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裝載凝血酶的DNA自組裝納米結構、其制備方法及應用.pdf

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裝載 凝血酶 DNA 組裝 納米 結構 制備 方法 應用
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摘要
申請專利號:

CN201410207351.X

申請日:

20140516

公開號:

CN103948938B

公開日:

20160302

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K47/48,A61K9/14,A61K38/48,A61P35/00 主分類號: A61K47/48,A61K9/14,A61K38/48,A61P35/00
申請人: 國家納米科學中心
發明人: 聶廣軍,李素萍,丁寶全,宋晨,田艷華,蔣喬
地址: 100190 北京市海淀區中關村北一條11號
優先權: CN201410207351A
專利代理機構: 北京品源專利代理有限公司 代理人: 鞏克棟;楊晞
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201410207351.X

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種站裝載凝血酶的DNA自組裝納米結構的制備方法,其包括:利用DNA折紙技術,將單鏈DNA分子自組裝成長方形的納米結構;將凝血酶固定于所述長方形納米結構的表面,并在所述長方形納米結構的兩個長邊固定一個能對腫瘤血管內皮特異性受體響應的“鎖”結構,從而將凝血酶封閉其中,并在運載至腫瘤血管組織時產生響應,從而實現凝血酶對腫瘤血管組織的靶向輸送與可控釋放;所制備的裝載凝血酶的DNA自組裝納米結構可用于靜脈注射,實現了對腫瘤的靶向治療,具有廣闊的臨床應用前景。

