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一種白花蛇舌草的組織培養方法.pdf

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一種 白花蛇舌草 組織培養 方法
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摘要
申請專利號:

CN201711084223.0

申請日:

20171107

公開號:

CN108243951A

公開日:

20180706

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01H4/00 主分類號: A01H4/00
申請人: 中國計量大學
發明人: 鄒克琴,李素芳,林麗
地址: 310018 浙江省杭州市下沙高教區學源街258號
優先權: CN201711084223A
專利代理機構: 浙江永鼎律師事務所 代理人: 陸永強
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201711084223.0

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種白花蛇舌草的組織培養方法,使得在短期內可以獲得大量的優質白花蛇舌草種苗,滿足市場的需要;所述方法包括無菌材料的獲得及芽誘導培養、芽的增殖、生根和生根苗移栽等步驟;本發明以腋芽為外植體,對培養基進行了改良,添加了酸水解酪蛋白,大大提高了分化率,克服了白花蛇舌草繁殖周期長、繁殖系數低、易感染和傳播病毒等缺點;用該方法生產出來的組培苗具有病毒少、遺傳性穩定等優點。

權利要求書

1.一種白花蛇舌草(Hedyotisdiffusa)組織培養方法,其特征在于所述方法按如下步驟進行:(1)無菌材料的獲得及誘導培養:切取長勢良好、無病蟲害的白花蛇舌草的腋芽,用自來水沖洗30~60min,然后在體積濃度為1%洗潔精的水溶液中振搖2~5min,用無菌水沖凈;在超凈工作臺上用體積濃度70~75%乙醇水溶液浸泡30~60s,然后用混合消毒液浸泡10~20min,再用無菌水沖洗3~5遍;在滅菌的濾紙上吸干水分,然后將腋芽接種到裝叢生芽誘導培養基的培養瓶中,蓋上瓶蓋并用封口膜封住瓶口,置于培養箱中,在24~26℃,光照1500~2500lx條件下培養15~25天;所述混合消毒液為體積比1:200的吐溫20和84消毒液的混合液;所述叢生芽誘導培養基為添加6-BA0.5~2.0mg/L、2,4-D0.5~1.5mg/L、NAA0.05~0.5mg/L和酸水解酪蛋白0.2~0.6g/L的MS基本培養基;(2)芽的增殖:觀察步驟(1)所述24~26℃,光照1500~2500lx條件下培養5~15天后,腋芽切口部位出現綠色突起,20~40天后出現叢生芽,再培養10~20天,當叢生芽長到2~4cm時,將叢生芽切下轉接到芽增殖培養基中,在24~26℃,光照1500~2500lx條件下進行增殖培養,獲得叢生苗;所述芽增殖培養基為添加6-BA0.5~2.0mg/L、2,4-D0.5~1.5mg/L、NAA0.05~0.2mg/L、酸水解酪蛋白0.2~0.6g/L和脯氨酸200~600mg/L的MS基本培養基;(3)生根培養:將分化的叢生苗從基部切下,插入生根培養基中培養至芽生根,所述的生根培養基為改良的1/2MS培養基中加入0.05mg/L~0.15mg/L的NAA,0.2~0.5g/L的酸水解酪蛋白;(4)生根苗移栽:待小苗葉片舒展,葉色濃綠,苗高3-5cm時,打開瓶蓋煉苗2~4天后,將小苗植株上的瓊脂和雜物洗凈,移栽至消毒后的育苗基質上,澆透水,蓋上薄膜,保持濕度80%以上,置通風陰涼處,在24~26℃、光照1500~2500lx條件下培養8~12d;所述育苗基質為細沙、腐殖土與谷糠灰按照質量比5:3:2的比例配制而成,所述育苗基質的消毒方法為:采用體積濃度0.5%福爾馬林水溶液均勻噴灑基質,塑料薄膜覆蓋3~5天后揭開薄膜再曝曬基質1~3天,完成對育苗基質的消毒,或者采用體積濃度0.5%福爾馬林水溶液均勻噴灑基質,塑料薄膜覆蓋3~5天后揭開薄膜再在60℃下干燥2天,完成對育苗基質的消毒。2.如權利要求1所述白花蛇舌草組織培養方法,其特征在于步驟(1)所述叢生芽誘導培養基為添加6-BA1.0mg/L、2,4-D1.0mg/L、NAA0.2mg/L和酸水解酪蛋白0.4g/L的MS基本培養基。3.如權利要求1所述白花蛇舌草組織培養方法,其特征在于步驟(2)所述的芽增殖培養基為添加6-BA1.0mg/L、2,4-D1.0mg/L、NAA0.1mg/L、酸水解酪蛋白0.4g/L和脯氨酸400mg/L的MS基本培養基。4.如權利要求1所述白花蛇舌草組織培養方法,其特征在于步驟(3)所述的生根培養基為改良的1/2MS培養基中加入0.1mg/L的NAA,0.3g/L的的酸水解酪蛋白。5.如權利要求1所述白花蛇舌草組織培養方法,其特征在于所述生根培養的改良的1/2MS培養基是指將大量元素、微量元素和鐵鹽的含量均降低為1/2的含量,不添加有機物,即終濃度組成為:NHNO0.83克、KNO0.95克、CaCl·2HO0.22克、MgSO·7HO0.19克、KHPO0.09克、KI0.42毫克、HBO3.1毫克、MnSO·4HO11.2毫克、ZnSO·7HO4.3毫克、NaMoO·2HO0.13毫克、CuSO·5HO0.013毫克、CoCl·6HO0.013毫克、NaEDTA18.7毫克、FeSO·7HO13.9毫克、蔗糖30克/升、瓊脂粉9克/升,溶劑為水,pH為5.6~6.0。6.如權利要求1所述白花蛇舌草組織培養方法,其特征在于所述的MS基本培養基終濃度組成為:NHNO1.65克/升、KNO1.9克/升、CaCl·2HO0.44克/升、MgSO·7HO0.37克/升、KHPO0.17克/升、KI0.83毫克/升、HBO6.2毫克/升、MnSO·4HO22.3毫克/升、ZnSO·7HO8.6毫克/升、NaMoO·2HO0.25毫克/升、CuSO·5HO0.025毫克/升、CoCl·6HO0.025毫克/升、NaEDTA37.25毫克/升、FeSO·7HO27.85毫克/升、肌醇100毫克/升、甘氨酸2毫克/升、鹽酸硫胺素0.1毫克/升、鹽酸吡哆醇0.5毫克/升、煙酸0.5毫克/升、蔗糖20~40克/升、瓊脂粉7~11克/升,溶劑為水,pH為5.6~6.0。

