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人分泌球蛋白的修飾和新型組合物.pdf

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分泌 球蛋白 修飾 新型 組合
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CN201480015618.3

申請日:

20140317

公開號:

CN105744946A

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20160706

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審查中

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IPC分類號: A61K38/16 主分類號: A61K38/16
申請人: 希拉布朗治療有限公司
發明人: 愛普瑞·L·皮隆,哈姆恰·K·哈里普拉卡什,理查德·S·克萊頓,梅莉莎·E·溫
地址: 美國馬里蘭州羅克維爾市
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專利代理機構: 北京中恒高博知識產權代理有限公司 代理人: 夏晏平
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法律狀態
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CN201480015618.3

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法律狀態類型:

摘要

已經在體外通過化學修飾純的蛋白質產生重組人CC10蛋白的新型組合物。已經通過利用活性氧物質和活性氮物質處理產生含有化學修飾rhCC10的亞型的幾種新型合成制劑。這些制劑含有rhCC10已被表征與未修飾的蛋白質相比具有增強的或改變的生物學特性的新型亞型。含新穎亞型制劑可以用作標準,以確定和表征從血液或尿液天然CC10蛋白的天然存在的亞型,并最終以測量新型基于CC10的生物標記以評估患者疾病狀態。這些制劑也可用于治療呼吸、自身免疫性、炎癥及用未修飾的蛋白質不能有效治療的其他病癥。

權利要求書

1.一種組合物,包括化學或酶促氧化合成的分泌球蛋白,具有一個或多個修飾的氨基酸。2.如權利要求1所述的組合物,其中化學或酶促氧化合成的分泌球蛋白具有一個或多個甲硫氨酸亞砜。3.如權利要求1所述的組合物,其中化學或酶促氧化合成的分泌球蛋白具有一個或多個硝基酪氨酸、氯代酪氨酸、或二酪氨酸。4.如權利要求1所述的組合物,其中化學或酶促氧化合成的分泌球蛋白具有一個或多個谷胱甘肽半胱氨酸或HNE-半胱氨酸。5.如權利要求1所述的組合物,其中化學或酶促氧化合成的分泌球蛋白具有一個或多個羰基。6.如權利要求1所述的組合物,其中化學或酶促氧化合成的分泌球蛋白具有一個或多個羥基脯氨酸或吡咯烷酮。7.如權利要求1所述的組合物,其中化學或酶促氧化合成的分泌球蛋白具有一個或多個α-氨基己二酸半醛、氯胺、MDA-賴氨酸、HNE-賴氨酸、丙烯醛-賴氨酸、羧甲基賴氨酸、或PHA-賴氨酸。8.如權利要求1所述的組合物,其中化學或酶促氧化合成的分泌球蛋白具有一個或多個2-氨基-3-酮丁酸、氯胺、羥基色氨酸、硝基色氨酸、犬尿氨酸、纈氨酸或亮氨酸過氧化物、草酸或丙酮酸、羥基苯丙氨酸2-氧代組氨酸或HNE-His。9.如權利要求1所述的組合物,其中化學或酶促氧化合成的分泌球蛋白具有一個或多個標記、化合物、脂質、或肽類連接到谷氨酰胺或賴氨酸殘基。10.一種組合物,包括化學或酶促氧化合成的CC10,具有一個或多個修飾的氨基酸。11.如權利要求10所述的組合物,其中化學或酶促氧化合成的CC10具有一個或多個甲硫氨酸亞砜。12.如權利要求10所述的組合物,其中化學或酶促氧化合成的CC10具有一個或多個硝基酪氨酸、氯代酪氨酸、或二酪氨酸。13.如權利要求10所述的組合物,其中化學或酶促氧化合成的CC10具有一個或多個谷胱甘肽半胱氨酸或HNE-半胱氨酸。14.如權利要求10所述的組合物,其中化學或酶促氧化合成的CC10具有一個或多個羰基。15.如權利要求10所述的組合物,其中化學或酶促氧化合成的CC10具有一個或多個羥基脯氨酸或吡咯烷酮。16.如權利要求10所述的組合物,其中化學或酶促氧化合成的CC10具有一個或多個羥基脯氨酸或吡咯烷酮。17.如權利要求10所述的組合物,其中化學或酶促氧化合成的CC10具有一個或多個α-氨基己二酸半醛、氯胺、MDA-賴氨酸、HNE-賴氨酸、丙烯醛-賴氨酸、羧甲基賴氨酸、或PHA-賴氨酸。18.如權利要求10所述的組合物,其中化學或酶促氧化合成的CC10具有一個或多個2-氨基-3-酮丁酸、氯胺、纈氨酸或亮氨酸過氧化物、草酸或丙酮酸、或羥基苯丙氨酸。19.如權利要求10所述的組合物,其中化學或酶促氧化合成的CC10具有一個或多個標記、化合物、脂質、或肽類連接到谷氨酰胺或賴氨酸殘基。

說明書

技術領域

本發明的領域涉及化學或酶修飾的合成的分泌球蛋白制劑,與未修飾版本相比具有改變或增強的性能。更具體地,利用活性氧物質(ROS)、活性氮物質(RNS)、酶催化修飾的重組人分泌球蛋白蛋白質的修飾,如髓過氧化物酶加的過氧化氫,或轉谷氨酰胺酶催化修飾。本發明進一步涉及的修飾分泌球蛋白的新亞型的特性,修飾分泌球蛋白的優化工藝,及分泌球蛋白亞型的隔分離。本文中的術語“亞型”是指包含一個或多個化學修飾的氨基酸的一種分泌球蛋白或CC10單體、二聚體、或其它包含長度為至少60個氨基酸的完整單體的多聚體復合物。本發明還涉及生物活性的改變,結構構象的變化,或通過它的一個或多個氨基酸化學或酶修飾的分泌球蛋白的生物化學特性。本發明還涉及通過用ROS、RNS、和酶催化的氨基酸修飾的化學修飾增強rhCC10的抗病毒活性。本發明還涉及通過用ROS、RNS、和酶催化的氨基酸修飾的化學修飾增強抑制中性粒細胞的遷移。

發明背景

分泌球蛋白是包括四螺旋束單體以形成二硫化物二聚體、四聚體和更高的多聚體結構上相關蛋白質的一族。有8個已知的人分泌球蛋白(圖1)及克拉拉細胞(ClaraCell)10kDa蛋白(CC10),也被稱為子宮珠蛋白、克拉拉細胞16kDa蛋白(CC16)、克拉拉細胞分泌蛋白(CCSP)、子宮球蛋白、尿蛋白-1,及分泌球蛋白1A1(SCGB1A1),是這一族中最豐富的和眾所周知的成員。分泌球蛋白和CC10被認為在所有脊椎動物存在。雖然這些蛋白質生理作用和具體機制,包括CC10尚不清楚,但是認為基于所知的CC10、分泌球蛋白在調節免疫反應中起作用。

哺乳動物分泌球蛋白的主要來源是肺和氣管上皮細胞,尤其是無纖毛支氣管氣道上皮細胞(主要是克拉拉細胞),及他們在成人肺的細胞外液中是非常豐富的局部產生的蛋白質。它們也在鼻腔上皮細胞中分泌。在血清和尿液中也存在呼吸分泌球蛋白,其在很大程度上是來自于肺源。CC10也由生殖組織(子宮、精囊)、外分泌腺(前列腺、乳腺、胰腺)、內分泌腺(甲狀腺、垂體、腎上腺和卵巢)以及由胸腺和脾臟產生(Mukherjee,1999;Mukherjee,2007)。人CC10體內的主要是同型二聚體,由兩個相同的70個氨基酸的單體組成,具有4.7-4.8的等電點。雖然它在SDSPAGE上以約10kDa的表觀分子量遷移,但是其分子量為15.8kDa。單體以反向平行構型排列,具有與其它C-末端相鄰的N-末端,及以完全氧化形式的二聚體,在Cys3單體和其它Cys69之間通過兩個二硫鍵連接(Mukherjee,1999)。

