆或表達宿主,包括其糖基化途徑已經“人源化”,導致生成具有部分或完全人的糖基化樣式的抗體的真菌和酵母菌株。見Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004),及Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。

適合于表達糖基化抗體的宿主細胞也自多細胞生物體(無脊椎動物和脊椎動物)衍生。無脊椎動物細胞的例子包括植物和昆蟲細胞。已經鑒定出許多桿狀病毒株,其可以與昆蟲細胞一起使用,特別是用于轉染草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)細胞。

也可以利用植物細胞培養物作為宿主。見例如美國專利No.5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978和6,417,429(其描述了用于在轉基因植物中生成抗體的PLANTIBODIESTM技術)。

也可以使用脊椎動物細胞作為宿主。例如,適合于在懸浮液中生長的哺乳動物細胞系可以是有用的。有用的哺乳動物宿主細胞系的其它例子是經SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7);人胚腎系(293或如記載于例如Graham等,J.GenViroi.36:59(1977)的293細胞);幼倉鼠腎細胞(BHK);小鼠塞托利(sertoli)細胞(TM4細胞,如記載于例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)的);猴腎細胞(CVl);非洲綠猴腎細胞(VERO-76);人宮頸癌細胞(HELA);犬腎細胞(MDCK;牛鼠(buffalorat)肝細胞(BRL3A);人肺細胞(W138);人肝細胞(HepG2);小鼠乳房腫瘤(MMT060562);TRI細胞,如記載于例如Mather等,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)的;MRC5細胞;和FS4細胞。其它有用的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞,包括DHFR-CHO細胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980));和骨髓瘤細胞系諸如Y0,NS0和Sp2/0。關于適合于抗體生成的某些哺乳動物宿主細胞系的綜述,見例如Yazaki和Wu,MethodsinMolecularBiology,第248卷(B.K.C.Lo編,HumanaPress,Totowa,NJ),第255-268頁(2003)。

C.測定法

可以通過本領域中已知的多種測定法對本文中提供的抗RSPO抗體鑒定,篩選,或表征其物理/化學特性和/或生物學活性。

1.結合測定法和其它測定法

一方面,對本發明的抗體測試其抗原結合活性,例如通過已知方法,諸如ELISA,Western印跡,等。

測定結合親和力的方法是本領域已知的。在一些實施方案中,可以依照本文實施例1所述測定法來測定結合親和力。具體地,在一些實施方案中,可以使用-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)使用表面等離振子共振測定法來測量Kd。

測定抗RSPO抗體破壞和/或抑制RSPO對LGR(例如LGR4,5,和/或6),黏結蛋白聚糖(例如SDC4),和/或E3遍在蛋白酶(例如ZNRF3和/或RNF43)的結合的能力的方法是本領域已知的。參見例如WO2011/076932;WO2013012747;Lau等,Nature476:293-297(2011);Hao等,Nature485:195-200(2012),據此通過援引將其完整收錄。在一些實施方案中,可以通過流式細胞術,BIAcore測定法,和/或ELISA(例如競爭性結合ELISA)來測定抗RSPO抗體顯著破壞R-spondin(RSPO)對LGR,黏結蛋白聚糖和/或E3遍在蛋白酶的結合的能力。在一些實施方案中,可以依照本文實施例1所述競爭性結合ELISA來測定抗RSPO抗體破壞和/或抑制RSPO對LGR(例如LGR4,5,和/或6),黏結蛋白聚糖(SDC4),和/或anE3遍在蛋白酶(例如ZNRF3和/或RNF43)的結合的能力。

在另一個方面,可以使用競爭測定法來鑒定與4H1,4D4,5C2,5D6,5E11,6E9,21C2,26E11,1A1,11F11,36D2,和/或49G5競爭結合RSPO(例如RSPO2和/或RSPO3)的抗體。

測定抗體競爭的方法是本領域已知的。在一種例示性競爭測定法中,在包含第一經標記抗體(其結合RSPO(例如RSPO2和/或RSPO3),例如4H1,4D4,5C2,5D6,5E11,6E9,21C2,26E11,1A1,11F11,36D2,和/或49G5)和第二未標記抗體(其要測試與第一抗體競爭對RSPO(例如RSPO2和/或RSPO3)的結合的能力)的溶液中溫育固定化RSPO(例如RSPO2和/或RSPO3)。第二抗體可存在于雜交瘤上清液中。作為對照,在包含第一經標記抗體但不包含第二未標記抗體的溶液中溫育固定化RSPO(例如RSPO2和/或RSPO3)。在允許第一抗體結合RSPO(例如RSPO2和/或RSPO3)的條件下溫育后,除去過量的未結合抗體,并測量與固定化RSPO(例如RSPO2和/或RSPO3)聯合的標記物的量。如果測試樣品中與固定化RSPO(例如RSPO2和/或RSPO3)聯合的標記物的量與對照樣品相比實質性降低,那么這指示第二抗體與第一抗體競爭對RSPO(例如RSPO2和/或RSPO3)的結合。參見HarloWandLane(1988)Antibodies:ALaboratoryManualch.14(ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY)。

實施例1中描述了對于表位分倉和/或測定兩種抗體是否競爭結合有用的另一種例示性競爭測定法。在一些實施方案中,可以依照本文實施例1所述測定法來測定表位分倉和/或測定兩種抗體是否競爭結合。

在某些實施方案中,抗體結合4H1,4D4,5C2,5D6,5E11,6E9,21C2,26E11,1A1,11F11,36D2,和/或49G5所結合的相同表位(例如線性或構象表位)。用于定位抗體結合的表位的詳細例示性方法提供于Morris(1996)“EpitopeMappingProtocols,”inMethodsinMolecularBiologyvol.66(HumanaPress,Totowa,NJ)。在一些實施方案中,通過肽競爭來測定表位。在一些實施方案中,通過質譜術來測定表位。在一些實施方案中,通過結晶學來測定表位。實施例1中描述了一種例示性結晶學方法。

2.活性測定法

在一個方面,提供用于鑒定具有生物學活性的抗RSPO抗體的測定法。生物學活性可以包括例如抑制wnt信號傳導,抑制血管發生,抑制細胞增殖,抑制癌干細胞增殖,和/或消減癌干細胞。還提供在體內和/或在體外具有此類生物學活性的抗體。

測定抗RSPO抗體破壞wnt/β-聯蛋白信號傳導的能力的方法是本領域已知的。參見例如WO2005/040418和WO2013/012747,據此通過援引將其完整收錄。在一些實施方案中,可以使用報告基因測定法來測定抗RSPO抗體顯著破壞wnt/β-聯蛋白信號傳導的能力。在一些實施方案中,例如,可以將包含在wnt/β-聯蛋白響應性啟動子(諸如例如包含多聚化TCF/LEFDNA結合位點的啟動子)控制下的報告基因(諸如例如螢光素酶基因)的報告構建物轉染入細胞中。然后在RSPO抗體存在和缺失下使細胞接觸Wnt配體(諸如Wnt3a)和RSPO(諸如RSPO1,RSPO2,RSPO3,和/或RSPO4),并測量螢光素酶表達。

測定抗RSPO抗體抑制血管發生和/或血管形成的能力的方法是本領域已知的。參見例如WO2008/046649,據此通過援引將其完整收錄。測定法的例子包括體內Matrigel栓和角膜新血管形成測定法,體內/體外小雞絨毛膜尿囊膜(CAM)測定法,體外細胞(增殖,遷移,管形成)和器官型(主動脈環)測定法,小雞主動脈弓測定法,和Matrigel海綿測定法。

測定抗RSPO抗體誘導干細胞分化和/或癌干細胞消減的能力的方法是本領域已知的。參見例如WO2013/036867,據此通過援引將其完整收錄。在一些實施方案中,可以通過測定在抗RSPO抗體存在和缺失下隱窩基底柱狀細胞(CBC)(它是小腸中快速循環的干細胞)分化成例如腸細胞,杯形細胞,和/或腸內分泌細胞的能力來測定干細胞分化。

在某些實施方案中,通過本文中及WO2005/040418;WO2008/046649;WO2011/076932;WO2013/012747;WO2013/054307;Lau等,Nature476:293-297(2011);Hao等,Nature485:195-200(2012)(據此通過援引將其完整收錄)中描述的測定法對本發明的抗體測試此類生物學活性和/或結合相互作用。

在一些實施方案中,通過結晶學來測定表位。在一些實施方案中,該通過結晶學測定的表位是使用RSPO3的氨基酸M33-E210測定的。在一些實施方案中,該通過結晶學測定的表位是如下實施的,即使用100nL坐滴(sittingdrop)使用LabcyteEcho液體操作器設置數個稀疏矩陣晶體篩。將篩保存于18℃。在一些實施方案中,可以在含有100mMMIBpH9和25%PEG1500作為母液的一滴中獲得晶體。在一些實施方案中,可以在含有200mM甲酸鈉和20%(w/v)PEG3,350作為母液的一滴中獲得晶體。在一些實施方案中,可以收獲晶體,在防凍劑溶液中浸泡10秒,并在液氮中閃凍。在一些實施方案中,該防凍劑溶液可以通過混合1μL70%甘油與1.8μL儲備溶液來生成。在一些實施方案中,該晶體可以在基于PEG的條件中生長,例如約20-25%PEG3,350。在一些實施方案中,該晶體可以在約20%PEG6,000,約20-25%PEG4,000,和約25%PEG1,500中生長。在一些實施方案中,該pH的范圍可以是約3.5-9,例如介于約7和約8之間。在一些實施方案中,該鹽濃度為約200mM。

D.免疫綴合物

本發明還提供了包含與一種或多種細胞毒劑,諸如化療劑或化療藥物,生長抑制劑,毒素(例如,蛋白質毒素,細菌,真菌,植物,或動物起源的酶活性毒素,或其片段),或放射性同位素綴合的本文中的抗RSPO抗體的免疫綴合物。

在一個實施方案中,免疫綴合物是抗體-藥物綴合物(ADC),其中抗體與一種或多種藥物綴合,包括但不限于美登木素生物堿(見美國專利No.5,208,020,5,416,064和歐洲專利EP0425235B1);奧瑞司他汀(auristatin)諸如單甲基奧瑞司他汀藥物模塊DE和DF(MMAE和MMAF)(見美國專利No.5,635,483和5,780,588及7,498,298);多拉司他汀(dolastatin);加利車霉素(calicheamicin)或其衍生物(見美國專利No.5,712,374,5,714,586,5,739,116,5,767,285,5,770,701,5,770,710,5,773,001和5,877,296;Hinman等,CancerRes.53:3336-3342(1993);及Lode等,CancerRes.58:2925-2928(1998));蒽環類抗生素諸如道諾霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(見Kratz等,CurrentMed.Chem.13:477-523(2006);Jeffrey等,Bioorganic&Med.Chem.Letters16:358-362(2006);Torgov等,Bioconj.Chem.16:717-721(2005);Nagy等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:829-834(2000);Dubowchik等,Bioorg.&Med.Chem.Letters12:1529-1532(2002);King等,J.Med.Chem.45:4336-4343(2002);及美國專利No.6,630,579);甲氨蝶呤;長春地辛(vindesine);紫杉烷(taxane)諸如多西他賽(docetaxel),帕利他塞(paclitaxel),larotaxel,tesetaxel,和ortataxel;單端孢霉素(trichothecene);和CCl065。