說明書

(一)技術領域

本發明涉及植物組織培養技術領域,尤其涉及一種白花蛇舌草的組織培養和快速繁苗方法。通過這種方法,可以進行優良種苗規模生產。

(二)背景技術

白花蛇舌草(Hedyotis diffusa)是茜草科一年生草本植物,高 15-50cm。莖細長,白花。莖光滑無毛。其廣泛分布于福建、廣東、廣西、云南、浙江、江蘇、安徽等省區。白花蛇舌草中含有蒽醌類化合物和環烯醚苷萜類化合物,同時還含有具有免疫活性的多糖類化合物。其主要功效是清熱解毒、消痛散結、利尿除濕。民間常用此草藥內服治療扁桃體炎、咽喉炎、闌尾炎、肝炎、痢疾、尿路感染、小兒疳積等。它也有增強非特異性免疫的作用,是重要的抗癌植物,臨床上用于治療多種惡性腫瘤。

由于市場對白花蛇舌草的需求用量不斷增大,而野生資源卻在逐漸減少,雖然可以種子繁殖,但是種子繁殖顆粒太小,難以大量繁殖,另外種子繁殖周期長,容易受季節和地區限制,嚴重影響的白花蛇舌草的開發利用。白花蛇舌草在種子繁殖過程中也容易引起變異,種植過程中易感染病毒,并且世代相傳,逐年加重。病毒病易導致病毒的感染和傳播,致使其品種退化嚴重。目前白花蛇舌草的繁殖主要采用播種繁殖,繁殖時間長,繁殖系數低,無法滿足生產和市場需求。許多白花蛇舌草的優良品種資源得不到利用,直接影響了其藥用的產量和質量,使白花蛇舌草的經濟效益受到一定影響。

生物技術的快速發展,特別是植物組織和細胞培養技術,為白花蛇舌草的快速繁殖育種研究提供了重要基礎。因此,發明一種快速高效的白花蛇舌草繁殖方法是非常必要的。

目前國內外對白花蛇舌草的組織培養也有研究報道(白花蛇舌草組織培養研究,巢建國等,南京中醫藥大學學報,2005年,21卷第6期369-370 頁;一種白花蛇舌草莖段成苗的快速繁殖方法,中國,公開號 201510757407.3)。但是這些文獻均采用了對環境具有極大危害的升汞作為消毒劑,培養過程經過了愈傷組織誘導的過程,增加了愈傷組織分化過程中繼代增殖造成種苗變異的風險,無法保證其性狀的穩定性,降低了種苗的品質和質量。本發明是以白花蛇舌草的腋芽為外植體,以繁芽的方式直接誘導分化不定芽。通過這種途徑獲得的不定芽無愈傷組織的產生,能有效避免繼代增殖過程中出現的變異,更好地保持母株原有的優良性狀。

(三)發明內容

本發明目的是提供一種白花蛇舌草的組織培養和離體快速繁殖的方法,使得在短期內可以獲得大量的優質白花蛇舌草種苗,滿足市場的需要。

本發明采用的技術方案是:

一種白花蛇舌草組織培養方法,所述方法按如下步驟進行:

(1)無菌材料的獲得及誘導培養:切取長勢良好、無病蟲害的白花蛇舌草幼嫩的腋芽,用自來水沖洗30~60min,然后在體積濃度為1%洗潔精(體積比w/w)的水溶液中振搖2~5min,用無菌水沖凈;在超凈工作臺上用體積濃度70~75%乙醇水溶液浸泡30~60s,然后用混合消毒液浸泡10~20min,再用無菌水沖洗3~5遍;在滅菌的濾紙上吸干水分,然后將腋芽接種到裝叢生芽誘導培養基的培養瓶中,蓋上瓶蓋并用封口膜封住瓶口,置于培養箱中,在24~26℃,光照1500~2500lx條件下培養 15~25天;所述混合消毒液為體積比1:200的吐溫20和84消毒液的混合液;所述叢生芽誘導培養基為添加6-BA(即6-芐氨基腺嘌呤)0.5~ 2.0mg/L、2,4-D(即2,4-二氯苯氧基乙酸)0.5~1.5mg/L、NAA(即萘乙酸)0.05~0.5mg/L和酸水解酪蛋白0.2~0.6g/L的MS基本培養基;

(2)芽的增殖:觀察步驟(1)所述24~26℃,光照1500~2500lx 條件下培養15~25天后的腋芽切口出現綠色突起,20~40天后出現叢生芽,再培養10~20天,當叢生芽長到2~4cm時,將不定芽切下轉接到芽增殖培養基中,在24~26℃,光照1500~2500lx條件下進行增殖培養,獲得叢生苗;所述芽增殖培養基為添加6-BA 0.5~2.0mg/L、2,4-D 0.5~ 1.5mg/L、NAA 0.05~0.2mg/L、酸水解酪蛋白0.2~0.6g/L和脯氨酸200~ 600mg/L的MS基本培養基;

(3)生根培養:將分化的叢生苗從基部切下,插入生根培養基中培養至芽生根,所述的生根培養基為改良的1/2MS培養基中加入0.05mg/L~ 0.15mg/L的NAA,0.2~0.5g/L的酸水解酪蛋白;

(4)生根苗的移栽:待小苗葉片舒展,葉色濃綠,苗高3-5cm左右打開瓶蓋煉苗2-4d即可進行移栽。移栽前將植株上的瓊脂和雜物洗凈,移栽與經0.1%高錳酸鉀消毒過的育苗基質上,澆透定根水,蓋上薄膜,保持濕度80%以上,置通風陰涼處,在24~26℃、光照1500~2500lx條件下培養,并定期進行噴藥預防病蟲害的發生。所述移栽基質為細沙、腐殖土與谷糠灰按照質量比5:3:2的比例配置而成,所述移栽基質的消毒方法為:采用體積濃度0.5%福爾馬林水溶液均勻噴灑基質,塑料薄膜覆蓋3~5天后揭開薄膜再曝曬基質1~3天,完成對移栽基質的消毒,或者采用體積濃度0.5%福爾馬林水溶液均勻噴灑基質,塑料薄膜覆蓋3~5天后揭開薄膜再在60℃下干燥2天,完成對移栽基質的消毒。

進一步,步驟(1)所述叢生芽誘導培養基為添加6-BA 1.0mg/L、2, 4-D 1.0mg/L、NAA 0.2mg/L和酸水解酪蛋白0.4g/L的MS基本培養基。

進一步,步驟(2)所述的芽增殖培養基為添加6-BA1.0mg/L、2,4-D 1.0mg/L、NAA0.1mg/L、酸水解酪蛋白0.4g/L和脯氨酸400mg/L的MS基本培養基。

進一步,步驟(3)所述的生根培養基為改良的1/2MS培養基中加入 0.1mg/L的NAA,0.3g/L的的酸水解酪蛋白。

進一步,所述的MS基本培養基終濃度組成為:NH4NO3 1.65克/升、 KNO3 1.9克/升、CaCl2·2H2O 0.44克/升、MgSO4·7H2O 0.37克/升、KH2PO4 0.17克/升、KI 0.83毫克/升、H3BO3 6.2毫克/升、MnSO4·4H2O 22.3毫克/ 升、ZnSO4·7H2O 8.6毫克/升、Na2MoO4·2H2O 0.25毫克/升、CuSO4·5H2O 0.025毫克/升、CoCl2·6H2O 0.025毫克/升、Na2EDTA 37.3毫克/升、 FeSO4·7H2O 27.8毫克/升、肌醇100毫克/升、甘氨酸2毫克/升、鹽酸硫胺素0.1毫克/升、鹽酸吡哆醇0.5毫克/升、煙酸0.5毫克/升、蔗糖20~40克/ 升、瓊脂粉7~11克/升,溶劑為水,pH為5.6~6.0。

