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一種流感病毒通用疫苗及其制備方法.pdf

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一種 流感病毒 通用 疫苗 及其 制備 方法
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摘要
申請專利號:

CN201410173067.5

申請日:

20140426

公開號:

CN103948942B

公開日:

20160323

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K48/00,A61K39/145,A61P31/16 主分類號: A61K48/00,A61K39/145,A61P31/16
申請人: 青島農業大學
發明人: 單虎,李桂梅,黃娟,張傳美,劉煥
地址: 266109 山東省青島市城陽區長城路700號
優先權: CN201410173067A
專利代理機構: 代理人:
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201410173067.5

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明提供了一種流感病毒通用疫苗及其制備方法,本發明的實質內容是將流感H1N1病毒株進行大量擴增,與真核表達載體進行連接轉化,并從轉化后的大腸桿菌中獲取新質粒,經過收獲、加工,制備一種流感病毒通用疫苗,本疫苗能夠誘導機體特異性的體液免疫和細胞免疫應答,有效預防各種流感病毒病的發生,并能顯著減少注射疫苗后的不良反應,為疾病的控制創造條件。

權利要求書

1.一種流感病毒通用基因疫苗的制備方法,包括如下步驟:1)流感H1N1病毒株的HA2基因的獲取;2)流感病毒重組質粒的制備;3)將重組質粒進行濃度調整,分裝至不同EP管中,獲得疫苗成品;其中所述的流感H1N1病毒株的HA2基因的獲取步驟包括:將A/PuertoRico/8/1934(H1N1)病毒株倍比稀釋,并將稀釋產物接種9-11日齡的SPF雞胚,進行病毒的大量擴增,48h后收取雞胚尿囊液,利用引物進行HA2基因的大量擴增,并對其進行產物回收;其中所述引物序列為:正向引物:5’-ATCGATGGTCTATTTGGAGCCAT-3’反向引物:5’-AGATCTGATGCATATTCTGCACT-3’;其中流感病毒重組質粒的制備步驟包括:對獲取的HA2基因及pCAGGS真核表達載體進行ClaⅠ/BglⅡ雙酶切,對產物進行回收及連接轉化,并作大量擴增,從克隆產物中提取重組質粒。2.根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于,所述的轉化及大量擴增是將目的基因與表達載體連接,并將連接產物轉入DH5α大腸桿菌中,利用常見的含有氨芐青霉素的LB溶液過夜培養。3.流感H1N1病毒株的HA2基因和pCAGGS真核表達載體在制備流感病毒通用基因疫苗中的用途,其中所述流感病毒通用基因疫苗的制備方法包括如下步驟:1)流感H1N1病毒株的HA2基因的獲取;2)流感病毒重組質粒的制備;3)將重組質粒進行濃度調整,分裝至不同EP管中,獲得疫苗成品;其中所述的流感H1N1病毒株的HA2基因的獲取步驟包括:將A/PuertoRico/8/1934(H1N1)病毒株倍比稀釋,并將稀釋產物接種9-11日齡的SPF雞胚,進行病毒的大量擴增,48h后收取雞胚尿囊液,利用引物進行HA2基因的大量擴增,并對其進行產物回收;其中所述引物序列為:正向引物:5’-ATCGATGGTCTATTTGGAGCCAT-3’反向引物:5’-AGATCTGATGCATATTCTGCACT-3’;其中流感病毒重組質粒的制備步驟包括:對獲取的HA2基因及pCAGGS真核表達載體進行ClaⅠ/BglⅡ雙酶切,對產物進行回收及連接轉化,并作大量擴增,從克隆產物中提取重組質粒。

說明書

技術領域

本發明涉及一種流感病毒通用疫苗及其制備方法,屬于獸醫生物制品技術領域。

背景技術

流行性感冒病毒(Infuenzavirus,IV)簡稱流感病毒,屬正粘病毒科。其臨床特征是高熱、呼吸困難以及其他各系統程度不同的臨床癥狀。該病的流行特點是發病急驟、傳播迅速、感染譜廣、流行范圍大,可引起多種動物出現大批死亡。

由流感病毒引起的流行性感冒廣泛分布于世界各地,而且歷史已久,關于本病的報道不僅包含雞群還包含豬群,近年來,隨著各地養殖業的迅速發展,畜禽的流通大幅增加,流感病毒的感染日趨嚴重,給養殖業帶來了重大的經濟損失,成為危害畜牧業發展的重大疫病之一。本病發病急驟,疫苗免疫接種是預防本病的有效措施。

本發明的目的是制備出一種安全、有效的流感病毒通用疫苗。

發明內容

本發明的目的是利用流感H1N1病毒株作為生產疫苗的毒株,通過雞胚培養的方法進行病毒增殖,并利用基因工程的方法進行目的基因的擴增,將其與pCAGGS真核表達載體進行連接、轉化及克隆,制備一種流感病毒通用疫苗,從而達到減少畜禽在注射疫苗后的不良反應又能增強其對該病毒的應答反應。

