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一種枳的組織培養再生苗的培養方法.pdf

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一種 組織培養 再生 培養 方法
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摘要
申請專利號:

CN201710025535.8

申請日:

20170113

公開號:

CN106613993A

公開日:

20170510

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A01H4/00 主分類號: A01H4/00
申請人: 四川農業大學
發明人: 王小蓉,李根,何文,馬有軍,李雪鷗,謝銳,伏曉科,王浩,張靜,王燕,陳濤,湯浩茹
地址: 611130 四川省成都市溫江區惠民路211號
優先權: CN201710025535A
專利代理機構: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 代理人: 湯東鳳
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201710025535.8

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種枳的組織培養再生苗的培養方法,選取枳的莖段作為組培用的外植體;對莖段進行愈傷組織誘導,成功誘導后通過切割愈傷組織進行進一步繼代培養、增大并逐漸分化形成不定芽;再通過光下誘導不定芽再分化形成莖和葉;最后,經生根培養形成不定根后進行馴化移栽,然后正常培養。本發明枳的組織培養再生苗的方法,建立了枳的高效再生體系,該方法不受地區、季節、氣候限制,可實現優質再生苗的工廠化規模化生產。

權利要求書

1.一種枳的組織培養再生苗的培養方法,其特征在于,選取枳的莖段作為組培用的外植體;對莖段進行愈傷組織誘導;成功誘導后通過切割愈傷組織進行進一步繼代培養、增大并逐漸分化形成不定芽;再通過光下誘導不定芽再分化形成莖和葉;最后,經生根培養形成不定根后進行馴化移栽,然后正常培養。2.根據權利要求1所述的枳的組織培養再生苗的培養方法,其特征在于,包括以下步驟:步驟1、外植體的選擇及處理:選取枳的莖段為起始材料,消毒后作為組培用的外植體;步驟2、愈傷組織的誘導培養:將經過消毒的外植體接種于愈傷組織誘導培養基MS+6-BA1.0-2.0mg/L+IBA0.1-0.2mg/L+GA0.25-0.5mg/L上進行暗培養,莖段切口處逐漸形成愈傷組織。步驟3、愈傷組織的增殖培養:形成的愈傷組織經切割后轉接到愈傷組織增殖培養基MS+6-BA0.5-1.0mg/L+IBA0.1-0.2mg/L+GA0.25-0.5mg/L上進行暗培養,愈傷組織較為迅速的生長膨大;步驟4、愈傷組織的分化及再分化培養:將增殖后的愈傷組織轉移到光下培養,通過光誘導,迅速分化形成不定芽,而后緩慢分化為莖和葉;步驟5、生根成苗及馴化移栽:將再分化形成的莖和葉轉移到生根培養基1/2MS+IBA0.25-0.5mg/L上進行培養,20~30天后,長出1-2條肉質不定根,生根成苗成為新的植株,煉苗、緩苗后正常培養。3.根據權利要求2所述的枳的組織培養再生苗的培養方法,其特征在于,愈傷組織的誘導及增殖的培養條件均為:培養溫度23-27℃,避光進行暗培養;愈傷組織分化及再分化培養、再生苗的生根培養條件均為23-27℃,光照時間為10~12h/d,光照強度為2500-3000lux。4.根據權利要求2所述的枳的組織培養再生苗的培養方法,其特征在于,愈傷組織誘導培養基、愈傷組織增殖及分化培養基及再生苗的生根培養基均為MS培養基,蔗糖用量為20~40g/L,凝固劑為瓊脂粉、用量為6~7g/L,培養基pH為5.7-5.9。5.根據權利要求2所述的枳的組織培養再生苗的培養方法,其特征在于,所述煉苗、緩苗具體為:先在組培室打開瓶蓋煉苗3天,然后將其移至溫室或蔭棚,再煉苗3天;然后將組培苗從培養瓶中取出,洗凈其表面的瓊脂,移栽到培養基質中進行緩苗,然后正常培養。6.根據權利要求5所述的枳的組織培養再生苗的培養方法,其特征在于,所述培養基質為蛭石與珍珠鹽。7.根據權利要求5或6所述的枳的組織培養再生苗的培養方法,其特征在于,所述培養基質含水量25%以內,空氣相對濕度60~80%,遮光50%。

