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牛樟芝液體培養基及其制備方法.pdf

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牛樟芝 液體 培養基 及其 制備 方法
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摘要
申請專利號:

CN201810005885.2

申請日:

20180103

公開號:

CN108243834A

公開日:

20180706

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01G18/20,A01G18/00,A01G18/40 主分類號: A01G18/20,A01G18/00,A01G18/40
申請人: 廣東東陽光藥業有限公司,乳源南嶺好山好水食品有限公司
發明人: 向婷,李紅保,楊德明,梁蕾,胡生華,朱志鋼,白雪芳,曾斯文
地址: 523000 廣東省東莞市松山湖科技產業園區
優先權: CN201810005885A
專利代理機構: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 代理人: 趙天月
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201810005885.2

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明提出了液體培養基,該液體培養基包括:葡萄糖,麥芽提取物,蛋白胨以及單萜類化合物,所述單萜類化合物包括選自香葉醇、香茅醇以及樟腦的至少之一。該液體培養基中添加有單萜類化合物香葉醇、香茅醇、樟腦的至少之一,有效促進了牛樟芝三萜類物質形成,進而顯著提高牛樟芝總三萜含量,且原料易得,成本低,操作簡單,適合工業化大生產。

權利要求書

1.一種液體培養基,其特征在于,包括:葡萄糖,麥芽提取物,蛋白胨以及單萜類化合物,所述單萜類化合物包括選自香葉醇、香茅醇以及樟腦的至少之一。2.根據權利要求1所述的液體培養基,其特征在于,所述香葉醇的濃度為0.05~0.1%;優選地,所述香茅醇的濃度為0.05~0.1%;優選地,所述樟腦的濃度為0.01~0.05%。3.根據權利要求1所述的液體培養基,其特征在于,所述葡萄糖的濃度為20g/L,所述麥芽提取物的濃度為20g/L,所述蛋白胨的濃度為1g/L。4.一種制備權利要求1~3任一項所述液體培養基的方法,其特征在于,將水、葡萄糖、麥芽提取物以及蛋白胨進行第一混合和滅菌處理,將滅菌后的混合物與單萜類化合物進行第二混合處理,以便得到所述液體培養基,其中,所述單萜類化合物包括選自香葉醇、香茅醇以及樟腦的至少之一。5.根據權利要求4所述的方法,其特征在于,所述香葉醇的濃度為0.05~0.1%;優選地,所述香茅醇的濃度為0.05~0.1%;優選地,所述樟腦的濃度為0.01~0.05%;任選地,所述葡萄糖的濃度為20g/L,所述麥芽提取物的濃度為20g/L,所述蛋白胨的濃度為1g/L;任選地,所述第一混合處理中,所述水、葡萄糖、麥芽糖提取物以及蛋白胨的用量比為1000mL:20g:20g:1g;任選地,所述滅菌處理是在溫度為121攝氏度的條件下進行30min的;任選地,所述單萜類化合物包括香葉醇、香茅醇以及樟腦,所述第二混合處理中,所述滅菌后的混合物與所述香葉醇、香茅醇以及樟腦的用量比為1000mL:0.5~1mL:0.5-1mL:0.1-0.5g。6.一種牛樟芝的培養方法,其特征在于,利用權利要求1~3任一項所述的液態培養基或根據權利要求4~5任一項所述的方法制備獲得的液體培養基對牛樟芝進行培養。7.根據權利要求6所述的方法,其特征在于,利用所述培養基對牛樟芝進行培養,以便獲得牛樟芝菌絲體,所述培養是在溫度為28℃、轉速為120rpm的條件下進行暗培養10-15d;任選地,進一步包括將所述牛樟芝菌絲體接種于固體培養基體,以便獲得牛樟芝子實體,所述固體培養基體浸泡于所述培養基中。8.根據權利要求7所述的方法,其特征在于,進行所述培養之前,進一步包括:將牛樟芝固體菌種接種于所述培養基。9.根據權利要求8所述的方法,其特征在于,所述接種是通過將大小為2*2cm的牛樟芝固體菌種塊接種于所述液態培養基實現的,接種量為:每200mL的所述培養基接種3塊所述牛樟芝固體菌種塊。10.根據權利要求6所述的方法,其特征在于,利用所述培養基對牛樟芝進行培養,以便獲得牛樟芝子實體,進行所述培養之前,進一步包括:將牛樟芝固體菌種接種于固體培養基體,所述固體培養基體浸泡于所述培養基中;任選地,進一步包括:將牛樟芝固體菌種接種于所述液體培養基,所述接種是通過將大小為5*5cm的牛樟芝固體菌種塊接種于所述液態培養基實現的,所述培養是在溫度為28℃、濕度為80%的條件下進行暗培養18個月。

