鬼佬大哥大
  • / 14
  • 下載費用:30 金幣  

一種長期保存過表達BFGF的C172的神經干細胞保存液.pdf

關 鍵 詞:
一種 長期 保存 表達 BFGF C172 神經 干細胞
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
摘要
申請專利號:

CN201810022013.7

申請日:

20180110

公開號:

CN108244097A

公開日:

20180706

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01N1/02 主分類號: A01N1/02
申請人: 暨賽再生醫學科技有限公司
發明人: 吳琨,朱思品,徐家科,徐麗婉
地址: 510000 廣東省廣州市天河區大靈山路61號第28棟D2-101房
優先權: CN201810022013A
專利代理機構: 廣州勝沃園專利代理有限公司 代理人: 孫文卉
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN201810022013.7

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明屬于生物醫藥領域,涉及一種細胞保存液,具體涉及一種長期保存過表達bFGF的C17.2的神經干細胞保存液。所述保存液包括以下組分:白蛋白、維生素、海藻糖、氯化鈉、氯化鉀、肉蓯蓉苷、甘油、堿性成纖維細胞生長因子、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、復方氨基酸和注射用水。該保存液無毒環保、成分明確、安全穩定,便于細胞保存和運輸;本發明的長期保存過表達bFGF的C17.2的神經干細胞保存液能提高細胞的保存時間和保存率,能維持細胞的高活力和生物學特性,具有廉價、高效、無毒的優勢。

權利要求書

1.一種長期保存過表達bFGF的C17.2的神經干細胞保存液,其特征在于,所述保存液包括以下組分:白蛋白、維生素、海藻糖、氯化鈉、氯化鉀、肉蓯蓉苷、甘油、堿性成纖維細胞生長因子、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、硫酸軟骨素、復方氨基酸和注射用水。2.根據權利要求1所述的保存液,其特征在于,每100mL保存液中包括以下組分:白蛋白1-5g、維生素1.0-1.5g、葡萄糖0.2-0.4g、氯化鈉0.5-0.8g、氯化鉀0.025-0.030g、肉蓯蓉苷0.03-0.06g、甘油1.5-2.0g、堿性成纖維細胞生長因子0.03-0.06g、磷酸氫二鈉0.15-0.17g、磷酸氫二鉀0.04-0.05g、硫酸軟骨素0.1-0.15g、復方氨基酸0.10-0.15g,其余為注射用水。3.根據權利要求1所述的保存液,其特征在于,每100mL保存液中包括以下組分:白蛋白3-5g、維生素1.2-1.4g、葡萄糖0.25-0.3g、氯化鈉0.6-0.8g、氯化鉀0.025-0.027g、肉蓯蓉苷0.05-0.06g、甘油1.5-1.8g、堿性成纖維細胞生長因子0.04-0.05g、磷酸氫二鈉0.16-0.17g、磷酸氫二鉀0.04-0.05g、硫酸軟骨素0.12-0.14g、復方氨基酸0.11-0.13g,其余為注射用水。4.根據權利要求1所述的保存液,其特征在于,所述維生素選自維生素B、維生素C、維生素E和維生素K中的一種或多種。5.根據權利要求4所述的保存液,其特征在于,所述維生素為維生素E。6.根據權利要求1所述的保存液,其特征在于,所述復方氨基酸由甘氨酸、精氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸組成。7.根據權利要求6所述的保存液,其特征在于,所述復方氨基酸由以下質量分數的原料組成:甘氨酸5%、精氨酸5%、亮氨酸15%、異亮氨酸25%、蘇氨酸30%和甲硫氨酸20%組成。8.一種長期保存過表達bFGF的C17.2的神經干細胞的方法,其特征在于,將細胞加入如權利要求1-7任一項所述的保存液中,置于0-5℃條件下保存。9.一種長期保存過表達bFGF的C17.2的神經干細胞保存液的制備方法,其特征在于,包括以下步驟:A)將維生素、海藻糖、氯化鈉、氯化鉀、硫酸軟骨素、復方氨基酸加入50mL注射用水,攪拌溶解,得溶液A;B)將白蛋白、肉蓯蓉苷、甘油、堿性成纖維細胞生長因子加入到10mL注射用水中,攪拌均勻,得溶液B;C)將溶液B緩慢加入溶液A中,邊加入邊攪拌,混合均勻后,邊攪拌邊加入磷酸氫二鈉和磷酸氫二鉀,之后攪拌30min,注射用水定容至100mL,即得。10.如權利要求1至7任一項所述的保存液在保存細胞中的應用。