說明書

技術領域

本發明屬于植物繁殖技術領域,具體地說,涉及一種枳的組織培養再生苗的培養方法。

背景技術

枳(Poncirus trifoliata(L.)Raf)是蕓香科柑橘亞科枳屬(Poncirus Raf.)的一種植物,為小喬木;樹冠傘形或圓頭形,枝有刺,花單朵或成對腋生,果近圓球形或梨形,為溫帶樹種,喜光,稍耐蔭,喜溫暖濕潤氣候,耐寒力較強,耐熱;對土壤不要求不嚴,多以此作柑橘類砧木,同時具有較高的藥用價值和觀賞價值,中國各地均有栽培。

枳雖然在中國各地均有栽培,但隨著柑橘類的果樹栽培面積越來越廣,枳作為一種抗逆性較強,生長旺的砧木,需求量也越來越大,同時,對枳砧木的要求也越來越高。若沿用傳統的分株繁殖方法,繁殖系數低,增殖速度慢,遠遠不能滿足人們的需要;若用種子播種,存在變異變化大,難以保存親本的優良性狀等缺點;同時自然環境復雜,傳統繁殖方法培育的砧木存在細菌、真菌及病毒的侵害,還會對嫁接的柑橘接穗造成一定的影響。因此,通過組織培養建立無毒再生苗的培育體系成為當前的一種趨勢。

發明內容

有鑒于此,本發明針對枳的繁殖系數低、增殖速度慢及易受到細菌、真菌、病毒侵害的問題,提供了一種枳的組織培養再生苗的培養方法,建立枳的高效再生體系,可實現優質種苗的工廠化規模化生產及實驗室脫毒再生苗的培養體系。

為了解決上述技術問題,本發明公開了一種枳的組織培養再生苗的培養方法,選取枳的莖段作為組培用的外植體;對莖段進行愈傷組織誘導;成功誘導后通過切割愈傷組織進行進一步繼代培養、增大并逐漸分化形成不定芽;再通過光下誘導不定芽再分化形成莖和葉;最后,經生根培養形成不定根后進行馴化移栽,然后正常培養。

進一步地,包括以下步驟:

步驟1、外植體的選擇及處理:選取枳的莖段為起始材料,消毒后作為組培用的外植體;

步驟2、愈傷組織的誘導培養:將經過消毒的外植體接種于愈傷組織誘導培養基MS+6-BA1.0-2.0mg/L+IBA0.1-0.2mg/L+GA30.25-0.5mg/L上進行暗培養,莖段切口處逐漸形成愈傷組織。

步驟3、愈傷組織的增殖培養:

形成的愈傷組織經切割后轉接到愈傷組織增殖培養基MS+6-BA0.5-1.0mg/L+IBA0.1-0.2mg/L+GA30.25-0.5mg/L上進行暗培養,愈傷組織較為迅速的生長膨大;

步驟4、愈傷組織的分化及再分化培養:

將增殖后的愈傷組織轉移到光下培養,通過光誘導,迅速分化形成不定芽,而后緩慢分化為莖和葉;

步驟5、生根成苗及馴化移栽:

將再分化形成的莖和葉轉移到生根培養基1/2MS+IBA0.25-0.5mg/L上進行培養,20~30天后,長出1-2條肉質不定根,生根成苗成為新的植株,煉苗、緩苗后正常培養。

進一步地,愈傷組織的誘導及增殖的培養條件均為:培養溫度23-27℃,避光進行暗培養;愈傷組織分化及再分化培養、再生苗的生根培養條件均為23-27℃,光照時間為10~12h/d,光照強度為2500-3000lux。

進一步地,愈傷組織誘導培養基、愈傷組織增殖及分化培養基及再生苗的生根培養基均為MS培養基,蔗糖用量為20~40g/L,凝固劑為瓊脂粉、用量為6~7g/L,培養基pH為5.7-5.9。

進一步地,煉苗、緩苗具體為:先在組培室打開瓶蓋煉苗3天,然后將其移至溫室或蔭棚,再煉苗3天;然后將組培苗從培養瓶中取出,洗凈其表面的瓊脂,移栽到培養基質中進行緩苗,然后正常培養。