修飾蛋白質上的氨基酸殘在有許多化學和酶促方法。所述分泌球蛋白經受N-末端信號肽的裂解,這是在哺乳動物細胞中分泌過程的一個組成部分。但是不知道他們是被糖基化還是脂質化。然而,在炎癥反應期間分泌球蛋白通過相同的過程在細胞外環境中影響所有其他蛋白質。天然CC10在體內進行化學修飾及在患者樣本中已經確定的天然CC10的新亞型在來自正常人的樣本中不存在(Lindhal,1999;Ramsay,2001;Ariaz-Martinez,2012)。假定修飾是由炎癥過程導致的,因為新亞型只在來自患有特征在于持續的或急性炎癥的呼吸病癥患者的氣道內膜液(ALF)的樣本中被確定。盡管有些人推測,修飾CC10是與由炎癥反應所產生的活性氧物質反應的結果,但是修飾的性質目前是未知的。此外,氧化修飾天然CC10被認為代表損壞蛋白質,其抗炎活性和免疫調節功能受損,從而促進患有呼吸窘迫的早產兒慢性肺病的發展(Ramsay,2001)。

合成CC10蛋白可通過重組或化學合成方法進行(Barnes,1996;Mantile,1993;Nicolas,2005)。CC10是結構相關的蛋白質統稱分泌球蛋白的族中最知名的一個成員(Klug,2000)。八種人分泌球蛋白成熟分泌序列的氨基酸序列如圖1中所示。N-末端是基于共識的信號肽切割位點的預測,并沒有通過天然蛋白質的N-末端測序確認。所有分泌球蛋白共享一個保守的四螺旋束的二級結構,因此,一般認為介導相似的生理功能。

生成活性氧物質(ROS)和活性氮物質(RNS)為與衰老和疾病相關的慢性炎癥過程的一部分,或作為嚴重的炎癥反應的結果,以對抗感染和其他急性損傷,如煙霧吸入。常見體內介導蛋白質氧化的ROS和RNS的化學試劑包括過氧化氫(H202)、Fe2+、Cu1+、谷胱甘肽、HOCl、HOCBr、1O2、和ONOO-,ROS和RNS可以作為酶的活性的結果在體內合成或釋放,如髓過氧化物酶、黃嘌呤氧化酶、和P-450酶、和活化吞噬細胞的活性氧迸發的結果。脂質過氧化物如4-羥基-2-反式-壬烯醛(HNE)、(MDA)和丙烯醛是ROS和RNS的與脂質反應的產物,反過來,高反應性并能與蛋白質形成加合物。臭氧和紫外線,以及在O2和線粒體電子傳遞鏈泄漏存在下的γ照射,也引起蛋白質氧化。

ROS和RNS的是不加區別化學反應劑,破壞的基本生物組分,包括核酸、脂質(包括膜和表面活性劑的磷脂)、和蛋白,在病原體和宿主二者中,往往造成明顯的組織損傷比原來的感染或炎癥反應的其他原因可能更危及生命。例如,急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)通常是由急性肺部感染(肺炎)引發,其導致ROS和RNS的釋放,并且因肺組織損傷包括肺功能損害通常具有40-60%的死亡率,甚至在病原體引起的感染使用抗菌藥物被控制之后還是一樣。

有幾種類型的氧化蛋白質修飾,其中最常見的是硫氧化,在其中在半胱氨酸(Cys),S-巰基化,和甲硫氨酸(Met)亞砜之間的二硫鍵中形成。蛋白質的羰基也是常見的氧化修飾,其中氨基酸側鏈被轉化成醛和酮,特別是賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)和脯氨酸(Pro)。脂肪族氨基酸可被轉化為它們的羥基(過氧)衍生物。可能會出現氯胺和脫氨基化合物。某些氨基酸可被轉化成其它氨基酸,如組氨酸(His)與天冬酰胺(ASN),而其他的可能形成的脂質過氧化加成物、氨基酸氧化加成物(例如p-羥基苯乙醛)、和糖基化加成物(例如羧甲基賴氨酸)。在宏觀蛋白質水平,暴露于ROS和RNS可能會出現交聯、聚合和肽鍵裂解的結果。

有12種氨基酸通過ROS和RNS被在體內修飾成幾個生理氧化產物,如表1中所示。在一般情況下,氨基酸半胱氨酸(Cys)和甲硫氨酸(Met)是最易被氧化的,不像其他氨基酸氧化,Met和Cys的氧化是可逆的(甲硫氨酸亞砜還原酶和谷胱甘肽和硫氧化還原蛋白氧化還原系統)(Stadtman,2002)。

表1:ROS和RNS引起的氨基酸修飾

修飾分泌球蛋白也可酶促介導的,而不是僅僅由通過酶例如MPO產生的ROS和RNS的下游效應,而且還通過轉谷氨酰胺酶(TGs)。TGs是在自然界中普遍存在,在從微生物到哺乳動物所有生命形式中都可以發現。TGs在哺乳動物幾個之間和細胞內的過程是必不可少的,包括細胞外基質合成、嗜中性粒細胞和單核細胞粘附和運動、受體的胞吞作用、胞飲作用、抗原攝取和加工、血液凝固、G蛋白信號傳導和細胞凋亡(reviewedinLorand,2003)。TGs是介導至少一個主要的酶活性的多功能酶;經典轉谷氨酰胺酶活性,其中在一個蛋白質中的谷氨酰胺殘基作為酰基供體和第二蛋白中的一個賴氨酸殘基作為酰基受體。TGs也介導蛋白質的脫酰胺和酯化,以及創建和重排半胱氨酸殘基之間的二硫鍵。所有這些活動的沒有能量要求及所需的唯一的輔因子是鈣。

轉谷氨酰胺酶在炎癥和免疫反應中發揮著重要的作用,尤其是TG2或組織轉谷氨酰胺酶。它大多存在于細胞質中,但部分與膜相關的酶在細胞表面上及眾所周知的為一種纖連蛋白的受體。TGs也表明交聯蛋白質至細胞膜特定脂質部分,允許在皮膚的結構蛋白支架上創建脂質屏障(Lesort,2000;Nemes,1999)。最近,TGs在病毒感染的新的作用已被確認(reviewedinJeon,2006)。胞內TG2通常存在于惰性狀態,及被由病毒感染導致的氧化應激和鈣動員激活。活化的細胞內TG2通過直接修飾/滅活病毒蛋白質,以及病毒進入、復制、或轉運所需的細胞蛋白質的修飾介導其抗病毒活性。CC10先前已證明是TG2的一個底物(Mukherjee,1988)。CC10通過TG2交聯到其它CC10分子,以形成在SDS-PAGE凝膠和蛋白印跡觀察到的共價連接的多聚體和聚集體。然而,CC10或其它分泌球蛋白沒有其他的TG-介導反應產物被表征過。

發明內容

發明目的

上述提供了通過本發明實施方式所實現的目的的非排他性列舉:

本發明的一個主要目的是一種組合物包括化學或酶促氧化合成的分泌球蛋白(無論是通過重組方法或化學方法)。

本發明進一步的目的是一種組合物包括化學或酶促氧化合成的CC10(無論是通過重組方法或化學方法)。

本發明進一步的目的是一種組合物包括化學或酶促氧化合成的SCGB3A2(無論是通過重組方法或化學方法)。

本發明進一步的目的是一種組合物包括化學或酶促氧化合成的SCGB3A1(無論是通過重組方法或化學方法)。

本發明進一步的目的是一種組合物包括化學或酶促氧化合成的SCGB2A1(無論是通過重組方法或化學方法)。

本發明進一步的目的是一種組合物包括化學或酶促氧化合成的SCGB2A2(無論是通過重組方法或化學方法)。

本發明進一步的目的是一種組合物包括化學或酶促氧化合成的SCGB1D1(無論是通過重組方法或化學方法)。

本發明進一步的目的是一種組合物包括化學或酶促氧化合成的SCGB1D2(無論是通過重組方法或化學方法)。

本發明進一步的目的是一種組合物包括化學或酶促氧化合成的SCGB1D4(無論是通過重組方法或化學方法)。

本發明進一步的目的是一種組合物包括修飾合成的分泌球蛋白,包括一個或多個甲硫氨酸亞砜。

本發明進一步的目的是一種組合物包括修飾合成的分泌球蛋白,包括一個或多個谷胱甘肽半胱氨酸。

本發明進一步的目的是一種組合物包括修飾合成的分泌球蛋白,包括一個或多個HNE-半胱氨酸。

本發明進一步的目的是一種組合物包括修飾合成的分泌球蛋白,包括一個或多個硝基酪氨酸。

本發明進一步的目的是一種組合物包括修飾合成的分泌球蛋白,包括一個或多個二酪氨酸。

本發明進一步的目的是一種組合物包括修飾合成的分泌球蛋白,包括一個或多個羰基。

本發明進一步的目的是一種組合物包括修飾合成的分泌球蛋白,包括兩個或多個選自于由甲硫氨酸亞砜、硝基酪氨酸、或二酪氨酸構成的組合的氨基酸的組合。

本發明進一步的目的是一種組合物包括修飾合成的分泌球蛋白,包括一個或多個氯代酪氨酸。

本發明進一步的目的是一種組合物包括修飾合成的分泌球蛋白,包括一個或多個羥基脯氨酸、吡咯烷酮或谷氨酸半醛。

本發明進一步的目的是一種組合物包括修飾合成的分泌球蛋白,包括一個或多個2-氨基-3-酮丁酸。

本發明進一步的目的是一種組合物包括修飾合成的分泌球蛋白,包括一個或多個氯胺。

本發明進一步的目的是一種組合物包括修飾合成的分泌球蛋白,包括一個或多個α-氨基己二酸半醛、氯胺、MDA-Lys、HNE-Lys、丙烯醛-Lys、羧甲基賴氨酸、或PHA-Lys。

本發明進一步的目的是一種組合物包括修飾合成的分泌球蛋白,包括一個或多個羥基色氨酸、硝基-色氨酸或犬尿氨酸。

本發明進一步的目的是一種組合物包括修飾合成的分泌球蛋白,包括一個或多個纈氨酸或亮氨酸過氧化物。

本發明進一步的目的是一種組合物包括修飾合成的分泌球蛋白,包括一個或多個草酸或丙酮酸。

本發明進一步的目的是一種組合物包括修飾合成的分泌球蛋白,包括一個或多個二羥基苯丙氨酸。

本發明進一步的目的是一種組合物包括修飾合成的分泌球蛋白,包括一個或多個谷氨酸半醛。

本發明進一步的目的是一種組合物包括修飾合成的分泌球蛋白,包括一個或多個2-氧代組氨酸或HNE-His。

本發明進一步的目的是一種組合物包括未修飾合成的分泌球蛋白和氧化或酶促修飾合成的分泌球蛋白的組合,其中未修飾和修飾制劑是相同的分泌球蛋白。

本發明進一步的目的是一種組合物包括未修飾合成的分泌球蛋白和氧化或酶促修飾合成的分泌球蛋白的組合,其中未修飾和修飾制劑不是相同的分泌球蛋白。

本發明進一步的目的是一種組合物包括兩個或多個氧化或酶促修飾合成的分泌球蛋白的組合,其中未修飾和修飾制劑為是相同的分泌球蛋白。

本發明進一步的目的是一種組合物包括兩個或多個氧化或酶促修飾合成的分泌球蛋白的組合,其中未修飾和修飾制劑為不是相同的分泌球蛋白。

本發明進一步的目的是一種組合物包括一個或多個未修飾合成的分泌球蛋白和一個或多個氧化或酶促修飾合成的分泌球蛋白的組合,其中未修飾和修飾制劑是相同的分泌球蛋白。

本發明進一步的目的是一種組合物包括一個或多個未修飾合成的分泌球蛋白和一個或多個氧化或酶促修飾合成的分泌球蛋白的組合,其中未修飾和修飾制劑不是相同的分泌球蛋白。

本發明次要的目的是一種藥物組合物包括一種修飾合成的分泌球蛋白,可用作治療試劑。

本發明進一步的目的是一種藥物組合物包括兩種或多種修飾合成的分泌球蛋白的組合,可用作治療試劑。

本發明進一步的目的是一種藥物組合物包括修飾和未修飾合成的分泌球蛋白的組合,可用作治療試劑。

本發明進一步的目的是施用一種修飾合成的分泌球蛋白給患有炎癥病癥或的病毒感染的患者。

本發明進一步的目的是施用一種修飾合成的分泌球蛋白給患有呼吸疾病或的病癥、自身免疫性疾病或病癥,纖維變性病癥,代謝疾病,感染性疾病,或任何急性或慢性炎癥疾病或病癥的患者。

本發明進一步的目的是施用一種修飾合成的分泌球蛋白給患者,施用特征在于施用對應于所述施用合成分泌球蛋白缺乏的天然分泌球蛋白的亞型。

本發明進一步的目的是施用一種修飾合成的分泌球蛋白以治療或防止患有潛在慢性疾病或病癥的患者潛在病癥的嚴重加重。

本發明進一步的目的是施用一種修飾合成的CC10給患有炎癥病癥或病毒感染的患者。

本發明進一步的目的是施用一種修飾合成的CC10給患有呼吸疾病或的病癥、自身免疫性疾病或病癥,纖維變性病癥,代謝疾病,感染性疾病,或任何急性或慢性炎癥疾病或病癥的患者。

本發明進一步的目的是施用一種修飾合成的CC10給患者,施用特征在于施用對應于所述施用合成CC10缺乏的天然CC10的亞型。

本發明進一步的目的是施用一種修飾合成的CC10以治療或防止患有潛在慢性疾病或病癥的患者潛在病癥的嚴重加重。

本發明進一步的目的是用一種修飾合成的分泌球蛋白,可用于開發診斷分析,以評估患者樣本。

本發明進一步的目的是用一種修飾合成的分泌球蛋白作為標準,可用于診斷分析,以評估患者樣本。

本發明進一步的目的是用一種修飾合成的CC10,可用于開發診斷分析,以評估患者樣本。

本發明進一步的目的是用一種修飾合成的CC10作為標準,可用于診斷分析,以評估患者樣本。

本發明進一步的目的是用一種修飾合成的分泌球蛋白作為標準,以使能夠從生物來源如血液、尿液、或組織純化修飾天然分泌球蛋白。

本發明進一步的目的是用一種修飾合成的分泌球蛋白作為標準,以使能夠發展從生物來源如血液、尿液、或組織純化修飾天然分泌球蛋白的過程。

本發明進一步的目的是用一種修飾合成的分泌球蛋白作為標準,以使能夠監控從生物來源如血液、尿液、或組織純化修飾天然分泌球蛋白的過程。

本發明進一步的目的是用一種修飾合成的分泌球蛋白作為標準,以控制從生物來源如血液、尿液、或組織純化修飾天然分泌球蛋白的質量。

本發明進一步的目的是一種方法,其中用化學氧化將未修飾合成的分泌球蛋白轉換成修飾合成的分泌球蛋白。

本發明進一步的目的是一種方法,其中用一種活性氧物質(ROS)將未修飾合成的分泌球蛋白轉換成修飾合成的分泌球蛋白。

本發明進一步的目的是一種方法,其中用一種活性氮物質(RNS)將未修飾合成的分泌球蛋白轉換成修飾合成的分泌球蛋白。

本發明進一步的目的是一種方法,其中用次氯酸鈉(NaOCI)將未修飾合成的分泌球蛋白轉換成修飾合成的分泌球蛋白。

本發明進一步的目的是一種方法,其中用次氯酸根(HOCI)將未修飾合成的分泌球蛋白轉換成修飾合成的分泌球蛋白。

本發明進一步的目的是一種方法,其中用間氯過苯甲酸(mCPBA)將未修飾合成的分泌球蛋白轉換成修飾合成的分泌球蛋白。

本發明進一步的目的是一種方法,其中用過氧化氫(H202)將未修飾合成的分泌球蛋白轉換成修飾合成的分泌球蛋白。

本發明進一步的目的是一種方法,其中用一種酶將未修飾合成的分泌球蛋白轉換成修飾合成的分泌球蛋白。

本發明進一步的目的是一種方法,其中用髓過氧物酶將未修飾合成的分泌球蛋白轉換成修飾合成的分泌球蛋白。

本發明進一步的目的是一種方法,其中用轉谷氨酰胺酶將未修飾合成的分泌球蛋白轉換成修飾合成的分泌球蛋白。

本發明進一步的目的是一種方法,其中用轉谷氨酰胺酶附著標記、化合物、脂質、或肽段至未修飾合成的分泌球蛋白。

附圖簡述

圖1:分泌球蛋白的氨基酸序列。示出了8種人分泌球蛋白單體形式的氨基酸序列。所有序列均取自基因庫及轉錄產物的信號肽已被移除以示出各單體預測N-末端。所有分泌球蛋白共享一個保守的四螺旋束的二級結構及形成同型二聚體、異型二聚體、四聚體、和大的多聚體。

