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一種結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體的制備方法.pdf

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一種 結合 生長因子 型溫敏水 凝膠 生物 載體 制備 方法
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摘要
申請專利號:

CN201410201006.5

申請日:

20140509

公開號:

CN103948962A

公開日:

20140730

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61L27/22,A61L27/16,A61L27/54,A61L27/52,A61L15/32,A61L15/24,A61L15/44,A61K47/42,A61K47/32,C08J3/24,C08J3/075 主分類號: A61L27/22,A61L27/16,A61L27/54,A61L27/52,A61L15/32,A61L15/24,A61L15/44,A61K47/42,A61K47/32,C08J3/24,C08J3/075
申請人: 天津工業大學
發明人: 楊寧,石璐,張魯杰,張浩
地址: 300387 天津市西青區賓水西道399號
優先權: CN201410201006A
專利代理機構: 代理人:
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201410201006.5

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摘要

本發明公開了一種結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體的制備方法。是以γ-聚谷氨酸(γ-PGA)、牛磺酸、N-異丙基丙烯酰胺(NIPA)為主要原料,N,N-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA)為交聯劑,過硫酸銨或過硫酸鉀為引發劑,N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)為促進劑。本發明主要采用半互穿網絡技術,制備方法包括γ-PGA-S72單體的合成、溫敏水凝膠生物載體的制備、溫敏水凝膠生物載體的純化和溫敏水凝膠生物載體與生長因子的結合四個步驟。本發明的原料來源豐富、制備方法簡單。本發明的結合生長因子型溫敏水凝膠具有良好的生物相容性,在組織工程支架、生物藥物載體、生物粘合劑和創傷敷料等生物醫療領域具有廣闊的應用前景。

權利要求書

1.一種結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體的制備方法,其特征在于該方法包括以下步驟:1)γ-PGA-S72單體的合成:將γ-聚谷氨酸和牛磺酸在室溫下溶解于0.5M碳酸氫鈉溶液中,待溶解完全后將反應液置于4℃的冰水浴中冷卻降溫,待冷卻后加入縮合劑EDC·HCl攪拌30min,之后將反應液置于室溫攪拌24h,50000分子量透析袋透析,冷凍干燥制得γ-PGA-S72單體;2)溫敏水凝膠生物載體的制備:將NIPAAm和γ-PGA-S72溶解于去離子水中,NIPAAm和γ-PGA-S72單體在水溶液中的質量百分比濃度分別為3~5%和2~8%,20~25℃攪拌25~45min至完全溶解,將反應液置于冰水浴中冷卻降溫至0~4℃,加入質量百分比濃度為2~6%的交聯劑攪拌均勻,在N保護和磁力攪拌下加入質量百分比濃度為0.5~2%的引發劑水溶液,攪拌5~15min后,向混合液中加入促進劑50~120μL,攪拌30~60s,將溶液緩慢倒入厚度為1.5mm的玻璃器皿中,密封后進行原位自由基聚合反應,控制反應溫度在20~25℃,24~48h后停止反應;3)溫敏水凝膠生物載體的純化:將反應后的產物用直徑為18mm的打孔器進行打孔,浸泡于去離子水中7~10天,每間隔6~8小時更換去離子水,以除去未完全反應的單體、交聯劑和各種雜質,制得所述的溫敏水凝膠生物載體;4)溫敏水凝膠生物載體與生長因子的結合:將步驟3所得的溫敏水凝膠置于體積濃度為75%的酒精中浸泡30min進行滅菌,之后用無菌的PBS溶液浸泡2d除去多余的酒精,將凝膠浸泡于濃度為50ng/ml的含有0.1%BSA的PBS溶液中4℃10h,之后用PBS沖洗3次,制得結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體。2.根據權利要求1所述的一種結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體的制備方法,其特征在于:所述的N-異丙基丙烯酰胺單體分子結構中存在著一定比例的疏水基團異丙基-CH(CH),以及親水基團酰胺基團-CO-NH-,它們會競爭性地和水分子產生氫鍵作用力。在較低溫度下及外界溫度小于PNIPAAm的低臨界溶解溫度LCST≈32℃時,PNIPAAm與水分子之間的相互作用力主要體現為酰胺基團和水分子之間的氫鍵作用,此時分子鏈呈現伸展的線團構象,隨著溫度升高,當T>LCST時,部分與水分子形成的氫鍵被破壞,PNIPAAm大分子內酰胺鍵之間會形成氫鍵,形成疏水層,將水分子排出。由于PNIPAAm在人體生理溫度附近LCST≈32℃表現出優良的溫度響應性,使得它在組織工程溫敏支架材料中得到廣泛的應用。3.根據權利要求1所述的一種結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體的制備方法,其特征在于:所述的γ-聚谷氨酸是由谷氨酸單體通過α-氨基和γ-羧基以酰胺鍵的方式縮合成的一種多肽型高分子,γ-PGA的分子鏈上含有大量的活性較高游離側鏈羧基-COOH,使得它具有極好的吸水保濕性,易于與一些藥物形成穩定的復合物,是一類理想的可生物降解的生物醫用高分子材料。4.根據權利要求1所述的一種結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體的制備方法,其特征在于:所述的γ-PGA-S72單體中磺酸基團-SOH和羧基-COOH的相對含量之比恰好適合與生長因子中陽離子氨基酸結合,從而對溫敏水凝膠生物載體起到了增強生物相容性和保護緩慢釋放生長因子的作用。5.根據權利要求1所述的一種結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體的制備方法,其特征在于:所述的交聯劑是N,N-亞甲基雙丙烯酰胺,所述的引發劑為過硫酸銨或過硫酸鉀,所述的促進劑為N,N,N’,N’-四甲基乙二胺。6.根據權利要求1所述的一種結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體的制備方法,其特征在于:所述的水凝膠溶脹后外觀為透明狀,當外界溫度升至31~35℃后,水凝膠立刻由透明色變為乳白色。7.根據權利要求1所述的一種結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體的制備方法,其特征在于:根據上述結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體,于37℃條件下凝膠表面接種小鼠胚胎成纖維細胞,細胞數量隨γ-PGA-S72單體含量的增加而增加。并能夠在結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體表面培養iPS細胞,使得iPS細胞能夠通過水凝膠的親疏水性自動脫附,從而避免了酶對細胞增殖和分化的影響。