進一步地,培養基質為蛭石與珍珠鹽。

進一步地,培養基質含水量25%以內,空氣相對濕度60~80%,遮光50%。

與現有技術相比,本發明可以獲得包括以下技術效果:

1)本發明通過選取枳的莖段作為組培用的外植體;對莖段進行愈傷組織誘導培養形成愈傷組織;愈傷組織可通過特定培養基進行有效增殖,并逐漸分化形成不定芽;不定芽可繼續分化形成莖和葉;再通過生根培養形成不定根后進行馴化移栽,然后正常培養,解決了枳的繁殖系數低、增殖速度慢及易受細菌、真菌和病毒侵害的問題,建立了枳的高效再生體系;

2)通過莖段組織培養進行枳的愈傷組織誘導,不受地區、季節、氣候限制,可實現優質再生苗的工廠化規模化生產及實驗室脫毒再生苗的培養體系,而且遺傳性狀相對穩定一致;

3)為完善枳的遺傳轉化體系,建立分子育種的平臺,從分子水平對其進行遺傳改良,深入研究開發利用奠定了基礎。

當然,實施本發明的任一產品并不一定需要同時達到以上所述的所有技術效果。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對本發明的進一步理解,構成本發明的一部分,本發明的示意性實施例及其說明用于解釋本發明,并不構成對本發明的不當限定。在附圖中:

圖1是本發明枳的組織培養再生苗過程對比圖;圖中,A為枳莖段誘導的愈傷組織,B為愈傷組織的增殖培養,C為愈傷組織進行分化形成不定芽,D為愈傷組織開始再分化形成莖和葉,E為枳經愈傷組織形成的未生根的再生苗,F為生根培養后的完整的枳再生苗;

圖2是本發明愈傷組織切割增殖效率。

具體實施方式

以下將配合實施例來詳細說明本發明的實施方式,藉此對本發明如何應用技術手段來解決技術問題并達成技術功效的實現過程能充分理解并據以實施。

本發明公開了一種枳的組織培養再生苗的培養方法,具體包括以下步驟:

步驟1、外植體的選擇及處理:

選取枳的莖段為起始材料,消毒后作為組培用的外植體;

具體地,所述消毒具體為:材料去葉后用多菌靈1000倍液處理30min-50min,清水洗凈后流水沖洗2小時后備用;在超凈工作臺上剪成小段后轉移到無菌燒杯中;用體積分數為75%的乙醇滅菌30s,期間不斷晃動燒杯,然后用無菌水(ddH2O)清洗2-3次,再用質量分數為0.1%的HgCl2浸泡8-10min,無菌水清洗2-3次。

步驟2、愈傷組織的誘導培養:

在超凈工作臺上,將經過表面消毒的外植體轉移至無菌接種盤中,用無菌濾紙吸干外植體表面水分,用消過毒的鑷子將材料橫向接種于培養基中,并輕壓,保證材料嵌入培養基中;愈傷組織誘導的培養基為MS+6-BA1.0-2.0mg/L+IBA0.1-0.2mg/L+GA30.25-0.5mg/L,接種后20-30d形成明顯的愈傷組織;誘導出的愈傷組織切割后如圖1(A)所示;

培養條件:培養溫度25±2℃,暗培養。

愈傷組織(callus)原指植物體的局部受到創傷刺激后,在傷口表面新生的組織。是由植物創口的細胞脫分化形成的薄壁細胞,在一定條件下可進一步誘導器官再生或胚狀體而形成植株。

步驟3、愈傷組織的增殖培養:

將步驟2形成的愈傷組織經切割后轉接到愈傷組織增殖培養基MS+6-BA0.5-1.0mg/L+IBA0.1-0.2mg/L+GA30.25-0.5mg/L上進行暗培養,愈傷組織較為迅速的生長膨大,如圖1(B)所示。

切除莖段兩側切口處的愈傷組織,接到繼代培養基上;愈傷組織在上述愈傷組織增殖培養基中各組分濃度范圍內均能正常生長。

培養條件:培養溫度25±2℃,暗培養。

步驟4、愈傷組織的分化及再分化:

將增殖后的愈傷組織轉移到光下培養,通過光誘導,迅速分化形成不定芽,如圖1(C)所示;而后緩慢分化為莖和葉,如圖1(D)所示。

培養條件均為:培養溫度25±2℃,光照時間為10~12h/d,光照強度為2500-3000lux。

步驟5、生根成苗及馴化移栽

將再分化形成的莖和葉轉移到生根培養基1/2MS+IBA0.25-0.5mg/L上進行培養,如圖1(E)所示;20~30天后,長出1-2條肉質不定根,生根成苗成為新的植株,如圖1(F)所示;煉苗、緩苗后正常培養。

其中,愈傷組織誘導培養、愈傷組織增殖及分化培養及再生苗的生根培養,所用的基本培養基均為MS培養基,蔗糖用量為20~40g/L,凝固劑為瓊脂粉、用量為6~7g/L,培養基pH為5.8±0.1;其中,所添加的植物激素為6-BA:芐氨基嘌呤、IBA:吲哚丁酸、GA3:赤霉素。

進一步地,所述煉苗、緩苗具體為:先在組培室打開瓶蓋煉苗3天,然后將其移至溫室或蔭棚,再煉苗3天;然后將組培苗從培養瓶中取出,洗凈其表面的瓊脂,移栽到培養基質中進行緩苗,然后正常培養。

優選的,所述培養基質為蛭石與珍珠鹽;所述培養基質含水量25%以內,空氣相對濕度60~80%,遮光50%。

本發明利用枳的莖段在一定濃度的植物生長調節劑誘導下產生愈傷組織,愈傷組織又能進行增殖培養;又因增殖培養后的愈傷組織能經過光誘導和生根培養形成完整的再生苗;期間,能通過切割愈傷組織使之能以幾何倍數進行增殖生長,還可通過有無光誘導來調控是否進行分化與再分化,從而可實現優質種苗的規模化生產,而且遺傳性狀相對穩定一致。

其中,IBA是植物主根生長促進劑,常用于木本和草本植物的浸根移栽,硬枝桿插,能加速根的生長,提高植物生根的百分率,也可用于植物種子的浸種和拌種,可提高發芽率和成活率。6-BA的主要作用是促進芽的形成,也可以誘導愈傷組織發生。GA3為植物生長調節劑,主要用于促進作物的生長發育,提早成熟,提高產量和打破種子、塊莖、鱗莖等器官的休眠,促進發芽等。在前期愈傷組織的誘導和培養中,6-BA能有效的促進愈傷組織的發生及增殖,而赤霉素能促進愈傷組織的增殖生長。IBA可提高植物的發芽率和成活率,同時在生根培養中,能十分有效的加速根的形成與生長。

其中,6-BA的取值范圍為1.0-2.0mg/L、IBA的取值范圍為0.1-0.2mg/L、GA3的取值范圍為0.25-0.5mg/L;光照時長為10-12h/d,光照強度為2500-3000lux。6-BA在1.0mg/L的條件下能成功誘導愈傷組織,但誘導率不高,在2.0mg/L的時候誘導率最高,如再繼續添加,反而會抑制愈傷組織的發生;IBA同理,在0.1mg/L的時候能有效促進愈傷組織生長分化及生根,0.2mg/L的時候為最適濃度,但如果超過0.2mg/L,則會出現抑制效果。GA3的濃度0.25mg/L時,對芽的分化及再分化有促進作用,但不明顯,當達到0.5mg/L的時候,效果最佳,但如果繼續增加濃度,則會大幅度抑制芽的分化及再分化。光照時長和光照強度為協同作用,當光照時長為10h/d時,光照強度為2500lux時,愈傷組織能進行正常的分化和再分化,但增殖系數不高,且在生根培養條件下,葉片會出現不同程度的營養不良,表現為黃化,但不影響生根及煉苗移栽的成活率。光照時長為12h/d時,光照強度為3000lux為最佳條件。如果繼續增加其光照時長或光照強度,在愈傷組織分化和再分化中則會出現愈傷組織快速老化的現象,表現為愈傷組織表面變成淡黃色至深黃色,愈傷組織表現為疏散,且與正常愈傷組織比較為干燥,同時,老化的愈傷組織不能有效的進行分化和再分化,即使分化成不定芽,也會在再分化過程中停止再分化,變黃后衰亡。

實施例1

一種枳的組織培養再生苗的培養方法,具體包括以下步驟:

步驟1、外植體的選擇及處理:

選取枳的莖段為起始材料,消毒后作為組培用的外植體;消毒具體為:材料去葉后用多菌靈1000倍液處理30min,清水洗凈后流水沖洗2小時后備用;在超凈工作臺上剪成小段后轉移到無菌燒杯中;用75%乙醇滅菌30s,期間不斷晃動燒杯,然后用無菌水(ddH2O)清洗2-3次,再用0.1%HgCl2浸泡8-10min,無菌水清洗2-3次。

步驟2、愈傷組織的誘導培養:

在超凈工作臺上,將經過表面消毒的外植體轉移至無菌接種盤中,用無菌濾紙吸干外植體表面水分,用消過毒的鑷子將材料橫向接種于培養基中,并輕壓,保證材料嵌入愈傷組織誘導培養基中;接種后20-30d形成明顯的愈傷組織;誘導出的愈傷組織切割后如圖1(A)所示;

枳莖段愈傷組織誘導:采用愈傷組織誘導培養基,愈傷組織誘導培養基以MS為基礎培養基(含大量元素),瓊脂為6g/L,蔗糖為30g/L,培養基pH為5.8;培養溫度25℃,暗培養;其中,愈傷組織誘導培養基的植物生長調節劑濃度如表1所示:

表1愈傷組織誘導培養基的植物生長調節劑濃度

愈傷組織誘導成功率為100%,莖段兩側切口均能長出愈傷組織。

步驟3、愈傷組織的增殖培養:

將步驟2形成的愈傷組織經切割后轉接到愈傷組織增殖培養基上進行暗培養,愈傷組織較為迅速的生長膨大,如圖1(B)所示。

枳莖段愈傷組織增殖培養條件:采用愈傷組織增殖培養基,愈傷組織增殖培養基以MS為基礎培養基(含大量元素),瓊脂為6g/L,蔗糖為30g/L,培養基pH為5.8;培養溫度25℃,暗培養;愈傷組織增殖培養基的植物生長調節劑濃度如表2所示:

表2愈傷組織增殖培養基的植物生長調節劑濃度

步驟4、愈傷組織的分化及再分化:

將增殖后的愈傷組織轉移到光下培養,通過光誘導,迅速分化形成不定芽,如圖1(C)所示;而后緩慢分化為莖和葉,如圖1(D)所示。

培養條件均為:培養溫度25℃,光照時間為12h/d,光照強度為3000lux。在上述濃度下,光下培養,再分化率為80%;已分化出不定芽。未分化的主要原因為愈傷組織的老化。

步驟5、生根成苗及馴化移栽

將再分化形成的莖和葉轉移到生根培養基上進行培養,如圖1(E)所示;20~30天后,長出1-2條肉質不定根,生根成苗成為新的植株,如圖1(F)所示;煉苗、緩苗后正常培養。

生根培養條件:采用生根培養基,生根培養基以MS為基礎培養基(含大量元素),瓊脂為6g/L,蔗糖為30g/L,培養基pH為5.8;培養溫度25℃,光照時間為12h/d,光照強度為3000lux。生根培養基的植物生長調節劑濃度如表3所示:

表3生根培養基的植物生長調節劑濃度

煉苗、緩苗具體為:先在組培室打開瓶蓋煉苗3天,然后將其移至溫室或蔭棚,再煉苗3天;然后將組培苗從培養瓶中取出,洗凈其表面的瓊脂,移栽到培養基質中進行緩苗,然后正常培養。培養基質為蛭石與珍珠鹽;所述培養基質含水量25%以內,空氣相對濕度60~80%,遮光50%。

實施例2

一種枳的組織培養再生苗的培養方法,具體包括以下步驟:

步驟1、外植體的選擇及處理:

選取枳的莖段為起始材料,消毒后作為組培用的外植體;消毒具體為:材料去葉后用多菌靈1000倍液處理30min,清水洗凈后流水沖洗2小時后備用;在超凈工作臺上剪成小段后轉移到無菌燒杯中;用75%乙醇滅菌30s,期間不斷晃動燒杯,然后用無菌水(ddH2O)清洗2-3次,再用0.1%HgCl2浸泡8-10min,無菌水清洗2-3次。

步驟2、愈傷組織的誘導培養:

在超凈工作臺上,將經過表面消毒的外植體轉移至無菌接種盤中,用無菌濾紙吸干外植體表面水分,用消過毒的鑷子將材料橫向接種于培養基中,并輕壓,保證材料嵌入愈傷組織誘導培養基中;接種后20-30d形成明顯的愈傷組織;誘導出的愈傷組織切割后如圖1(A)所示;

枳莖段愈傷組織誘導:采用愈傷組織誘導培養基,愈傷組織誘導培養基以MS為基礎培養基(含大量元素),瓊脂為6g/L,蔗糖為30g/L,培養基pH為5.8;培養溫度23℃,暗培養;其中,愈傷組織誘導培養基的植物生長調節劑濃度如表4所示:

表4愈傷組織誘導培養基的植物生長調節劑濃度

愈傷組織誘導成功率為80%,部分切口未成功誘導愈傷組織。

步驟3、愈傷組織的增殖培養:

將步驟2形成的愈傷組織經切割后轉接到愈傷組織增殖培養基上進行暗培養,愈傷組織較為迅速的生長膨大,如圖1(B)所示。

枳莖段愈傷組織增殖培養條件:采用愈傷組織增殖培養基,愈傷組織增殖培養基以MS為基礎培養基(含大量元素),瓊脂為6g/L,蔗糖為30g/L,培養基pH為5.8;培養溫度25℃,暗培養;愈傷組織增殖培養基的植物生長調節劑濃度如表5所示:

表5愈傷組織增殖培養基的植物生長調節劑濃度

步驟4、愈傷組織的分化及再分化:

將增殖后的愈傷組織轉移到光下培養,通過光誘導,迅速分化形成不定芽,如圖1(C)所示;而后緩慢分化為莖和葉,如圖1(D)所示。

培養條件均為:培養溫度23℃,光照時間為10h/d,光照強度為2500lux。在上述濃度下,光下培養,再分化率為64%;已分化出不定芽。未分化的主要原因為愈傷組織的老化,且老化的愈傷組織明顯增多。

步驟5、生根成苗及馴化移栽

將再分化形成的莖和葉轉移到生根培養基上進行培養,如圖1(E)所示;20~30天后,長出1-2條肉質不定根,生根成苗成為新的植株,如圖1(F)所示;煉苗、緩苗后正常培養。

生根培養條件:采用生根培養基,生根培養基以MS為基礎培養基(含大量元素),瓊脂為6g/L,蔗糖為30g/L,培養基pH為5.8;培養溫度25℃,光照時間為10h/d,光照強度為2500lux。生根培養基的植物生長調節劑濃度如表6所示:

表6生根培養基的植物生長調節劑濃度

煉苗、緩苗具體為:先在組培室打開瓶蓋煉苗3天,然后將其移至溫室或蔭棚,再煉苗3天;然后將組培苗從培養瓶中取出,洗凈其表面的瓊脂,移栽到培養基質中進行緩苗,然后正常培養。培養基質為蛭石與珍珠鹽;所述培養基質含水量25%以內,空氣相對濕度60~80%,遮光50%。

實施例3

一種枳的組織培養再生苗的培養方法,具體包括以下步驟:

步驟1、外植體的選擇及處理:

選取枳的莖段為起始材料,消毒后作為組培用的外植體;消毒具體為:材料去葉后用多菌靈1000倍液處理30min,清水洗凈后流水沖洗2小時后備用;在超凈工作臺上剪成小段后轉移到無菌燒杯中;用75%乙醇滅菌30s,期間不斷晃動燒杯,然后用無菌水(ddH2O)清洗2-3次,再用0.1%HgCl2浸泡8-10min,無菌水清洗2-3次。

步驟2、愈傷組織的誘導培養:

在超凈工作臺上,將經過表面消毒的外植體轉移至無菌接種盤中,用無菌濾紙吸干外植體表面水分,用消過毒的鑷子將材料橫向接種于培養基中,并輕壓,保證材料嵌入愈傷組織誘導培養基中;接種后20-30d形成明顯的愈傷組織;誘導出的愈傷組織切割后如圖1(A)所示;