說明書

技術領域

本發明涉及生物技術領域,具體地,本發明涉及液體培養基及其制備方法。

背景技術

樟芝(Antrodiacamphorata)又名牛樟菇、樟窟內菇、紅樟芝,隸屬擔子菌亞門(Basidiomycotina),層菌綱(Hymenomycetes),多孔菌科(Polyporaceae),薄孔菌屬(Antrodia),是一種原產于臺灣的珍稀藥用菌。牛樟芝原生于中國臺灣山區海拔450~2000米之間特有的樹齡百年以上的牛樟樹(Cinnamomea kanehirai)樹干腐朽心材的內壁,是臺灣的地道藥材,被稱為“臺灣瑰寶”、“臺灣森林中的紅寶石”。

牛樟芝含有豐富的活性物質,現在已知的超過78種化合物,包括三萜類(terpenoids)、苯酸類(benzenoids)、木脂素(lignans)、苯醌及其衍生物(benzoquinonederivatives)、琥珀酸與馬來酸及其衍生物(uccinic and maleic derivatives)及多糖體等。近年來牛樟芝在抗發炎、保肝、抗肝癌、抗肺癌、抗乳癌、抗卵巢癌、抗結腸癌、抗口腔癌、抗氧化、降低系統性紅斑狼瘡性腎炎及抗血小板凝集等方面的研究皆顯示其未來具有高度發展潛力。同時牛樟芝對于酒后或宿醉的解酒效果也非常顯著。

三萜類物質為牛樟芝的主要活性成分之一,且最為特別,高達200種以上,是其他菇菌無法相比的,具有抗癌、保肝等功效。藥理研究表明三萜具有抗癌,抗炎,抗病毒和保肝等多種活性。

因而,提高牛樟芝菌絲體中活性產物三萜類成分的含量是提高牛樟芝藥物價值的有效手段。

發明內容

本申請是基于發明人對以下事實和問題的發現和認識作出的:

現有技術的液體培養可以在較短時間內獲得大量的牛樟芝菌絲體,彌補牛樟芝生長緩慢這個缺點,但是其活性產物三萜類成分的含量卻很低。基于上述問題的發現,發明人開發了一種液體培養基,該液體培養基中添加有單萜類化合物香葉醇、香茅醇、樟腦的至少之一,有效促進了牛樟芝三萜類物質形成,進而顯著提高了牛樟芝總三萜含量,且原料易得,成本低,操作簡單,適合工業化大生產。

在本發明的第一方面,本發明提出了一種液體培養基。根據本發明的實施例,所述液體培養基包括:葡萄糖,麥芽提取物,蛋白胨以及單萜類化合物,所述單萜類化合物包括選自香葉醇、香茅醇以及樟腦的至少之一。發明人發現,在液體培養基中加入單萜類化合物香葉醇、香茅醇以及樟腦的至少之一可以顯著促進牛樟芝三萜類物質的形成。根據本發明實施例的液體培養基用于培養牛樟芝,可顯著提高牛樟芝中總三萜含量,且培養基的原料易得,成本低,操作簡單,適合工業化大生產。