本發明所述MS基本培養基包含大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物、蔗糖和瓊脂粉。所述大量元素組成是在配置1升(1000毫升)培養基時,加硝酸銨NH4NO3 1.65克、硝酸鉀(KNO3)1.9克、氯化鈣(CaCl2·2H2O) 0.44克、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.37克、磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.17 克。所述微量元素組成是在配置1升(1000毫升)培養基時,加碘化鉀(KI) 0.83毫克、硼酸(H3BO3)6.2毫克、硫酸錳(MnSO4·4H2O)22.3毫克、硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)8.6毫克、鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)0.25毫克、硫酸銅(CuSO4·5H2O)0.025毫克、氯化鈷(CoCl2·6H2O)0.025毫克。所述鐵鹽元素組成是在配置1升(1000毫升)培養基時,加乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)37.3毫克,硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)27.8毫克。所述有機物組成是在配置1升(1000毫升)培養基時,加肌醇100毫克、甘氨酸 2毫克、鹽酸硫胺素(VB1)0.1毫克,鹽酸吡哆醇(VB6)0.5毫克,煙酸 (VB5)0.5毫克。蔗糖濃度是20~40克/升,瓊脂粉濃度是7~11克/升,溶劑為水,pH為5.6~6.0。

更進一步,本發明所述一種白花蛇舌草組織培養方法推薦按照以下步驟進行:

(1)無菌材料的獲得及誘導培養:切取長勢良好、無病蟲害的白花蛇舌草的腋芽,用自來水沖洗45min,然后在體積濃度為1%洗潔精(體積比w/w)的水溶液中振搖3min,用無菌水沖凈;在超凈工作臺上用體積濃度70%乙醇水溶液浸泡45s,然后用混合消毒液浸泡15min,再用無菌水沖洗4遍;在滅菌的濾紙上吸干水分,然后將腋芽接種到裝叢生芽誘導培養基的培養瓶中,蓋上瓶蓋并用封口膜封住瓶口,置于培養箱中,在 25℃,光照2000lx條件下培養20天;所述混合消毒液為體積比1:200 的吐溫20和84消毒液的混合液;所述叢生芽誘導培養基為添加6-BA 1.0mg/L、2,4-D 1.0mg/L、NAA 0.2mg/L和酸水解酪蛋白0.4g/L的MS 基本培養基,MS基本培養基中蔗糖30g/L、瓊脂粉9g/L、溶劑為水,pH5.8。

(2)芽的增殖:觀察步驟(1)所述25℃,光照2000lx條件下培養 20天后,切口部位出現綠色突起,30天后出現叢生芽,再培養15天,當叢生芽長到3cm時,將叢生芽切下轉接到芽增殖培養基中,在25℃,光照2000lx條件下進行增殖培養,獲得叢生苗;所述芽增殖培養基為添加 6-BA 1.0mg/L、2,4-D 1.0mg/L、NAA 0.1mg/L、酸水解酪蛋白0.4g/L和脯氨酸400mg/L的MS基本培養基。

(3)生根培養:將分化的叢生苗從基部切下,插入生根培養基中培養至芽生根;所述的生根培養基為改良的1/2MS培養基中加入0.1mg/L 的NAA和0.3g/L的酸水解酪蛋白。

(4)生根苗的移栽:待小苗葉片舒展,葉色濃綠,苗高4cm左右打開瓶蓋煉苗3d即可進行移栽。移栽前將植株上的瓊脂和雜物洗凈,移栽與經0.1%高錳酸鉀消毒過的育苗基質上,澆透定根水,蓋上薄膜,保持濕度80%以上,置通風陰涼處,在25℃、光照2000lx條件下培養,并定期進行噴藥預防病蟲害的發生。所述移栽基質為細沙、腐殖土與谷糠灰按照質量比5:3:2的比例配置而成,所述移栽基質的消毒方法為:采用體積濃度0.5%福爾馬林水溶液均勻噴灑基質,塑料薄膜覆蓋4天后揭開薄膜再曝曬基質2天,完成對移栽基質的消毒,或者采用體積濃度0.5%福爾馬林水溶液均勻噴灑基質,塑料薄膜覆蓋4天后揭開薄膜再在60℃下干燥2天,完成對移栽基質的消毒。

本發明所述白花蛇舌草的腋芽選自浙江臨安天目山的長勢良好、無病蟲害的白花蛇舌草植株。

本發明所述改良的1/2MS培養基是指將傳統1/2MS基本培養基進行改良,傳統1/2MS是僅僅將大量元素減半,微量元素、有機物和鐵鹽的含量均不變,而本發明中改良的1/2MS不但其中大量元素減半,而且微量元素和鐵鹽的含量均降低為1/2的含量,不添加有機物,取消的有機物包含有肌醇、甘氨酸、鹽酸硫胺素(VB1)、鹽酸吡哆醇(VB6)、煙酸(VB5) 等。即終濃度組成為:硝酸銨NH4NO3 0.83克、硝酸鉀(KNO3)0.95克、氯化鈣(CaCl2·2H2O)0.22克、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.19克、磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.09克、碘化鉀(KI)0.42毫克、硼酸(H3BO3)3.1 毫克、硫酸錳(MnSO4·4H2O)11.2毫克、硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)4.3 毫克、鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)0.13毫克、硫酸銅(CuSO4·5H2O)0.013 毫克、氯化鈷(CoCl2·6H2O)0.013毫克、乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA) 18.7毫克、硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)13.9毫克、蔗糖20~40克/升、瓊脂粉7~11克/升,溶劑為水,pH為5.6~6.0。