在另一個實施方案中,免疫綴合物包含與酶活性毒素或其片段綴合的如本文中所描述的抗體,所述酶活性毒素包括但不限于白喉A鏈,白喉毒素的非結合活性片段,外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)),蓖麻毒蛋白(ricin)A鏈,相思豆毒蛋白(abrin)A鏈,蒴蓮根毒蛋白(modeccin)A鏈,α-帚曲霉素(sarcin),油桐(Aleutitesfordii)毒蛋白,香石竹(dianthin)毒蛋白,美洲商陸(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI,PAPII和PAP-S),苦瓜(Momordicacharantia)抑制物,麻瘋樹毒蛋白(curcin),巴豆毒蛋白(crotin),肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制劑,白樹毒蛋白(gelonin),絲林霉素(mitogellin),局限曲菌素(restrictocin),酚霉素(phenomycin),依諾霉素(enomycin)和單端孢菌素(trichothecenes)。

在另一個實施方案中,免疫綴合物包含與放射性原子綴合以形成放射性綴合物的如本文中所描述的抗體。多種放射性同位素可用于生成放射性綴合物。例子包括At211,I131,I125,y90,Re186,Re188,Sm153,Bi212,P32,Pb212和Lu的放射性同位素。在使用放射性綴合物進行檢測時,它可以包含供閃爍法研究用的放射性原子,例如Tc99m或I123,或供核磁共振(NMR)成像(又稱為磁共振成像,MRI)用的自旋標記物,諸如再一次的碘-123,碘-131,銦-111,氟-19,碳-13,氮-15,氧-17,釓,錳或鐵。

可以使用多種雙功能蛋白質偶聯劑來生成抗體和細胞毒劑的綴合物,諸如N-琥珀酰亞氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP),琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來酰亞氨基甲基)環己烷-1-羧酸酯(SMCC),亞氨基硫烷(IT),亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二甲酯),活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯),醛類(諸如戊二醛),雙疊氮化合物(諸如雙(對-疊氮苯甲酰基)己二胺),雙重氮衍生物(諸如雙(對-重氮苯甲酰基)-乙二胺),二異硫氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯),和雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的雙功能衍生物。例如,可以如Vitetta等,Science238:1098(1987)中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標記的1-異硫氰酸芐基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苷酸與抗體偶聯的例示性螯合劑。參見WO94/11026。接頭可以是便于在細胞中釋放細胞毒性藥物的“可切割接頭”。例如,可使用酸不穩定接頭,肽酶敏感性接頭,光不穩定接頭,二甲基接頭或含二硫化物接頭(Chari等,CancerRes52:127-131(1992);美國專利No.5,208,020)。

本文中的免疫綴合物或ADC明確涵蓋,但不限于用交聯試劑制備的此類綴合物,所述交聯試劑包括但不限于BMPS,EMCS,GMBS,HBVS,LC-SMCC,MBS,MPBH,SBAP,SIA,SIAB,SMCC,SMPB,SMPH,sulfo-EMCS,sulfo-GMBS,sulfo-KMUS,sulfo-MBS,sulfo-SIAB,sulfo-SMCC,和sulfo-SMPB,及SVSB(琥珀酰亞氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯),它們是商品化的(例如,來自PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。

E.用于診斷和檢測的方法和組合物

在某些實施方案中,本文中提供的任何抗RSPO抗體可用于檢測樣品中RSPO的存在。如本文中使用的,術語“檢測”涵蓋定量或定性檢測。在某些實施方案中,樣品包含細胞或組織,諸如胃腸,胃,食道,結腸,直腸,和/或結直腸組織。在一些實施方案中,樣品包含細胞或組織,諸如腎上腺,膀胱,腦,乳腺,宮頸,結腸,頭和頸,腎,白血病,肝,肺,淋巴樣,卵巢,胰腺,前列腺,直腸,皮膚,胃,甲狀腺,和/或子宮組織。在一些實施方案中,樣品包含細胞或組織,諸如肺,卵巢,乳腺,肝,或多發性骨髓瘤組織。

在一個實施方案中,提供了在診斷或檢測方法中使用的抗RSPO抗體。在又一方面,提供了檢測樣品中RSPO的存在的方法。在某些實施方案中,該方法包括在允許抗RSPO抗體結合RSPO的條件下使樣品與如本文中所描述的抗RSPO抗體接觸,并檢測是否在抗RSPO抗體與RSPO之間形成復合物。此類方法可以是體外或體內方法。在一個實施方案中,使用抗RSPO抗體來選擇適合用抗RSPO抗體治療的受試者,例如其中RSPO是一種用于選擇患者的生物標志物。在一些實施方案中,該RSPO為RSPO2。在一些實施方案中,該RSPO為RSPO3。在一些實施方案中,該RSPO為RSPO2和RSPO3。在一些實施方案中,該個體和/或癌癥具有升高的一種或多種干細胞生物標志物表達。在一些實施方案中,該干細胞生物標志物包含Myc,Axin2,LGR5,TERT,BIRC5,和/或Ascl2。在一些實施方案中,該個體和/或癌癥具有降低的一種或多種分化生物標志物表達。在一些實施方案中,該分化生物標志物包含CEACAM7,SLC26A3,CA1,SYT15,CA4,TFF1,和/或KRT20。

例如,本文中提供的是在個體中治療癌癥的方法,其中該癌癥包含一種或多種生物標志物,該方法包括對該個體施用有效量的抗RSPO抗體。本文中還提供的是在個體中治療癌癥的方法,其包括對該個體施用有效量的抗RSPO抗體,其中治療基于該個體具有包含一種或多種生物標志物的癌癥。

易位是異常有力的癌癥突變,因為它們常常對靶基因具有多重影響:在單一“突變”中,它們能顯著改變蛋白質的表達,去除蛋白質的調節域,推動蛋白質的寡聚化,改變蛋白質的亞細胞定位或將蛋白質連接至新的結合域。這在臨床上反映為如下事實,即一些瘤依照特定融合基因的存在來分類或管理。在任何方法的一些實施方案中,該一種或多種生物標志物包含表2中所列一種或多種基因的易位(例如染色體內易位,染色體間易位,重排和/或融合)。

在任何方法的一些實施方案中,該易位為PVT1。在一些實施方案中,該PVT1易位包含PVT1和MYC。在一些實施方案中,該RSPO2易位包含PVT1和IncDNA。在任何方法的一些實施方案中,該易位為R-spondin易位。在一些實施方案中,該R-spondin易位為RSPO1易位。在一些實施方案中,該R-spondin易位為RSPO2。在一些實施方案中,該RSPO2易位包含EMC2和RSPO2。在一些實施方案中,該RSPO2易位包含EIF3E和RSPO2。在一些實施方案中,該RSPO2易位包含EIF3E外顯子1和RSPO2外顯子2。在一些實施方案中,該RSPO2易位包含EIF3E外顯子1和RSPO2外顯子3。在一些實施方案中,該RSPO2易位包含SEQIDNO:71。在一些實施方案中,該RSPO2易位是包括SEQIDNO:114,143,和/或145的引物可檢測的。在一些實施方案中,該RSPO2易位是由EIF3E啟動子驅動的。在一些實施方案中,該RSPO2易位是由RSPO2啟動子驅動的。在一些實施方案中,該R-spondin易位為RSPO3易位。在一些實施方案中,該RSPO3易位包含PTPRK和RSPO3。在一些實施方案中,該RSPO3易位包含PTPRK外顯子1和RSPO3外顯子2。在一些實施方案中,該RSPO3易位包含PTPRK外顯子7和RSPO3外顯子2。在一些實施方案中,該RSPO3易位包含SEQIDNO:171和/或SEQIDNO:172。在一些實施方案中,該RSPO3易位是包括SEQIDNO:115,116,145,和/或146的引物可檢測的。在一些實施方案中,該RSPO3易位是由PTPRK啟動子驅動的。在一些實施方案中,該RSPO3易位是由RSPO3啟動子驅動的。在一些實施方案中,該RSPO3易位包含PTPRK分泌信號序列(和/或不包含RSPO3分泌信號序列)。

在一些實施方案中,該R-spondin易位為RSPO4易位。在一些實施方案中,該R-spondin易位導致R-spondin的表達水平升高(例如與沒有該R-spondin易位的參照相比)。在一些實施方案中,該R-spondin易位導致R-spondin的活性和/或激活升高(例如與沒有該R-spondin易位的參照相比)。在一些實施方案中,一種或多種生物標志物的存在包含R-spondin易位,諸如表2中的易位,和KRAS和/或BRAF。在一些實施方案中,一種或多種生物標志物的存在為R-spondin易位(例如重排和/或融合),諸如表2中的易位,和KRAS和/或BRAF中的變異(例如多態性或突變)的存在。在一些實施方案中,該個體和/或癌癥包含KRAS和/或BRAF中的變異(多態性或突變)。在一些實施方案中,一種或多種生物標志物的存在為R-spondin易位,諸如表2中的易位的存在,而且一種或多種生物標志物的缺失為CTNNB1和/或APC中的變異(例如多態性或突變)的缺失。

在任何易位(例如染色體內易位,染色體間易位,重排和/或融合)的一些實施方案中,該易位(例如染色體內易位,染色體間易位,重排和/或融合)為體細胞易位(例如染色體內易位,染色體間易位,重排和/或融合)。在一些實施方案中,該易位為染色體內易位。在一些實施方案中,該易位為染色體間易位。在一些實施方案中,該易位為倒位。在一些實施方案中,該易位為刪除。在一些實施方案中,該易位為功能性易位融合多核苷酸(例如功能性R-spondin易位融合多核苷酸)和/或功能性易位融合多肽(例如功能性R-spondin易位融合多肽)。在一些實施方案中,該功能性易位融合多肽(例如功能性R-spondin易位融合多肽)激活已知受到易位基因之一調控的途徑(例如wnt信號傳導途徑)。在一些實施方案中,該途徑為規范wnt信號傳導途徑。在一些實施方案中,該途徑為非規范wnt信號傳導途徑。在一些實施方案中,測定途徑激活的方法是本領域已知的,而且包括本文所述螢光素酶報告物測定法。在一些實施方案中,該方法為Seshagiri等,Nature488:660-664(2012)和/或WO2013/120056中描述的一種或多種方法,通過援引將其完整收錄。

可以使用本發明的抗體來診斷的例示性病癥包括腫瘤,細胞增殖性病癥,癌癥,胃腸癌,胃癌,結直腸癌,結腸癌,和/或直腸癌。可以使用本發明的抗體來診斷的例示性病癥進一步包括腎上腺癌,膀胱癌,腦癌,乳腺癌,宮頸癌,結腸癌,頭和頸癌,腎癌,白血病,肝癌,肺癌(例如NSCLC),淋巴樣癌,卵巢癌,胰腺癌,前列腺癌,直腸癌,皮膚癌(例如黑素瘤),胃癌,甲狀腺癌,和/或子宮癌。可以使用本發明的抗體來診斷的例示性病癥還包括肺癌(例如NSCLC),卵巢癌,乳腺癌,肝癌,或多發性骨髓瘤。

