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MIR146A5P在非小細胞肺癌細胞系中的應用.pdf

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MIR146A5P 細胞 肺癌 細胞系 中的 應用
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摘要
申請專利號:

CN201410162140.9

申請日:

20140422

公開號:

CN103948941A

公開日:

20140730

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A61K48/00,A61P35/00 主分類號: A61K48/00,A61P35/00
申請人: 上海大學
發明人: 馬中良,金由辛,趙波濤,申雨晴,王強
地址: 200444 上海市寶山區上大路99號
優先權: CN201410162140A
專利代理機構: 上海上大專利事務所(普通合伙) 代理人: 陸聰明
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201410162140.9

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及miR-146a-5p在非小細胞肺癌細胞系中的應用。miR-146a-5p在非小細胞肺癌細胞以及一系列肺癌組織臨床樣本中特異低表達;在H1299、Spca-1細胞中,過表達的miR-146a-5p抑制細胞的增殖,同時抑制H1299細胞G1/S轉化,把細胞阻滯在G1期。實驗通過生物信息學分析,以及westernblotting等實驗驗證,確定Ccnd1、Ccnd2基因為miR-146a-5p的靶基因。本實驗首次證實Ccnd1、Ccnd1基因為miR-146a-5p的靶基因,該發明在臨床上為利用miRNA來診斷和治療非小細胞肺癌,以及提供藥物靶點方面提供了一定的應用價值。

權利要求書

1.miR-146a-5p在制備抑制非小細胞肺癌細胞系H1299細胞增殖藥物中的應用。2.miR-146a-5p在制備抑制非小細胞肺癌細胞系Spca-1細胞增殖藥物中的應用。3.miR-146a-5p在制備抑制非小細胞肺癌細胞系H1299細胞G1/S轉化藥物中的應用。

說明書

技術領域

本發明涉及一種miR-146a-5p在非小細胞肺癌細胞系中的應用。

背景技術

微RNA(microRNA,?miRNA)是真核生物中廣泛存在的一種長約18到25個核苷酸(nucleotide)的RNA分子,它們在維持正常細胞的功能方面起到重要的作用。miRNA的表達異常會導致包括肺癌,肝癌,肉瘤等癌癥在內的許多疾病的發生。研究發現,miRNA能在轉錄后水平調節其靶基因的表達,一般都是和靶基因3?-UTR或者5’-UTR直接結合,它們在人類癌癥的發病機理和預測中都有所涉及。值得注意的是,miRNA在血清中也穩定的存在,表明它們具有作為癌癥生物標記的潛在可能性。

肺癌是所有腫瘤中發病率、死亡率最高的腫瘤。我國每年新發肺癌患者70萬人,其中三分之二的患者初診時已失去手術機會。根據癌細胞的顯微鏡下組織學上的大小和外觀,肺癌主要分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌。其中,非小細胞肺癌占據了80%~85%之多。目前,miRNA在肺癌中的功能調控已成為研究的熱點。經過對已報導文獻的總結及在幾株非小細胞肺癌細胞系中的含量檢測,發現miR-146a-5p的表達量相比正常分肺組織細胞明顯降低,顯示了其潛在的抑癌作用。另外miR-146a-5p在肺癌細胞周期,甲基化過程以及細胞增殖過程中起到重要的調控作用,并且參與到多功能轉錄因子調控網絡中,成為非小細胞肺癌細胞系重要的調控因子。

發明內容

本發明的目的之一在于提供miR-146a-5p在制備抑制非小細胞肺癌細胞系H1299細胞增殖藥物中的應用。

本發明的目的之二在于提供miR-146a-5p在制備抑制非小細胞肺癌細胞系Spca-1細胞增殖藥物中的應用。

本發明的目的之三在于提供miR-146a-5p在制備抑制非小細胞肺癌細胞系H1299細胞G1/S轉化藥物中的應用。

1)??通過qRT-PCR手段,在正常的肺組織細胞系Beas-2B和不同的非小細胞肺癌細胞系H1299、Spca-1、H23、95-D、HCC827、A549中,檢測miR-146a-5p的表達量變化。發現,miR-146a-5p在Hcc827中的表達量最高,并且高于正常的肺組織細胞系Beas-2B。在其余細胞系中的表達量,均低于正常的肺組織細胞系Beas-2B一半以上。另外檢測了31組人肺癌組織樣本與相應的癌旁組織,發現有20組樣本中肺癌組織miR-146a-5p表達量明顯低于癌旁組織。