說明書

技術領域

本發明涉及生物醫藥領域,具體涉及一種長期保存過表達bFGF的C17.2的神經干細胞保存液。

背景技術

缺血性腦卒中是因腦血栓形成或腦栓塞所致腦供血障礙而引起的局部腦組織缺血、缺氧,進而引起腦組織軟化、死亡。干細胞移植能夠改善缺血性腦卒中造成的神經功能缺陷,很多不同類型的干細胞如胚胎干細胞(ES)、骨髓間充質干細胞(BMSC)、誘導多功能干細胞(iPS)和神經干細胞(NSC)都被用來治療缺血性腦中風,并且移植這些細胞能夠減輕神經性損傷。C17.2神經干細胞系是經過v-myc基因改造后得到的永生化的細胞,最早是從新生小鼠的小腦中分離的到的。移植C17.2神經干細胞系被廣泛的用于研究中樞神經系統失調疾病,例如帕金森病、亨廷頓病、顱腦損傷、缺血缺氧腦損傷、成年大鼠皮層選擇性神經退化、脊髓損傷等。C17.2神經干細胞系是一種很好的治療缺血性腦卒中的細胞來源。但是由于缺血性腦卒中造成的腦內惡劣的微環境使得移植細胞的存活率并不高。堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)是由155個氨基酸組成的18kD多肽,主要分布于垂體、腦和神經組織及視網膜、腎上腺、胎盤等組織,可促進來源于中胚層和神經外胚層的多種類型細胞增殖、分化,具有廣泛的生物學效應。bFGF在成年哺乳動物腦組織中呈低水平表達,主要由星形膠質細胞產生,但在腦組織損傷后bFGF表達顯著上調。bFGF促進血管生成、軸突再生、神經保護、組織修復、動員內源性神經干細胞,在中樞神經系統發育與損傷修復中具有重要作用。在局灶性腦缺血損傷大鼠模型中,bFGF抑制神經細胞凋亡,增加腦缺血區血液供應,顯著縮小腦梗塞面積,改善神經功能障礙。但是bFGF體內半衰期短,靜脈給藥后迅速降解,難以保持其生物活性;bFGF是生物大分子,難以透過血腦屏障;FGF受體體內分布廣泛,存在于全身許多組織器官,經靜脈全身給藥副作用大。因此,將干細胞移植和bFGF兩者聯合起來,將bFGF基因序列利用基因轉染技術插入到干細胞中,得到高表達bFGF蛋白的C17.2神經干細胞系,然后將得到的C17.2神經干細胞通過靜脈注射的方式給藥。干細胞表達的bFGF蛋白一方面可以提高移植的干細胞在缺血性微環境下的生存能力,又可以作為蛋白治療藥物去改善神經功能。而干細胞一方面作為表達bFGF蛋白的載體,避免了bFGF蛋白作為蛋白藥物半衰期段、難以透過血腦屏障、全身反應等缺陷,另一方面也使得移植干細胞本身的存活率升高,同時bFGF蛋白的促分化的功能可以促進干細胞的分化,能夠更好的改善缺血性腦卒中后的神經功能缺陷。