樣品包括但不限于原代或培養的細胞或細胞系,細胞上清液,細胞裂解物,血小板,血清,血漿,玻璃體液,淋巴液,滑液,濾泡液,精液,羊水,乳,全血,血液衍生細胞,尿液,腦脊液,唾液,痰液,淚液,汗液,粘液,腫瘤裂解物,和組織培養液,組織提取物諸如勻漿組織,腫瘤組織,細胞提取物,及其組合。在一些實施方案中,該樣品為來自胃腸,胃,食道,結腸,直腸,和/或結直腸組織的樣品。在一些實施方案中,該樣品為來自腎上腺,膀胱,腦,乳腺,宮頸,結腸,頭和頸,腎,白血病,肝,肺,淋巴樣,卵巢,胰腺,前列腺,直腸,皮膚,胃,甲狀腺,和/或子宮組織的樣品。在一些實施方案中,該樣品為來自肺,卵巢,乳腺,肝,或多發性骨髓瘤組織的樣品。

在某些實施方案中,提供了經標記的抗RSPO抗體。標記物包括但不限于直接檢測的標記物或模塊(諸如熒光,發色,電子致密,化學發光,和放射性標記物),及例如經由酶反應或分子相互作用間接檢測的模塊,諸如酶或配體。例示性的標記物包括但不限于放射性同位素32p,14C,125I,3H,和131I,熒光團諸如稀土螯合物或熒光素及其衍生物,羅丹明(rhodamine)及其衍生物,丹酰,傘形酮,螢光素酶,例如,螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶(美國專利No.4,737,456),螢光素,2,3-二氫酞嗪二酮,辣根過氧化物酶(HRP),堿性磷酸酶,β-半乳糖苷酶,葡糖淀粉酶,溶菌酶,糖類氧化酶,例如,葡萄糖氧化酶,半乳糖氧化酶,和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶,雜環氧化酶諸如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶(其與采用過氧化氫氧化染料前體的酶諸如HRP偶聯),乳過氧化物酶,或微過氧化物酶,生物素/親合素,自旋標記物,噬菌體標記物,穩定的自由基,等等。

在任何方法的一些實施方案中,升高的表達指生物標志物(例如蛋白質或核酸(例如基因或mRNA))水平中相比于參照樣品,參照細胞,參照組織,對照樣品,對照細胞或對照組織的任意的約10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或更高的總體增加,其通過標準的本領域已知方法諸如本文中描述的那些檢測。在某些實施方案中,升高的表達指樣品中生物標志物的表達水平/量的增加,其中所述增加是參照樣品,參照細胞,參照組織,對照樣品,對照細胞或對照組織中相應生物標志物表達水平/量的任意的至少約1.5倍,1.75倍,2倍,3倍,4倍,5倍,6倍,7倍,8倍,9倍,10倍,25倍,50倍,75倍或100倍。在一些實施方案中,升高的表達指相比參照樣品,參照細胞,參照組織,對照樣品,對照細胞,對照組織或內部對照(例如持家基因)高約1.5倍,約1.75倍,約2倍,約2.25倍,約2.5倍,約2.75倍,約3.0倍或約3.25倍的總體增加。

在任何方法的一些實施方案中,降低的表達指生物標志物(例如蛋白質或核酸(例如基因或mRNA))水平中相比于參照樣品,參照細胞,參照組織,對照樣品,對照細胞或對照組織的任意的約10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或更高的總體降低,其通過標準的本領域已知方法諸如本文中描述的那些檢測。在某些實施方案中,降低的表達指樣品中生物標志物的表達水平/量的降低,其中所述降低是參照樣品,參照細胞,參照組織,對照樣品,對照細胞或對照組織中相應生物標志物表達水平/量的任意的至少約0.9倍,0.8倍,0.7倍,0.6倍,0.5倍,0.4倍,0.3倍,0.2倍,0.1倍,0.05倍或0.01倍。

可通過許多方法學來分析樣品中各種生物標志物的存在和/或表達水平/量,其中許多是本領域中已知且熟練技術人員理解的,包括但不限于免疫組織化學(“IHC”),Western印跡分析,免疫沉淀,分子結合測定法,ELISA,ELIFA,熒光激活細胞分選(“FACS”),MassARRAY,蛋白組學,基于血液的定量測定法(如例如血清ELISA),生化酶活性測定法,原位雜交,Southern分析,Northern分析,全基因組測序,聚合酶鏈式反應(“PCR”)(包括定量實時PCR(“qRT-PCR”)和其他擴增類型檢測方法,如例如分支的DNA,SISBA,TMA等),RNA-Seq,FISH,微陣列分析,基因表達概況分析,和/或基因表達系列分析(“SAGE”),以及可通過蛋白質,基因和/或組織陣列分析實施的許多種測定法中的任一種。用于評估基因和基因產物狀態的典型方案見于例如Ausubel等,eds.,1995,CurrentProtocolsInMolecularBiology,Units2(NorthernBlotting),4(SouthernBlotting),15(Immunoblotting)和18(PCRAnalysis)。還可使用多重免疫測定法如那些可從RulesBasedMedicine或MesoScaleDiscovery(“MSD”)獲得的。

在一些實施方案中,使用包括以下的方法測定生物標志物的存在和/或表達水平/量:(a)在樣品(如患者癌癥樣品)上實施基因表達概況分析,PCR(諸如rtPCR),RNA-seq,微陣列分析,SAGE,MassARRAY技術,或FISH;并(b)測定生物標志物在樣品中的存在和/或表達水平/量。在一些實施方案中,微陣列方法包括使用微陣列芯片,其具有一種或多種能在嚴格條件下與編碼上文所述基因的核酸分子雜交的核酸分子或具有一種或多種能與一種或多種由上文所述基因編碼的蛋白質結合的多肽(諸如肽或抗體)。在一個實施方案中,PCR方法是qRT-PCR。在一個實施方案中,PCR方法是多重PCR。在一些實施方案中,通過微陣列測量基因表達。在一些實施方案中,通過qRT-PCR測量基因表達。在一些實施方案中,通過多重PCR來測量表達。

F.藥物配制劑

通過混合具有期望純度的此類抗體與一種或多種任選的藥學可接受載體(Remington’sPharmaceuticalSciences第16版,Osol,A.編(1980))以凍干配制劑或水性溶液形式制備如本文中所描述的抗RSPO抗體的藥物配制劑。一般地,藥學可接受載體在所采用的劑量和濃度對接受者是無毒的,而且包括但不限于緩沖劑,諸如磷酸鹽,檸檬酸鹽,和其它有機酸;抗氧化劑,包括抗壞血酸和甲硫氨酸;防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基芐基銨;氯化己烷雙胺;苯扎氯銨,苯索氯銨;酚,丁醇或苯甲醇;對羥基苯甲酸烴基酯,諸如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯;鄰苯二酚;間苯二酚;環己醇;3-戊醇;和間甲酚);低分子量(少于約10個殘基)多肽;蛋白質,諸如血清清蛋白,明膠或免疫球蛋白;親水性聚合物,諸如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,諸如甘氨酸,谷氨酰胺,天冬酰胺,組氨酸,精氨酸或賴氨酸;單糖,二糖和其它碳水化合物,包括葡萄糖,甘露糖或糊精;螯合劑,諸如EDTA;糖類,諸如蔗糖,甘露醇,海藻糖或山梨醇;成鹽相反離子,諸如鈉;金屬復合物(例如Zn-蛋白質復合物);和/或非離子表面活性劑,諸如聚乙二醇(PEG)。本文中的例示性的藥學可接受載體進一步包含間質藥物分散劑諸如可溶性中性活性透明質酸酶糖蛋白(sHASEGP),例如人可溶性PH-20透明質酸酶糖蛋白,諸如rHuPH20(BaxterInternational,Inc.)。某些例示性的sHASEGP和使用方法,包括rHuPH20記載于美國專利公開文本No.2005/0260186和2006/0104968。在一方面,將sHASEGP與一種或多種其它的糖胺聚糖酶諸如軟骨素酶組合。

例示性的凍干抗體配制劑記載于美國專利No.6,267,958。水性抗體配制劑包括那些記載于美國專利No.6,171,586和WO2006/044908的,后一種配制劑包含組氨酸-乙酸鹽緩沖液。

本文中的配制劑還可含有超過一種所治療具體適應癥所必需的活性組分,優選那些活性互補且彼此沒有不利影響的化合物。此類活性組分適于以有效用于所需目的的量而組合存在。

活性成分可包載于例如通過凝聚技術或通過界面聚合制備的微膠囊中(例如分別是羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊),在膠狀藥物投遞系統中(例如脂質體,清蛋白微球體,微乳劑,納米顆粒和納米膠囊),或在粗滴乳狀液中。此類技術披露于例如Remington′sPharmaceuticalSciences,第16版,Osol,A.編(1980)。

可以制備持續釋放制劑。持續釋放制劑的合適的例子包括含有抗體的固體疏水性聚合物的半透性基質,該基質為成形商品形式,例如膜,或微膠囊。

用于體內施用的配制劑一般是無菌的。無菌性可容易地實現,例如通過穿過無菌濾膜過濾。

G.治療性方法和組合物

可以在治療性方法中使用本文中提供的任何抗RSPO抗體。

在一個方面,提供作為藥物使用的抗RSPO抗體。在又一些方面,提供在治療腫瘤,細胞增殖性病癥,和/或癌癥中使用的抗RSPO抗體。在一些實施方案中,提供在促進細胞分化(包括癌細胞終末分化)中使用的抗RSPO抗體。在某些實施方案中,提供在治療方法中使用的抗RSPO抗體。在某些實施方案中,本發明提供在治療具有腫瘤,細胞增殖性病癥,和/或癌癥的個體的方法中使用的抗RSPO抗體,該方法包括對該個體施用有效量的抗RSPO抗體。在一些實施方案中,該癌癥為結直腸癌。在一個此類實施方案中,該方法進一步包含對該個體施用有效量的至少一種別的治療劑,例如下文所述。在一些實施方案中,該RSPO為RSPO2。在一些實施方案中,該RSPO為RSPO3。在一些實施方案中,該RSPO為RSPO2和RSPO3。在又一些實施方案中,本發明提供在抑制wnt信號傳導,抑制血管發生,抑制細胞增殖,抑制癌干細胞增殖,和/或消減癌干細胞中使用的抗RSPO抗體。在某些實施方案中,本發明提供在個體中抑制wnt信號傳導,抑制血管發生,抑制細胞增殖,抑制癌干細胞增殖,和/或消減癌干細胞的方法中使用的抗RSPO抗體,該方法包括對該個體施用有效量的抗RSPO抗體以抑制wnt信號傳導,抑制血管發生,抑制細胞增殖,抑制癌干細胞增殖,和/或消減癌干細胞。依照任何上述實施方案的“個體”優選是人。在一些實施方案中,該個體和/或癌癥具有一種或多種生物標志物。在一些實施方案中,該一種或多種生物標志物包含RSPO易位。在一些實施方案中,該RSPO易位包含RSPO2和/或RSPO3易位。在一些實施方案中,該個體和/或癌癥具有升高的一種或多種生物標志物表達。在一些實施方案中,該一種或多種生物標志物包含RSPO,例如RSPO2和/或RSPO3。在一些實施方案中,該一種或多種生物標志物包含干細胞生物標志物。在一些實施方案中,該干細胞生物標志物包含Myc,Axin2,LGR5,TERT,BIRC5,和/或Ascl2。在一些實施方案中,該個體和/或癌癥具有降低的一種或多種分化生物標志物表達。在一些實施方案中,該分化生物標志物包含CEACAM7,SLC26A3,CA1,SYTl5,CA4,TFF1,和/或KRT20。在一些實施方案中,抗RSPO抗體治療降低一種或多種干細胞生物標志物(例如Myc,Axin2,LGR5,TERT,BIRC5,和/或Ascl2)的表達。在一些實施方案中,抗RSPO抗體治療提高一種或多種分化生物標志物(例如CEACAM7,SLC26A3,CA1,SYTl5,CA4,TFF1,和/或KRT20)的表達。在一些實施方案中,該癌癥為腎上腺癌,膀胱癌,腦癌,乳腺癌,宮頸癌,結腸癌,頭和頸癌,腎癌,白血病,肝癌,肺癌癥(例如NSCLC),淋巴樣癌,卵巢癌,胰腺癌癥,前列腺癌,直腸癌,皮膚癌(例如黑素瘤),胃癌,甲狀腺癌,和/或子宮癌。在一些實施方案中,該癌癥為肺癌(例如NSCLC),卵巢癌,乳腺癌,肝癌,或多發性骨髓瘤。在一些實施方案中,該癌癥為結直腸癌。