權利要求書

1.一種裝載凝血酶的DNA自組裝納米結構的制備方法,其特征在于,包括以下步驟:(1)利用DNA折紙技術,將單鏈DNA分子自組裝成長方形的納米結構;(2)將凝血酶固定于步驟(1)所得長方形納米結構的表面;(3)將包含可特異性識別腫瘤血管內皮受體的適配體的輔鏈1和包含該適配體的互補序列的輔鏈2進行雜交,并將該雜交體中的兩個自由單鏈部分通過堿基互補配對分別固定于所述長方形納米結構的兩條長邊。2.根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于,步驟(1)中,通過訂書釘鏈的輔助折疊,將所述單鏈DNA分子自組裝成長方形的納米結構。3.根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于,步驟(1)所述單鏈DNA分子為M13噬菌體基因組DNA。4.根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于,步驟(1)所述長方形的長寬比為(1.5~2.5):1。5.根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于,步驟(1)所述長方形的長寬比為(1.5~2):1。6.根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于,步驟(1)所述長方形的長寬比為1.5:1。7.根據權利要求2所述的制備方法,其特征在于,步驟(1)的自組裝過程為:將所述單鏈DNA分子與訂書釘鏈按1:(6-10)的摩爾比混合,所得混合溶液從60-70℃,以0.8-1.2℃為一個梯度,逐漸降溫至20-30℃進行退火,得到所述長方形納米結構。8.根據權利要求2所述的制備方法,其特征在于,步驟(1)的自組裝過程為:將所述單鏈DNA分子與訂書釘鏈按1:8的摩爾比混合,所得混合溶液從62-68℃,以1℃為一個梯度,逐漸降溫至22-28℃進行退火,得到所述長方形納米結構。9.根據權利要求7或8所述的制備方法,其特征在于,每個梯度停留時間為8-12分鐘,整個退火過程為6-8小時。10.根據權利要求7或8所述的制備方法,其特征在于,每個梯度停留時間為10分鐘,整個退火過程為7小時。11.根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于,步驟(2)中,所述凝血酶通過偶聯劑偶聯到巰基化的寡聚dT上,所得復合體再通過巰基化的寡聚dT共價結合于所述長方形結構的表面。12.根據權利要求11所述的制備方法,其特征在于,所述偶聯劑為4-(N-馬來酰亞胺甲基)環己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽。13.根據權利要求11所述的制備方法,其特征在于,在所述長方形結構的表面設3-6個凝血酶結合位點。14.根據權利要求11所述的制備方法,其特征在于,在所述長方形結構的表面設4個凝血酶結合位點。15.根據權利要求11所述的制備方法,其特征在于,步驟(2)包括:(1’)將凝血酶與偶聯劑混合,于20-30℃下反應40-90min,得到凝血酶與偶聯劑的復合物;(2’)將步驟(1’)所得復合物與巰基化的寡聚dT混合,于2-8℃下反應12-20小時,得到凝血酶-偶聯劑-寡聚dT的復合物;(3’)將步驟(2’)所得復合物與所述長方形納米結構混合,所得混合物從40-50℃,以0.8-1.2℃為一個梯度,逐漸降溫至20-30℃進行退火,從而將凝血酶共價結合于長方形納米結構上。16.根據權利要求15所述的制備方法,其特征在于,步驟(1’)所得復合物與巰基化的寡聚dT的摩爾比為1:(12-20)。17.根據權利要求15所述的制備方法,其特征在于,步驟(1)所得復合物與巰基化的寡聚dT的摩爾比為1:15。18.根據權利要求15所述的制備方法,其特征在于,步驟(2’)所得復合物與所述長方形納米結構的摩爾比為(8-12):1。19.根據權利要求15所述的制備方法,其特征在于,步驟(2’)所得復合物與所述長方形納米結構的摩爾比為10:1。20.根據權利要求15所述的制備方法,其特征在于,步驟(3’)每個梯度停留時間為8-12分鐘,整個退火過程為2-4小時。21.根據權利要求15所述的制備方法,其特征在于,步驟(3’)每個梯度停留時間為10分鐘,整個退火過程為3小時。22.根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于,步驟(3)中,所述可特異性識別腫瘤血管內皮性受體的適配體為DNA或RNA適配體。23.根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于,步驟(3)中,所述可特異性識別腫瘤血管內皮性受體的適配體為AS-1411。24.根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于,包含所述適配體的輔鏈1的序列如SEQIDNO.1所示,包含該適配體的互補序列的輔鏈2的序列如SEQIDNO.2所示。25.根據權利要求22所述的制備方法,其特征在于,步驟(3)包括:將所述輔鏈1與輔鏈2退火雜交,所得雜交體與步驟(2)所得產物混合,并從35-40℃,以1℃為一個梯度,逐漸降溫至12-18℃進行退火,從而將所述雜交體的兩個自由單鏈部分通過堿基互補配對分別固定于所述長方形結構的兩個長邊。26.根據權利要求22所述的制備方法,其特征在于,步驟(3)包括:將所述輔鏈1與輔鏈2退火雜交,所得雜交體與步驟(2)所得產物混合,并從37℃,以1℃為一個梯度,逐漸降溫至15℃進行退火,從而將所述雜交體的兩個自由單鏈部分通過堿基互補配對分別固定于所述長方形結構的兩個長邊。27.根據權利要求25或26所述的制備方法,其特征在于,所述雜交體與步驟(2)所得產物的摩爾比為(18-22):1。28.根據權利要求25或26所述的制備方法,其特征在于,所述雜交體與步驟(2)所得產物的摩爾比為20:1。29.根據權利要求25或26所述的制備方法,其特征在于,每個梯度停留時間為8-12分鐘,整個退火過程為3-5小時。30.根據權利要求25或26所述的制備方法,其特征在于,每個梯度停留時間為10分鐘,整個退火過程為4小時。31.根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于,還包括:(4)在所述長方形納米結構的寬邊上固定能夠特異性識別腫瘤血管的靶向鏈,所述靶向鏈為腫瘤血管內皮特異性受體的適配體、多肽、抗體或抗體片段。32.根據權利要求31所述的制備方法,其特征在于,所述靶向鏈為AS-1411適配體。33.根據權利要求31所述的制備方法,其特征在于,寬邊上的適配體的種類與數目與長邊上的相同。34.根據權利要求32所述的制備方法,其特征在于,將AS-1411適配體與步驟(3)所得產物混合,從35-40℃,以0.8-1.2℃為一個梯度,逐漸降溫至12-18℃進行退火,形成所述裝載凝血酶的自組裝DNA納米結構。35.根據權利要求34所述的制備方法,其特征在于,所述AS-1411適配體與步驟(3)所得產物的摩爾比為(3-8):1。36.根據權利要求34所述的制備方法,其特征在于,所述AS-1411適配體與步驟(3)所得產物的摩爾比為5:1。37.根據權利要求34所述的制備方法,其特征在于,每個梯度停留時間為8-12分鐘,整個退火過程為3-5小時。38.一種裝載凝血酶的DNA自組裝納米結構,其特征在于,由權利要求1-37任一項所述制備方法制得。39.根據權利要求38所述的裝載凝血酶的DNA自組裝納米結構,其特征在于,所述DNA自組裝納米結構為管狀,底部直徑為16-22nm,高為80-100nm。40.根據權利要求38所述的裝載凝血酶的DNA自組裝納米結構,其特征在于,所述DNA自組裝納米結構為管狀,底部直徑為18-20nm,高為85-95nm。41.根據權利要求38所述的裝載凝血酶的DNA自組裝納米結構,其特征在于,每個DNA自組裝納米結構的內部結合3-6個凝血酶蛋白分子。42.如權利要求38所述的DNA自組裝納米結構在制備用于阻斷腫瘤血供從而抑制腫瘤生長的藥物中的應用。43.根據權利要求42所述的應用,其特征在于,所述腫瘤為乳腺癌、黑色素瘤、肉瘤、非小細胞肺癌及胃癌。