本發明所述洗潔精為浙江傳化洗潔精,作為清洗劑使用時通常以體積比1:100添加水。本發明所述封口膜購自山東青島普朗特生物有限公司。

與現有技術相比,本發明的有益效果主要體現在:

(1)以腋芽為外植體,應用組織培養的方法進行快速繁殖,克服了白花蛇舌草利用傳統種子繁殖而繁殖周期長、繁殖系數低、易感染和傳播病毒等缺點;用該方法生產出來的組培苗具有病毒少、遺傳性穩定等優點。

(2)改進外植體消毒方法:用毒性小并且易降解的84消毒液代替傳統的不可降解的氯化汞消毒劑;氯化汞屬于重金屬有極大的腐蝕性,并含有劇毒;長期接觸更可能引起皮膚過敏或腎病綜合癥,進入環境對人類食物鏈也有相當大的破壞性,采用84消毒液對生態環境更安全環保;質量濃度0.1%HgCl2消毒對芽的誘導率低而且外植體有發褐現象,芽的生長也比較慢,而混合消毒液雖然污染率與0.1%HgCl2污染率均為10%,但是對細胞毒害最小,芽生長也快。。

(3)對培養基進行了改良,添加了酸水解酪蛋白營養因子。酸水解酪蛋白不但在白花蛇舌草的組織培養中有抗褐化作用,還具有增加營養促進分化,避免愈傷組織產生的作用。當在培養基中同時添加脯氨酸,其活性因子與酸水解酪蛋白協同作用大大提高了白花蛇舌草的芽分化和增殖率,增殖率可以達到730%,增殖倍數達到8.3。

(4)對生根的傳統1/2MS進行了改良,傳統1/2MS是僅僅將大量元素減半,微量元素和鐵鹽的含量均不變,而本發明中改良的1/2MS不但其中大量元素減半,而且微量元素和鐵鹽的含量均降低為1/2的含量,取消了傳統1/2MS中的有機物,取消的有機物包括肌醇、甘氨酸、鹽酸硫胺素(VB1)、鹽酸吡哆醇(VB6)、煙酸(VB5)等,大大節約了組織培養工廠化育苗生根成本;而在生根培養基中添加酸水解酪蛋白后,不但抑制了褐化,而且促進了生根,生根率100%,根系粗壯。

(5)改進了組培程序,本方法獲得的白花蛇舌草不定芽分化和誘導過程,不經愈傷組織脫分化,直接以腋芽誘導無菌芽,比通過葉片和莖段為外植體先獲得愈傷組織,再從愈傷組織獲得的無菌芽材料更快,更容易,而且能有效避免繼代增殖過程中造成的種苗變異,提高了其性狀的穩定性,保證了種苗的品質和質量,有利于種質資源保存和生產利用,可有效解決白花蛇舌草的優質種苗的供應問題。

(四)具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述,但本發明的保護范圍并不僅限于此:

本發明所述MS基本培養基包含大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物、蔗糖和瓊脂粉。所述大量元素組成是在配置1升(1000毫升)培養基時,加硝酸銨NH4NO3 1.65克、硝酸鉀(KNO3)1.9克、氯化鈣(CaCl2·2H2O) 0.44克、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.37克、磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.17 克。所述微量元素組成是在配置1升(1000毫升)培養基時,加碘化鉀(KI) 0.83毫克、硼酸(H3BO3)6.2毫克、硫酸錳(MnSO4·4H2O)22.3毫克、硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)8.6毫克、鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)0.25毫克、硫酸銅(CuSO4·5H2O)0.025毫克、氯化鈷(CoCl2·6H2O)0.025毫克。所述鐵鹽元素組成是在配置1升(1000毫升)培養基時,加乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)37.3毫克,硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)27.8毫克。所述有機物組成是在配置1升(1000毫升)培養基時,加肌醇100毫克、甘氨酸 2毫克、鹽酸硫胺素(VB1)0.1毫克,鹽酸吡哆醇(VB6)0.5毫克,煙酸 (VB5)0.5毫克;蔗糖20~40克/升、瓊脂粉7~11克/升,溶劑為水,pH 為5.6~6.0。

