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一種以牛大力花藥為外植體的再生方法.pdf

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一種 大力 花藥 外植體 再生 方法
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摘要
申請專利號:

CN201710016948.X

申請日:

20170111

公開號:

CN106613991A

公開日:

20170510

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01H4/00 主分類號: A01H4/00
申請人: 中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所
發明人: 李志英,黃碧蘭,徐立
地址: 570000 海南省儋州市寶島新村
優先權: CN201710016948A
專利代理機構: 海口翔翔專利事務有限公司 代理人: 莫臻
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201710016948.X

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明屬植物組培技術領域,涉及一種以牛大力花藥為外植體的再生方法,是以牛大力花藥為材料經愈傷組織誘導、胚性愈傷組織誘導及增殖,將增殖后的胚性愈傷組織誘導形成胚狀體,再由胚狀體誘導發育形成小植株,最后將小植株進行壯苗培養形成正常植株。本發明以牛大力花藥為外植體,通過愈傷組織誘導、胚性愈傷組織誘導、胚發育和胚萌發成苗的過程,建立了一種牛大力的再生體系,并創建了子葉型胚的二次誘導體系,能長期提供胚性愈傷組織,可為牛大力誘變育種、轉基因育種以及牛大力的產業化發展提供技術支持。

權利要求書

1.一種以牛大力花藥為外植體的再生方法,其特征在于,其具體步驟如下:1)、外植體獲取在牛大力盛花期,選取花瓣即將露出花萼或露出花萼1mm以內的花蕾,用0.1%HgCl消毒10min后,無菌水沖洗4次,吸干水分后取花藥;或75%酒精噴霧,于超凈工作臺吹干后取花藥;或直接依次剝掉花萼和部分花瓣,用尖頭鑷子小心的取花藥;2)、愈傷組織及胚性愈傷組織誘導將獲取的牛大力花藥接種在愈傷組織培養基上,培養溫度24~26℃,暗培養;培養25天時,肉眼可見花藥分化出少量愈傷組織;繼續培養,60天后,部分愈傷組織形成胚性愈傷組織;所述愈傷組織培養基是以改良的MS為基本培養基,并添加2,4-D3.5mg/L以下、6-BA0.2~2.0mg/L、蔗糖30g/L、卡拉膠6.5g/L,pH值為5.8;3)、胚性愈傷組織增殖誘導將胚性愈傷組織轉接子葉胚誘導培養基上,培養條件:溫度24~26℃,光照時間10~12h/d,光照強度20~30μmol·m·s;培養60~90天,部分胚性愈傷組織發育為子葉型胚;將子葉型胚切成2╳2~5mm的小塊,接入增殖培養基上,培養條件:溫度24~26℃,光照時間10~12h/d,光照強度20~30μmol·m·s;培養40天后,可分化出胚性愈傷組織;所述子葉胚誘導培養基是以改良的MS為基本培養基,并添加6-BA2mg/L以下、NAA0.5mg/L以下、CH1.0mg/L、Glu0.5mg/L、蔗糖30g/L、卡拉膠6.5g/L、10%椰子水,pH5.8;所述增殖培養基是以改良的MS為基本培養基,并添加2,4-D2.0mg/L、BA0.5mg/L、CH1.0mg/L、Glu0.5mg/L、10%椰子水、蔗糖30g/L、卡拉膠6.5g/L,pH5.8;4)、胚狀體的誘導將增殖后的胚性愈傷組織轉接到胚誘導培養基上,培養條件:溫度24~26℃,光照時間10~12h/d,光照強度20~30μmol·m·s;培養60~90天,部分胚性愈傷組織發育胚狀體;所述胚誘導培養基以改良的MS為基本培養基,添加6-BA1.0mg/L以下、NAA0.5mg/L以下、CH1.0mg/L、Glu0.5mg/L、蔗糖30g/L、卡拉膠6.5g/L,pH值為5.8;5)、胚狀體發育誘導及壯苗培養將誘導出的胚狀體單個剝離并轉接到胚發育培養基上,培養條件:溫度24~26℃,光照時間10~12h/d,光照強度20~30μmol·m·s;培養90天后,形成具有芽和根的完整小植株;將發育成的小植株轉接到壯苗培養基上,培養條件:溫度24~26℃,光照時間10~12h/d,光照強度20~30μmol·m·s;培養60天后,小植株莖伸長至5cm以上,葉片數2-3,部分展開,根系發育良好,形成壯苗;所述胚發育培養基是以改良的MS為基本培養基,并添加6-BA0.1~0.5mg/L、NAA0.01~0.15mg/L、10%CW、蔗糖30g/L、卡拉膠6.5g/L,pH5.8;所述壯苗培養基是以改良MS為基本培養基,并添加NAA0.1~0.5mg/L、IBA0.1~1.0mg/L、蔗糖30g/L、卡拉膠6.5g/L,pH5.8;上述改良的MS培養基是在MS培養基的基礎上,在其它成分和含量不變的條件下將肌醇濃度調整為200mg/L。