雖然細胞治療的臨床應用前景已經得到了廣泛認可,但是在實際應用仍有許多問題需要解決。細胞治療大多采用靜脈注射的方式進行,將體外培養好的細胞注射到不同規格的氯化鈉注射液中,部分情況下加入血清或人血白蛋白制成懸液回輸給患者。然而,將氯化鈉注射液或含有血清/人血白蛋白的混合液作為細胞保存液,幾個小時后細胞存活率和生物學效力會很大程度的降低,不利于細胞較長時間的保存和遠距離運輸。目前,中國專利CN104928248A公開了一種用于制備神經干細胞的試劑盒及制備神經干細胞的方法,其中神經組織保存液為含有鏈霉素50~250ug/ml、青霉素50~250ug/ml的RPMI-1640、DMEM、α-MEM、DMEM/F12中的一種或兩種以上混合的培養基。中國專利CN107156108A公開了一種外周血干細胞保存液及制備方法,其中外周血干細胞保存液的包括以下組分:人血白蛋白3-8份、海藻糖2-4份、羥乙基淀粉1-3份、營養素5-15份、右旋糖酐1-3份、二甲基亞砜1-3份和適量水。中國專利CN102948413B公開了一種肝干細胞保存液及其應用,該保存液是將0.1-1g有效劑量的人血白蛋白、2.60-4.97g氯化鈉、2.48-4.74g葡萄糖酸鈉、1.82-3.40g醋酸鈉、0.18-0.35g氯化鉀、0.15-0.28g氯化鎂和0.4-0.7mL肝素鈣注射液用水定容至100mL得到的。

雖然,對于干細胞保存液的組成和制備有一定的研究,但是針對不同種類的干細胞的保存液組分有很大的差別,但大都含有培養基或人血白蛋白,而且保存液中加入血清或人血白蛋白,其來源一般是牛血清或人AB血清,因其成分不明,可能會引起血清污染或者未知病毒污染等問題。除此之外,目前國內大部分細胞培養基均是僅供科研使用,不作為臨床應用的常規試劑;其安全性和可靠性不確定;而且針對神經干細胞保存液的研究較少,不同類型的細胞保存時所需的酸堿環境、滲透壓、營養物質等都有一定的差異,如果保存不當,可能會出現細胞脫分化、活力下降、死亡等現象,而且目前并沒有針對長期保存過表達bFGF的C17.2的神經干細胞保存液的研究。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對上述缺陷,提供一種長期保存過表達bFGF的C17.2的神經干細胞保存液,該保存液能提高細胞的保存時間和保存率,能維持細胞的高活力和生物學特性,具有廉價、高效、無毒的優勢。

為了實現上述目的,本發明采用如下技術方案:

一種長期保存過表達bFGF的C17.2的神經干細胞保存液,其特征在于,所述保存液包括以下組分:白蛋白、維生素、海藻糖、氯化鈉、氯化鉀、肉蓯蓉苷、甘油、堿性成纖維細胞生長因子、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、硫酸軟骨素、復方氨基酸和注射用水。

肉蓯蓉是我國著名中藥,現代藥理研究表明,肉蓯蓉具有抗衰老、調整內分泌、促進代謝、提高學習記憶能力、抗老年癡呆癥、通便等多方面的功效,而肉蓯蓉苷是肉蓯蓉主要成分的提取物,還具有促進神經干細胞增殖的作用。本發明中加入少量肉蓯蓉苷起到延緩衰老、維持細胞代謝、維持神經干細胞的多能性、保持細胞活性的作用。

堿性成纖維細胞生長因子是一種多效能的細胞生長因子,具有促進血管生成,創傷愈合與組織修復,促進骨、軟骨的生長,神經再生作用,在細胞分化和機體發育過程中發揮重要作用。本發明中加入少量堿性成纖維細胞生長因子具有促進細胞損傷的修復,細胞形態的重建,調節細胞膜表面各種整合素的表達,促進內皮細胞的黏附生長,刺激內皮細胞的增殖等作用,能夠減少保存過程中細胞的凋亡、維持細胞形態和活性的作用。

硫酸軟骨素是一種糖胺聚糖,廣泛分布于東大購物組織的細胞外基質和細胞表面,糖鏈由交替的葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺二糖單位組成,生物活性廣泛如神經保護、免疫調節、抗氧化和抗肝纖維化、軟骨保護、抗動脈粥樣硬化等。在本發明中加入硫酸軟骨素可以提高細胞的穩定性。