在又一個方面,本發明提供抗RSPO抗體在制造或制備藥物中的用途。在一個實施方案中,該藥物用于治療腫瘤,細胞增殖性病癥,和/或癌癥。在又一個實施方案中,該藥物用于治療腫瘤,細胞增殖性病癥,和/或癌癥的方法,該方法包括對具有腫瘤,細胞增殖性病癥,和/或癌癥的個體施用有效量的該藥物。在一些實施方案中,該癌癥為結直腸癌。在一個此類實施方案中,該方法進一步包括對該個體施用有效量的至少一種別的治療劑,例如下文所述。在又一個實施方案中,該藥物用于抑制wnt信號傳導,抑制血管發生,抑制細胞增殖,抑制癌干細胞增殖,和/或消減癌干細胞。在又一個實施方案中,該藥物用于在個體中抑制wnt信號傳導,抑制血管發生,抑制細胞增殖,抑制癌干細胞增殖,和/或消減癌干細胞的方法,其包括對該個體施用有效量的該藥物以抑制wnt信號傳導,抑制血管發生,抑制細胞增殖,抑制癌干細胞增殖,和/或消減癌干細胞。依照任何上述實施方案的“個體”可以是人。在一些實施方案中,該個體和/或癌癥具有一種或多種生物標志物。在一些實施方案中,該一種或多種生物標志物包含RSPO易位。在一些實施方案中,該RSPO易位包含RSPO2和/或RSPO3易位。在一些實施方案中,該個體和/或癌癥具有升高的一種或多種生物標志物表達。在一些實施方案中,該一種或多種生物標志物包含RSPO,例如RSPO2和/或RSPO3。在一些實施方案中,該一種或多種生物標志物包含干細胞生物標志物。在一些實施方案中,該干細胞生物標志物包含Myc,Axin2,LGR5,TERT,BIRC5,和/或Ascl2。在一些實施方案中,該個體和/或癌癥具有降低的一種或多種分化生物標志物表達。在一些實施方案中,該分化生物標志物包含CEACAM7,SLC26A3,CA1,SYTl5,CA4,TFF1,和/或KRT20。在一些實施方案中,抗RSPO抗體治療降低一種或多種干細胞生物標志物(例如Myc,Axin2,LGR5,TERT,BIRC5,和/或Ascl2)的表達。在一些實施方案中,抗RSPO抗體治療提高一種或多種分化生物標志物(例如CEACAM7,SLC26A3,CA1,SYTl5,CA4,TFFl,和/或KRT20)的表達。在一些實施方案中,該癌癥為腎上腺癌,膀胱癌,腦癌,乳腺癌,宮頸癌,結腸癌,頭和頸癌,腎癌,白血病,肝癌,肺癌(例如NSCLC),淋巴樣癌,卵巢癌,胰腺癌,前列腺癌,直腸癌,皮膚癌(例如黑素瘤),胃癌癥,甲狀腺癌,和/或子宮癌。在一些實施方案中,該癌癥為肺癌(例如NSCLC),卵巢癌,乳腺癌,肝癌,或多發性骨髓瘤。

在又一個方面,本發明提供治療腫瘤,細胞增殖性病癥,和/或癌癥的方法。在一個實施方案中,該方法包括對具有此類腫瘤,細胞增殖性病癥,和/或癌癥的個體施用有效量的抗RSPO抗體。在一些實施方案中,該癌癥為結直腸癌。在一個此類實施方案中,該方法進一步包括對該個體施用有效量的至少一種別的治療劑,如下文所述。依照任何上述實施方案的“個體”可以是人。在一些實施方案中,該個體和/或癌癥具有一種或多種生物標志物。在一些實施方案中,該一種或多種生物標志物包含RSPO易位。在一些實施方案中,該RSPO易位包含RSPO2和/或RSPO3易位。在一些實施方案中,該個體和/或癌癥具有升高的一種或多種生物標志物表達。在一些實施方案中,該一種或多種生物標志物包含RSPO,例如RSPO2和/或RSPO3。在一些實施方案中,該一種或多種生物標志物包含干細胞生物標志物。在一些實施方案中,該干細胞生物標志物包含Myc,Axin2,LGR5,TERT,BIRC5,和/或Ascl2。在一些實施方案中,該個體和/或癌癥具有降低的一種或多種分化生物標志物表達。在一些實施方案中,該分化生物標志物包含CEACAM7,SLC26A3,CA1,SYTl5,CA4,TFF1,和/或KRT20。在一些實施方案中,抗RSPO抗體治療降低一種或多種干細胞生物標志物(例如Myc,Axin2,LGR5,TERT,BIRC5,和/或Ascl2)的表達。在一些實施方案中,抗RSPO抗體治療提高一種或多種分化生物標志物(例如CEACAM7,SLC26A3,CA1,SYTl5,CA4,TFF1,和/或KRT20)的表達。在一些實施方案中,該癌癥為腎上腺癌,膀胱癌,腦癌,乳腺癌,宮頸癌,結腸癌,頭和頸癌,腎癌,白血病,肝癌,肺癌(例如NSCLC),淋巴樣癌,卵巢癌,胰腺癌,前列腺癌,直腸癌,皮膚癌(例如黑素瘤),胃癌癥,甲狀腺癌,和/或子宮癌。在一些實施方案中,該癌癥為肺癌(例如NSCLC),卵巢癌,乳腺癌,肝癌,或多發性骨髓瘤。

在又一個方面,本發明提供在個體中抑制wnt信號傳導,抑制血管發生,抑制細胞增殖,抑制癌干細胞增殖,和/或消減癌干細胞的方法。在一個實施方案中,該方法包括對該個體施用有效量的抗RSPO抗體以抑制wnt信號傳導,抑制血管發生,抑制細胞增殖,抑制癌干細胞增殖,和/或消減癌干細胞。在一個實施方案中,“個體”為人。在一些實施方案中,該個體和/或癌癥具有一種或多種生物標志物。在一些實施方案中,該一種或多種生物標志物包含RSPO易位。在一些實施方案中,該RSPO易位包含RSPO2和/或RSPO3易位。在一些實施方案中,該個體和/或癌癥具有升高的一種或多種生物標志物表達。在一些實施方案中,該一種或多種生物標志物包含RSPO,例如RSPO2和/或RSPO3。在一些實施方案中,該一種或多種生物標志物包含干細胞生物標志物。在一些實施方案中,該干細胞生物標志物包含Myc,Axin2,LGR5,TERT,BIRC5,和/或Ascl2。在一些實施方案中,該個體和/或癌癥具有降低的一種或多種分化生物標志物表達。在一些實施方案中,該分化生物標志物包含CEACAM7,SLC26A3,CA1,SYTl5,CA4,TFFl,和/或KRT20。在一些實施方案中,抗RSPO抗體治療降低一種或多種干細胞生物標志物(例如Myc,Axin2,LGR5,TERT,BIRC5,和/或Ascl2)的表達。在一些實施方案中,抗RSPO抗體治療提高一種或多種分化生物標志物(例如CEACAM7,SLC26A3,CA1,SYTl5,CA4,TFF1,和/或KRT20)的表達。在一些實施方案中,該癌癥為腎上腺癌,膀胱癌,腦癌,乳腺癌,宮頸癌,結腸癌,頭和頸癌,腎癌,白血病,肝癌,肺癌(例如NSCLC),淋巴樣癌,卵巢癌,胰腺癌,前列腺癌,直腸癌,皮膚癌(例如黑素瘤),胃癌,甲狀腺癌,和/或子宮癌癥。在一些實施方案中,該癌癥為肺癌(例如NSCLC),卵巢癌,乳腺癌,肝癌,或多發性骨髓瘤。在一些實施方案中,該癌癥為結直腸癌。

在又一個方面,本發明提供藥物配制劑,其包含本文中提供的任何抗RSPO抗體,例如在任何上述治療性方法中使用。在一個實施方案中,藥物配制劑包含本文中提供的任何抗RSPO抗體和藥學可接受載劑。在另一個實施方案中,藥物配制劑包含本文中提供的任何抗RSPO抗體和至少一種別的治療劑,例如下文所述。在一些實施方案中,該RSPO為RSPO2。在一些實施方案中,該RSPO為RSPO3。在一些實施方案中,該RSPO為RSPO2和RSPO3。在一些實施方案中,該個體和/或癌癥具有升高的一種或多種生物標志物表達。在一些實施方案中,該一種或多種生物標志物包含RSPO,例如RSPO2和/或RSPO3。在一些實施方案中,該一種或多種生物標志物包含干細胞生物標志物。在一些實施方案中,該干細胞生物標志物包含Myc,Axin2,LGR5,TERT,BIRC5,和/或Ascl2。在一些實施方案中,該個體和/或癌癥具有降低的一種或多種分化生物標志物表達。在一些實施方案中,該分化生物標志物包含CEACAM7,SLC26A3,CA1,SYTl5,CA4,TFF1,和/或KRT20。在一些實施方案中,抗RSPO抗體治療降低一種或多種干細胞生物標志物(例如Myc,Axin2,LGR5,TERT,BIRC5,和/或Ascl2)的表達。在一些實施方案中,抗RSPO抗體治療提高一種或多種分化生物標志物(例如CEACAM7,SLC26A3,CA1,SYTl5,CA4,TFF1,和/或KRT20)的表達。在一些實施方案中,該癌癥為腎上腺癌,膀胱癌,腦癌,乳腺癌,宮頸癌,結腸癌,頭和頸癌,腎癌,白血病,肝癌,肺癌(例如NSCLC),淋巴樣癌,卵巢癌,胰腺癌,前列腺癌,直腸癌,皮膚癌(例如黑素瘤),胃癌癥,甲狀腺癌,和/或子宮癌。在一些實施方案中,該癌癥為肺癌(例如NSCLC),卵巢癌,乳腺癌,肝癌,或多發性骨髓瘤。在一些實施方案中,該癌癥為結直腸癌。