圖2:rhCC10與NaOCl反應的HPLC圖譜。未修飾rhCC10和rhCC10制劑與氧化劑當量的量增加的NaOCl反應用C-18柱通過反相HPLC進行分析。箭頭指向的反應混合物中未修飾rhCC10的峰。每次HPLC運行裝載大約25mcg的蛋白質以顯示HPLC。

圖3:rhCC10NaOCl反應的SDS-PAGE。使用10-20%甘氨酸SDS-PAGE凝膠。用增量的NaOCl修飾rhCC10制劑;示出了為每個泳道的氧化劑當量數。所有樣本,每個含~5mcg蛋白質,用1mMDTT還原在SDS上樣緩沖液,并凝膠上樣之前加熱至65℃15分鐘。

圖4:rhCC10NaOCl反應的等電聚焦(IEF)。IEF凝膠覆蓋的pH值范圍從3-7。用增量的NaOCl修飾rhCC10制劑;示出了為每個泳道的氧化劑當量數。所有樣本,每個含~5mcg蛋白質,樣本未還原,暴露于在SDS,并凝膠上樣之前加熱。

圖5:使用抗rhCC10抗體的rhCC10NaOCl反應的IEF凝膠的蛋白印跡。IEF凝膠覆蓋的pH值范圍從3-7及印跡到PVDF膜上,然后用蛋白質-A純化的兔多克隆抗體監測使用未修飾的rhCC10為抗原。修飾rhCC10制劑與NaOCl反應的條件在泳道的描述中示出。所有樣本,每個含~5mcg蛋白質,樣本未還原,暴露于在SDS,并凝膠上樣之前加熱。

圖6:使用抗DNP抗體的DNPH處理的rhCC10NaOCl反應的蛋白印跡。10-20%甘氨酸SDS-PAGE凝膠上運行修飾的rhCC10制劑。NaOCl反應產物與MPO和mCPBA反應產物并排運行。將該凝膠印跡到PVDF上然后用兔多克隆抗DNP抗體(可商購)監測。樣本未還原,但混合用SDSPAGE上樣緩沖液,并上樣之前加熱至65℃15分鐘。未修飾rhCC10和MPO和mCPBA反應產物沒有在使用的條件下通過抗體識別。只有在NaOCl反應產物含有可檢測到的DNP,表示這些制劑中的存在羰基。

圖7:mCPBA氧化產物的HPLC分析。未修飾rhCC10和rhCC10制劑與氧化劑當量的量增加的mCPBA反應用C-18柱通過反相HPLC進行分析。箭頭指向的反應混合物中未修飾rhCC10的峰。每次HPLC運行裝載大約25mcg的蛋白質以顯示HPLC。

圖8:rhCC10mCPBA反應的等電聚焦。IEF凝膠覆蓋的pH值范圍從3-7。用增量的mCPBA修飾rhCC10制劑;示出了為每個泳道的氧化劑當量數及對兩種不同的溫度進行了測試。所有樣本,每個含~25mcg蛋白質,樣本未還原,暴露于在SDS,并凝膠上樣之前加熱。

圖9:使用抗rhCC10抗體的rhCC10mCPBA反應的IEF凝膠的蛋白印跡。IEF凝膠覆蓋pH范圍3-7,并印跡到PVDF膜,然后針對rhCC10用蛋白質-A純化的兔多克隆抗體監測。用量增加的mCPBA修飾rhCC10制劑,及示出了為每個泳道的氧化劑當量數和對兩種不同的溫度進行了測試。所有樣本,每個含~25mcg蛋白質。樣本未還原,暴露于在SDS,并凝膠上樣之前加熱。

圖10:rhCC10mCPBA反應的等電聚焦;附加條件。IEF凝膠覆蓋的pH值范圍從3-7。在附加條件下用mCPBA修飾rhCC10制劑,包括CaCl2的存在及對比高得多氧化劑當量數。所有樣本,每個含~25mcg蛋白質,樣本未還原,暴露于在SDS,并凝膠上樣之前加熱。

圖11:mCPBA反應產物:CC10亞型的純化&質譜分析。C-18RP-HPLC用于從mCBPA反應混合物分離表示為不同的峰的八個個體CC10亞型中的每個。在這個例子中,峰值#3收集,重新運行到HPLC來估計純度,然后發送質譜分析(電噴霧法)。箭頭指出了在該實施例中純化的峰值。所有樣本中含有~25mcg的蛋白質。ESI-MS分析的結果顯示在面板D。

圖12:MPO-H202反應的優化;CaCl2的作用。使用C-18RP-HPLC比較有和沒有2mMCaCl2的MPO-H202反應來監控反應。所有反應均在黑暗中進行,在pH5.0的檸檬酸鹽緩沖液中,50當量的氧化劑H202,在37℃下,共60分鐘。箭頭指向對應于未修飾rhCC10的峰,所有樣本中含有~25mcg的蛋白質。

圖13:MPO-H202氧化產物的HPLC分析。有2mMCaCl2的MPO-H202反應用C-18RP-HPLC監控MPO和H202遞增量。所有反應均在黑暗中進行,在pH5.0的檸檬酸鹽緩沖液中,50當量的氧化劑H202,在37℃下,共30分鐘。箭頭指向對應于未修飾rhCC10的峰,所有樣本中含有~25mcg的蛋白質。

圖14:rhCC10MPO+H202反應的等電聚焦。IEF凝膠覆蓋的pH值范圍從3-7。用增量的MPO修飾rhCC10制劑。所有反應均在黑暗中進行,在pH5.0的檸檬酸鹽緩沖液中,50當量的氧化劑H202,在37℃下,1或24小時。所有樣本中含有~25mcg的蛋白質。樣本未還原,暴露于在SDS,并凝膠上樣之前加熱。

圖15:使用抗rhCC10抗體的rhCC10MPO和H202反應的IEF凝膠的蛋白印跡。IEF凝膠覆蓋pH范圍3-7,并印跡到PVDF膜,然后針對rhCC10用蛋白質-A純化的兔多克隆抗體監測。用量增加的MPO修飾rhCC10制劑,及示出了為每個泳道的氧化劑當量數和對兩種不同的溫度進行了測試。所有反應均在黑暗中進行,在pH5.0的檸檬酸鹽緩沖液中,50當量的氧化劑H202,在37℃下,1或24小時。所有樣本中含有~25mcg的蛋白質。樣本未還原,暴露于在SDS,并凝膠上樣之前加熱。

圖16:MPO和H202反應的CC10亞型的純化&質譜分析。C-18RP-HPLC用于從MPO和H202反應混合物分離表示為不同的峰,編號為9-17的八個個體CC10亞型中的每個。在這個例子中,峰值#10收集,重新運行到HPLC來估計純度,然后發送質譜分析(電噴霧法)。箭頭指出了在該實施例中純化的峰值。所有樣本中含有~25mcg的蛋白質。ESI-MS分析的結果顯示在面板D。

圖17:過氧化亞硝酸鹽氧化產物的HPLC分析。有過氧化亞硝酸鹽的rhCC10反應用C-18RP-HPLC監控氧化劑當量遞增量。所有反應均在水中進行,在室溫下在黑暗中進行1小時。箭頭指向對應于未修飾rhCC10的峰,所有樣本中含有~25mcg的蛋白質。

圖18:pH和CaCl2在過氧化亞硝酸鹽介導rhCC10氧化中的作用,有過氧亞硝酸鹽的rhCC10反應在存在或不存在CaCl2及在不同pH時用C-18RP-HPLC監測隨氧化劑當量的數字被監視的存在和不存在。反應用10當量的氧化劑監控氧化劑當量遞增量,在室溫下,在黑暗中進行1小時。箭頭指向出對應于未修飾rhC10的峰,所有樣本中含有~25mcg的蛋白質。