說明書

【技術領域】:本發明涉及生物材料、組織工程和高分子材料領域,具體涉及一種結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體的制備方法。

【背景技術】:生物醫學組織工程是一個涉及細胞生物學、材料科學、反應器工程和臨床醫學的多學科交叉研究領域。其目的在于構建新的組織和器官。最初認為,所謂組織工程就是將細胞置于適合的反應器條件下進行三維培養,使其構建成為組織,并進而發展成為人體器官的替代物。組織工程的三要素就是支架材料、種子細胞和生長因子。

用于組織工程的支架材料必須具有良好的生物相容性;良好的細胞親和性;合適的生物降解性和降解速率;可負載生長因子及傳遞生物信號等特點。目前可用于組織工程的支架材料有:無機材料,羥基磷灰石、磷酸鈣;天然高分子材料,殼聚糖、海藻酸鹽、透明質酸、絲膠、聚谷氨酸;合成材料,聚乳酸、聚己內酯等。

水凝膠是一類引起組織工程領域極大關注的生物材料。因為水凝膠具有高度的生物相容性以及可與軟組織媲美的機械特性。水凝膠是以水為分散介質的凝膠,在具有網狀交聯結構的水溶性高分子中引入一部分疏水基團和親水殘基,親水殘基與水分子結合,將水分子連接在網狀內部,而疏水殘基遇水膨脹形成交聯聚合物。

聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)具有溫度敏感性,其LCST約為32℃。Okano等根據PNIPAAm的疏-親水性間可逆變化的特性,將PNIPAAm以共價鍵形式固定在聚苯乙烯板(TCPS)表面進行細胞培養。37℃時細胞在TCPS表面粘附增殖,當溫度由37℃降至32℃時,TCPS由疏水性轉化為親水性,即接枝有PNIPAAm的TCPS吸水膨脹,整體細胞群則在保持細胞間連接狀態下以片狀的形態得以脫附,這種方法經濟、方便,可以更好地保持細胞的分化特性及細胞的完整性。然而此類凝膠存在機械性能差、易碎、生物相容性差等缺點,不利于在組織工程等領域應用。

γ-聚谷氨酸是由谷氨酸單體通過α-氨基和γ-羧基以酰胺鍵的方式縮合而成的一種多肽型高分子。γ-PGA具有良好的生物相容性和生物降解性,可單獨使用或者與傳統的組織工程材料結合用于組織修復,引入γ-PGA可改善材料的細胞親和性,更有利于細胞的粘附和增殖;也可用于藥物載體提供藥物緩釋性和靶向性。