根據本發明的實施例,上述液體培養基還可以進一步包括如下附加技術特征至少之一:

根據本發明的實施例,所述香葉醇的濃度為0.05~0.1%。需要說明的是,香葉醇的濃度為體積百分比。發明人發現,往液體培養基里加入0.05~0.1%的香葉醇,能顯著提高牛樟芝三萜類物質的含量。加入太少,三萜類物質提高的不明顯,加入太多,會促進非必需副產物的產生,且造成浪費。

根據本發明的實施例,所述香茅醇的濃度為0.05~0.1%。需要說明的是,香茅醇的濃度為體積百分比。發明人發現,往液體培養基里加入0.05~0.1%的香葉醇,能顯著提高牛樟芝三萜類物質的含量。加入太少,三萜類物質提高的不明顯,加入太多,會促進非必需副產物的產生,且造成浪費。

根據本發明的實施例,所述樟腦的濃度為0.01~0.05%。需要說明的是,樟腦的濃度為質量體積百分數,單位是g/L。發明人發現,往液體培養基里加入0.05~0.1%的香葉醇,能顯著提高牛樟芝三萜類物質的含量。加入太少,三萜類物質提高的不明顯,加入太多,會促進非必需副產物的產生,且造成浪費。

根據本發明的實施例,所述葡萄糖的濃度為20g/L,所述麥芽提取物的濃度為20g/L,所述蛋白胨的濃度為1g/L。進而牛樟芝的產量進一步提高。

在本發明的第二方面,本發明提出了一種制備前面所述液體培養基的方法。根據本發明的實施例,所述方法包括:將水、葡萄糖、麥芽提取物以及蛋白胨進行第一混合和滅菌處理;將滅菌后的混合物與單萜類化合物進行第二混合處理,以便得到所述液體培養基,其中,所述單萜類化合物包括選自香葉醇、香茅醇以及樟腦的至少之一。葡萄糖、麥芽提取物和蛋白胨是培養基的營養物質,滅菌處理后可為牛樟芝的生長提供無菌的營養環境同時而單萜類化合物在高溫下易揮發,進而將葡萄糖、麥芽提取物以及蛋白胨進行第一混合和滅菌處理后再與單萜類化合物進行第二混合處理,既可為牛樟芝的生長提供無菌的營養環境,又可有效避免單萜類化合物有效成分的損失。根據本發明實施例的方法獲得的液體培養基,通過添加單萜類化合物香葉醇、香茅醇、樟腦的至少之一,顯著提高了牛樟芝總三萜含量,且原料易得,成本低,操作簡單,適合工業化大生產。

根據本發明的實施例,上述方法還可以進一步包括如下附加技術特征至少之一:

根據本發明的實施例,所述香葉醇的濃度為0.05~0.1%。需要說明的是,香葉醇的濃度為體積百分比。發明人發現,往液體培養基里加入0.05~0.1%的香葉醇,能顯著提高牛樟芝三萜類物質的含量。加入太少,三萜類物質提高的不明顯,加入太多,會促進非必需副產物的產生,且造成浪費。

根據本發明的實施例,所述香茅醇的濃度為0.05~0.1%。需要說明的是,香茅醇的濃度為體積百分比。發明人發現,往液體培養基里加入0.05~0.1%的香葉醇,能顯著提高牛樟芝三萜類物質的含量。加入太少,三萜類物質提高的不明顯,加入太多,會促進非必需副產物的產生,且造成浪費。

根據本發明的實施例,所述樟腦的濃度為0.01~0.05%。需要說明的是,樟腦的濃度為質量體積百分數,單位是g/L。發明人發現,往液體培養基里加入0.05~0.1%的香葉醇,能顯著提高牛樟芝三萜類物質的含量。加入太少,三萜類物質提高的不明顯,加入太多,會促進非必需副產物的產生,且造成浪費。