枳莖段愈傷組織誘導:采用愈傷組織誘導培養基,愈傷組織誘導培養基以MS為基礎培養基(含大量元素),瓊脂為6g/L,蔗糖為30g/L,培養基pH為5.8;培養溫度27℃,暗培養;其中,愈傷組織誘導培養基的植物生長調節劑濃度如表7所示:

表7愈傷組織誘導培養基的植物生長調節劑濃度

愈傷組織誘導成功率為100%,莖段兩側切口均能長出愈傷組織。

步驟3、愈傷組織的增殖培養:

將步驟2形成的愈傷組織經切割后轉接到愈傷組織增殖培養基上進行暗培養,愈傷組織較為迅速的生長膨大,如圖1(B)所示。

枳莖段愈傷組織增殖培養條件:采用愈傷組織增殖培養基,愈傷組織增殖培養基以MS為基礎培養基(含大量元素),瓊脂為6g/L,蔗糖為30g/L,培養基pH為5.8;培養溫度27℃,暗培養;愈傷組織增殖培養基的植物生長調節劑濃度如表7所示:

表7愈傷組織增殖培養基的植物生長調節劑濃度

步驟4、愈傷組織切割及再培養:

將步驟3增殖出的愈傷組織進行切割,每塊愈傷組織切割至10個小塊,然后繼續放在愈傷組織增殖培養基中進行培養,培養2-3周即可用于再次切割,也可培養4-5周,用于分化及再分化;以上操作均在無菌操作臺進行。

步驟5、愈傷組織的分化及再分化:

將增殖后的愈傷組織轉移到光下培養,通過光誘導,迅速分化形成不定芽,如圖1(C)所示;而后緩慢分化為莖和葉,如圖1(D)所示。

培養條件均為:培養溫度25℃,光照時間為12h/d,光照強度為3000lux。在上述濃度下,光下培養,再分化率為80%;已分化出不定芽。未分化的主要原因為愈傷組織的老化。

步驟6、生根成苗及馴化移栽

將再分化形成的莖和葉轉移到生根培養基上進行培養,如圖1(E)所示;20~30天后,長出1-2條肉質不定根,生根成苗成為新的植株,如圖1(F)所示;煉苗、緩苗后正常培養。

生根培養條件:采用生根培養基,生根培養基以MS為基礎培養基(含大量元素),瓊脂為6g/L,蔗糖為30g/L,培養基pH為5.8;培養溫度27℃,光照時間為12h/d,光照強度為3000lux。生根培養基的植物生長調節劑濃度如表9所示:

表9生根培養基的植物生長調節劑濃度

煉苗、緩苗具體為:先在組培室打開瓶蓋煉苗3天,然后將其移至溫室或蔭棚,再煉苗3天;然后將組培苗從培養瓶中取出,洗凈其表面的瓊脂,移栽到培養基質中進行緩苗,然后正常培養。培養基質為蛭石與珍珠鹽;所述培養基質含水量25%以內,空氣相對濕度60~80%,遮光50%。采用本發明的方法愈傷組織切割增殖效率如圖2所示,增殖培養后的愈傷組織,可經過切割,繼續進行增殖培養,愈傷組織的個數將成幾何倍數增長(以增值后的愈傷組織切割成10個較小的愈傷組織為例);切割后培養(培養至可切割大小為2-3周,培養至可誘導分化為4-5周)的愈傷組織經過可按本發明后續的技術措施進行分化及再分化、生根培養、煉苗移栽。采用本發明的繁殖方法對枳進行繁殖,在步驟2中對增殖后的愈傷組織進行切割再培養可使其增殖系數呈現幾何基數式增長,遠遠高于傳統的分株繁殖方式,采用上述通過枳的組織培養再生苗的方法,繁殖系數高,增殖速度快,且不受地區、季節、氣候限制,可實現優質再生苗的工廠化規模化生產及實驗室脫毒再生苗的培養體系。

上述說明示出并描述了發明的若干優選實施例,但如前所述,應當理解發明并非局限于本文所披露的形式,不應看作是對其他實施例的排除,而可用于各種其他組合、修改和環境,并能夠在本文所述發明構想范圍內,通過上述教導或相關領域的技術或知識進行改動。而本領域人員所進行的改動和變化不脫離發明的精神和范圍,則都應在發明所附權利要求的保護范圍內。

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本文標題:一種枳的組織培養再生苗的培養方法.pdf
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