2)??將miR-146a-5p過表達后,檢測H1299、Spca-1細胞增殖和細胞周期的變化。在H1299、Spca-1細胞中轉染miR-146a-5p的mimics,通過CCK8和流式細胞周期分析手段發現,miR-146a-5p抑制H1299、Spca-1的細胞增殖,同時抑制H1299細胞G1/S轉化,把細胞阻滯在G1期。

3)??通過STARBASE(http://starbase.sysu.edu.cn/)預測,Ccnd1、Ccnd2的3′-UTR中有miR-146a-5p序列的結合位點。將Ccnd1、Ccnd2野生型3′-UTR以及含有種子序列突變的3′-UTR構建到pGL-3報告基因的下游,通過雙熒光素酶報告分析,發現帶有Ccnd1、Ccnd2野生型3′-UTR報告基因受到miR-146a-5p調控,而突變型不受miR-146a-5p調節。

4)??在H1299細胞中過表達miR-146a-5p,western?blotting結果證明Ccnd1、Ccnd2受到miR-146a-5p的下調。上述結果證實,Ccnd1、Ccnd2是miR-146a-5p的靶基因。

綜上所述,miR-146a-5p在非小細胞肺癌細胞系H1299、Spca-1、H23、95-D、A549中特異低表達。通過實驗證明,過表達miR-146a-5p能夠抑制細胞增殖,并抑制細胞周期中G1/S期轉化。同時,過表達miR-146a-5p在western?blotting等實驗中驗證Ccnd1、Ccnd2基因為miR-146a-5p的靶基因。本實驗首次證實Ccnd1、Ccnd1基因為miR-146a-5p的靶基因,該發現對肺癌發生機制研究及發展做出一定貢獻。

附圖說明

圖1為miR-146a-5p在Beas-2B、H1299、Spca-1、H23、95-D、Hcc827、A549??細胞中的表達量。

圖2為miR-146a-5p在31對肺癌組織臨床樣本中的表達量。結果顯示miR-146a-5p表達在肺癌細胞系及組織中明顯降低。

圖3為H1299細胞中分別轉染Negtive?control(NC)、miR-146a-5p?mimics,?連續4天CCK8法檢測細胞增殖。

圖4為Spca-1細胞中分別轉染NC、miR-146a-5p?mimics,?連續4天CCK8法檢測細胞增殖。

????miR-146a-5p抑制H1299、Spca-1細胞的增殖。

圖5?miR-146a-5p對H1299細胞周期影響

????H1299細胞中分別轉染NC、miR-146a-5p?mimics,?檢測細胞周期變化。

上述結果表明,miR-146a-5p能抑制G1/S轉化,G1期阻滯增加。

圖6?miR-146a-5p靶向作用于Ccnd1、Ccnd2的3′-UTR

(A)?miR-146a-5p與Ccnd1、Ccnd2野生型和突變型3′-UTR結合序列示意圖。

(B)?雙熒光報告分析。miR-146a-5p家族下調含有野生型3′-UTR的報告基因表達,而對含有突變型3′-UTR的報告基因表達沒有影響。

(C)?過表達miR-146a-5p下調H1299中Ccnd1、Ccnd2的蛋白水平。轉染miR-146a-5p的mimics,通過western?blotting檢測Ccnd1、Ccnd2的蛋白含量。

具體實施方式

)細胞系培養

????人正常肺上皮細胞BEAS-2B被培養在含有10%胎牛血清的LHC-8培養基中;非小細胞肺癌H1299、H23、95-D、HCC827細胞被培養在含有10%胎牛血清的1640培養基中;非小細胞肺癌A549、Spca-1細胞被培養在含有10%胎牛血清的DMEM培養基中。CO2培養箱中含有5%?CO2并且濕潤,溫度為37℃。

)qRT-PCR

細胞轉染所用的轉染試劑為lipo2000?(Invitrogen)。每孔接種的細胞數量盡量保持一致,并且細胞在各孔的表面平均分布。本實驗中每個轉染樣品設置了3個復孔。

用來檢測的儀器為Bio-Rad公司的iQ5系統,試劑為TaKaRa公司的SYBR?Green?Mix。這種試劑里面含有Taq?DNA聚合酶,dNTP?mix,SYBR?Green?dye。對miRNA的檢測以U6作為內參基因,對基因檢測以18?s為內參。本實驗所用到的qRT-PCR引物為:

miR146a-5p,Forward:5′-TGAGAACTGAATTCCATGGGTT-3′;?