根據本發明的實施例,所述葡萄糖的濃度為20g/L,所述麥芽提取物的濃度為20g/L,所述蛋白胨的濃度為1g/L。進而牛樟芝的產量進一步提高。

根據本發明的實施例,所述第一混合處理中,所述水、葡萄糖、麥芽糖提取物以及蛋白胨的用量比為1000mL:20g:20g:1g。

根據本發明的實施例,所述滅菌處理是在溫度為121攝氏度的條件下進行30min的。

根據本發明的實施例,所述單萜類化合物包括香葉醇、香茅醇以及樟腦,所述第二混合處理中,所述滅菌后的混合物與所述香葉醇、香茅醇以及樟腦的用量比為1000mL:0.5~1mL:0.5-1mL:0.1-0.5g。

在本發明的第三方面,本發明提出了一種牛樟芝的培養方法。根據本發明的實施例,所述培養方法包括:利用前面所述的液體培養基或根據前面所述的方法制備獲得的液體培養基對牛樟芝進行培養。根據本發明實施例的培養方法,可促進牛樟芝三萜類物質形成,顯著提高牛樟芝總三萜含量,且原料易得,成本低,操作簡單,適合工業化大生產。

根據本發明的實施例,上述方法還可以進一步包括如下附加技術特征至少之一:

根據本發明的實施例,利用所述培養基對牛樟芝進行培養,以便獲得牛樟芝菌絲體,所述培養是在溫度為28℃、轉速為120rpm的條件下進行暗培養10-15d。在上述溫度、轉速的條件下暗培養10-15d,獲得的牛樟芝菌絲體總三萜含量進一步提高。

根據本發明的實施例,進一步包括將所述牛樟芝菌絲體接種于固體培養基體,以便獲得牛樟芝子實體,所述固體培養基體浸泡于所述培養基中。固體培養基體浸泡于前面所述液體培養基中,之后將牛樟芝菌絲體接種于固體培養基體中,所獲得的牛樟芝子實體中總三萜含量顯著提高。

根據本發明的實施例,進行所述培養之前,進一步包括:將牛樟芝固體菌種接種于所述培養基。

根據本發明的具體實施例,所述接種是通過將大小為2*2cm的牛樟芝固體菌種塊接種于所述液態培養基實現的,接種量為:每200mL的所述培養基接種3塊所述牛樟芝固體菌種塊。上述接種密度下,更適合牛樟芝菌種的生長,進一步提高牛樟芝的產量和其中有效成分的含量。

根據本發明的實施例,利用所述培養基對牛樟芝進行培養,以便獲得牛樟芝子實體,進行所述培養之前,進一步包括:將牛樟芝固體菌種接種于固體培養基體,所述固體培養基體浸泡于所述培養基中。通過上述方法獲得的牛樟芝子實體中的三萜物質的含量顯著提高。

根據本發明的實施例,利用所述培養基對牛樟芝進行培養,以便獲得牛樟芝子實體,進行所述培養之前,進一步包括:將牛樟芝固體菌種接種于所述液體培養基,所述接種是通過將大小為5*5cm的牛樟芝固體菌種塊接種于所述液態培養基實現的,所述培養是在溫度為28℃、濕度為80%的條件下進行暗培養18個月。通過上述方法獲得的牛樟芝子實體中的三萜物質的含量顯著提高。

具體實施方式

下面詳細描述本發明的實施例。下面的實施例是示例性的,旨在用于解釋本發明,而不能理解為對本發明的限制。

一般操作方法:

1.配制ME液體培養基,其中葡萄糖20g/L、麥芽提取物20g/L、蛋白胨1g/L,搖瓶裝量為200mL/500mL,于121℃滅菌30min。2.待培養基冷卻后,分別添加濃度為0.05-0.1%的香葉醇、香茅醇,以及濃度為0.01-0.05%樟腦,并以未添加為對照。