圖19:過氧亞硝酸鹽的反應產物的蛋白印跡分析。10-20%甘氨酸SDS-PAGE凝膠上運行修飾的rhCC10制劑。將該凝膠印跡到PVDF上然后用兔多克隆抗硝基酪氨酸抗體(可商購)監測。樣本中含有~10mcg的蛋白質,樣本未還原,但混合用SDSPAGE上樣緩沖液,并上樣之前加熱至65℃15分鐘。未修飾rhCC10通過抗體識別。

圖20:rhCC10蛋白質檢測ROS和RNS的分泌球蛋白反應產物。用rhCC10觀察氧化修飾反應產物的示意圖;氧加成至甲硫氨酸,硝基加成至酪氨酸,形成羰基是與DNPH反應的。

圖21:通過轉谷氨酰胺酶修飾rhCC10。用TG2+4.5mm的鈣的rhCC10與兩種不同的生物素化胺化合物體外反應的蛋白印跡。該反應在25mMTris/150mMNaClpH8.0下,與1.5mMDTT,在使用5微單元TG2酶,在37℃下進行60分鐘完成反應。反應在10-20%SDS-PAGE甘氨酸凝膠上運行,印跡到PVDF膜上,并用鏈霉親和素-HRP復合物監測,其確認生物素。所有泳道包含還原劑以消除二硫鍵。

圖22:通過修飾rhCC10增強病毒復制的抑制作用。中性紅測定指示有和沒有通過兩株流感的感染及在1mg/ml未修飾和修飾的rhCC10存在下細胞的存活。

圖23:通過修飾rhCC10增強中性粒細胞的趨化性的抑制作用。PLB-985細胞遷移分化、存在100mcg/ml未修飾rhCC10(CC10-A)、NaOCl修飾rhCC19(CC10-B)、和mCBPA-修飾rhCC10(CC10-C)的遷移分化的熒光測量。

發明概要

本發明涉及化學和/或酶促修飾合成的分泌球蛋白,以改變或增強與未修飾版本相比的生物或生化特性。化學試劑如活性氧物質(ROS)、和活性氮物質(RNS),或酶,如髓過氧化物酶或轉谷氨酰胺酶,用于實現所述氨基酸修飾。加入脂質和其他部分至分泌球蛋白也由TGs介導的。本發明還涉及化學或酶-介導方法的優化,實現氨基酸修飾,以及修飾分泌球蛋白混合物的生化和物理特征,及個體分泌球蛋白亞型的分離和表征。本文中的術語“亞型”是指一種分泌球蛋白單體,二聚體,或其它多聚體復合物,其中包含至少60個氨基酸長度的單體單元,但優選全長單體是至少75%與如圖1中所示的氨基酸序列相同,包含一個或多個化學修飾的氨基酸。生物特性,包括但不限于,在化學修飾的分泌球蛋白混合物和亞型中可改變或增強病毒復制的抑制作用和中性粒細胞趨化性的抑制作用。

具體實施方式

通過ROS,RNS的分泌球蛋白的修飾,及酶促活性如MPO和TG2沒有被詳細研究過。初步報告表明,天然CC10在體內急性炎癥反應如在呼吸窘迫期間修飾,從而產生迄今確定交叉反應性抗CC10抗體和等電點與未修飾的CC10(pi~4.8)不同的新亞型,這是生物流體樣本中的主要形式。它也被報道,CC10是體外組織轉谷氨酰胺酶的底物。除了穩定的多聚體和控制訪問中央疏水空腔的Cys殘基的作用,存在用于任何氨基酸中任何分泌球蛋白氧化沒有已知的生理作用。我們認為,Cys和Met的殘基可逆氧化是一種保護性的生理機制,CC10和其它分泌球蛋白能夠從局部的環境清除有害ROS,從而在炎癥反應期間備用組織。我們還認為,含有Cys和Met殘基分泌球蛋白氧化狀態會影響生化和生物特性,但并不代表蛋白質損傷,其導致功能喪失,而是對氧化分泌球蛋白的特性和功能進行調制。同樣地,氧化和/或酶促修飾其他分泌球蛋白氨基酸如酪氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、精氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、組氨酸、和色氨酸不代表蛋白質損害,而是調制生化和生物學特性,使其不同的或增強活性。

大多數已知的,具體的ROS,RNS,及MPO介導的氨基酸修飾與蛋白質損傷和功能喪失相關。氧化蛋白的積累與疾病和衰老過程(BerlettandStadtman,1997)然而,識別可逆氧化正在成為一個監管機制,改變蛋白質功能,而不僅僅是破壞失活蛋白一種形式。所有八種人分泌球蛋白含有Cys殘基,被認為是自然氧化狀態,二硫鍵之間的保守的半胱氨酸殘基存在的N-和C-末端穩定同質和異質二聚體,四聚體,和更高的多聚體。在分泌球蛋白所有半胱氨酸可能易于氧化及形成分子內或分子間二硫鍵,特別是呼吸分泌球蛋白、CC10、SCGB3A1和SCGB3A2。在CC10N-和C-末端Cys之間的二硫鍵在否則二聚體將分裂成單體的條件下當然穩定同型二聚體,如在非還原SDS-PAGE的條件。同樣,SCGB3A2的內部Cys(Cys60序列如圖1中所示)在體外穩定同型二聚體。沒有特別的功能是歸因于二聚體與單體或CC10或SCGB3A2的其他多聚體。然而,由于CC10和SCGB3A2都在體外自發無氧化劑的任何要求形成同型二聚體,它尚未能夠評價其它形式與二聚體在生化特性或生物活性的差別。盡管在任何給定的水性環境下單體和二聚體之間有一個平衡及可以改變緩沖液條件有利于單體和/或四聚體相對于二聚體的更高的百分比,但是這些同二聚體在體外非常穩定。盡管該二聚體是給藥于人類和動物的初始形式,許多可還原和非還原形式可以從生物流體來回收(Antico,2006)。生理上,在體內的谷胱甘肽氧化還原體系在肺部可能介導了呼吸分泌球蛋白和其它可能在肺部中找到的分泌球蛋白的二硫鍵的可逆氧化。

CC10的生理作用已被認為被認為是清除可以占據或結合到中央的疏水空腔的有毒的或有害的疏水基團從而從局部組織環境中除去(Peter,1992;Hard,1995;Umland,1992;1994)。在每個CC10二聚體單體組分的Cys殘基之間的二硫鍵(Cys3和Cys69)被認為像一個門由Cys殘基的可逆氧化打開和關閉形成和打破二硫鍵以允許疏水部分進入中央疏水空腔,然后捕獲它。一些研究報告體內CC10配體諸如多氯聯苯和孕激素的強結合假定,二聚物內及特定殘基例如Phe6和Tyr21的穩定配體結合(Callebaut,2000)。

所有分泌球蛋白含有相當比例的易于氧化和酶促氨基酸修飾的氨基酸。CC10的每70個氨基酸單體共包含42種氨基酸(超過70個;>50%),在表1中列出,可以通過涉及ROS和RNS的生理方法被氧化,造成可能釋放大量的ROS和RNS的反應產物,又名亞型。TG也可通過他們的谷氨酰胺、賴氨酸和半胱氨酸殘基將脂質或其它部分連接至分泌球蛋白,不僅僅是將分泌球蛋白交聯其他蛋白質。如以下實施例中所示,這里我們發現的是rhcc10的案例,其中氧化和酶促修飾產生可以分離并表征的多種亞型。含有氧化修飾rhCC10制劑也介導病毒復制和中性粒細胞趨化性的抑制作用的增強,代表在現有未經修飾的CC10藥物制劑顯著的改善。此外,使用rhCC10制劑體外修飾作為標準來評估包含CC10亞型在內,或從生物樣品中分離,使天然CC10亞型的評估作為在慢性疾病和急性病癥下肺狀態的生物指標。因此,在不存在氧化或酶促氨基酸修飾時,分泌球蛋白可能對特定細胞類型沒有影響,但修飾后具有不同的效果,因為修飾激活或禁止結合到細胞表面受體、細胞信號分子、脂質、配體、結構蛋白、或其它胞內或胞外組分。由于氧化和/或酶促氨基酸修飾在分泌球蛋白的生物化學和生物學特性上的影響,因此,開辟了在介導藥理作用上以前不可能使用未修飾制劑時使用修飾分泌球蛋白的新的可能性,以及用作標準以評價天然分泌球蛋白新的亞型作為不同患者疾病狀態下的生物指標,包括,但不限于患有癌癥、呼吸疾病、自身免疫性疾病、急性或慢性感染、過敏、代謝性疾病、心血管疾病、血液病、和暴露于煙霧、化學污染物、毒素或其他損害的患者。