進一步,每100mL保存液中包括以下組分:白蛋白1-5g、維生素1.0-1.5g、葡萄糖0.2-0.4g、氯化鈉0.5-0.8g、氯化鉀0.025-0.030g、肉蓯蓉苷0.03-0.06g、甘油1.5-2.0g、堿性成纖維細胞生長因子0.03-0.06g、磷酸氫二鈉0.15-0.17g、磷酸氫二鉀0.04-0.05g、硫酸軟骨素0.1-0.15g、復方氨基酸0.10-0.15g,其余為注射用水。

更進一步,每100mL保存液中包括以下組分:白蛋白3-5g、維生素1.2-1.4g、葡萄糖0.25-0.3g、氯化鈉0.6-0.8g、氯化鉀0.025-0.027g、肉蓯蓉苷0.05-0.06g、甘油1.5-1.8g、堿性成纖維細胞生長因子0.04-0.05g、磷酸氫二鈉0.16-0.17g、磷酸氫二鉀0.04-0.05g、硫酸軟骨素0.12-0.14g、復方氨基酸0.11-0.13g,其余為注射用水。

進一步,所述維生素選自維生素B、維生素C、維生素E和維生素K中的一種或多種。

優選地,所述維生素為維生素E。

維生素E是一種脂溶性維生素,是最重要的抗氧化劑之一,具有較強的抗氧化活性,能清除自由基對細胞的毒性作用,具有延緩細胞衰老和緩慢增殖,減少神經細胞的凋亡,保持細胞活性的作用。

進一步,所述復方氨基酸由甘氨酸、精氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸組成。

更進一步,所述復方氨基酸由以下質量分數的原料組成:甘氨酸5%、精氨酸5%、亮氨酸15%、異亮氨酸25%、蘇氨酸30%和甲硫氨酸20%組成。

氨基酸是構成動物營養所需蛋白質的基本物質,能在一定程度上促進神經干細胞的增殖,復方氨基酸能夠給細胞提供更多元的營養。

本發明提供一種長期保存過表達bFGF的C17.2的神經干細胞的方法,將細胞加入如上所述的保存液中,置于0-5℃條件下保存。

本發明提供一種長期保存過表達bFGF的C17.2的神經干細胞保存液的制備方法,包括以下步驟:A)將維生素、海藻糖、氯化鈉、氯化鉀、硫酸軟骨素、復方氨基酸加入50mL注射用水,攪拌溶解,得溶液A;

B)將白蛋白、肉蓯蓉苷、甘油、堿性成纖維細胞生長因子加入到10mL注射用水中,攪拌均勻,得溶液B;

C)將溶液B緩慢加入溶液A中,邊加入邊攪拌,混合均勻后,邊攪拌邊加入磷酸氫二鈉和磷酸氫二鉀,之后攪拌30min,注射用水定容至100mL,即得。

本發明提供一種如上所述的保存液在保存細胞中的應用。

優選地,所述細胞為神經干細胞;優選地,所述神經干細胞為C17.2神經干細胞;更優選過表達bFGF的C17.2的神經干細胞。

本發明的有益效果:

本發明的長期保存過表達bFGF的C17.2的神經干細胞保存液成分穩定、營養物質多元、溶液滲透體系緩沖力強,并且無毒環保、成分明確、安全穩定,便于細胞保存和運輸;同時還能提高細胞的保存時間和保存率,能維持細胞的高活力和生物學特性,具有廉價、高效、無毒的優勢。

具體實施方式

以下結合實施例對本發明做進一步闡述。這些實施例僅是出于解釋說明的目的,而不限制本發明的范圍和實質。基于本發明的實施例,本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例,都屬于本發明的保護范圍。實施例中未注明具體技術或條件者,按照本領域內的文獻所描述的技術或條件進行。