3.向上述液體培養基接種牛樟芝固體菌種,接種量為每瓶2*2cm大小的菌塊3塊,然后于28℃120rpm暗培養10-15d。

4.培養完成后,過濾菌液獲得牛樟芝菌球,檢測其三萜類含量,處理組為3.3-4.6%,對照組為1.5-1.9%。

實施例1

1.配制ME液體培養基,其中葡萄糖20g/L、麥芽提取物20g/L、蛋白胨1g/L,搖瓶裝量為200mL/500mL,于121℃滅菌30min。

2.待培養基冷卻后,分別添加香葉醇、香茅醇以及樟腦,使其終濃度分別為0.05%,0.1%,0.01%,并以未添加為對照。

3.取牛樟芝固體菌種,切成大小為2*2cm的菌塊,每瓶培養基接種3塊,然后于28℃120rpm暗培養10d。

4.培養完成后,過濾菌液獲得牛樟芝菌球,檢測其總三萜含量,添加香葉醇的處理為3.8%,添加香茅醇的處理為4.5%,添加樟腦的處理為3.7%,對照為1.7%。

實施例2

1.配制ME液體培養基,其中葡萄糖20g/L、麥芽提取物20g/L、蛋白胨1g/L,搖瓶裝量為200mL/500mL,于121℃滅菌30min。

2.待培養基冷卻后,分別添加香葉醇、香茅醇以及樟腦,使其終濃度分別為0.1%,0.05%,0.05%,并以未添加為對照。

3.取牛樟芝固體菌種,切成大小為2*2cm的菌塊,每瓶培養基接種3塊,然后于28℃120rpm暗培養15d。

4.培養完成后,過濾菌液獲得牛樟芝菌球,檢測其總三萜含量,添加香葉醇的處理為4.0%,添加香茅醇的處理為4.6%,添加樟腦的處理為3.3%,對照為1.5%。

實施例3

1.配制ME液體培養基,其中葡萄糖20g/L、麥芽提取物20g/L、蛋白胨1g/L,搖瓶裝量為200mL/500mL,于121℃滅菌30min。

2.待培養基冷卻后,分別添加香葉醇、香茅醇以及樟腦,使其終濃度分別為0.08%,0.07%,0.03%,并以未添加為對照。

3.取牛樟芝固體菌種,切成大小為2*2cm的菌塊,每瓶培養基接種3塊,然后于28℃120rpm暗培養10d。

4.培養完成后,過濾菌液獲得牛樟芝菌球,檢測其總三萜含量,添加香葉醇的處理為4.3%,添加香茅醇的處理為4.0%,添加樟腦的處理為3.6%,對照為1.9%。

實施例4

1.配制ME液體培養基,其中葡萄糖20g/L、麥芽提取物20g/L、蛋白胨1g/L,搖瓶裝量為200mL/500mL,于121℃滅菌30min。

2.待培養基冷卻后,添加香葉醇、香茅醇以及樟腦,使其終濃度分別為0.08%,0.07%,0.03%,并以未添加為對照。

3.將牛樟椴木裝袋,于121℃滅菌4h,待冷卻后向其底部加入上述液體培養基200mL,然后接種大小為5*5cm的牛樟芝固體菌種,在溫度28℃濕度80%的條件下暗培養18個月至子實體形成。

4.收集子實體,檢測其總三萜含量,添加香葉醇,香茅醇,樟腦處理為6.5%,對照為4.6%。

由實施例1~4可知,根據本發明實施例的液體培養基能顯著提高牛樟芝中的總三萜含量。

在本說明書的描述中,參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特點包含于本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中,對上述術語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且,描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。此外,在不相互矛盾的情況下,本領域的技術人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進行結合和組合。

盡管上面已經示出和描述了本發明的實施例,可以理解的是,上述實施例是示例性的,不能理解為對本發明的限制,本領域的普通技術人員在本發明的范圍內可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。

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