實施例

實施例1:通過ROS:次氯酸鈉(NaOCl)的rhCC10的化學修飾

每個反應啟動在~4℃(冰上),NaOCl(9.2μl;0.05%水溶液,62.1nmol,5當量)加入至10mM磷酸鹽緩沖液,pH值7.4或普通水的蛋白質溶液(0.2mg,12.42nmol)中,短暫混合并在暗處冰上孵育15分鐘(總體積0.2ml)。該反應通過加入L-甲硫氨酸(9.3μl;10mM在水中,93.15nmol)淬滅,然后孵育20分鐘并溫熱至室溫。

幾個反應用范圍為1-100的氧化劑的當量(“氧化劑當量”)進行。使用HPLC監測rhCC10的氧化進行,其中新的修飾亞型出現了新的HPLC峰,比未修飾rhCC10較早洗脫,如圖2所示。反應通過SpeedVac濃縮,然后在水中重懸。每次大約25μg樣品注射到HPLC柱(VYDAC聚合C18柱5μm,2.1mm×250mm,Cat#218TP52)在Agilent1100系統上使用的移動相如下:A:水;B:95%乙腈+5%水(均含有0.1%TFA)以0.3mL/min的流速。輸出通過在214nm處UV吸收監測。

NaOCl氧化劑當量數的增加增加了rhCC10亞型的數量以及峰高,表明每種亞型的數量隨著反應的進行增加。在20氧化劑當量,HPLC表明所有的未修飾rhCC10基本上不見了,只有修飾亞型依然存在。這些制劑的SDS-PAGE在還原條件下顯示出如預期的單體蛋白質(6kDa),但也顯示出二聚體(~12kDa),四聚體(~24kDa),六聚體(~32kDa),和其余的更高多聚體殘留帶,如圖3所示。這是由CC10形成的四聚體及在不存在轉谷氨酰胺酶活性的還原SDS-PAGE條件下穩定的第一次報道。單體的存在和優勢表明對于rhCC10氨基酸序列大量是完整的。甚至在100氧化劑當量下,雖然大多數蛋白質缺失,似乎被多氧化當量破壞,但是在SDS-PAGE上也有微弱CC10單體、二聚體、四聚體、及較高的多聚體帶。

修飾和未修飾rhCC10與C-18柱的相互作用反映在蛋白質和層析樹脂之間的疏水作用力。修飾后的亞型洗脫比未修飾的rhCC10更快,這表明修飾蛋白表面上的氨基酸殘基比未修飾蛋白質的疏水性低。表面疏水性模式的變化可能與表面電荷變化相一致,這可以通過等電點來測量。樣品用pH3-7等電聚焦凝膠通過等電聚焦分析,如圖4所示。有一個在pi逐步轉向更多的酸性亞型小于4.5。在具有2和5當量消失在20當量的反應中還有一個在pi~5.5的帶,可以代表反應中間體。這些反應的分析由IEF凝膠的蛋白印跡表明,所有的酸性的NaOCl亞型<4.5由兔多克隆抗rhCC10抗體確認,如圖5所示,然而,四聚體沒有通過多克隆抗rhCC10抗體識別。

rhCC10的化學反應和修飾程度可以通過反應性羰基的檢測來估計。在ROS-反應的rhCC10樣品中羰基的存在可通過用2,4-二硝基苯肼(DNPH)標記的羰基來檢測,它增加了一個二硝基苯腙基(DNP),然后使用抗DNP抗體通過蛋白印跡分析該反應產物,如圖6所示。無論ROS反應中使用的類型,在未修改CC10中有單體和四聚體的基線信號(泳道8),它超過了所有其它樣品。因此,所有的ROS反應產生了一些含有羰基的物種。未修飾的二聚物和二聚物在MPO中和加入mCPBA修飾制劑顯示沒有反應性,甚至堵塞了背景(參見泳道2,3和8中二聚體位置上的“鬼帶”)。在NaOCl反應中rhCC10濃度和緩沖液似乎有一種組合效果。在泳道4中的信號強度比泳道5大10X,這比目前蛋白中預期的2倍差異更大。這表明反應在水中進行時更高rhCC10濃度提供了一種比低濃度時更廣泛的反應。盡管泳道7含有一半的蛋白質,在泳道4和7中的信號強度是相等的,這表明該反應在10mM磷酸鹽緩沖液,pH7.4中比在水中更高效的。盡管該蛋白質的相同量存在,在泳道6中的信號強度比在泳道7低得多。這些觀察表明,rhCC10濃度較低在緩沖液存在時該NaOCl反應是更有效的。因此,在水和緩沖液中rhCC10濃度對反應效率的影響是相反的。這些差異說明如何用NaOCl的rhCC10化學修飾的工藝優化。例如,對于NaOCl介導CC10的化學修飾的優化方法將涉及在低強度的磷酸鹽緩沖液的存在中性pH中使用較低濃度的rhCC10。

實施例2:通過ROS:mCPBA的rhCC10的化學修飾

每個反應啟動在~24℃(室溫),間-氯苯甲酸(mCPBA)(6.21μl;2mM水溶液,12.42nmol,2當量)加入至蛋白質水溶液(0.1mg,6.21nmol)中,在暗處24℃偶爾攪拌孵育15分鐘(總體積0.2ml)。該反應通過加入L-甲硫氨酸(1.8μl;10mM在水中,18.6nmol)淬滅,然后在24°C孵育20分鐘。幾個反應用的mCPBA的氧化劑當量范圍從2-100進行。

使用HPLC監測rhCC10的氧化進行。反應通過SpeedVac濃縮,然后在水中重懸。每次大約25μg樣品注射到HPLC柱,與的NaOCl反應。新的修飾亞型出現了新的HPLC峰,比未修飾rhCC10較早洗脫,如圖7所示。mCPBA反應的等電聚焦,如圖8所示,表明生成了多個新的亞型,包括新亞型的pi4.5-5.2范圍內的簇(4.6、4.7、4.9、5.1、5.2),兩種亞型在5.3以上(~5.5,~5.8),一個亞型低于4.5(4.3~)。這些額外的8個帶與原來未修飾rhCC10不同,在Pi4.8有一主帶和在-4.65有一小帶。反應優化的重要參數是溫度。該反應的溫度,4℃對21℃,并沒有影響到產品或每個產品的表觀比重。IEF凝膠的蛋白印跡,如圖9所示,證明了大多數的這些亞型是通過兔多克隆抗體對抗rhCC10確認的。但是,像由NaOCl反應所產生的四聚體,在pi4.3的帶沒有通過抗rhCC10抗體確認,表明當mCPBA使用當量10時該蛋白質的結構被顯著改變。根據IEF凝膠染色的強度,在主要免疫反應帶為4.8的下面的亞型,也表現出比預期更少的信號。反應條件的進一步分析表明,CaCl2的存在阻止rhCC10修飾mCPBA(圖10,泳道2),即100當量的mCPBA完全消除了所有的原始未修改的蛋白質只留下更多的酸性亞型(Pis4.0、4.3、4.5;泳道4),及如果反應過長,rhCC10被破壞(泳道3)。