說明書

技術領域

本發明屬植物組培技術領域,涉及一種以牛大力花藥為材料的再生方法,具體是一種利用牛大力花藥誘導分化胚性愈傷組織后,再誘導胚狀體萌發,萌發的胚狀體發育為植株的組織培養方法。

背景技術

牛大力(Callerya speciosa),學名美麗雞血藤,又名豬腳笠、金鐘根、山蓮藕、倒吊金鐘、大力薯,為豆科(Leguminosae)雞血藤屬(Callerya)植物。牛大力是一種藥食兩用植物,我國野生分布在廣東、廣西、云南、福建和海南等地,《本草綱目》記載,牛大力具有健脾潤肺、養腎補虛、舒筋活絡之功效,適用于腎虛,血氣不旺,風濕骨痛,經常咳嗽患有急慢性支氣管炎及吸煙人士。國內南方各省,包括香港,民間有時常用牛大力泡酒、煲湯的飲食習慣,能強身健體,增強體質,提高抗病力。隨著市場需求量的不斷增加,野生資源已經接近枯竭,人工種植已成為牛大力產業化發展的有效途徑,如何獲取牛大力優良新品種已成為亟待解決的問題。

長期以來牛大力一直處于野生狀態,優良新品種稀缺,從雜合度很高的牛大力野生資源中獲得純化株系,需要很長時間的自交過程,嚴重影響了產業的發展。因此,通過組織培養技術培育牛大力優良無性系是獲得牛大力新品(系)種的有效途徑。經檢索尚未見以牛大力花藥為外植體進行再生的報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種以牛大力花藥為外植體的再生方法,利用牛大力花藥進行培養并再生,可以在短時間內純化牛大力種質,為不同種質間雜交育種提供材料。

本發明所采用的技術方案:

一種以牛大力花藥為外植體的再生方法,包括牛大力花藥獲取、愈傷組織誘導、胚性愈傷組織誘導及增殖、胚狀體誘導及發育和萌發成苗的過程,其具體步驟如下:

1、外植體獲取

在牛大力盛花期,選取花瓣即將露出花萼或露出花萼1mm以內的花蕾,用0.1%HgCl2消毒10min后,無菌水沖洗4次,吸干水分后取花藥;或75%酒精噴霧,于超凈工作臺吹干后取花藥;或直接依次剝掉花萼和部分花瓣,用尖頭鑷子小心的取花藥。污染率低于5%,存活率(不變黑或不變白者)90%以上。

2、愈傷組織及胚性愈傷組織誘導

將獲取的牛大力花藥接種在愈傷組織培養基上,培養溫度24~26℃,暗培養。培養25天時,肉眼可見花藥分化出少量愈傷組織;繼續培養,60天后,部分愈傷組織形成胚性愈傷組織。所述愈傷組織培養基是以改良的MS為基本培養基,并添加2,4-D 3.5mg/L以下、6-BA 0.2~2.0mg/L、蔗糖30g/L、卡拉膠6.5g/L,pH值為5.8。