過表達bFGF(GI:122745)的C17.2神經干細胞的構建,其中,C17.2神經干細胞購自天津賽爾生物技術有限公司,貨號C0151。

(一)過表達bFGF慢病毒載體構建

1.1擴增IRES-hrGFP-polyA片段

其中,引物IRES/GFP/PAR/F為通用引物。

反應過程:首先95℃,5min,接著98℃15s、60℃15s、72℃2min進行35個循環,再接著72℃20min,最后4℃保存。

1.2提取pShuttle/5HRE-CMVmp-bFGF質粒:

將pShuttle/5HRE-CMVmp-bFGF質粒的細菌轉接到5mLLB培養基中,在37℃、200rp/min搖床上擴增過夜,然后提取質粒。提取質粒過程按照質粒提取試劑盒(invotrigen)的說明書進行。

1.在室溫下吸取4mL含有質粒大腸桿菌菌液,離心轉速為10000g,1min,棄去上清液(用濾紙充分吸干);

2.加入250μL的Solution/RNAseA搖晃使之懸浮(震蕩器震蕩混勻);

3.加入250μL的Solution II輕輕混勻,從加液開始約3.5min后加入SolutionIII;

4.加入350μL的Solution III快速混勻,會出現白色沉淀;

5.在室溫下離心轉速為130000g·10min;

6.將離心后的上清液轉至DNA結合柱(不要將沉淀倒入),室溫下離心轉速為10000g·1min;

7.棄去濾液,加入500μL的HB Buffer,室溫下離心轉速為10000g·1min;

8.棄去濾液加入700μL的DNAwash Buffer,室溫下離心轉速為10000g·1min,重復一次;

9.棄去濾液,空柱,室溫下離心轉速為13000g·2min;

10.將DNA結合柱置于1.5mL滅菌微量離心管上,加入50μL預熱的滅菌去離子水放置2min,室溫下離心轉速為13000g·1min;

11.將提取的質粒電泳鑒定并置于4℃冰箱保存。

1.3質粒和PCR產物酶切鑒定;

使用SalI限制性內切酶進行鑒定,反應體系如下:

37℃酶切2h,電泳。

1.4 SalI酶切產物純化

純化步驟按照DNA純化試劑盒(invotrigen)說明書進行:

1.將bFGF PCR產物加入5倍體積的Buffer cp,震搖完全混合;

2.離心后將樣本加入DNA結合柱,室溫下離心轉速為10000g,1min;

3.棄去濾液,加入700μL的DNAwash Buffer,室溫下離心轉速為10000g,1min;

4.棄去濾液,重復步驟3;

5.棄去濾液,將空柱室溫下離心轉速為13000g,2min;

6.將DNA結合柱置于1.5mL滅菌微量離心管上,加入30μL的無菌水,靜置2min,室溫下離心轉速為13000g,2min;

7.將得到的純化DNA電泳鑒定并4℃保存。

1.5酶切產物連接;

反應體系

16℃連接過夜。

1.6連接產物轉化鋪板;

1、取出-80℃保存的感受態在冰上進行解凍;

2、加2μL的DNA(連接產物),輕彈混勻;

3、放于冰上30min;

4、42℃水浴熱激90s;

5、取出置冰上2min;

6、加入800μL預熱的培養基(37℃);

7、37℃搖床1h;

8、取100μL培養液放入不同含有氨芐抗生素的培養平板中;

9、轉化液保存在4℃中;

10、轉化的平板倒置于37℃培養箱過夜培養。

1.7挑選單菌落擴增

將平板上的但菌落挑至含有5mLLB/Kan培養基的試管中進行擴增,條件:37℃、200rp/min。

1.8質粒提取電泳酶切鑒定

質粒提取過程如上,酶切體系如下:

16℃過夜,電泳。

1.9擴增bFGF-IRES-hrGFP基因

以連接鑒定好的pShuttle-5HRE-bFGF-IRES-hrGFP質粒為模板,擴增bFGF-IRES-hrGFP基因。反應體系和反應條件同擴增IRES-hrGFP-polyA基因。

1.10 bFGF-IRES-hrGFPPCR產物與pENTER/D-TOPO質粒連接

反應體系如下:

室溫孵育10min。

bFGF-IRES-hrGFP PCR產物與pENTER/D-TOPO質粒連接產物轉化,擴增,提取質粒(步驟如上)。

1.11質粒雙酶切鑒定;

反應體系:

37℃孵育1h,電泳。

1.12重組pLenti6.4/R4R2/D5-CMV-bFGF-IRES-hrGFP質粒

反應體系如下:

25℃反應16h,之后加入1μL蛋白酶K終止反應,轉化鋪板,步驟如上,但是孵育時使用SOC培養基。

1.13挑選單克隆擴增,提取質粒單酶切鑒定

反應體系如下:

37℃酶切2h,電泳。

(二)病毒包裝

第一天:

鋪板:使T25培養瓶轉染時細胞數目達2×106(90%-95%融合),5mL不含抗生素含血清培養基過夜培養。

第二天:

1.A、在1.5mL EP管中加入4.5μg(濃度為1ug/μL,加入4.5μL)的virapower packaging mix和1.5μg(濃度為450ng/μL,7μL)的中提質粒到700μL的DMEM不含血清培養基中,移液槍上下輕柔抽吸混勻;

B、在另一個1.5mL EP管加入12μL lipofectamine2000到700μL的DMEM不含血清培養基,移液槍上下輕柔抽吸混勻,室溫孵育5分鐘;

C、孵育結束后,將A和B混合,移液槍上下輕柔抽吸混勻;

D、室溫孵育20min。(在6小時內轉染)。

2.棄去培養基,加入5mL不含抗生素的完全培養基。

3.將前面孵育好的轉染混合物加入到293T細胞的培養基中,前后方向輕柔搖晃培養瓶混勻,培養箱中過夜。

第三天:

1.移除培養基,加入5mL不含抗生素的完全培養基;

2.再孵育48-72h。

第五或六天:

1.將培養基轉移到15mL離心管中;

2.4℃離心2000g 15min;

3.將上清液等分成1mL轉移到五個1.5離心管中,其中取一管(1mL)再等分為200μL分五管;-80℃保存。

(三)細胞感染

第一天24孔板鋪板1·104個/孔,過夜培養。

第二天加入200μL病毒液至24孔板中,37℃培養箱孵育6小時,吸棄培養基更換新的培養基。

第三天更換在培養基中加入殺稻瘟菌素(2μg/mL)。

其后每隔兩天更換一次含有殺稻瘟菌素的培養基至14天。收集細胞,得到過表達bFGF的C17.2神經干細胞。

實施例1

一種長期保存過表達bFGF的C17.2的神經干細胞保存液,每100mL保存液中包括以下組分:

白蛋白3g、維生素E1.2g、葡萄糖0.25g、氯化鈉0.6g、氯化鉀0.025g、肉蓯蓉苷0.05g、甘油1.5g、堿性成纖維細胞生長因子0.04g、磷酸氫二鈉0.16g、磷酸氫二鉀0.04g、硫酸軟骨素0.12g、復方氨基酸0.11g,其余為注射用水。其中,復方氨基酸由以下質量分數的原料組成:甘氨酸5%、精氨酸5%、亮氨酸15%、異亮氨酸25%、蘇氨酸30%和甲硫氨酸20%組成。

制備方法:

A)將維生素、海藻糖、氯化鈉、氯化鉀、硫酸軟骨素、復方氨基酸加入50mL注射用水,攪拌溶解,得溶液A;

B)將白蛋白、肉蓯蓉苷、甘油、堿性成纖維細胞生長因子加入到10mL注射用水中,攪拌均勻,得溶液B;

C)將溶液B緩慢加入溶液A中,邊加入邊攪拌,混合均勻后,邊攪拌邊加入磷酸氫二鈉和磷酸氫二鉀,之后攪拌30min,注射用水定容至100mL,即得。

實施例2

一種長期保存過表達bFGF的C17.2的神經干細胞保存液,每100mL保存液中包括以下組分:

白蛋白5g、維生素B1.4g、葡萄糖0.3g、氯化鈉0.8g、氯化鉀0.027g、肉蓯蓉苷0.06g、甘油1.8g、堿性成纖維細胞生長因子0.05g、磷酸氫二鈉0.17g、磷酸氫二鉀0.05g、硫酸軟骨素0.14g、復方氨基酸0.13g,其余為注射用水。其中,復方氨基酸由以下質量分數的原料組成:甘氨酸5%、精氨酸5%、亮氨酸15%、異亮氨酸25%、蘇氨酸30%和甲硫氨酸20%組成。

制備方法參照實施例1。

實施例3

一種長期保存過表達bFGF的C17.2的神經干細胞保存液,每100mL保存液中包括以下組分:

白蛋白5g、維生素C1.5g、葡萄糖0.4g、氯化鈉0.8g、氯化鉀0.03g、肉蓯蓉苷0.06g、甘油2.0g、堿性成纖維細胞生長因子0.06g、磷酸氫二鈉0.17g、磷酸氫二鉀0.05g、硫酸軟骨素0.15g、復方氨基酸0.15g,其余為注射用水。其中,復方氨基酸由以下質量分數的原料組成:甘氨酸5%、精氨酸5%、亮氨酸15%、異亮氨酸25%、蘇氨酸30%和甲硫氨酸20%組成。

制備方法參照實施例1。

實施例4

一種長期保存過表達bFGF的C17.2的神經干細胞保存液,每100mL保存液中包括以下組分:

白蛋白1g、維生素K1.0g、葡萄糖0.2g、氯化鈉0.5g、氯化鉀0.025g、肉蓯蓉苷0.03g、甘油1.5g、堿性成纖維細胞生長因子0.03g、磷酸氫二鈉0.15g、磷酸氫二鉀0.04g、硫酸軟骨素0.1g、復方氨基酸0.10g,其余為注射用水。其中,復方氨基酸由以下質量分數的原料組成:甘氨酸5%、精氨酸5%、亮氨酸15%、異亮氨酸25%、蘇氨酸30%和甲硫氨酸20%組成。

制備方法參照實施例1。

對比例1

一種細胞保存液,每100mL保存液中包括以下組分:

白蛋白3g、維生素E1.2g、葡萄糖0.25g、氯化鈉0.6g、氯化鉀0.025g、甘油1.5g、堿性成纖維細胞生長因子0.04g、磷酸氫二鈉0.16g、磷酸氫二鉀0.04g、硫酸軟骨素0.12g、復方氨基酸0.11g,其余為注射用水。其中,復方氨基酸由以下質量分數的原料組成:甘氨酸5%、精氨酸5%、亮氨酸15%、異亮氨酸25%、蘇氨酸30%和甲硫氨酸20%組成。

制備方法:

A)將維生素、海藻糖、氯化鈉、氯化鉀、硫酸軟骨素、復方氨基酸加入50mL注射用水,攪拌溶解,得溶液A;

B)將白蛋白、甘油、堿性成纖維細胞生長因子加入到10mL注射用水中,攪拌均勻,得溶液B;

C)將溶液B緩慢加入溶液A中,邊加入邊攪拌,混合均勻后,邊攪拌邊加入磷酸氫二鈉和磷酸氫二鉀,之后攪拌30min,注射用水定容至100mL,即得。

對比例2

一種細胞保存液,每100mL保存液中包括以下組分:

白蛋白3g、維生素E1.2g、葡萄糖0.25g、氯化鈉0.6g、氯化鉀0.025g、肉蓯蓉苷0.05g、甘油1.5g、磷酸氫二鈉0.16g、磷酸氫二鉀0.04g、硫酸軟骨素0.12g、復方氨基酸0.11g,其余為注射用水。其中,復方氨基酸由以下質量分數的原料組成:甘氨酸5%、精氨酸5%、亮氨酸15%、異亮氨酸25%、蘇氨酸30%和甲硫氨酸20%組成。

制備方法:

A)將維生素、海藻糖、氯化鈉、氯化鉀、硫酸軟骨素、復方氨基酸加入50mL注射用水,攪拌溶解,得溶液A;

B)將白蛋白、肉蓯蓉苷、甘油加入到10mL注射用水中,攪拌均勻,得溶液B;

C)將溶液B緩慢加入溶液A中,邊加入邊攪拌,混合均勻后,邊攪拌邊加入磷酸氫二鈉和磷酸氫二鉀,之后攪拌30min,注射用水定容至100mL,即得。

對比例3

一種細胞保存液,每100mL保存液中包括以下組分:

白蛋白3g、維生素E1.2g、葡萄糖0.25g、氯化鈉0.6g、氯化鉀0.025g、甘油1.5g、磷酸氫二鈉0.16g、磷酸氫二鉀0.04g、硫酸軟骨素0.12g、復方氨基酸0.11g,其余為注射用水。其中,復方氨基酸由以下質量分數的原料組成:甘氨酸5%、精氨酸5%、亮氨酸15%、異亮氨酸25%、蘇氨酸30%和甲硫氨酸20%組成。

制備方法:

A)將維生素、海藻糖、氯化鈉、氯化鉀、硫酸軟骨素、復方氨基酸加入50mL注射用水,攪拌溶解,得溶液A;

B)將白蛋白、甘油加入到10mL注射用水中,攪拌均勻,得溶液B;

C)將溶液B緩慢加入溶液A中,邊加入邊攪拌,混合均勻后,邊攪拌邊加入磷酸氫二鈉和磷酸氫二鉀,之后攪拌30min,注射用水定容至100mL,即得。

實施例5

將過表達bFGF的C17.2的神經干細胞的細胞濃度調節為1×106cell/mL,與保存液配置成0.5%的細胞懸液。

在0-5℃保存0.5d、1d、7d、14d、28d、35d,取樣進行臺盼藍(Trypan Blue)染色,計數活細胞和死細胞數,計算細胞活率,細胞活率=活細胞數目/(活細胞數目+死細胞數目),結果如表1所示。

表1過表達bFGF的C17.2的神經干細胞的細胞活率的實驗結果

由表1可以看出本發明制備的過表達bFGF的C17.2的神經干細胞的保存液在保存過表達bFGF的C17.2的神經干細胞的過程中細胞活率很高。

實施例6

將過表達bFGF的C17.2的神經干細胞的細胞濃度調節為1×106cell/mL,與保存液配置成0.5%的細胞懸液。

在0-5℃保存0.5d、1d、7d、14d、28d、35d,分別取不同保存時間點的細胞懸液1mL,按照細胞懸液:0.4%臺盼藍(v:v)=5:1混勻,取20μL細胞混勻液加入細胞計數板中,用Countstar細胞計數器進行細胞結團率的檢測,結果見表2。

表2過表達bFGF的C17.2的神經干細胞的細胞結團率的實驗結果

由表2可知,本發明制備的過表達bFGF的C17.2的神經干細胞的保存液在保存過表達bFGF的C17.2的神經干細胞的過程中結團率低。

本發明的保存液,明顯優于對比例,說明本發明保存液各個組分搭配合理,缺一不可,這種特定的組合構成的保存液,產生了明顯的協同增效作用。本發明的長期保存過表達bFGF的C17.2的神經干細胞保存液成分穩定、營養物質多元、溶液滲透體系緩沖力強,并且無毒環保、成分明確、安全穩定,便于細胞保存和運輸;同時還能提高細胞的保存時間和保存率,能維持細胞的高活力和生物學特性,具有廉價、高效、無毒的優勢。

以上所述僅為本發明的優選實施例,并非因此限制本發明的專利范圍,凡是利用本發明說明書所作的等效變換,或直接或間接運用在其他相關的技術領域,均同理包括在本發明的專利保護范圍內。

關于本文
本文標題:一種長期保存過表達BFGF的C172的神經干細胞保存液.pdf
鏈接地址:http://www.wwszu.club/p-6914264.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 zhuanlichaxun.net網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開
鬼佬大哥大