為了進一步表征mCPBA反應中產生的CC10亞型,每個蛋白質樣品收集8個分離的HPLC主峰(編號為1-8),用SpeedVac濃縮,并通過重復HPLC來驗證表示單峰;例如峰3,如圖11所示。然后將樣品通過電噴霧質譜(ESI-MS)分析,得到每個亞型的分子量。表2示出了含有個體HPLC峰的亞型的質譜分析的結果。所有CC10亞型比未修飾的形式有較大的分子量(MW),其具有16,110道爾頓(Da)。加成一個氧的添加16Da。mCPBA反應是在修飾其它氨基酸之前氧化甲硫氨酸殘基的。這是明確的,因為8個峰的平均質量5通過倍數16增加(例如,峰2、4、5、6、和8)。峰3沒有通過倍數16增加;此峰含有二聚體,其中氧的平均數目是5.25或可表示比簡單氧氣的成更復雜的修飾。峰1和7沒有產生可用質譜。

表2:分離mCPBACC10亞型的質譜分析

實施例3:通過ROS:髓過氧化物酶(MPO)和過氧化氫(H 2 0 2 )的rhCC10的化學修飾

通過MPO加H202的rhCC10的修飾用HPLC監控。在觀察到任何CC10修飾之前rhCC10與MPO-H202的反應需要大量的優化。初始反應在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS),pH7.4中進行,不存在氯化鈣(CaCl2)時反應是不成功的。在呈中性pH的磷酸鹽緩沖液中隨MPO和過氧化氫量的增加,新的HPLC峰的數目和高度達到非常溫和增加。然而,pH值用檸檬酸鹽緩沖液降低到5和加入CaCl2劇烈增加了CC10反應產物,可檢測到新的HPLC峰,如圖12所示。一旦加入鈣和將pH值優化,MPO和H202氧化當量的量重新優化及可再現的HPLC峰圖譜呈現出明顯可觀察到的MPO-和H202-濃度和時間依賴性峰進展。簡要地說,蛋白質溶液(0.1mg,6.21nmol)在2mMCaCl2和10mM檸檬酸鹽緩沖液(pH5)中在黑暗中孵育30分鐘。反應在37℃下通過加入MPO(2.5μl;10μg/ml在水中,25ng)和H202(1.55μl;100mM在水中,155.25nmol,25當量)啟動,并在黑暗中孵育30分鐘在37℃下偶爾攪拌。另一等分MPO(25ng)和H202(1.55μl)的溶液加入并孵育另外30分鐘,在該溫度下攪拌(總體積0.2ml)。該反應通過加入L-甲硫氨酸(4.66μl;0.1M在水中,0.466μmol)淬滅,并在37℃孵育30分鐘。使用HPLC監測rhCC10的氧化進行。反應通常在SpeedVac中濃縮,然后在水中重懸。每次大約25μg樣品注射到HPLC柱,與的NaOCl和mCPBA反應。修飾亞型出現了新的HPLC峰,比未修飾rhCC10較早洗脫,如圖13所示。

MPO和H202反應的等電聚焦,如圖14所示,顯示只產生2類亞型具有變化等電點,包括一種亞型在5.5,及一個或多個亞型低于4.7。未修飾CC10有時會在IEF凝膠出現在4.8的一主帶加在4.7的一小帶(可能分別為二聚物和單體)。凝膠裝載有25mcg每個制劑,使不會錯過小帶。因此,通過HPLC觀察到的多個峰(n=8)與IEF上新帶的數目(N≧2)不匹配。這表明,顯著地,在疏水性相互作用的基礎上通過HPLC分離的至少6種亞型保留于未修改CC10相同的表面電荷。相同的IEF凝膠的蛋白印跡,如圖15所示,證明這些pi4.8亞型通過兔多克隆抗體對抗未修飾rhCC10確認。

為了進一步表征在MPO-H202反應中產生的CC10亞型,每個蛋白質樣品收集8個分離的HPLC主峰(編號為9-17),用SpeedVac濃縮,并通過重復HPLC來驗證表示單峰;例如峰10,如圖16所示。然后將樣品通過電噴霧質譜(ESI-MS)分析,得到每個亞型的分子量。表3示出了MS分析的結果。所有CC10亞型比未修飾的形式有較大的分子量(MW),其具有16,110道爾頓(Da)。與mCPBA亞型相對比,沒有MPO-H202亞型表現出分子量增加16的倍數(如:簡單加氧)。在測試條件下修飾可以包括添加氧、氯、或其它加合物、以及羰基的形成的一些組合。

表3:分離MPO-H202CC10亞型的質譜分析

實施例4:通過RNS:過氧亞硝酸鹽的rhCC10的化學修飾

通過過氧亞硝酸鹽的rhCC10的修飾用HPLC監控。每個反應啟動在~23℃(室溫),市售的過氧化亞硝酸鹽試劑(10-100當量)加入至0.1mg蛋白質(總反應體積0.2ml),短暫攪拌并在暗處孵育1小時。反應通常在SpeedVac中濃縮,然后在水中重懸。每次大約25μg樣品注射到HPLC柱,與其它反應。新的修飾亞型出現了新的HPLC峰,比未修飾rhCC10較早和較晚都洗脫,如圖17所示。四個新主要的峰是明顯的,用10個當量,除了一個峰在與未修飾CC10相同的保留時間洗脫。使用超過20當量導致峰丟失,拓寬成一個長凸點集中在一個點,洗脫略早于未修改CC10。這種廣泛的凹凸圖譜表明,產生了大量的修飾和亞型。由于HPLC峰分辨率的損失,10當量是在進一步的實驗中使用的最大限度。在pH范圍從3-6(10mM檸檬酸鹽緩沖液)中進行進一步的優化,具有和不具有2mMCaCl2如圖18所示。對比MPO-H202和mCPBA,其中鈣和pH是對反應一個顯著效果,對過氧亞硝酸鹽的反應產物沒有明顯的影響。

每個CC10單體包含單個酪氨酸,這些結果表明在RNS存在下易受硝化。隨與過氧亞硝酸鹽反應的進行,分子間鍵可以在不同的單體形成二-酪氨酸復合物。由過氧亞硝酸鹽的反應中產生的亞型大部分是完整的CC10,具有較大的共價連接的復合物,如圖19中的SDS-PAGE的蛋白印跡所示。CC10過氧亞硝酸鹽反應在1~10%的SDS-PAGE甘氨酸凝膠非還原條件下進行,將其印跡到PVDF膜上,用4%脫脂乳堵住,并用兔多克隆抗硝基酪氨酸抗體探測。該印跡顯示了免疫反應CC10二聚體、四聚體、以及較高分子量的復合物“污斑”,探測CC10單體中的酪氨酸殘基易受修飾。酪氨酸硝化不會破壞二聚體或四聚體的穩定性。此圖譜還表明酪氨酸硝化利于形成大復合物,可能是由兩個二-酪氨酸和二硫鍵連接在一起的形成,但不產生在沒有二-酪氨酸時通過簡單的二硫鍵的重排達到熱力學上是有利的多聚形成的不同的組。

實施例5:通過轉谷氨酰胺酶的CC10的修飾

CC10被證明是組織型轉谷氨酰胺酶(又名TG2)的一種體外底物(Manjunath,1984),及是通過谷氨酰胺和賴氨酸殘基交聯本身和其他蛋白質。使用生物素連接于兩個不同的單胺的組進行谷氨酰胺在子宮珠蛋白作為酰基供體/胺受體的可用性的測定。純化豚鼠肝臟轉谷氨酰胺酶和單胺生物素試劑;5-(煙酰胺)戊胺和(+)-生物素基-3,6-二氧雜辛二胺;從商業供應商購買。該反應在25mMTris/150mMNaClpH8.0與1.5mMDTT中的進行。在適用情況下,CaCl2以4.5mM的終濃度使用。鈣是谷氨酰胺和賴氨酸殘基交聯的必需的Tg輔助因子。在不存在鈣和還原劑下,TG2介導的二硫鍵重排在CC10,導致形成多聚體的可用還原劑還原的“梯子”(未示出)。蛋白質和關注的胺在緩沖液中在有鈣或沒有鈣下結合以測定0.1ml的體積。在轉谷氨酰胺酶加入之前,樣品在37℃下預培養30分鐘。EDTA以50mM的終濃度加入到無鈣樣品機充當陰性對照。轉谷氨酰胺酶預培養5μU后加入各個管中,使反應繼續在37℃下進行60分鐘。60分鐘后的EDTA(50mM)加入到含鈣管中以終止反應。100μlSDS樣品緩沖液加還原劑(1mM的DTT)加入到各反應中,然后將其在SDS-PAGE凝膠上分離之前加熱至95℃10分鐘。將該凝膠印跡到PVDF膜上。阻擋用5%BSA(通過2微米的膜過濾)在室溫下進行1小時。在孵育之間用PBS-Tween(0.4%)完成清洗。生物素基團在帶標記的蛋白質(多個)上通過用鏈霉抗堿性磷酸酶結合物孵育進行檢測。用比色試劑(NBT/BCIP)進行可視化,如圖21所示。結果表明,在CC10上的谷氨酰胺和賴氨酸都是TG2反應的酰基供體和酰基受體。該反應是鈣依賴性,并通過與螯合劑的除鈣廢止。非還原的高分子量帶表明CC10含有至少兩個反應性谷氨酰胺-賴氨酸對,由于高分子量的帶代表每個復合物用至少一個谷氨酰胺-胺生物素胺交聯CC10(例如,一個單一的單體是即標記有生物素標記又交叉連接到至少一個其它單體)。這還示出部分,例如標簽、化學制品、脂類、和含有伯胺基團的肽可在鈣和還原劑存在下使用TG2被添加到rhCC10同時含有巰基的其他部分在不存在還原劑下可以使用的TG添加到rhCC10。