3、胚性愈傷組織增殖誘導

將胚性愈傷組織轉接子葉胚誘導培養基上,培養條件:溫度24~26℃,光照時間10~12h/d,光照強度20~30μmol·m-2·s-1。培養60~90天,部分胚性愈傷組織發育為子葉型胚;將子葉型胚切成2×2~5mm的小塊,接入增殖培養基上,培養條件:溫度24~26℃,光照時間10~12h/d,光照強度20~30μmol·m-2·s-1。培養40天后,可二次分化出胚性愈傷組織,從而實現胚性愈傷組織增殖。所述子葉胚誘導培養基是以改良的MS為基本培養基,并添加6-BA 2mg/L以下、NAA 0.5mg/L以下、水解乳蛋白(CH)1.0mg/L、谷氨酰胺(Glu)0.5mg/L、蔗糖30g/L、卡拉膠6.5g/L、10%椰子水(CW),pH5.8。所述增殖培養基是以改良的MS為基本培養基,并添加2,4-D 2.0mg/L、BA 0.5mg/L、CH 1.0mg/L、Glu 0.5mg/L、10%椰子水、蔗糖30g/L、卡拉膠6.5g/L,pH5.8。

4、胚狀體的誘導

將增殖后的胚性愈傷組織轉接到胚誘導培養基上,培養條件:溫度24~26℃,光照時間10~12h/d,光照強度20~30μmol·m-2·s-1。培養60~90天,部分胚性愈傷組織發育胚狀體。所述胚誘導培養基以改良的MS為基本培養基,添加6-BA 1.0mg/L以下、NAA 0.5mg/L以下、CH 1.0mg/L、Glu 0.5mg/L、蔗糖30g/L、卡拉膠6.5g/L,pH值為5.8。

5、胚狀體發育誘導及壯苗培養

將誘導出的胚狀體單個轉接到胚發育培養基上,培養條件:溫度24~26℃,光照時間10~12h/d,光照強度20~30μmol·m-2·s-1。培養90天后,形成具有芽和根的完整小植株。將發育成的小植株轉接到壯苗培養基上,培養條件:溫度24~26℃,光照時間10~12h/d,光照強度20~30μmol·m-2·s-1。培養60天后,小植株莖伸長至5cm以上,葉片數2-3,部分展開,根系發育良好,形成壯苗。所述胚發育培養基是以改良的MS為基本培養基,并添加6-BA 0.1~0.5mg/L、NAA 0.01~0.15mg/L、10%CW、蔗糖30g/L、卡拉膠6.5g/L,pH 5.8。所述壯苗培養基是以改良MS為基本培養基,并添加NAA 0.1~0.5mg/L、IBA 0.1~1.0mg/L、蔗糖30g/L、卡拉膠6.5g/L,pH 5.8。

上述改良的MS培養基是在MS培養基的基礎上,在其它成分和含量不變的條件下將肌醇濃度提高到原來的2倍,即肌醇的濃度為200mg/L。

本發明以牛大力花藥為外植體,通過愈傷組織誘導、胚性愈傷組織誘導、胚發育和胚萌發成苗的過程,建立了一種牛大力的組織培養體系,并創建了子葉型胚的二次胚性愈傷組織誘導體系,能長期提供胚性愈傷組織,可為牛大力誘變育種、轉基因育種以及牛大力的產業發展提供技術支持。

具體實施方式

下面結合實施例,對本發明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發明,但不用來限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規條件,或按照制造廠商所建議的條件。

一、牛大力花藥培養及植株再生

本發明實施例中所采用的改良的MS培養基是在MS培養基的基礎上,將其中的肌醇濃度提高到原來的2倍,即肌醇的濃度為200mg/L,其它成分和含量不變。

實施例一

1、外植體獲取

在牛大力盛花期,取花瓣即將露出花萼或露出花萼1mm以內的花蕾,用0.1%HgCl2消毒10min后,無菌水沖洗4次,吸干水分后,依次剝掉花萼和部分花瓣,用尖頭鑷子小心的取花藥。