說明書

技術領域

本發明涉及納米載體藥物技術領域,尤其涉及一種裝載凝血酶的DNA自組裝納米結構、其制備方法及應用。

背景技術

腫瘤血管系統與腫瘤的生長、侵襲及轉移密切相關,它既是腫瘤組織獲取營養物質和氧氣的主要場所,也是腫瘤排走代謝產物、腫瘤細胞逃逸、轉移的通道,因而腫瘤血管成為腫瘤靶向治療的良好靶點。腫瘤血管靶向治療法主要包括兩種策略:抗新生血管生成的治療和阻斷腫瘤血供的治療。其中阻斷腫瘤血供治療法是通過栓塞已經存在的血管,使腫瘤細胞因缺乏營養和氧氣饑餓而死。該治療方法針對的靶點是血液成分,因而不易產生耐藥性,適用范圍廣泛。此外,對臨床大多數癌癥患者而言,藥物所針對的都是已經血管化的腫瘤。因此,阻斷腫瘤血供療法呈現出較好的臨床應用前景。然而,迄今為止尋找安全而有效的腫瘤血管栓塞方法仍然是該研究領域的一個“瓶頸”。

凝血酶(thrombin)又稱凝血因子IIa,是機體凝血系統的一種關鍵酶。它一方面可直接作用于血液中的纖維蛋白原,使之轉變為纖維蛋白,形成纖維蛋白凝膠,另一方面則通過受體介導途徑誘導血小板活化,活化的血小板發生聚集,在纖維蛋白凝膠網的作用下形成血小板血栓,之后血液中其他有形成分的加入導致穩定血栓的形成。因此,作為一種有效的促凝劑,凝血酶在不需要其它眾多凝血因子參與的情況下,快速而高效的誘導血栓的形成。那么,如果將凝血酶作為促凝藥物靶向遞送到腫瘤血管中,無疑可有效阻斷腫瘤血供,達到治療腫瘤的目的。然而,凝血酶自身的高促凝活性使其不適于靜脈注射,再者,凝血酶在血液中的半衰期較短。因此,如何實現凝血酶的靜脈注射以及對腫瘤組織的靶向輸送是將其應用于腫瘤治療的關鍵技術挑戰。

DNA納米技術在新興的納米領域中具有廣泛的潛在應用,其中DNA折紙術作為一種全新的DNA自組裝方法引起人們廣泛的關注。DNA折紙術(origami)是通過將一條長的DNA單鏈(稱為腳手架鏈,通常為基因組DNA)與一系列經過特定設計的短DNA單鏈(稱為訂書釘鏈)進行堿基互補,構造出各種復雜可控的納米圖案或結構。

發明內容

本發明的目的在于提出一種能夠實現凝血酶對腫瘤組織血管的靶向輸送和可控釋放的裝載凝血酶的DNA自組裝納米結構,該納米結構具有一可控的“鎖”結構以特異性響應腫瘤血管內皮特異性受體進而釋放出凝血酶,是一種可尋址、安全、高效,具有較高醫用價值的腫瘤血管阻斷劑。

為達此目的,本發明采用以下技術方案:

第一方面,本發明提供了一種裝載凝血酶的DNA自組裝納米結構的制備方法,該制備方法包括以下步驟:

(1)利用DNA折紙技術,將單鏈DNA分子自組裝成長方形的納米結構;