干細胞是人體及各種組織細胞的最初來源,具有高度的自我復制能力、高度增殖和多向分化性能,可分化成多種功能細胞及組織器官,在治療各種細胞損傷性疾病等方面擁有極強的優越性。胚胎干細胞(ES)/誘導多能干細胞(iPS)比其它干細胞更為原始,其擴增能力更強,具有體外培養無限增殖、自我更新和多向分化的特性。但是胚胎干細胞面臨著倫理道德和法律問題,使得iPS細胞的出現,在干細胞研究領域、表觀遺傳學研究領域以及生物醫學研究領域都引起了強烈的反響。

細胞生長因子在促進干細胞自我更新和定向分化的過程中扮演著重要的角色,但是生長因子都是分子量不大的可溶性多肽,對于微環境中的pH值變化、有機溶劑、超聲波及酶等都非常敏感,易于變性或降解,而且生長因子的半衰期較短,如果采用傳統的將生長因子加入細胞培養液的方式,其誘導作用將很快失效;同時,過量的生長因子加入會導致細胞的癌變。因此,細胞支架材料設計必須能夠穩定生長因子的活性并達到對其控制釋放的目的。肝素和硫酸化蛋白多糖等通過靜電相互作用來保持生長因子在體內的穩定性。據報道肝素、硫酸化蛋白多糖和合成的類肝素都具有保護生長因子活性的作用,因為當硫酸化多糖和生長因子相結合時,多糖中的硫酸化基團首先和生長因子中的堿性氨基酸殘基相結合,使其不被迅速降解。因此肝素與類肝素物質通過與生長因子的特異結合性,控制其緩慢釋放,從而更好地發揮生長因子對細胞的誘導及刺激分化作用。硫酸化的γ-PGA與肝素結構類似,同時是一種微生物發酵產物、可降解、降解產物無毒,無異源病毒污染,并且比肝素使用更加安全、可靠。所以可采用γ-PGA-S72作為溫敏水凝膠載體中保護生長因子活性和控制釋放生長因子的大分子物質,制備功能性生物載體。

查閱國內外文獻發現,目前尚無將γ-PGA-S72和PNIPAAm相結合的報導。本發明綜合考慮了γ-PGA-S72的生物相容性和能夠保護生長因子緩慢釋放的特點,采用半互穿網絡技術,將γ-PGA-S72引入到PNIPAAm水凝膠網絡中,制備得到結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體,提高傳統水凝膠的生物相容性、溫度響應性、細胞片層脫附和保護并緩慢釋放生長因子等特性。

【發明內容】:為了克服目前水凝膠存在的生物相容性不足的問題,本發明目的在于設計一種結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體,使該凝膠具有高透明性、快速溫度響應性、良好的生物相容性、保護生長因子緩慢釋放的特性和細胞片層脫附的功能。

為實現上述目的,本發明提供了一種結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體的制備方法,包括下述步驟:

1)γ-PGA-S72單體的合成:將γ-聚谷氨酸和牛磺酸在室溫下溶解于0.5M的碳酸氫鈉溶液中,待溶解完全后將反應液至于4℃的水浴中冷卻降溫,待冷卻后加入縮合劑EDC·HCl攪拌30min,之后將反應液置于室溫攪拌24h,50000分子量透析袋透析,冷凍干燥制得γ-PGA-S72單體;

2)凝膠的制備:將NIPAAm和γ-PGA-S72溶解于去離子水中,PNIPAAm和γ-PGA-S72單體在水溶液中的質量百分比濃度分別為3~5%和2~8%,20~25℃攪拌25~45min至完全溶解,將反應液置于冰水浴中冷卻降溫至0~4℃,加入質量百分比濃度為2~6%的交聯劑攪拌均勻,在N2保護和磁力攪拌下加入質量百分比濃度為0.5~2%的引發劑水溶液,攪拌5~15min后,向混合液中加入促進劑50~120μL,攪拌30~60s,將溶液緩慢倒入厚度為1.5mm的玻璃器皿中,密封后進行原位自由基聚合反應,控制反應溫度在20~25℃,24~48h后停止反應;