???Reverse:?Uni-miR?qPCR?primer?(TaKaRa公司提供);

U6,Forward:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-?3′;

Reverse:?5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;

細胞總RNA的提取采用生工生物公司的Trizol試劑。具體提取步驟如下:?????

直接在培養板中加入Total?RNA?Extractor裂解細胞,每10?cm2面積加1?ml?Total?RNA?Extractor,用移液器吹打混勻。

將裂解后樣品或勻漿液室溫放置?5-10?min,使得核蛋白與核酸完全分離。

加入0.2?ml?氯仿,劇烈振蕩15?sec,室溫放置3?min。12,000?rpm?4℃離心10?min。

吸取水相轉移至干凈的離心管中,加入等體積異丙醇,混勻,室溫放置20?min。

12,000?rpm?4℃?離心10?min,棄上清。

加入1?ml?75%乙醇洗滌沉淀。12,000?rpm?4℃?離心3?min,棄上清。室溫干燥5-10?min。

加入30-50ml?RNase-free?ddH2O,充分溶解RNA。將所得到的RNA溶液置于-70℃保存或用于后續試驗。

反轉錄PCR采用Takara公司?One?Step?PrimeScript?miRNA?cDNA?Synthesis?Kit。由于miRNA與mRNA不同,miRNA不具有Poly(A)結構,但在本轉錄試劑盒中可以同時對樣品中的miRNA以及它的small?noncoding?RNA進行Poly(A)加尾反應,然后利用Universal?Adaptor?Primer將經過加尾的RNA以及mRNA進行反轉錄反應得到的cDNA,并引入了Uni-miR?qPCR?Primer的結合位點,利用這一位置可以對樣品中任何cDNA進行定量PCR反應。

)轉染

轉染步驟如下:

轉染前一天,接種適當數量的細胞至培養板中,每孔加入不含抗生素的培養基,使轉染時的細胞密度能夠達到50%。

準備mimic-lipo2000混合液:a.稀釋miRNA?mimic:用50?μl不含血清培養基Opti-MEM稀釋miRNA?mimics,使加入細胞中的終濃度為60?nmol/L輕輕混勻,室溫孵育5?min;b.稀釋lipo2000:用50?μl不含血清的Opti-MEM稀釋1μl?lipo2000,輕輕混勻并室溫孵育5?min;c.將a與b輕輕混勻,室溫孵育20?min。

將miRNA-mimics-lipo?2000混合液加入含有細胞及培養液的培養孔中,輕輕混勻;

將培養板置于37?℃的CO2培養箱中。培養4h后,將孔里含有mimics-lipo2000混合液的培養基移去,更換新鮮培養基。

)CCK8

將H1299、Spca-1細胞均勻地鋪在96孔板中,每個樣品三次重復。24?h后轉染miR-146a-5p的mimics。24?h后,開始用CCK8法檢測細胞的活力,每隔24?h測量一次,檢測波長為450?nm。

)細胞周期檢測

將H1299細胞均勻地鋪在6孔板中,每個樣品三次重復。24?h后轉染miR-146a-5p的mimics。48?h后收集細胞。用PBS洗兩次,70%乙醇固定4℃過夜。PBS洗一次,50?mg/ml的RNase消化1?h,室溫。50?mg/ml?PI?染色30?min,4℃,用流式細胞儀檢測。

)Western?Bloting

將H1299細胞均勻地鋪在6孔板中,每個樣品三次重復。24h后轉染miR-146a-5p的mimics。48h后收集、裂解細胞,并定量各樣品中的蛋白含量。定量蛋白采用Lowry法。用Ccnd1、Ccnd2的多抗進行檢測。該抗體為Cell?Sigal公司生產。本實驗采用12%?SDS-PAGE膠進行蛋白電泳后,將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上。轉膜緩沖液和膜清洗液的配制均參照分子克隆。Ccnd1、Ccnd2蛋白的抗體按照1:800稀釋,Gapdh蛋白的抗體按照1:1000稀釋。所采用的二抗帶有HRP標記,按照1:10000稀釋。用Milipore的化學發光劑顯色。

盡管本發明描述了具體的實驗方案,但是有一點對于本領域技術人員來說是明顯的,即在不脫離本發明的精神和范圍的前提下可對本發明作各種變化和改動。因此,所附權利要求覆蓋了所有這些在本發明范圍內的變動。?

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