實施例6:對比未修飾rhCC10通過修飾rhCC10增強流感復制的體外抑制作用

為了確定修飾對rhCC10的活性的影響,通過結合等份與NaOCl、mCPBA、MPO+H202、和過氧亞硝酸鹽反應的rhCC10構建修飾rhCC10的單一的池。每個反應的HPLC峰均表示在池中。修飾和未修飾rhCC10制劑稀釋為八個半對數MEM溶液中的稀釋液,具有現有樣品可用性的盡可能高的濃度。每種稀釋液加至具有80-100%的融合MDCK細胞的96孔板的5個孔中。三個孔的每種稀釋液感染了病毒(H1H1或H5N1),及兩個孔仍然未感染作為毒性對照。每種病毒感染的復數(MOI)為0.1~1.0之間。培養基為有10單位/ml的胰蛋白酶的MEM溶液。未處理病毒對照孔達到最大致細胞病變效應(CPE)后,然后將板用中性紅染料染色約2小時,然后上清液染料從孔中除去,及摻入的染料在50:50索倫森檸檬酸鹽緩沖液/乙醇中萃取,然后在540nm的光密度上讀取分光光度計。中性紅染料吸收至活細胞,并用作病毒感染后剩余的細胞的度量。結果示于圖22。令人驚訝的是,經修飾的rhC10制劑證明針對兩株流感將增強抗病毒活性而非通常氧化蛋白質修飾的結果功能喪失。

實施例7:對比未修飾rhCC10通過修飾rhCC10增強中性粒細胞趨化性的體外抑制 作用

人PLB-985細胞是可在體外基本上分化成成熟的人嗜中性粒細胞的未成熟粒細胞白血病細胞系(Pedruzzi,2002)。分化的PLB-985細胞可被用作從在中性粒細胞功能測定法外周血中分離的實際人中性粒細胞的替代物,如響應于各種刺激的趨化性,包括fMLP。fMLP的是甲酰化肽(Met,Leu,Pro),其僅由細菌產生及是細菌過度生長的在主體上的信號,即引發一種強效的抗炎反應,包括沿朝向fMLP的源的濃度梯度的中性粒細胞的遷移。未修飾和修飾rhCC10都被評價為在該模型中分化PLB-985(dPLB-985)的抑制劑。

細胞生長在含有10%FBS,100U/ml青霉素,和100μg/ml鏈霉素,在37℃在5%CO2的潮濕氣氛的RPMI1640培養基中。為了誘導分化成成熟嗜中性粒細胞表型,PLB-985細胞在培養基每次實驗前添加有300μΜ聯丁酰基環狀AMP培養3天。分化的PLB-985細胞以107細胞/ml重新懸浮在含有10%FBS(RPMI/FBS)的RPMI-1640(無酚紅)。將細胞用5pg/鈣黃綠素-乙酰甲酯,在37℃下預孵育30分鐘在黑暗中恒定攪拌。然后將細胞洗滌并以2×106細胞/ml重新懸浮在RPMI/FBS中。所述dPLB-985細胞用100mcg/mlrhCC10制劑或PBS(50%)在37℃下孵育60分鐘。使用96孔ChemoTX一次性趨化系統(神經探針)監測細胞遷移。該板的下室的孔中充滿了32μl10-8M的fMLP。聚碳酸酯過濾器(3μΜ)被定位在板上,并dPLB-985細胞(30μl;60000個細胞/孔)置于過濾器上,并使其120分鐘在37℃下,在存在5%C02黑暗中遷移。尚未遷移的細胞通過用組織輕輕擦拭過濾器移除。

用分別使用的485和530nm的激發和發射波長的微孔板熒光閱讀器,將細胞在過濾器中的熒光測定。通過將它們放置在底室及產生標準曲線(圖23,板B),獲得從已知的號碼dPLB-985的熒光。圖23顯示了未修飾rhCC10(CC10-A),輕度抑制嗜中性粒細胞的遷移響應于fMLP的,而NaOCl修飾rhCC10(CC10-B)和mCPBA修飾rhCC10(CC10-C)都抑制嗜中性粒細胞遷移到顯著更大的程度。令人驚訝地發現,這些反應增強rhCC10活性,而不是造成氧化修飾經常的結果典型的功能損失。

定義

分泌球蛋白:一類蛋白質,包括CC10家族中的人和非人蛋白質,具有保守的四螺旋束模體及從大小范圍為約50-100個氨基酸長度。人分泌球蛋白如圖1所示。

合成分泌球蛋白:一種分泌球蛋白,由化學或重組方法制備,而不是從天然來源中分離。

未修飾分泌球蛋白:一種分泌球蛋白單體、二聚體、或其它多聚體,不含有化學或酶促修飾的氨基酸殘基,除了在同型二聚體和異型二聚體的半胱氨酸殘基之間自發產生二硫鍵。

未修飾CC10蛋白:一種CC10單體、二聚體、或其它多聚體,不含有化學或酶促修飾的氨基酸殘基,除了半胱氨酸殘基之間的二硫鍵。

修飾分泌球蛋白:一種分泌球蛋白單體、二聚體、或其它多聚體,含有一個或多個化學或酶促修飾的氨基酸殘基。

修飾合成的分泌球蛋白:一種合成的分泌球蛋白單體、二聚體、或其它多聚體,含有一個或多個化學或酶促修飾的氨基酸殘基。

修飾CC10:一種CC10單體、二聚體、或其它多聚體,含有一個或多個化學或酶促修飾的氨基酸殘基。

修飾重組人CC10:一種CC10單體、由重組DNA方法制備,及含有一個或多個化學或酶促修飾氨基酸殘基。

修飾合成CC10:一種CC10單體、由重組DNA方法或化學肽合成方法制備,及含有一個或多個化學或酶促修飾氨基酸殘基。

修飾氨基酸殘基:一種蛋白質的氨基酸,在其側鏈已被修飾,從最初的蛋白質翻譯完成時存在形式。20種天然未修飾的氨基酸的化學結構在蛋白質中發現可以在任何生化教科書中找到。

羰基:氨基酸側鏈上的醛基或酮基。

縮寫

CC10:Clara細胞10kDa蛋白質,又名CC16、CCSP、子宮珠蛋白、尿蛋白1

SCGB:分泌球蛋白

RNS:活性氮物質

ROS:活性氧物質

MPO:髓過氧化物酶

iNOS的:細胞內的一氧化氮合成酶

mCPBA:間-氯苯甲酸

DNP:2,4-二硝基苯腙

DNPH:2,4-二硝基苯肼

HNE:4-羥基-2-反式-壬烯醛(HNE);脂質過氧化產物

MDA:丙二醛

雖然本發明已經結合目前被認為是最實用和優選的實施方案進行了描述,但是應當理解,本發明并不限于所公開的實施例,而是,相反,意在覆蓋各種修飾和等效布置包括在所附權利要求的精神和范圍內。

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