本發明所述改良的1/2MS培養基是指將傳統1/2MS培養基進行改良,傳統1/2MS是僅僅將大量元素減半,微量元素、有機物和鐵鹽的含量均不變,而本發明中改良的1/2MS不但其中大量元素減半,而且微量元素和鐵鹽的含量均降低為1/2的含量,不添加有機物,取消的有機物包含肌醇、甘氨酸、鹽酸硫胺素(VB1)、鹽酸吡哆醇(VB6)、煙酸(VB5) 等。即終濃度組成為:硝酸銨NH4NO3 0.83克、硝酸鉀(KNO3)0.95克、氯化鈣(CaCl2·2H2O)0.22克、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.19克、磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.09克、碘化鉀(KI)0.42毫克、硼酸(H3BO3) 3.1毫克、硫酸錳(MnSO4·4H2O)11.2毫克、硫酸鋅(ZnSO4·7H2O) 4.3毫克、鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)0.13毫克、硫酸銅(CuSO4·5H2O) 0.013毫克、氯化鈷(CoCl2·6H2O)0.013毫克、乙二胺四乙酸二鈉 (Na2EDTA)18.7毫克、硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)13.9毫克、蔗糖20~ 40克/升、瓊脂粉7~11克/升,溶劑為水,pH為5.6~6.0。

本發明所述洗潔精為浙江傳化洗潔精。

本發明所述封口膜購自山東青島普朗特生物有限公司。

實施例1

(1)無菌材料的獲得及誘導培養:切取長勢良好、無病蟲害的白花蛇舌草的腋芽,用自來水沖洗30min,然后在體積濃度為1%洗潔精(體積比w/w)的水溶液中振搖2min,用無菌水沖凈;在超凈工作臺上用體積濃度70%乙醇水溶液浸泡30s,然后用混合消毒液浸泡10min,再用無菌水沖洗3遍;在滅菌的濾紙上吸干水分,然后將腋芽接種到裝叢生芽誘導培養基的培養瓶中,蓋上瓶蓋并用封口膜封住瓶口,置于培養箱中,在 24℃,光照1500lx條件下培養15天;所述混合消毒液為體積比1:200 的吐溫20和84消毒液的混合液;所述叢生芽誘導培養基為添加6-BA(即 6-芐氨基腺嘌呤)0.5mg/L、2,4-D(即2,4-二氯苯氧基乙酸)0.5mg/L、 NAA(即萘乙酸)0.05mg/L和酸水解酪蛋白0.2g/L的MS基本培養基; MS基本培養基中蔗糖20g/L、瓊脂粉7g/L、溶劑為水,pH5.6。

(2)芽的增殖:觀察步驟(1)所述24℃,光照1500lx條件下培養15天后的腋芽材料切口出現綠色突起,20天后出現叢生芽,再培養10 天,當叢生芽長到2cm時,將不定芽切下轉接到芽增殖培養基中,在24℃,光照1500lx條件下進行增殖培養,獲得叢生苗;所述芽增殖培養基為添加6-BA 0.5mg/L、2,4-D 0.5mg/L、NAA0.05mg/L、酸水解酪蛋白0.2g/L 和脯氨酸200mg/L的MS基本培養基。

(3)生根培養:將分化的叢生苗從基部切下,插入生根培養基中培養至芽生根;所述的生根培養基為改良的1/2MS培養基中加入0.05mg/L 的NAA,0.2g/L的酸水解酪蛋白。

(4)生根苗的移栽:待小苗葉片舒展,葉色濃綠,苗高3cm左右打開瓶蓋煉苗2d即可進行移栽。移栽前將植株上的瓊脂和雜物洗凈,移栽與經0.1%高錳酸鉀消毒過的育苗基質上,澆透定根水,蓋上薄膜,保持濕度80%以上,置通風陰涼處,在24℃、光照1500lx條件下培養,并定期進行噴藥預防病蟲害的發生。所述移栽基質為細沙、腐殖土與谷糠灰按照質量比5:3:2的比例配置而成,所述移栽基質的消毒方法為:采用體積濃度0.5%福爾馬林水溶液均勻噴灑基質,塑料薄膜覆蓋3天后揭開薄膜再曝曬基質1天,完成對移栽基質的消毒,或者采用體積濃度0.5%福爾馬林水溶液均勻噴灑基質,塑料薄膜覆蓋3天后揭開薄膜再在60℃下干燥2天,完成對移栽基質的消毒。

實施例2不同的消毒劑對白花蛇舌草外植體生長的影響

分別用質量濃度10%的過氧化氫(H2O2)水溶液、質量濃度0.1%的氯化汞(HgCl2)水溶液以及實施例1中的混合消毒液(即體積比1:200 的吐溫20和84消毒液)對白花蛇舌草的外植體材料(即腋芽)進行消毒,其它操作同實施例1。分別將腋芽接種到裝有叢生芽誘導培養基的培養瓶中,封口膜封住瓶口后,置于培養箱中。在24℃,光照1500lx條件下進行培養10天后,觀察統計不同消毒劑對白花蛇舌草芽誘導和生長的影響,結果見表1所示。結果表明,混合消毒液和質量濃度0.1%HgCl2的消毒效果基本相同,質量濃度10%的過氧化氫消毒效果稍差,污染率達到30%,生長緩慢。但是質量濃度0.1%HgCl2消毒對芽的誘導有影響,芽誘導率低而且外植體有發褐現象,芽的生長也比較慢,可能是HgCl2毒害細胞對芽的誘導有一定的影響,而混合消毒液雖然污染率與0.1%HgCl2污染率均為 10%,對細胞毒害最小,生長也快。