2、愈傷組織及胚性愈傷組織誘導

將花藥接種在愈傷組織培養基(改良MS+1.5mg/L 2,4-D+1.5mg/L 6-BA+蔗糖30g/L+卡拉膠6.5g/L,pH值為5.8)上,培養溫度24~26℃,暗培養。培養25天時,肉眼可見花藥分化出少量愈傷組織;在不更換培養基、不繼代的條件下繼續培養,60天后,部分愈傷組織形成胚性愈傷組織。

3、胚性愈傷組織增殖誘導

將胚性愈傷組織轉接子葉胚誘導培養基(改良MS+0.8mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+1.0mg/L CH+0.5mg/L Glu+10%CW+30g/L蔗糖+6.5g/L卡拉膠,pH5.8)上,培養條件:溫度24~26℃,光照時間10~12h/d,光照強度20~30μmol·m-2·s-1。培養60~90天,部分胚性愈傷組織發育為子葉型胚。將子葉型胚切成2×2~5mm的小塊,接入增殖培養基(改良MS+2.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L BA+1.0mg/L CH+0.5mg/L Glu+10%CW+蔗糖30g/L+卡拉膠6.5g/L,pH 5.8)上,培養條件:溫度24~26℃,光照時間10~12h/d,光照強度20~30μmol·m-2·s-1。培養40天后,多數外植體可分化出胚性愈傷組織,部分外植體可分化出次生子葉型胚。

4、胚狀體的誘導

將增殖后的胚性愈傷組織轉接到胚誘導培養基(改良MS+0.3mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+1.0mg/L CH+0.5mg/LGlu+蔗糖30g/L+卡拉膠6.5g/L,pH值為5.8)上,培養條件:溫度24~26℃,光照時間10~12h/d,光照強度20~30μmol·m-2·s-1。培養60~90天,部分胚性愈傷組織發育成胚狀體。

5、胚狀體發育誘導及壯苗培養

將誘導出的胚狀體單個剝離并轉接到胚發育培養基(改良MS+0.15mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+10%CW+30g/L蔗糖+6.5g/L卡拉膠,pH 5.8)上,培養條件:溫度24~26℃,光照時間10~12h/d,光照強度20~30μmol·m-2·s-1。培養90天后,形成具有芽和根的完整小植株。將發育成的小植株轉接到壯苗培養基(改良MS+0.15mg/L NAA+0.5mg/L IBA+蔗糖30g/L+卡拉膠6.5g/L,pH5.8)上,培養條件:溫度24~26℃,光照時間10~12h/d,光照強度20~30μmol·m-2·s-1。培養60天后,小植株莖伸長至5cm以上,葉片數2-3,部分展開,根系發育良好,形成壯苗。

實施例二

1、外植體獲取

在牛大力盛花期,取花瓣即將露出花萼或露出花萼1mm以內的花蕾,用75%酒精噴霧,于超凈工作臺吹干后取花藥,依次剝掉花萼和部分花瓣,用尖頭鑷子小心的取花藥。

2、愈傷組織及胚性愈傷組織誘導

將花藥接種在愈傷組織培養基(改良MS+2.0mg/L 2,4-D+1.0mg/L 6-BA+蔗糖30g/L+卡拉膠6.5g/L,pH值為5.8)上,培養溫度24~26℃,暗培養。培養25天時,肉眼可見花藥分化出少量愈傷組織;在不更換培養基、不繼代的條件下繼續培養,60天后,部分愈傷組織形成胚性愈傷組織。