可以單獨或與療法中的其它藥劑組合使用本發明的抗體。例如,可以與至少一種別的治療劑共施用本發明的抗體。在某些實施方案中,別的治療劑為細胞毒劑,化療劑,細胞抑制劑,抗激素劑,和/或EGFR抑制劑。

上文記錄的此類組合療法涵蓋組合施用(其中兩種或更多種治療劑包含在同一配制劑或分開的配制劑中),和分開施用,在該情況中,可以在施用一種或多種別的治療劑之前,同時,和/或之后發生本發明的抗體的施用。在一個實施方案中,抗RSPO抗體的施用和別的治療劑的施用彼此在約一個月內,或約一,兩或三周內,或約1,2,3,4,5,或6天內發生。也可以與放射療法組合使用本發明的抗體。

可以通過任何合適的手段,包括胃腸外,肺內,和鼻內,及若期望用于局部治療的話,損傷內施用來施用本發明的抗體(和任何別的治療劑)。胃腸外輸注包括肌肉內,靜脈內,動脈內,腹膜內,或皮下施用。部分根據施用是短暫的還是長期的,劑量給藥可以通過任何合適的路徑,例如通過注射,諸如靜脈內或皮下注射進行。本文中涵蓋各種劑量給藥日程表,包括但不限于單次施用或在多個時間點里的多次施用,推注施用,和脈沖輸注。

本發明的抗體應當以一種符合良好的醫學實踐的方式配制,確定劑量及給藥。關于這一點考慮的因素包括在治療的特定病癥,在治療的特定哺乳動物,患者個體的臨床狀態,病因,藥物遞送部位,給藥方法,服藥日程以及其它為開業醫生所知的因素。抗體無需但可任選地與一種或多種目前用于預防或治療所述病癥的藥物一起配制。上述其它藥物的有效量取決于配方中所存在的抗體的量,所治療病癥的類型,以及其它上述討論的因素。這些藥物通常以相同的劑量使用并具有本文中所描述的給藥途徑,或以約1-99%的本文所描述的劑量使用,或以任何劑量并通過任何途徑使用,所述劑量和途徑是憑經驗確定的/經臨床測定合適的。

為了預防或治療疾病,本發明的抗體(當單獨或與一種或多種其它別的治療劑聯合使用時)的合適劑量應取決于所要治療的疾病的類型,抗體的種類,疾病的嚴重性和病程,所給予抗體的預防或治療目的,之前的治療,患者的臨床史和對抗體的應答,以及主治醫師的斟酌決定。抗體適合于在一次或一系列的治療中給予患者。取決于疾病的類型和嚴重性,約1μg/kg-15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗體可作為首次候選用量給予患者,無論是例如通過一次或多次單獨的給藥或通過連續輸注。取決予上述提及的因素,一個典型的日劑量可在約1μg/kg-100mg/kg或更多的范圍內。對于幾天或更長時間的重復給藥,取決于病情,治療應通常持續直至出現病癥得到期望的抑制為止。抗體的一種例示性劑量會在約0.05mg/kg至約10mg/kg的范圍中。如此,可以對患者施用約0.5mg/kg,2.0mg/kg,4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意組合)的一或多劑。上述劑量可間歇給予,如每周或每三周給予一次(如使得患者得到約2-約20個,或例如約6個劑量的抗體)。可給予初始較高的負荷劑量,接著給予一個或多個較低的劑量。然而,可使用其它給藥方案。通過常規技術和測定方法易于監測該治療的進展。

應當理解,可以替換抗RSPO抗體或在抗RSPO抗體外使用本發明的免疫綴合物實施任何上述配制劑或治療性方法。

H.制品

在本發明的另一方面,提供了一種制品,其含有可用于治療,預防和/或診斷上文所描述的病癥的材料。制品包含容器和容器上或與容器聯合的標簽或包裝插頁。合適的容器包括例如瓶,管形瓶,注射器,IV溶液袋,等等。容器可以由多種材料諸如玻璃或塑料形成。容器容納單獨或與另一種組合物組合有效治療,預防和/或診斷狀況的組合物,并且可以具有無菌存取口(例如,容器可以是具有由皮下注射針可穿過的塞子的管形瓶或靜脈內溶液袋)。組合物中的至少一種活性劑是本發明的抗體。標簽或包裝插頁指示使用組合物來治療選擇的狀況。此外,制品可以包含(a)具有其中含有的組合物的第一容器,其中組合物包含本發明的抗體;和(b)具有其中含有的組合物的第二容器,其中組合物包含其它的細胞毒性或其它方面治療性的藥劑。在本發明的此實施方案中的制品可以進一步包含包裝插頁,其指示可以使用組合物來治療特定的狀況。或者/另外,制品可以進一步包含第二(或第三)容器,其包含藥學可接受緩沖液,諸如抑菌性注射用水(BWFI),磷酸鹽緩沖鹽水,Ringer氏溶液和右旋糖溶液。它可以進一步包含從商業和用戶觀點看期望的其它材料,包括其它緩沖液,稀釋劑,濾器,針,和注射器。

應當理解,任何上述制品可包括本發明的免疫綴合物來代替或補充抗RSPO抗體。

III.實施例

下面是本發明的方法和組合物的實施例。要理解,根據上文提供的一般描述,可以實施各種其它實施方案。

方法

克隆和純化:通過抗FLAG親和層析(Genentech),接著是大小排阻層析(Superdex75,GEHealthcare)來純化帶FLAG標簽的RNF43。通過抗FLAG親和層析,接著是陽離子交換層析(MonoS,GEHealthcare)來純化帶FLAG標簽的R-spondin(hRSPO2,hRSPO2L186,cynoRSPO2,hRSPO3,和cynoRSPO3FLAG)。通過親和層析(MabSelectSuRe,GEHealthcare),接著是大小排阻層析(Superdex200,GEHealthcare)來純化帶人IgG1Fc標簽的LGR胞外域。

WNT報告物測定法:在96孔板中,在90ul補充有2.5%胎牛血清的DMEM中分配每孔4,500個293T細胞。培養16-20小時后,使用Fugene6(Promega,Madison,WI)在10ul轉染混合物中用0.04ugTopbrite25和0.02ugSV40海腎(Renilla)DNA共轉染細胞。另培養16-20小時后,于37℃將細胞用25ul5X溶液刺激6小時。對于上清液篩選,用補充有50ng/mlrmWNT3a(R&DSystems,Minneapolis,MN)和250pMrhRSPO2或rhRSPO3(R&DSystems,Minneapolis,MN)的雜交瘤上清液刺激細胞。對于使用所克隆的抗體的測定法,添加補充有10%胎牛血清,50ng/mlrmWNT3a,250pM或5X計算EC50rRSPO(如所示的)和漸增濃度的抗體的DMEM。對于測試條件化培養基的測定法,通過使用Fugene6依照制造商的說明書(Promega,Madison,WI)用所示基因轉染293T來準備培養基。轉染后3天收集條件化培養基,補充50ng/mlrnWNT3a+/-抗RSPO抗體,并添加至報告細胞。刺激6小時后,使用PromegaDual-Glo系統(Promega,Madison,WI)檢測螢光素酶活性。或是作為螢火蟲/海腎(RLUWNT報告物)的比或是作為在抗體缺失下的標準化值(有抗體的RLU/無抗體的RLU)來分析數據。通過用EC50的rRSPO及漸增濃度的抗體刺激細胞來測定IC50測量。使用GraphPadPrism將經過對數換算的數據擬合四參數劑量-向應方程。

表達RSPO的細胞團粒的生成:pGCIG是一種基于HIV的自我滅活型慢病毒載體,它是通過用含有CMVie啟動子,多克隆位點(MCS),內部核糖體進入位點(IRES)和增強型綠色熒光蛋白(eGFP)的片段替換pGIPZ(OpenBiosystems)的ZeoR-CMVie-tGFP-IRES-PuroR-shRNA-WRE內容而創建的。通過PCR在C端用HA表位(YPYDVPDYA)給人R-spondin1-4可讀框(ORF)帶上標簽,并插入pGCIG的MCS中。轉染前24小時,在含10%熱滅活的FBS的DMEM高葡萄糖中以15x106個細胞/板在15-cm盤上分配HEK-293細胞。如下制備慢病毒上清液,即使用6ugpGCIG-hRSPO,12ug包裝載體Δ8.9(Zuffereyetal.,1997),3ug包膜載體pVSV-G(Clontech)和轉染試劑Genejuice(Novagen)進行共轉染。轉染后12小時更換培養基,并在24小時后收集病毒上清液,穿過0.45μmPES濾器(Nalgene)過濾,并于4℃保存直至進一步加工。在含10%熱滅活的FBS的DMEM高葡萄糖中以1x106個細胞/板在10-cm盤上分配HEK-293細胞。容許細胞貼壁12小時,之后用10ml病毒上清液更換培養基。將病毒上清液在細胞上保留60小時,之后收獲細胞,并通過FACS來分析熒光蛋白表達。設定門來對每種病毒構建體分選出2x105個eGFP表達低,中等和高的細胞。擴充細胞系,并使用HIV-1p24抗原ELISA2.0試劑盒(ZeptoMetrixCorporation)測試復制勝任病毒(RCV)生成的缺失。通過濃縮細胞培養物上清液的抗HAWestern印跡來確認人R-spondin的表達和分泌,與eGFP表達水平關聯較好。

IHC反應性篩選:以4um將福爾馬林固定石蠟包埋細胞團粒切片。于99℃將載片用基于檸檬酸鹽的pH6.0緩沖液(Dako產品目錄號S1699,Carpinteria,CA)預處理20分鐘。10%血清封閉后,以1:250使用抗RSPO血清,并運行雜交瘤上清液。使用1:250的免疫前血清或總濃度10ug/ml的未免疫小鼠IgG1,2a,和2b作為陰性對照。以5ug/ml使用生物素化驢抗小鼠二抗(JacksonImmuno產品目錄號715-065-151,WestGrove,PA)。使用VECTASTAINEliteABC試劑盒(標準型*)(VectorLabs產品目錄號PK-6100)作為檢測,并用Pierce金屬增強型DAB(Thermo產品目錄號34065,Rockford,IL)顯現信號。

表位分倉:使用OctetRED384儀器(ForteBio)實施抗RSPO抗體的表位分倉。生物素化重組RSPO(R&DSystems,Minneapolis,MN),并以10μg/ml捕捉到鏈霉親合素生物傳感器上達120秒。通過添加10μg/ml達600秒來實現第一抗體的飽和結合。將相同的生物傳感器浸入5μg/ml競爭性抗體中,并測量結合達300秒。在飽和性數量的第一抗體存在下第二抗體結合失敗指示這兩種抗體處于相同的表位倉中。