表1不同的消毒劑對白花蛇舌草外植體生長的影響

實施例3不同激素組合對白花蛇舌草芽的誘導影響

將白花蛇舌草腋芽分別接種在添加了不同濃度6-BA、2,4-D和NAA 的MS基本培養基中,其它操作同實施例1,白花蛇舌草不定芽生長結果見表2所示。結果表明,不同激素組合的培養基均可以不同程度地誘導芽的形成。其中以培養基MS+6-BA1.0mg/L+2,4-D 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+0.4g/L酸水解酪蛋白為最佳,誘導出的再生芽最多,生長快,平均芽長2.55cm,芽誘導率達76%,苗大而健壯,無玻璃化苗現象,而且很少產生愈傷組織,而不添加酸水解酪蛋白的培養基切口部位均呈現不同程度的褐化。

其中芽誘導率=總芽數/接種芽數×100%

表2不同激素組合對白花蛇舌草的芽誘導影響

實施例4酸水解酪蛋白和脯氨酸對白花蛇舌草芽增殖的影響

將白花蛇舌草的叢生芽分別接種到添加了不同濃度酸水解酪蛋白和 脯氨酸的芽增殖培養基中,其它操作同實施例1,酸水解酪蛋白和脯氨酸 對白花蛇舌草芽增殖的影響結果如表3所示。結果發現,白花蛇舌草不定 芽在未添加酸水解酪蛋白和脯氨酸的培養基中,均呈現芽增殖分化率低, 組織褐化,不定芽增殖少,生長慢的現象,即使在優化的增殖培養基 MS+6-BA 1.0mg/L+2,4-D 1.0mg/L+NAA0.1mg/L中,未添加酸水解酪蛋 白和脯氨酸時,白花蛇舌草不定芽雖然也有增殖,但是褐化嚴重。單獨添 加酸水解酪蛋白0.4~0.6g/L,能改善褐化的狀態,而單獨添加脯氨酸200~600mg/L均能促進芽生長分化。在優化的芽增殖培養基MS+6-BA 1.0mg/L+2,4-D 1.0mg/L+NAA0.1mg/L中添加0.4g/L的酸水解酪蛋白和 400mg/L脯氨酸,增殖率可以達到730%,增殖倍數達到8.3,苗較大,葉 綠色,健壯而且增殖多。

其中增殖率=(總芽數-接種芽數)/接種芽數×100%

增殖倍數=總芽數/接種芽數

表3酸水解酪蛋白和脯氨酸對白花蛇舌草芽增殖的影響

實施例5酸水解酪蛋白對白花蛇舌草生根的影響

將白花蛇舌草的叢生芽分別接種到添加了不同濃度酸水解酪蛋白的 生根培養基中,其它操作同實施例1,酸水解酪蛋白對白花蛇舌草芽生根 的影響結果如表4所示。結果發現,白花蛇舌草不定芽在未添加酸水解酪 蛋白的生根培養基中,生根少,有褐化現象,在添加酸水解酪蛋白的生根 培養基中,促進生根,生根啟動天數均縮短,無褐化現象,而且根系粗壯。 其中酸水解酪蛋白的添加濃度為0.3g/L,對抑制褐化和生根效果較好,生 根率可以達到100%,在第4天就啟動生根。

生根率=生根苗數/接種數×100%

表4酸水解酪蛋白對白花蛇舌草芽生根的影響

實施例6

(1)無菌材料的獲得及誘導培養:切取長勢良好、無病蟲害的白花蛇舌草的腋芽,用自來水沖洗45min,然后在體積濃度為1%洗潔精(體積比w/w)的水溶液中振搖3min,用無菌水沖凈;在超凈工作臺上用體積濃度70%乙醇水溶液浸泡45s,然后用混合消毒液浸泡15min,再用無菌水沖洗4遍;在滅菌的濾紙上吸干水分,然后將腋芽接種到裝叢生芽誘導培養基的培養瓶中,蓋上瓶蓋并用封口膜封住瓶口,置于培養箱中,在 25℃,光照2000lx條件下培養20天;所述混合消毒液為體積比1:200 的吐溫20和84消毒液的混合液;所述叢生芽誘導培養基為添加6-BA 1.0mg/L、2,4-D 1.0mg/L、NAA0.2mg/L和酸水解酪蛋白0.4g/L的MS 基本培養基,MS基本培養基中蔗糖30g/L、瓊脂粉9g/L、溶劑為水,pH5.8。