3)凝膠的純化:將反應后的產物用直徑為18mm的打孔器進行打孔,浸泡于去離子水中7~10天,每間隔6~8小時更換去離子水,以除去未完全反應的單體、交聯劑和各種雜質,制得所述的溫敏水凝膠生物載體;

4)與生長因子的結合:將步驟3所得的溫敏水凝膠置于體積濃度為75%的酒精中浸泡30min進行滅菌,之后用無菌的PBS溶液浸泡2d除去多余的酒精,將凝膠浸泡于濃度為50ng/ml的含有0.1%BSA的PBS溶液中4℃10h,之后用PBS沖洗3次,制得結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體。

所述的N-異丙基丙烯酰胺單體分子結構中存在著一定比例的疏水基團(異丙基,-CH(CH3)2)和親水基團(酰胺基團,-CO-NH-),它們會競爭性地和水分子產生氫鍵作用力。在較低溫度下及外界溫度小于PNIPAAm的低臨界溶解溫度(LCST≈32℃)時,PNIPAAm與水分子之間的相互作用力主要體現為酰胺基團和水分子之間的氫鍵作用,此時分子鏈呈現伸展的線團構象,隨著溫度升高,當T>LCST時,部分與水分子形成的氫鍵被破壞,PNIPAAm大分子內酰胺鍵之間會形成氫鍵,形成疏水層,將水分子排出。由于PNIPAAm在人體生理溫度附近(LCST≈32℃)表現出優良的溫度響應性,使得它在組織工程溫敏支架材料中得到廣泛的應用。

所述的γ-聚谷氨酸是由谷氨酸單體通過α-氨基和γ-羧基以酰胺鍵的方式縮合成的一種多肽型高分子,γ-PGA的分子鏈上含有大量的活性較高游離側鏈羧基(-COOH),使得它具有極好的吸水保濕性,易于與一些藥物形成穩定的復合物,是一類理想的可生物降解的生物醫用高分子材料。

所述的γ-PGA-S72單體中磺酸基團(-SO3H)和羧基(-COOH)的相對含量之比恰好對堿性成纖維細胞生長因子bFGF具有良好的保護和緩慢釋放的功能,對細胞的增殖有很大的促進作用。

所述的交聯劑是N,N-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA),所述的引發劑為過硫酸銨或過硫酸鉀,所述的促進劑為N,N,N’,N’-四甲基乙二胺。

所述的水凝膠溶脹后外觀為透明狀,當外界溫度升至31~35℃后,水凝膠立刻由透明色變為乳白色。

根據上述結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體,于37℃條件下凝膠表面接種小鼠胚胎成纖維細胞(NIH-3T3),細胞數量隨γ-PGA-S72單體含量的增加而增加。并能夠在結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體表面培養iPS細胞,使得iPS細胞能夠呈現弱貼壁的擬胚體樣細胞生長,利于保持iPS細胞的全能性。

本發明的原理是:N-異丙基丙烯酰胺單體在引發劑和催化劑的氧化還原作用下,分子結構中的雙鍵打開聚合;由于γ-PGA-S72分子鏈中的羧基基團和磺酸基團的比例恰好適合與生長因子中陽離子氨基酸結合,從而對凝膠起到了增強生物相容性和保護緩慢釋放生長因子的作用。而在聚合過程中加入γ-PGA-S72后,由于γ-PGA-S72為水溶性的分子鏈并沒有雙鍵并不發生聚合,反應完成后只是穿插在聚N-異丙基丙烯酰胺形成的高分子三維網絡中,形成了半互穿的結構,又由于γ-PGA-S72分子鏈中含有極性親水基團(如-COOH、-SO3H),可以和酰胺鍵形成氫鍵,因此不易從凝膠三維網絡中滲出,從仿生構思和網絡設計的角度出發,結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體可以提高溫敏水凝膠的生物功能性,將溫敏脫附和控制釋放生長因子的特性相結合,制備新一代干細胞培養支架材料。

與其他凝膠及其制備方法相比,本發明具有如下有益效果:

(1)本發明結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體制備過程操作簡便可控,水相反應無毒無害,具有較高的實用價值;

(2)本發明所制備的結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體具有高的溶脹度、良好的細胞相容性和良好的保護緩慢釋放堿性成纖維細胞生長因子bFGF的性能,可應用于細胞培養支架、藥物載體、創傷敷料等方面;