為達到上述目的,本發明所采用的具體技術方案如下:

一方面,本發明提供一種流感病毒通用基因疫苗,其特征在于:由克隆有流感H1N1病毒株的HA2基因的pCAGGS真核表達載體構成。

另一方面,本發明提供上述流感病毒通用基因疫苗的制備方法,具體步驟如下:

1)流感H1N1病毒株的HA2基因的獲取;

2)流感病毒重組質粒的制備;

3)將重組質粒進行濃度調整,分裝至不同EP管中,獲得疫苗成品。

優選地,所述的流感H1N1病毒株的HA2基因的獲取步驟包括:將A/PuertoRico/8/1934(H1N1)病毒株倍比稀釋,并將稀釋產物接種9-11日齡的SPF雞胚,進行病毒的大量擴增,48h后收取雞胚尿囊液,利用引物進行HA2基因的大量擴增,并對其進行產物回收。

優選地,引物序列為:

正向引物:5’-ATCGATGGTCTATTTGGAGCCAT-3’

反向引物:5’-AGATCTGATGCATATTCTGCACT-3’

優選地,流感病毒重組質粒的制備步驟包括:對獲取的HA2基因及pCAGGS真核表達載體進行ClaⅠ/BglⅡ雙酶切,對產物進行回收及連接轉化,并作大量擴增,從克隆產物中提取重組質粒。

進一步優選地,所述的轉化及大量擴增是將目的基因與表達載體連接,并將連接產物轉入DH5α大腸桿菌中,利用常見的含有氨芐青霉素的LB溶液過夜培養即可。

再一方面,本發明提供流感H1N1病毒株的HA2基因和pCAGGS真核表達載體在制備流感病毒通用基因疫苗中的用途。

本發明的流感病毒通用疫苗的用途,主要用于控制流感病毒病。

附圖說明

圖1為免疫天數與HA特異性抗體滴度關系的圖。

具體實施方式

1.A/PuertoRico/8/1934(H1N1)病毒株HA2基因擴增。

(1)取9-11日齡的SPF雞胚,于尿囊腔中接種0.2mL/胚的病毒液,37℃孵育,收集24-48h自然死亡或未死亡雞胚尿囊液。血凝試驗(HA)測定病毒的滴度,將有血凝滴度的尿囊液保存于-80℃備用。

(2)根據Genbank上收錄的HA2基因核酸序列(SEQID:NO.1)設計引物并引入限制性內切酶酶切位點,利用分子生物學方法對病毒中的HA2基因進行大量擴增。

其中,引物序列為:

正向引物:5’-ATCGATGGTCTATTTGGAGCCAT-3’

反向引物:5’-AGATCTGATGCATATTCTGCACT-3’

(3)對HA2基因進行回收,并利用限制性內切酶ClaⅠ/BglII進行雙酶切使HA2暴露出粘性末端。

2.粘性末端真核表達載體的制備

取由哈爾濱獸醫研究所贈與的pCAGGS真核表達載體質粒,利用限制性內切酶ClaⅠ/BglII進行雙酶切使載體暴露出粘性末端,以方便其余目的基因進行連接。

3.成品的制備

將暴露出粘性末端的HA2和pCAGGS進行連接轉化,并大量擴增,利用質粒提取試劑盒大量提取重組質粒。

將重組質粒進行濃度調整,分裝至不同EP管中,獲得疫苗成品,密封保存于-20℃中。

針對HA基因和HA1基因,以類似的方法分別構建pCAGGS-HA和pCAGGS-HA1質粒,在后續試驗中作為對照。

4.流感病毒通用疫苗的檢驗方法

(1)性狀白色、透明均一的溶液

(2)無菌檢驗按《中國獸藥典》規定的方法進行檢驗,應無菌生長。

5.甲醛和汞類防腐劑殘留量測定按《中國獸藥典》附錄進行測定,應符合獸用生物制品通則的規定。

6.流感病毒通用疫苗安全性試驗

(1)酶聯免疫吸附試驗取6-8周齡BALB/c小鼠25只,雙側脛前肌注射,每只50μg疫苗成品,于免疫后10、20、30、40、50、60天分別進行小鼠眼眶取血,分離血清,按間接ELISA抗體檢測試驗步驟進行檢測,于450nm測定各孔的OD值,記錄試驗結果,評價血清中特異性抗體滴度。