(2)將凝血酶固定于步驟(1)所得長方形納米結構的表面;

(3)將包含可特異性識別腫瘤血管內皮受體的適配體的輔鏈1和包含該適配體的互補序列的輔鏈2進行雜交,并將該雜交體中的兩個自由單鏈部分通過堿基互補配對分別固定于所述長方形納米結構的兩條長邊。

上述制備方法中,作為優選,步驟(1)中,通過訂書釘鏈的輔助折疊,將所述單鏈DNA分子自組裝成長方形的納米結構;

優選地,所述單鏈DNA分子為M13噬菌體基因組DNA;

所述長方形的長寬比可根據實際需要進行調整,優選地,所述長方形的長寬比為(1.5~2.5):1、優選為(1.5~2):1、更優選為1.5:1。

在本發明優選的實施方案中,所述長方形的長×寬=90nm×60nm。

進一步優選地,步驟(1)的自組裝過程為:

將所述單鏈DNA分子與訂書釘鏈按1:(6-10)、優選1:8的摩爾比混合,所得混合溶液從60-70℃、優選62-68℃、更優選65℃,以0.8-1.2℃、優選1℃為一個梯度,逐漸降溫至20-30℃、優選22-28℃、更優選25℃進行退火,得到所述長方形納米結構;

優選地,每個梯度停留時間為8-12分鐘、優選為10分鐘,整個退火過程為6-8小時,優選為7小時。

上述制備方法中,作為優選,步驟(2)中,所述凝血酶通過偶聯劑偶聯到巰基化的寡聚dT上,所得復合體再通過巰基化的寡聚dT共價結合于所述長方形結構的表面;

優選地,所述偶聯劑為4-(N-馬來酰亞胺甲基)環己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽;

優選地,在所述長方形結構的表面設3-6個、優選為4個凝血酶結合位點。

進一步優選地,步驟(2)包括:

(1’)將凝血酶與偶聯劑混合,于20-30℃、優選22-28℃、更優選25-26℃下反應40-90min、優選60min,得到凝血酶與偶聯劑的復合物;

(2’)將步驟(1’)所得復合物與巰基化的寡聚dT混合,于2-8℃、優選4-6℃、更優選4℃下反應12-20小時、優選14-18小時、更優選16小時,得到凝血酶-偶聯劑-寡聚dT的復合物;

優選地,步驟(1)所得復合物與巰基化的寡聚dT的摩爾比為1:(12-20)、優選為1:15;

(3’)將步驟(2’)所得復合物與所述長方形納米結構混合,所得混合物從40-50℃、優選42-48℃、更優選45℃,以0.8-1.2℃、優選1℃為一個梯度,逐漸降溫至20-30℃、優選22-28℃、更優選25℃進行退火,從而將凝血酶共價結合于長方形納米結構上;

優選地,步驟(2’)所得復合物與所述長方形納米結構的摩爾比為(8-12):1、優選為10:1;

優選地,每個梯度停留時間為8-12分鐘、優選為10分鐘,整個退火過程為2-4小時,優選為3小時。

上述制備方法中,作為優選,步驟(3)中,所述可特異性識別腫瘤血管內皮受體的適配體為DNA或RNA適配體,優選為AS-1411;

優選地,包含所述適配體的輔鏈1的序列如SEQIDNO.1所示,包含該適配體的互補序列的輔鏈2的序列如SEQIDNO.2所示:

SEQIDNO.1:

5’-GTGCGCAAAGAGTTTACAAAATTAAAGTACGGTGTCTGGAAGAGGTCA-3’;

SEQIDNO.2:

5’-GTGCGCAAAGAGTTTATTTTTGCGCAGAAAACGAGAATGAATGTTTAG-3’。

進一步優選地,步驟(3)包括:

將所述輔鏈1與輔鏈2退火雜交,所得雜交體與步驟(2)所得產物混合,并從35-40℃、優選37℃,以1℃為一個梯度,逐漸降溫至12-18℃、優選為15℃進行退火,從而將所述雜交體的兩個自由單鏈部分通過堿基互補配對分別固定于所述長方形結構的兩個長邊;

優選地,所述雜交體與步驟(2)所得產物的摩爾比為(18-22):1、優選為20:1;

優選地,每個梯度停留時間為8-12分鐘、優選為10分鐘,整個退火過程為3-5小時,優選為4小時。

作為優選,上述制備方法還包括:

(4)在所述長方形納米結構的寬邊上固定能夠特異性識別腫瘤血管的靶向鏈,所述靶向鏈優選為腫瘤血管內皮特異性受體的適配體、多肽、抗體或抗體片段,更優選為AS-1411適配體;

優選地,寬邊上的適配體的種類和數目與長邊上的相同;

優選地,將AS-1411適配體與步驟(3)所得產物混合,從35-40℃、優選37℃,以0.8-1.2℃、優選1℃為一個梯度,逐漸降溫至12-18℃、優選為15℃進行退火,形成所述裝載凝血酶的自組裝DNA納米結構;

優選地,所述AS-1411適配體與步驟(3)所得產物的摩爾比為(3-8):1、優選為5:1;

優選地,每個梯度停留時間為8-12分鐘、優選為10分鐘,整個退火過程為3-5小時,優選為4小時。

步驟(4)的增加,可加強所述DNA自組裝納米結構對腫瘤血管組織的識別和結合能力,更有利于凝血酶的靶向運輸和可控釋放。

上述制備方法中,由于DNA納米結構自組裝中的可控、可預測性,從而可實現凝血酶在納米結構中精密的空間定位。

第二方面,本發明提供了一種裝載凝血酶的DNA自組裝納米結構,由第一方面所述制備方法制得;

優選地,所述DNA自組裝納米結構為管狀,底部直徑為16-22nm、優選為18-20nm、更優選為19nm,高為80-100nm、優選為85-95nm、更優選為90nm;

優選地,每個DNA自組裝納米結構的內部結合3-6個、優選4個凝血酶蛋白分子。

第三方面,本發明提供了第二方面所述的DNA自組裝納米結構在制備用于阻斷腫瘤血供從而抑制腫瘤生長的藥物中的應用;優選地,所述腫瘤為乳腺癌、黑色素瘤、肉瘤、非小細胞肺癌及胃癌。

本發明利用DNA折紙技術,以較長的單鏈DNA為主鏈(即腳手架鏈),通過與過量的訂書釘鏈在特定位置的雜交互補,使其自組裝成長方形的DNA納米結構;再將凝血酶蛋白固定在長方形納米結構的表面,隨后,將包含腫瘤血管內皮特異性受體的適配體的輔鏈1以及包含適配體互補序列的輔鏈2雜交,并將雜交體的兩個自由單鏈部分分別固定在長方形的兩條長邊,從而形成一個“鎖”結構,將長方形的納米結構閉合為管狀,最終得到一種內部裝載有凝血酶,同時具有一可控的“鎖”以響應腫瘤血管內皮特異性受體的管狀DNA納米結構。

本發明的裝載凝血酶的DNA自組裝納米結構的靶向輸送與可控釋放的機理為:在到達腫瘤血管組織前的血管運輸中,輔鏈1和輔鏈2所形成的“鎖”結構將凝血酶封閉于管狀結構的內部,避免了凝血酶發揮非特異凝血效應;當到達腫瘤血管組織時,輔鏈1所含特異性適配體可以響應腫瘤血管內皮特異性受體,從而打開“鎖”結構,釋放凝血酶,進而實現了凝血酶對腫瘤血管組織的靶向輸送與可控釋放。

本發明的裝載凝血酶的DNA自組裝納米結構可用于靜脈注射,實現了對腫瘤的靶向治療;并且,由于DNA納米結構易于修飾、生物相容性好、尺寸均勻、在溶液中穩定性好,因此具有廣闊的醫用前景。

附圖說明

圖1是實施例1中所制備的長方形DNA折紙結構的原子力顯微鏡(AFM)形貌圖,比例尺為200nm。

圖2是實施例1中所制備的長方形DNA折紙結構的透射電鏡(TEM)形貌圖,比例尺為200nm。

圖3是實施例1所制備的管狀DNA納米結構對乳腺癌腫瘤生長的抑制作用;箭頭代表給藥時間點。

具體實施方式

下面通過具體實施方式來進一步說明本發明的技術方案。本領域技術人員能夠理解,這些實施例僅用于說明本發明,其不以任何方式限制本發明的范圍。

實施例1:本發明裝載凝血酶的DNA自組裝納米結構的制備

具體步驟如下:

(1)長方形DNA折紙結構的制備

將M13噬菌體基因組DNA主鏈和訂書釘鏈混合,主鏈和訂書釘鏈的最終濃度分別為10nM和80nM。利用梯度PCR儀對混合物進行緩慢退火,退火條件為:從65℃到25℃,每1℃為一個梯度,每個梯度停留時間為10分鐘,整個退火過程約為7個小時。

退火程序完畢以后,將DNA折紙結構樣品取出,用100kDa離心柱(MWCO)離心分離,除去過量的訂書釘鏈和捕獲鏈。離心條件為:取100μL樣品,加入350μL1×TAE-Mg緩沖溶液,于4700轉/分鐘條件下離心3分鐘,離心柱內剩余溶液的體積大約為100μL,重復該過程兩遍。最終收集的樣品分別用于1%的瓊脂糖凝膠電泳分析,以及原子力顯微鏡和投射電鏡下的折紙結構形貌觀察,原子力顯微鏡和透射電鏡下的折紙結構形貌圖分別如圖1、圖2所示。經檢測,所得長方形DNA折紙結構的長為90nm,寬為60nm,厚度為2nm。

(2)制備凝血酶-偶聯劑-巰基化的寡聚dT的復合物

將200μL3μM的凝血酶(購自中生華美科技有限公司)和9μL15mM的sulfo-SMCC(購自天津希恩思生化科技有限公司)混合后于室溫反應1小時,反應結束后,將混合物用30kDa離心柱于7500轉/分鐘的條件下離心30分鐘以除去過量的sulfo-SMCC。收集的溶液中加入15倍過量的巰基化的寡聚dT,混合物于4℃反應過夜,用30kDa離心柱離心純化OligodT修飾的凝血酶產物,純化產物通過4%-12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行鑒定。

(3)裝載凝血酶的管狀自組裝DNA納米顆粒的制備

將步驟(1)所得純化后的長方形DNA折紙結構溶液和步驟(2)所得凝血酶復合物按照1:10的摩爾比例混合均勻后,放入梯度PCR儀中,緩慢從45℃降至25℃,每1℃為一個梯度,每個梯度停留時間為10分鐘,整個退火過程所需時間約為3個小時。

退火程序結束后,將樣品用100kDa離心柱離心分離以除去過量的OligodT修飾的凝血酶復合物。然后,向收集的樣品中加入20倍過量的輔鏈1(序列如SEQIDNO.1所示)與輔鏈2(序列如SEQIDNO.2所示)的雜交體,以及5倍過量的靶向鏈AS-1411適配體,再次放入梯度PCR儀中進行緩慢退火,退火條件為從37℃降至15℃,每1℃為一個梯度,每個梯度停留時間為10分鐘,整個退火過程約歷時4個小時。用100kDa離心柱離心分離PCR產物,瓊脂糖凝膠電泳純化回收得到提純的包載有凝血酶的管狀DNA納米顆粒。

實施例2:本發明裝載凝血酶的DNA自組裝納米結構的抗腫瘤效果

抗腫瘤效果的評價方法:

將2.0×106個人源MDA-MB-231乳腺癌細胞原位接種于BALB/c裸鼠的乳房墊,至腫瘤體積生長到大約100mm3。將實施例1所制備的裝載凝血酶的DNA自組裝納米顆粒溶液按照每只小鼠大約1.5U單位凝血酶劑量給荷瘤小鼠尾靜脈注射,每隔2天注射一次并測量腫瘤體積大小,注射6次以后,統計分析腫瘤體積變化情況。腫瘤體積按照以下公式計算:體積=(d2×D)/2,其中d是腫瘤的最小直徑,D是最大直徑。注射生理鹽水、游離的凝血酶、空白DNA納米顆粒,作為陰性對照。實驗結果如圖3所示。

由圖3可得,與生理鹽水組、游離凝血酶組及空白DNA納米顆粒組相比,本發明的裝載凝血酶的DNA納米顆粒組的腫瘤體積增長明顯變慢,其抗腫瘤效果明顯。

申請人聲明,本發明通過上述實施例來說明本發明的技術方案,但本發明并不局限于上述實施例,即不意味著本發明必須依賴上述實施例才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了,對本發明的任何改進,包括本發明所用核苷酸序列的適當改進、具體參數的選擇等,均落在本發明的保護范圍和公開范圍之內。

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