親和力測量:使用BIAcoreTM-2000儀器通過表面等離振子共振(SPR)測量抗RSPO抗體的結合親和力。依照供應商(GEHealthcareBiosciences,Piscataway,NJ)的說明書用鹽酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)試劑活化CM5生物傳感器芯片。將RSPO抗原固定化到生物傳感器芯片上以實現大約250個響應單元(RU),接著用1M乙醇胺封閉。

對于動力學測量,于25℃以30μl/min的流速注射抗RSPOFab在HBS-P緩沖液(0.01MHEPESpH7.4,0.15MNaCl,0.005%表面活性劑P20)中的兩倍連續稀釋液。使用簡單一對一朗格繆爾(Langmuir)結合模型(BIAcoreEvaluationSoftwareversion3.2)計算結合速率(kon)和解離速率(koff)。作為koff/kon比計算平衡解離常數(KD)。

競爭性結合ELISA:為了測量抗RSPO抗體在阻斷LGR4和LGR5ECD結合RSPO中的活性,將MaxiSorp384孔微孔板(ThermoScientificNunc,Roskilde,Denmark)用25ul/孔50mM碳酸鹽緩沖液pH9.6中的0.5μg/mlhRSPO2或hRSPO3(Genentech)于4℃包被過夜。將板用80ul/孔磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)pH7.4中的0.5%牛血清清蛋白,15ppmProclin300封閉1小時。以25ul/孔將測定緩沖液(含0.5%BSA,0.05%聚山梨酯20,15ppmProclin300的PBS)中含有0.1μg/mlLGR4-Fc或0.015μg/mlLGR5-Fc的連續稀釋的抗RSPO抗體(0.078-10ng/ml,3倍連續稀釋液加緩沖液空白)添加至板。溫育2小時后,使用過氧化物酶標記的山羊F(ab’)2抗人Fc(JacksonImmunoResearch,WestGrove,PA)檢測結合至板的LGR4-Fc和LGR5-Fc。溫育1小時后,將底物3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺(MOssInc.,Pasadena,Maryland)添加至板,并通過添加1M磷酸來停止反應。在各步驟之間用含有0.05%Tween20的PBS,pH7.4清洗板,而且包被步驟之后的所有溫育步驟是于室溫在定軌搖床上實施的。在MultiskanAscent讀數儀(ThermoScientific,Hudson,NH)上于450nm讀取吸光度。

使用0.5ng/ml生物素化RNF43-Flag(在RSPO2包被板上)或20ng/ml生物素化RNF43-Flag(在RSPO3包被板上)類似地測量抗RSPO抗體在阻斷RNF43結合RSPO中的活性。如上所述使用過氧化物酶標記的鏈霉親合素(GEHealthcare,Piscataway,NJ),接著是底物來檢測結合的生物素化RNF43-Flag。

抗RSPO3抗體的人源化:如下所述人源化單克隆抗體5D6。殘基編號依照Kabatetal.,Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thEd.,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991)。

以Fab形式評估5D6人源化期間構建的變體。比對來自鼠5D6的VL和VH域與人VL卡帕I(VLKI)和人VH亞組IV(VH4)共有序列。將來自鼠抗體的高變區工程化改造成VLKI和VHI受體框架。具體地,將來自mu5D6VL域的位置24-34(L1),50-56(L2)和89-97(L3)嫁接入VLKI中,并將來自mu5D6VH域的位置26-35(H1),50-65(H2)和95-102(H3)嫁接入VHI中。還分別將來自mu5D6的所有VL和VH游標位置嫁接至VLK1和VH4。此嫁接物稱作v1。

這個部分中的抗體的結合親和力是通過BIAcoreTMT200型式測定的。簡言之,依照供應商的說明書用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)試劑活化BIAcoreTM研究級CM5芯片。固定化huRSPO3以實現每個流動室中大約50個響應單位(RU)。用1M乙醇胺封閉未反應的偶聯基團。對于動力學測量,于25℃以30μl/min的流速注射變體抗體在HBS-P緩沖液(0.01MHEPESpH7.4,0.15MNaCl,0.005%surfactantP20)中的四倍連續稀釋液。使用1:1朗格繆爾結合模型(BIAcoreTMT200EvaluationSoftwareversion2.0)計算結合速率(kon)和解離速率(koff)。作為koff/kon比計算平衡解離常數(Kd)。

結晶學RSPO3(M33-E210)純化:在用Kifunensine處理的培養基中生長的SF9細胞中共表達含有N端His-MBP標簽的RSPO3(M33-E210)與不帶標簽的EndoH。收獲細胞上清液,并通過在清洗緩沖液(25mMTris-HClpH7.5,500mMNaCl,20mM咪唑,5%甘油)中預平衡的10mL鎳-NTA瓊脂糖柱。然后用10個柱體積的清洗緩沖液清洗柱。使用5個柱體積的洗脫緩沖液(25mMTris-HClpH7.5,500mMNaCl,300mM咪唑,10%甘油)自柱洗脫蛋白質,并濃縮至少于30mL。添加TEV蛋白酶,并于4℃將樣品針對透析緩沖液(25mMTris-HClpH7.5,500mMNaCl,10mM咪唑,10%甘油)透析過夜。透析后,使樣品通過用清洗緩沖液預平衡的5mLHisTrap柱。然后將樣品濃縮至少于2mL,并應用于用凝膠過濾緩沖液(25mMTris-HClpH7.5,300mMNaCl,5%甘油)預平衡的Superdex7516/60柱。合并含有RSPO3(M33-E210)的級分,并濃縮。于-80℃保存等分試樣。

結晶學Fab純化:在大腸桿菌細胞中表達Fab5D6和26E11。在裂解緩沖液(補充有25mMEDTA和1mMPMSF的PBS)中重懸浮細胞漿,并通過三次穿過微射流儀來裂解細胞。然后將裂解物以12,000rpm旋轉1小時,并將經過澄清的裂解物過濾穿過0.8μm濾器。將經過澄清的裂解物直接應用于用補充有25mMEDTA的PBS預平衡的25mL蛋白G柱。用10個柱體積的PBS清洗柱,并用0.58%乙酸洗脫蛋白質。然后將洗脫液加載到用緩沖液A(20mMMESpH5.5)預平衡的HiTrapSPHP柱上。用10個柱體積的緩沖液A清洗柱,并在緩沖液A至緩沖液B(20mMMESpH5.5,500mMNaCl)的20個柱體積的線性梯度上洗脫蛋白質。合并含有Fab的級分,濃縮至少于2mL,并應用于用凝膠過濾緩沖液預平衡的Superdex7526/60柱。合并含有Fab的級分,并濃縮。于-80℃保存等分試樣。

結晶學RSPO3/Fab復合物純化:為了形成復合物,在800μL含有結合反應的凝膠過濾緩沖液中將1.25倍摩爾過量的RSPO3(M33-E210)添加至150nmolFab。將結合反應在冰上溫育1小時。然后于4℃以13,000rpm旋轉反應,并加載到用凝膠過濾緩沖液預平衡的Superdex7516/60柱上。合并含有復合物的級分,并濃縮至20mg/mL。于-80℃保存等分試樣。

結晶學:對于RSPO3(M33-E210)/Fab5D6,使用LabcyteEcho液體操作器使用100nL坐滴設置數個稀疏矩陣晶體篩。將篩保存于18℃。在含有100mMMIBpH9和25%PEG1500作為母液的一滴中獲得晶體。通過混合1μL70%甘油與1.8μL儲備溶液來生成防凍劑溶液。收獲一粒晶體,在防凍劑溶液中浸泡10秒,并在液氮中閃凍。

對于RSPO3(M33-E210)/Fab26E11,使用LabcyteEcho液體操作器使用100nL坐滴設置數個稀疏矩陣晶體篩。將篩保存于18℃。在含有200mM甲酸鈉和20%(w/v)PEG3,350作為母液的一滴中獲得晶體。通過混合1μL70%乙二醇與1.8μL儲備溶液來生成防凍劑溶液。收獲一粒晶體,在防凍劑溶液中浸泡10秒,并在液氮中閃凍。

這兩種復合物均在較寬范圍的相似條件中結晶。幾乎所有晶體在基于PEG的條件中生長,其中最常見的是20-25%PEG3,350。其它成功的沉淀劑包括20%PEG6,000,20-25%PEG4,000,和25%PEG1,500。pH范圍為3.5-9,其中在介于7和8之間看到大多數晶體生長。200mM濃度的多種鹽有助于晶體生長。

晶體結構測定和細化:在同步加速器上收集兩種RSPO3/Fab復合物的衍射數據。使用XDS和SCALA對數據進行編索引,整合和定標。使用Fab結構作為搜索模型通過分子置換來解析RSPO3/5D6和RSPO3/26E11的晶體結構。使用PHENIX通過溶劑變平和密度修改來改進初始分子置換解析的相。使用迭代輪次的細化和重建來構建RSPO3結構。下文是RSPO3/5D6和RSPO/26E11的結晶學統計量。

表1:數據收集和細化統計量

括號中顯示的是分辨率最高的殼的統計量。

體內功效實驗:使RSPO3融合陽性患者衍生的腫瘤在Balbc/裸鼠中皮下生長。一旦腫瘤達到大約200mm3的大小,以30mg/kg用對照抗體或抗RSPO3抗體(5D6)處理小鼠,一周兩次,持續3-4周。對于抗RSPO3抗體(5D6)與伊立替康組合使用的實驗,抗RSPO3抗體的劑量給藥如上所述進行,而伊立替康的劑量給藥在第0天或在第0天和第3天以100mg/kg進行。

對于連續移植研究,如上所述用對照抗體或抗RSPO3抗體處理植入有RSPO3融合陽性患者衍生的腫瘤的小鼠。一旦生長曲線開始分開,取出腫瘤碎片,并移植入未免疫Balbc/裸鼠中。然后如上所述用對照或抗RSPO3抗體處理移植有腫瘤碎片的小鼠。

結果

功能阻斷性和IHC反應性抗RSPO抗體的生成

為了生成抗RSPO抗體,給小鼠和倉鼠免疫接種重組人RSPO2和/或人RSPO3,并生成了雜交瘤細胞系。首先通過ELISA對來自這些細胞的上清液篩選對hRSPO1,hRSPO2,hRSPO3和hRSPO4的結合。然后對顯示hRSPO2和/或hRSPO3結合的上清液測試阻斷WNT報告物活性的hRSPO2和hRSPO3刺激的能力。隨后克隆,表達并純化候選者。如圖1所示,一個子集的經過純化的克隆有力地抑制rhRSPO2刺激的WNT報告物活性(圖1A)和/或rhRSPO3刺激的WNT報告物活性(圖1B)。

另外,篩選上清液以鑒定能用作IHC試劑的抗RSPO抗體。自穩定表達高,中等,或低水平hRSPO2或hRSPO3的293細胞制備福爾馬林固定石蠟包埋的細胞團粒。另外,自293細胞和穩定表達hRSPO1或hRSPO4的293細胞制備細胞團粒。在制備的細胞團粒上對雜交瘤上清液和抗體克隆測試IHC反應性。如圖2所示,根據IHC反應性,抗體49G5識別高,中等,和低水平的hRSPO2表達(D-F),但不識別hRSPO3(A-C),hRSPO1(G),hRSPO4(H),或非hRSPO1-4(I)。下文表4顯示了測試的所有抗體的結果的匯總。抗體4H1,4D4,5C2,5D6,5E11,21C2特異性識別hRSPO3。抗體1A1,36D2,49G5特異性識別hRSPO2。抗體6E9和26E11識別hRSPO2和hRSPO3。