(3)本發明所制備的結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體的溶脹度和細胞相容性可以通過調節γ-PGA-S72的含量來實現。并能夠在結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體表面培養iPS細胞,使得iPS細胞能夠呈現弱貼壁的擬胚體樣細胞生長,利于保持iPS細胞的全能性。

【附圖說明】:

圖1為結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體制備機理

圖2為實例1結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體的SEM圖

圖3為小鼠胚胎成纖維細胞(NIH-3T3)在實例1結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體表面生長5天的倒置顯微鏡圖

圖4為iPS細胞在實例2結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體表面生長3天的倒置顯微鏡圖

【具體實施方式】:

實施例1:

1)γ-PGA-S72單體的合成:將645mgγ-聚谷氨酸和626mg牛磺酸在室溫下溶解于30ml0.5M碳酸氫鈉溶液,待溶解完全后將反應液置于4℃的冰水浴中降溫冷卻,待冷卻后加入1917mg縮合劑EDC·HCl攪拌30min,之后將反應液置于室溫攪拌24h,50000分子量透析袋透析,冷凍干燥制得γ-PGA-S72;

2)溫敏水凝膠生物載體的制備:將3.39g?NIPAAm和0.2712gγ-PGA-S72溶解于去離子水中,25℃攪拌30min至完全溶解,將反應液置于冰水浴中冷卻降溫至4℃,加入0.139g交聯劑N,N亞甲基雙丙烯酰胺攪拌均勻,在N2保護和磁力攪拌下加入0.0678g引發劑過硫酸銨水溶液,攪拌15min后,向混合液中加入促進劑50μL,攪拌30s,將溶液緩慢倒入厚度為1.5mm的玻璃器皿中,密封后進行原位自由基聚合反應,控制反應溫度在25℃,48h后停止反應;

3)溫敏水凝膠生物載體的純化:將反應后的產物用直徑為18mm的打孔器進行打孔,浸泡于無離子水中7天,每間隔6小時更換去離子水,以除去未完全反應的單體、交聯劑和各種雜質,制得所述的溫敏水凝膠生物載體;

4)將步驟3所得的溫敏水凝膠生物載體置于體積濃度為75%的酒精中浸泡30min進行滅菌,之后用無菌的PBS溶液浸泡2d除去多余的酒精,將凝膠浸泡于濃度為50ng/ml的含有0.1%BSA的PBS溶液中4℃10h,之后用PBS沖洗3次,制得所述的結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體。

5)將步驟4所得的溫敏水凝膠生物載體進行小鼠胚胎成纖維細胞(NIH-3T3)接種,細胞的接種密度密度是2×104cells/mL。

實施例2:

1)γ-PGA-S72單體的合成:將645mgγ-聚谷氨酸和626mg牛磺酸在室溫下溶解于30ml0.5M碳酸氫鈉溶液,待溶解完全后將反應液置于4℃的冰水浴中降溫冷卻,待冷卻后加入1917mg縮合劑EDC·HCl攪拌30min,之后將反應液置于室溫攪拌24h,50000分子量透析袋透析,冷凍干燥制得γ-PGA-S72;

2)溫敏水凝膠生物載體的制備:將3.39g?NIPAAm和0.1695gγ-PGA-S72溶解于去離子水中,20℃攪拌45min至完全溶解,將反應液置于冰水浴中冷卻降溫至4℃,加入0.139g交聯劑N,N亞甲基雙丙烯酰胺攪拌均勻,在N2保護下和磁力攪拌下加入0.0678g引發劑過硫酸銨水溶液,攪拌15min后,向混合液中加入促進劑50μL,攪拌30s,將溶液緩慢倒入厚度為1.5mm的玻璃器皿中,密封后進行原位自由基聚合反應,控制反應溫度在20℃,30h后停止反應;

3)溫敏水凝膠生物載體的純化:將反應后的產物用直徑為18mm的打孔器進行打孔,浸泡于無離子水中10天,每間隔5小時更換去離子水,以除去未完全反應的單體、交聯劑和各種雜質,制得所述的溫敏水凝膠生物載體。

4)將步驟3所得的溫敏水凝膠生物載體置于體積濃度為75%的酒精中浸泡30min進行滅菌,之后用無菌的PBS溶液浸泡2d除去多余的酒精,將凝膠浸泡于濃度為50ng/ml的含有0.1%BSA的PBS溶液中4℃10h,之后用PBS沖洗3次,制得所述的結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體。

5)將步驟4所得的溫敏水凝膠生物載體進行iPS細胞接種。

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