(2)芽的增殖:觀察步驟(1)所述25℃,光照2000lx條件下培養 20天后,腋芽切口部位出現綠色突起,30天后出現叢生芽,再培養15 天,當叢生芽長到3cm時,將叢生芽切下轉接到芽增殖培養基中,在25℃,光照2000lx條件下進行增殖培養,獲得叢生苗;所述芽增殖培養基為添加6-BA 1.0mg/L、2,4-D 1.0mg/L、NAA 0.1mg/L、酸水解酪蛋白0.4g/L 和脯氨酸400mg/L的MS基本培養基。

(3)生根培養:將分化的叢生苗從基部切下,插入生根培養基中培養至芽生根;所述的生根培養基為改良的1/2MS培養基中加入0.1mg/L 的NAA和0.3g/L的酸水解酪蛋白。

(4)生根苗的移栽:待小苗葉片舒展,葉色濃綠,苗高4cm左右打開瓶蓋煉苗3d即可進行移栽。移栽前將植株上的瓊脂和雜物洗凈,移栽與經0.1%高錳酸鉀消毒過的育苗基質上,澆透定根水,蓋上薄膜,保持濕度80%以上,置通風陰涼處,在25℃、光照2000lx條件下培養,并定期進行噴藥預防病蟲害的發生;所述移栽基質為細沙、腐殖土與谷糠灰按照質量比5:3:2的比例配置而成,所述移栽基質的消毒方法為:采用體積濃度0.5%福爾馬林水溶液均勻噴灑基質,塑料薄膜覆蓋4天后揭開薄膜再曝曬基質2天,完成對移栽基質的消毒,或者采用體積濃度0.5%福爾馬林水溶液均勻噴灑基質,塑料薄膜覆蓋4天后揭開薄膜再在60℃下干燥2天,完成對移栽基質的消毒。

實施例7

(1)無菌材料的獲得及誘導培養:切取長勢良好、無病蟲害的白花蛇舌草的腋芽,用自來水沖洗60min,然后在體積濃度為1%洗潔精(體積比w/w)的水溶液中振搖5min,用無菌水沖凈;在超凈工作臺上用體積濃度70%乙醇水溶液浸泡60s,然后用混合消毒液浸泡20min,再用無菌水沖洗5遍;在滅菌的濾紙上吸干水分,切取1.0cm的嫩芽,然后將嫩芽接種到裝叢生芽誘導培養基的培養瓶中,蓋上瓶蓋并用封口膜封住瓶口,置于培養箱中,在26℃,光照2500lx條件下培養25天;所述混合消毒液為體積比1:200的吐溫20和84消毒液的混合液;所述叢生芽誘導培養基為添加6-BA 2.0mg/L、2,4-D 1.5mg/L、NAA 0.5mg/L和酸水解酪蛋白0.6g/L的MS基本培養基,MS基本培養基中蔗糖40g/L、瓊脂粉11g/L、溶劑為水,pH6.0。

(2)芽的增殖:觀察步驟(1)所述26℃,光照2500lx條件下培養 25天后,腋芽切口部位出現綠色突起,40天后出現叢生芽,再培養20 天,當叢生芽長到4cm時,將叢生芽切下轉接到芽增殖培養基中,在26℃,光照2500lx條件下進行增殖培養,獲得叢生苗;所述芽增殖培養基為添加6-BA 2.0mg/L、2,4-D 1.5mg/L、NAA 0.2mg/L、酸水解酪蛋白0.6g/L 和脯氨酸600mg/L的MS基本培養基。

(3)生根培養:將分化的叢生苗從基部切下,插入生根培養基中培養至芽生根;所述的生根培養基為改良的1/2MS培養基中加入0.15mg/L 的NAA和0.5g/L的酸水解酪蛋白。

(4)生根苗的移栽:待小苗葉片舒展,葉色濃綠,苗高5cm左右打開瓶蓋煉苗4d即可進行移栽。移栽前將植株上的瓊脂和雜物洗凈,移栽與經0.1%高錳酸鉀消毒過的育苗基質上,澆透定根水,蓋上薄膜,保持濕度80%以上,置通風陰涼處,在26℃、光照2500lx條件下培養,并定期進行噴藥預防病蟲害的發生。所述移栽基質為細沙、腐殖土與谷糠灰按照質量比5:3:2的比例配置而成,所述移栽基質的消毒方法為:采用體積濃度0.5%福爾馬林水溶液均勻噴灑基質,塑料薄膜覆蓋5天后揭開薄膜再曝曬基質3天,完成對移栽基質的消毒,或者采用體積濃度0.5%福爾馬林水溶液均勻噴灑基質,塑料薄膜覆蓋5天后揭開薄膜再在60℃下干燥2天,完成對移栽基質的消毒。

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