3、胚性愈傷組織增殖誘導

將胚性愈傷組織轉接子葉胚誘導培養基(改良MS+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+1.0mg/L CH+0.5mg/L Glu+10%CW+30g/L蔗糖+6.5g/L卡拉膠,pH5.8)上,培養條件:溫度24~26℃,光照時間10~12h/d,光照強度20~30μmol·m-2·s-1。培養60~90天,部分胚性愈傷組織發育為子葉型胚。將子葉型胚切成2×2~5mm的小塊,接入增殖培養基(改良MS+2.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L BA+1.0mg/L CH+0.5mg/L Glu+10%CW+蔗糖30g/L+卡拉膠6.5g/L,pH5.8)上,培養條件:溫度24~26℃,光照時間10~12h/d,光照強度20~30μmol·m-2·s-1。培養40天后,多數外植體可分化出胚性愈傷組織,部分外植體可分化出次生子葉型胚。

4、胚狀體的誘導

將增殖后的胚性愈傷組織轉接到胚誘導培養基(改良MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+1.0mg/L CH+0.5mg/LGlu+蔗糖30g/L+卡拉膠6.5g/L,pH值為5.8)上,培養條件:溫度24~26℃,光照時間10~12h/d,光照強度20~30μmol·m-2·s-1。培養60~90天,部分胚性愈傷組織發育成胚狀體。

5、胚狀體發育誘導及壯苗培養

將誘導出的胚狀體單個剝離并轉接到胚發育培養基(改良MS+0.2mg/L6-BA+0.05mg/L NAA+10%CW+30g/L蔗糖+6.5g/L卡拉膠,pH 5.8)上,培養條件:溫度24~26℃,光照時間10~12h/d,光照強度20~30μmol·m-2·s-1。培養90天后,形成具有芽和根的完整小植株。將發育成的小植株轉接到壯苗培養基(改良MS+0.2mg/L NAA+0.8mg/L IBA+蔗糖30g/L+卡拉膠6.5g/L,pH5.8)上,培養條件:溫度24~26℃,光照時間10~12h/d,光照強度20~30μmol·m-2·s-1。培養60天后,小植株莖伸長至5cm以上,葉片數2-3,部分展開,根系發育良好,形成壯苗。

實施例三

1、外植體獲取

在牛大力盛花期,取花瓣即將露出花萼或露出花萼1mm以內的花蕾,直接在超凈工作臺上剝取花藥:依次剝掉花萼和部分花瓣,用尖頭鑷子小心的取花藥。

2、愈傷組織及胚性愈傷組織誘導

將花藥接種在愈傷組織培養基(改良MS+3.0mg/L 2,4-D+1.5mg/L 6-BA+蔗糖30g/L+卡拉膠6.5g/L,pH值為5.8)上,培養溫度24~26℃,暗培養。培養25天時,肉眼可見花藥分化出少量愈傷組織;在不更換培養基、不繼代的條件下繼續培養,60天后,部分愈傷組織形成胚性愈傷組織。

3、胚性愈傷組織增殖誘導

將胚性愈傷組織轉接子葉胚誘導培養基(改良MS+1.5mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+1.0mg/L CH+0.5mg/L Glu+10%CW+30g/L蔗糖+6.5g/L卡拉膠,pH5.8)上,培養條件:溫度24~26℃,光照時間10~12h/d,光照強度20~30μmol·m-2·s-1。培養60~90天,部分胚性愈傷組織發育為子葉型胚。將子葉型胚切成2×2~5mm的小塊,接入增殖培養基(改良MS+2.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L BA+1.0mg/L CH+0.5mg/L Glu+10%CW+蔗糖30g/L+卡拉膠6.5g/L,pH5.8)上,培養條件:溫度24~26℃,光照時間10~12h/d,光照強度20~30μmol·m-2·s-1。培養40天后,多數外植體可分化出胚性愈傷組織,部分外植體可分化出次生子葉型胚。