表4:一組抗RSPO抗體的IHC反應性

-,+,++,+++指示相對強度,其中-為無顯著染色且+++為最高水平的染色;

百分比指示細胞染色的相對百分比

抗RSPO抗體的表位分倉

為了進一步表征抗RSPO抗體,使用OCTETRED測定法測定了抗體所落入的獨特表位倉的數目。首先將抗體的親和力排序。將具有最高親和力的抗體結合至結合有hRSPO2或hRSPO3的生物傳感器至飽和。然后評估第二抗體的結合。所測試的抗RSPO2抗體落入通過與1A1或11F11任一競爭的能力而定義的兩個獨特表位倉。第一獨特表位倉包括1A1,49G5,和36D2,而第二獨特表位倉包括11F11。所測試的抗RSPO3抗體落入通過與26E11,4H1,或21C2競爭的能力而定義的三個獨特表位倉。第一獨特表位倉包括26E11,5D6,5E11,和6E9,第二獨特表位倉包括4H1,而第三獨特表位倉包括5C2和21C2。

抗RSPO抗體的結合特異性和親和力

為了進一步表征抗RSPO抗體,針對小鼠RSPO2(R&DSystems)和食蟹猴RSPO2(Genentech)測試了它們的功能阻斷活性。一個子集的抗體克隆能阻斷WNT報告細胞的hRSPO2,cynoRSPO2,和mRSPO2刺激(圖3A-C)。在人群體中鑒定出RSPO2中的位置186處的多態性。為了評估抗RSPO抗體對此多態性的功能阻斷活性及在此患者群體中的潛在有用性,首先純化hRSPO2L186P蛋白質,然后用于刺激WNT報告細胞。一個子集的抗RSPO抗體能阻斷hRSPO2L186P的功能(圖3D)。

另外,對抗RSPO抗體測試了它們阻斷小鼠RSPO3(R&DSystems)和食蟹猴RSPO3(Genentech)功能的能力。一個子集的抗體能抑制WNT報告細胞的hRSPO3,cynoRSPO3,mRSPO3刺激(圖4A-C)。對抗RSPO抗體另外測試了它們抑制最近在結直腸腫瘤中鑒定的RSPO3融合基因(Seshagirietal.,Nature488:660-664(2012))的能力。通過轉染編碼所鑒定的兩種PTPRK-RSPO3融合基因(SEQIDNO:176和178)的構建物,制備條件化培養基。含有RSPO3或RSPO3融合基因的條件化培養基能刺激WNT報告物活性。一種抗RSPO3抗體能抑制報告細胞的RSPO3融合基因刺激(圖4D)。此結果指示該抗RSPO3抗體能抑制RPSO易位介導的wnt信號傳導。

使用表面等離振子共振來確認對人,小鼠,和食蟹猴RSPO的結合特異性和親和力。自抗體克隆消化Fab片段,純化,然后使用BIAcoreTM-2000儀器測定對重組蛋白的結合。抗體落入三個組:對RSPO2特異性的那些,對RSPO3特異性的那些,和具有一些程度的交叉反應性的那些(圖5)。結合親和力在亞納摩爾至低納摩爾的范圍中(范圍為0.073-80nM)。

抗RSPO抗體的結合特征

先前已經顯示了RSPO蛋白能結合兩種不同類別的跨膜蛋白:E3-連接酶(RNF43和ZNRF3)和LGR(LGR4和LGR5)(Haoetal.,Nature485(7397):195-200(2012))。為了測試抗RSPO抗體是否能抑制與這兩類蛋白的結合,開發了一種競爭性結合ELISA測定法。在測試抑制LGR4或LGR5結合hRSPO2和hRSPO3的能力時,抗RSPO抗體落入三個范疇:能抑制的那些,不抑制的那些,和促進LGR4和LGR5的相互作用的一個(圖6A-B和未顯示的數據)。同樣地,抗RSPO抗體組的一個子集抑制RNF43結合hRSPO2或hRSPO3(圖7A-B)。下文(表5)顯示了抗RSPO結果的匯總。

抗RSPO抗體的人源化

與嵌合5D6比較人源化5D6v1(稱作hu5D6v1)抗體的結合親和力。將hu5D6v1的鼠游標位置轉變回人殘基以評估鼠游標位置對結合hRSPO3的貢獻。四種另外的輕鏈(L1:v1+Y36(稱作v2.1),v1+L46(稱作v2.2),v1+T69(稱作v2.3),v1+F71(稱作v2.4))和四種另外的重鏈(v1+V71(稱作v2.8),v1+R94(稱作v2.10),v1+W47+I48+F78(稱作v3.2),v1+W47+I48+v67+F78(稱作v3.3))。基于上文所述變體抗體的結合親和力評估,輕鏈上的F36和T46是關鍵的小鼠游標殘基,而重鏈上的V71和R94據測定是關鍵的小鼠游標殘基(未顯示的數據)。嵌合5D6以3.3E-11M的KD結合,而v1+T69(LC)+W47+I48+V67+F78(HC)(稱作hu5D6v4.1),v1+T69(LC)+W47+I48+F78(HC)(稱作hu5D6v4.3)分別以6.3E-11M和7.0E-11M的KD結合。

如上所述,只是用食蟹猴或鼠RSPO3替換結合測定法中的huRSPO3,對hu5D6v4.1和嵌合5D6測試了它們結合食蟹猴和小鼠RSPO3的能力。下文表5顯示了人源化抗體的結合特性。

在熱應力(40℃,pH5.5,2周)和鹽酸2,2′-偶氮二(2-脒基丙烷)(AAPH)分析下測試了人源化抗體hu5D6v4.1。然后對樣品施加熱應力以模擬產品在保存期里的穩定性。將樣品緩沖液交換入20mM組氨酸乙酸酯,240mM蔗糖,pH5.5中,并稀釋至1mg/mL的濃度。對1mL樣品施加應力,即40C,2周,并將第二份于-70C保存作為對照。然后使用胰蛋白酶消化這兩份樣品以創建能使用液體層析(LC)-質譜(MS)分析來分析的肽。對于樣品中的每一種肽,獲取了保留時間(來自LC)以及高分辨率精確質量和肽離子片段化信息(氨基酸序列信息)(在MS中)。對感興趣的肽(天然的和經修飾的肽離子)以+-10ppm的窗自數據集取得提取離子層析圖(XIC),并對峰積分以確定面積。為每一份樣品計算修飾的相對百分比,即(經修飾肽的面積)/(經修飾肽的面積+天然肽的面積)x100。

如通過熱應力測試測定的,hu5D6v4.1在CDR-H3中具有W100b,它對氧化易感(色氨酸氧化升高11.5%。AAPH應力后自對照中的24.1%升高至35.6%)。構建了F100b(稱作hu5D6v5.1)和W100bH(稱作hu5D6v5.2)變體以降低潛在氧化。

通過結晶學進行的表位作圖

為了進一步表征抗RSPO抗體,如上所述制備RSPO3/Fab(5D6和26E11)復合物的晶體,并測定晶體結構。見圖8。表6含有5D6重鏈(HC)和輕鏈(LC)與RSPO3(F鏈)之間的接觸的列表。表6的截留為4埃。表7含有26E11重鏈(HC)和輕鏈(LC)與RSPO3(F鏈)之間的接觸的列表。表7的截留為4埃。5D6和26E11二者的大多數接觸是與RSPO3的弗林蛋白酶1域的。

表6:RSPO3和5D6重和輕鏈的接觸殘基

表7:RSPO3和26E11重和輕鏈的接觸殘基

體內功效

在結直腸癌PTPRK-RSPO融合患者衍生的腫瘤模型中測試了抗RSPO3抗體的功效。在PTPRK-RSPO融合患者衍生的腫瘤模型和/或NSCLC組織中,與用抗RSPO3抗體處理之前的表達水平相比,抗RSPO3抗體(5D6)顯著降低腸干細胞標志物的基因表達:Myc,Axin2,LGR5,TERT,BIRC5,和/或Ascl2,而分化標志物的基因表達是升高的,例如CEACAM7,SLC26A3,CA1,SYTl5,CA4,TFF1,和KRT20(未顯示的數據)。不希望受任何特定理論束縛,如通過基因表達標志物測定的,這些結果提示抗RSPO3抗體(5D6)能夠促進干細胞樣標志物概況轉變成分化標志物概況。

還在結直腸癌PTPRK-RSPO融合患者衍生的腫瘤模型中測試了用抗RSPO3抗體(5D6)處理后隨時間對腫瘤體積的影響(例如腫瘤生長抑制),如圖11A-D所示。用抗RSPO3抗體(5D6)處理該模型顯示腫瘤生長的顯著降低或腫瘤生長的停滯。在該模型中,消退和/或停滯并非在用抗RSPO3抗體(5D6)處理后立即發生;治療啟動后消退或停滯的發生存在延遲。而且,在用H&E染劑和AlcianBlue染劑對用抗豚草抗體或抗RSPO3抗體(5D6)處理的結直腸癌患者衍生的模型腫瘤染色時,組織病理學存在驚人的差異,如圖12A-D所示。在用抗RSPO3(5D6)處理的腫瘤中,腫瘤細胞的數目有顯著的減少。大多數剩余細胞的組織學與已分化的,成熟的非增殖的杯形細胞一致。另外,與抗豚草抗體對照相比,粘液有顯著的增多,如AlcianBlue染色所示。相應地,測量得到的腫瘤體積可能實際上有顯著部分是由粘液而非腫瘤細胞占據的,因此,對腫瘤生長抑制的影響可能實際上是低估的。不希望受任何特定理論束縛,這些功效數據與RSPO3融合陽性腫瘤的等級組織一致:癌干細胞的增殖依賴于RSPO蛋白質,而且在用抗RSPO3抗體(5D6)處理后,癌干細胞死亡或分化成過渡擴增(TA)細胞。在確保它們補給的干細胞源缺失下,后者經歷有限次數的細胞分裂,此后它們終末分化,導致它們的耗盡。因此,TA細胞群體的動力學和總體大小可能決定腫瘤生長抑制的發生。

再次,不希望受任何特定理論束縛,基于所描述的RSPO3融合陽性腫瘤的等級組織的理論,與在PTPRK-RSPO融合患者衍生的腫瘤模型中單獨用該化療劑治療相比,通過殺死TA細胞群體和提高功效,與化療劑的組合治療應當縮短消退和/或停滯發生的延遲。與此理論一致且如圖11D和13A所示,與在CRCD和CRCC結直腸癌PTPRK-RSPO融合患者衍生的腫瘤模型中單獨用伊立替康處理相比,抗RSPO3抗體(5D6)與伊立替康組合顯著縮短消退和/或停滯和降低的腫瘤生長發生的延遲。通過施用抗RSPO3抗體與化療的組合,癌干細胞和TA細胞二者被靶向更早的消退或腫瘤生長停滯。