用A/PuertoRico/8/1934(H1N1)流感病毒的HA抗原包被ELISA板,從特異性ELISA抗體檢測結果分析,免疫后的10天各免疫組沒有明顯的抗體產生。從免疫后的第20天起,各免疫組的抗體產生較明顯,對照pCAGGS組沒有抗體產生,在第40天免疫組的抗體含量明顯高于對照組(p<0.01),第60天免疫組的抗體水平達到了最高值。以上結果表明:pCAGGS-HA,pCAGGS-HA1和pCAGGS-HA2三種重組質粒所形成的DNA疫苗能夠顯著刺激小鼠產生抗HA特異性抗體,但各免疫組之間差異不顯著。結果見圖1。

(2)血凝抑制試驗取6-8周齡BALB/c小鼠25只,雙側脛前肌注射,每只50μg疫苗成品,于免疫后10、20、30、40、50、60天分別進行小鼠眼眶取血,分離血清測HI抗體效價,觀察并記錄試驗結果。

在免疫后的第60天,所研制疫苗成品免疫的小鼠產生了針對A/PuertoRico/8/1934(H1N1)流感病毒和A/chicken/Hebei/4/2008(H9N2)病毒的HI抗體。從表中明顯可以看到三個免疫組之間的HI抗體效價是差異不顯著。而其他組的結果表明不具有血凝抑制活性。以上結果說明,疫苗成品能夠誘導產生HI抗體,結果見表1。

表1免疫后第60天小鼠血清的HI抗體檢測

(3)中和試驗取6-8周齡BALB/c小鼠25只,雙側脛前肌注射,每只50μg疫苗成品,于免疫后10、20、30、40、50、60天分別進行小鼠眼眶取血,分離血清進行中和試驗,觀察結果并記錄。

根據Reed-Muench法,可計算出pCAGGS-HA組、pCAGGS-HA1組、pCAGGS-HA2組對于A/PuertoRico/8/1934(H1N1)和A/chicken/Hebei/4/2008(H9N2)具有中和效價,pCAGGS空載體組和PBS對照組不具有中和作用。免疫組的小鼠免疫血清具有中和病毒所選病毒的能力。而對照組的小鼠血清卻不具有這樣的作用。試驗結果表明,上述設計的疫苗成品能夠引起機體的抗體保護應答,保護機體不會被異源甲型流感病毒(H1N1或H9N2)感染,其中pCAGGS-HA2組對異源流感病毒的交叉保護作用要稍優于其他兩組。結果見表2。

表2免疫后第60天小鼠血清中和試驗

(4)細胞因子(IL-4和IFN-γ)的檢測試驗

取6-8周齡BALB/c小鼠25只,雙側脛前肌注射,每只50μg疫苗成品,于免疫后10、20、30、40、50、60天分別進行小鼠眼眶取血,分離血清按IL-4和IFN-γ檢測試劑盒說明書進行檢測,評價這兩種DNA疫苗誘導的體液免疫和細胞免疫水平。

(5)疫苗保存期試驗將疫苗在-20℃下保存3、6、9、12、15個月時,分別進行物理性狀、安全性和免疫效力試驗。

(6)結論用流感病毒通用基因疫苗進行了小鼠血清的抗體消長規律試驗:酶聯免疫吸附試驗、血凝抑制試驗、血清中和試驗,及細胞因子(IL-4和IFN-γ)的檢測試驗、疫苗保存期試驗,結果均能誘導小鼠產生有效抗體效價。表明該疫苗用于免疫接種小鼠是安全的,并可以冷藏保存。

7.本發明的優點

指將編碼某種蛋白質抗原的重組真核表達載體直接注射到動物體內,使外源基因在活體內表達,產生的抗原激活機體的免疫系統,從而誘導特異性的體液免疫和細胞免疫應答。該疫苗既具有減毒疫苗的優點。同時又無逆轉的危險,因此越來越受到人們的重視,被看作是繼傳統疫苗及基因工程亞單位疫苗之后的第三代疫苗。

序列表

<110>青島農業大學

<120>一種流感病毒通用疫苗及其制備方法

<160>2

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>669

<212>DNA

<400>1

GGTCTATTTGGAGCCATTGCCGGTTTTATTGAAGGGGGATGGACTGGA

ATGATAGATGGATGGTATGGTTATCATCATCAGAATGAACAGGGATCA

GGCTATGCAGCGGATCAAAAAAGCACACAAAATGCCATTAACGGGAT

TACAAACAAGGTGAACACTGTTATCGAGAAAATGAACATTCAATTCAC

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AACTGTCGCCAGTTCACTGGTGCTTTTGGTCTCCCTGGGGGCAATCAGT

TTCTGGATGTGTTCTAATGGATCTTTGCAGTGCAGAATATGCATCTGA

669

<210>2

<211>23

<212>DNA

<400>2

ATCGATGGTCTATTTGGAGCCAT23

<210>3

<211>23

<212>DNA

<400>3

AGATCTGATGCATATTCTGCACT23

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