4、胚狀體的誘導

將增殖后的胚性愈傷組織轉接到胚誘導培養基(改良MS+0.8mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+1.0mg/L CH+0.5mg/LGlu+蔗糖30g/L+卡拉膠6.5g/L,pH值為5.8)上,培養條件:溫度24~26℃,光照時間10~12h/d,光照強度20~30μmol·m-2·s-1。培養60~90天,部分胚性愈傷組織發育成胚狀體。

5、胚狀體發育誘導及壯苗培養

將誘導出的胚狀體單個剝離并轉接到胚發育培養基(改良MS+0.4mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+10%CW+30g/L蔗糖+6.5g/L卡拉膠,pH 5.8)上,培養條件:溫度24~26℃,光照時間10~12h/d,光照強度20~30μmol·m-2·s-1。培養90天后,形成具有芽和根的完整小植株。將發育成的小植株轉接到壯苗培養基(改良MS+0.3mg/L NAA+0.8mg/L IBA+蔗糖30g/L+卡拉膠6.5g/L,pH5.8)上,培養條件:溫度24~26℃,光照時間10~12h/d,光照強度20~30μmol·m-2·s-1。培養60天后,小植株莖伸長至5cm以上,葉片數2-3,部分展開,根系發育良好,形成壯苗。

二、牛大力花藥培養效果鑒定

1、愈傷組織誘導效果鑒定

為鑒定牛大力花藥誘導形成愈傷組織、胚性愈傷組織的效果,對上述實施例的誘導分化情況進行觀察,統計花藥誘導愈傷組織誘導數、胚性愈傷組織數,計算誘導率,結果見表1。

表1牛大力花藥誘導情況

上述結果表明,本發明采用牛大力花藥作為外植體誘導形成愈傷組織,繼續培養后,愈傷組織形成胚性愈傷組織,具有較高的誘導率。

2.子葉胚誘導及增殖效果鑒定

為鑒定胚性愈傷組織誘的增殖效果,對上述實施例的胚性愈傷組織誘導子葉胚及子葉胚切塊誘導增殖情況進行觀察,統計誘導數,計算誘導率、增殖系數,結果見表2、表3。

表2子葉胚的誘導情況

項目 胚性愈傷組織塊數 形成子葉胚的塊數 誘導率 實施例一 10 2 20% 實施例二 10 4 40% 實施例三 10 3 30%

表3子葉胚的增殖情況

項目 子葉胚切塊數 形成胚性愈傷組織的塊數 誘導率 增殖系數 實施例一 100 50 50% 120倍 實施例二 100 90 90% 150倍 實施例三 100 76 38% 140倍

上述結果表明,本發明利用胚性愈傷組織誘導形成子葉胚后,誘導子葉胚二次分化胚性愈傷組織的方式進行增殖,效果明顯。

3、胚性愈傷組織的發育效果鑒定

為考察增殖后的胚性愈傷組織的發育情況,對上述實施例中胚性愈傷組織誘導成胚狀體情況進行觀察,統計胚狀體數,計算誘導率。結果見表4。

表4胚性愈傷組織的發育情況

項目 胚性愈傷組織塊數 形成胚狀體的塊數 誘導率 實施例一 200 56 28% 實施例二 200 80 40% 實施例三 200 64 32%

上述結果表明,本發明以增殖后的胚性愈傷組織為材料,誘導形成胚狀體的效果較為明顯,誘導率最高可達40%。

4、胚狀體發育及壯苗培養效果鑒定

為鑒定所胚狀體的發育情況,對上述實施例中的胚狀體進行誘導培養,并對萌發的胚狀體進行壯苗培養,統計萌發數和壯苗數,計算萌發率及壯苗形成率,結果見表5。

表5胚狀體萌發及壯苗培養情況

上述結果表明,本發明利用胚狀體誘導形成小植株并進行壯苗培養,具有較高的胚狀體萌發率和壯苗形成率。

以上所述僅是本發明的優選實施方式,應當指出,對于本技術領域的普通技術人員來說,在不脫離本發明技術原理的前提下,還可以做出若干改進和潤飾,這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。

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