而且,不希望受任何特定理論束縛,基于上文所述RSPO3融合陽性腫瘤的等級組織的理論以及干細胞隔室負責腫瘤起始的想法,如通過腫瘤移植測定法測量的,用抗RSPO3抗體處理的移植的PTPRK-RSPO融合患者衍生的腫瘤模型應當具有減少的癌干細胞群體,這應當降低連續PTPRK-RSPO融合患者衍生的腫瘤的建立和腫瘤生長。還有,與此理論一致且如圖13B-C所示,在連續移植物實驗中,抗RSPO3抗體(5D6)處理導致在連續移植后來自經抗RSPO3處理的碎片的腫瘤建立及生長更少。

雖然出于清楚理解的目的,前述發明已經作為例示和例子相當詳細地進行了描述,但是說明書和實施例不應解釋為限制本發明的范圍。通過提及而明確將本文中引用的所有專利和科學文獻的公開內容完整收錄。

SEQIDNO:1>sp|Q6UXX9|RSPO2_人R-spondin-2OS=HomosapiensGN=RSPO2MQFRLFSFALIILNCMDYSHCQGNRWRRSKRASYVSNPICKGCLSCSKDNGCSRCQQKLFFFLRREGMRQYGECLHSCPSGYYGHRAPDMNRCARCRIENCDSCFSKDFCTKCKVGFYLHRGRCFDECPDGFAPLEETMECVEGCEVGHWSEWGTCSRNNRTCGFKWGLETRTRQIVKKPVKDTILCPTIAESRRCKMTMRHCPGGKRTPKAKEKRNKKKKRKLIERAQEQHSVFLATDRANQ

SEQIDNO:2>sp|Q9BXY4|RSPO3_人R-spondin-3OS=HomosapiensGN=RSPO3MHLRLISWLFIILNFMEYIGSQNASRGRRQRRMHPNVSQGCQGGCATCSDYNGCLSCKPRLFFALERIGMKQIGVCLSSCPSGYYGTRYPDINKCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYLHLGKCLDNCPEGLEANNHTMECVSIVHCEVSEWNPWSPCTKKGKTCGFKRGTETRVREIIQHPSAKGNLCPPTNETRKCTVQRKKCQKGERGKKGRERKRKKPNKGESKEAIPDSKSLESSKEIPEQRENKQQQKKRKVQDKQKSVSVSTVH

SEQIDNO:3>sp|Q2MKA7|RSPO1_人R-spondin-1OS=HomosapiensGN=RSPO1MRLGLCVVALVLSWTHLTISSRGIKGKRQRRISAEGSQACAKGCELCSEVNGCLKCSPKLFILLERNDIRQVGVCLPSCPPGYFDARNPDMNKCIKCKIEHCEACFSHNFCTKCKEGLYLHKGRCYPACPEGSSAANGTMECSSPAQCEMSEWSPWGPCSKKQQLCGFRRGSEERTRRVLHAPVGDHAACSDTKETRRCTVRRVPCPEGQKRRKGGQGRRENANRNLARKESKEAGAGSRRRKGQQQQQQQGTVGPLTSAGPA

SEQIDNO:4>sp|Q2I0M5|RSPO4_人R-spondin-4OS=HomosapiensGN=RSPO4MRAPLCLLLLVAHAVDMLALNRRKKQVGTGLGGNCTGCIICSEENGCSTCQQRLFLFIRREGIRQYGKCLHDCPPGYFGIRGQEVNRCKKCGATCESCFSQDFCIRCKRQFYLYKGKCLPTCPPGTLAHQNTRECQGECELGPWGGWSPCTHNGKTCGSAWGLESRVREAGRAGHEEAATCQVLSESRKCPIQRPCPGERSPGQKKGRKDRRPRKDRKLDRRLDVRPRQPGLQP

EIF3E(e1)-RSPO2(e2)易位融合多核苷酸(SEQIDNO:173)

GAGCACAGACTCCCTTTTCTTTGGCAAGATGGCGGAGTACGACTTGACTACTCGCATCGCGCACTTTTTGGATCGGCATCTAGTCTTTCCGCTTCTTGAATTTCTCTCTGTAAAGGAGGTTCGTGGCGGAGAGATGCTGATCGCGCTGAACTGACCGGTGCGGCCCGGGGGTGAGTGGCGAGTCTCCCTCTGAGTCCTCCCCAGCAGCGCGGCCGGCGCCGGCTCTTTGGGCGAACCCTCCAGTTCCTAGACTTTGAGAGGCGTCTCTCCCCCGCCCGACCGCCCAGATGCAGTTTCGCCTTTTCTCCTTTGCCCTCATCATTCTGAACTGCATGGATTACAGCCACTGCCAAGGCAACCGATGGAGACGCAGTAAGCGAGCTAGTTATGTATCAAATCCCATTTGCAAGGGTTGTTTGTCTTGTTCAAAGGACAATGGGTGTAGCCGATGTCAACAGAAGTTGTTCTTCTTCCTTCGAAGAGAAGGGATGCGCCAGTATGGAGAGTGCCTGCATTCCTGCCCATCCGGGTACTATGGACACCGAGCCCCAGATATGAACAGATGTGCAAGATGCAGAATAGAAAACTGTGATTCTTGCTTTAGCAAAGACTTTTGTACCAAGTGCAAAGTAGGCTTTTATTTGCATAGAGGCCGTTGCTTTGATGAATGTCCAGATGGTTTTGCACCATTAGAAGAAACCATGGAATGTGTGGAAGGATGTGAAGTTGGTCATTGGAGCGAATGGGGAACTTGTAGCAGAAATAATCGCACATGTGGATTTAAATGGGGTCTGGAAACCAGAACACGGCAAATTGTTAAAAAGCCAGTGAAAGACACAATACTGTGTCCAACCATTGCTGAATCCAGGAGATGCAAGATGACAATGAGGCATTGTCCAGGAGGGAAGAGAACACCAAAGGCGAAGGAGAAGAGGAACAAGAAAAAGAAAAGGAAGCTGATAGAAAGGGCCCAGGAGCAACACAGCGTCTTCCTAGCTACAGACAGAGCTAACCAATAA

EIF3E(e1)-RSPO2(e2)易位融合多肽序列(SEQIDNO:174)

MAEYDLTTRIAHFLDRHLVFPLLEFLSVKEVRGGEMLIALNMQFRLFSFALIILNCMDYSHCQGNRWRRSKRASYVSNPICKGCLSCSKDNGCSRCQQKLFFFLRREGMRQYGECLHSCPSGYYGHRAPDMNRCARCRIENCDSCFSKDFCTKCKVGFYLHRGRCFDECPDGFAPLEETMECVEGCEVGHWSEWGTCSRNNRTCGFKWGLETRTRQIVKKPVKDTILCPTIAESRRCKMTMRHCPGGKRTPKAKEKRNKKKKRKLIERAQEQHSVFLATDRANQ

PTPRK(e1)-RSPO3(e2)易位融合多核苷酸序列(SEQIDNO:175)

ATGGATACGACTGCGGCGGCGGCGCTGCCTGCTTTTGTGGCGCTCTTGCTCCTCTCTCCTTGGCCTCTCCTGGGATCGGCCCAAGGCCAGTTCTCCGCAGTGCATCCTAACGTTAGTCAAGGCTGCCAAGGAGGCTGTGCAACATGCTCAGATTACAATGGATGTTTGTCATGTAAGCCCAGACTATTTTTTGCTCTGGAAAGAATTGGCATGAAGCAGATTGGAGTATGTCTCTCTTCATGTCCAAGTGGATATTATGGAACTCGATATCCAGATATAAATAAGTGTACAAAATGCAAAGCTGACTGTGATACCTGTTTCAACAAAAATTTCTGCACAAAATGTAAAAGTGGATTTTACTTACACCTTGGAAAGTGCCTTGACAATTGCCCAGAAGGGTTGGAAGCCAACAACCATACTATGGAGTGTGTCAGTATTGTGCACTGTGAGGTCAGTGAATGGAATCCTTGGAGTCCATGCACGAAGAAGGGAAAAACATGTGGCTTCAAAAGAGGGACTGAAACACGGGTCCGAGAAATAATACAGCATCCTTCAGCAAAGGGTAACCTGTGTCCCCCAACAAATGAGACAAGAAAGTGTACAGTGCAAAGGAAGAAGTGTCAGAAGGGAGAACGAGGAAAAAAAGGAAGGGAGAGGAAAAGAAAAAAACCTAATAAAGGAGAAAGTAAAGAAGCAATACCTGACAGCAAAAGTCTGGAATCCAGCAAAGAAATCCCAGAGCAACGAGAAAACAAACAGCAGCAGAAGAAGCGAAAAGTCCAAGATAAACAGAAATCGGTATCAGTCAGCACTGTACACTAG

PTPRK(e1)-RSPO3(e2)易位融合多肽序列(SEQIDNO:176)

MDTTAAAALPAFVALLLLSPWPLLGSAQGQFSAVHPNVSQGCQGGCATCSDYNGCLSCKPRLFFALERIGMKQIGVCLSSCPSGYYGTRYPDINKCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYLHLGKCLDNCPEGLEANNHTMECVSIVHCEVSEWNPWSPCTKKGKTCGFKRGTETRVREIIQHPSAKGNLCPPTNETRKCTVQRKKCQKGERGKKGR

PTPRK(e7)-RSPO3(e2)易位融合多核苷酸序列(SEQIDNO:177)

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PTPRK(e7)-RSPO3(e2)易位融合多肽序列(SEQIDNO:178)

MDTTAAAALPAFVALLLLSPWPLLGSAQGQFSAGGCTFDDGPGACDYHQDLYDDFEWVHVSAQEPHYLPPEMPQGSYMIVDSSDHDPGEKARLQLPTMKENDTHCIDFSYLLYSQKGLNPGTLNILVRVNKGPLANPIWNVTGFTGRDWLRAELAVSTFWPNEYQVIFEAEVSGGRSGYIAIDDIQVLSYPCDKSPHFLRLGDVEVNAGQNATFQCIATGRDAVHNKLWLQRRNGEDIPVAQTKNINHRRFAASFRLQEVTKTDQDLYRCVTQSERGSGVSNFAQLIVREPPRPIAPPQLLGVGPTYLLIQLNANSIIGDGPIILKEVEYRMTSGSWTETHAVNAPTYKLWHLDPDTEYEIRVLLTRPGEGGTGLPGPPLITRTKCAVHPNVSQGCQGGCATCSDYNGCLSCKPRLFFALERIGMKQIGVCLSSCPSGYYGTRYPDINKCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYLHLGKCLDNCPEGLEANNHTMECVSIVHCEVSEWNPWSPCTKKGKTCGFKRGTETRVREIIQHPSAKGNLCPPTNETRKCTVQRKKCQKGERGKKGRERKRKKPNKGESKEAIPDSKSLESSKEIPEQRENKQQQKKRKVQDKQKSVSVSTVH

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本文標題:抗RSPO2和/或抗RSPO3抗體及其用途.pdf
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