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營養 組合 制備 方法
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摘要
申請專利號:

CN90103903.9

申請日:

19900424

公開號:

CN1030686C

公開日:

19960117

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有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A23L1/305 主分類號: A23L1/305
申請人: 協和發酵工業株式會社
發明人: 古川忠康,原孝博
地址: 日本東京
優先權: 104261/89,334483/89
專利代理機構: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 代理人: 唐偉杰
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法律狀態
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CN90103903.9

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摘要

用作氨基酸浸劑的營養組合物包含L-谷氨酰-L-胱氨酸和/或谷氨酰-L-半胱氨酸二硫化物。該營養組合物能獲取半胱氨酸和胱氨酸的極高利用,而半胱氨酸和胱氨酸迄今為止尚不能用于營養組合物。

權利要求書

1.??制備一種營養組合物的方法,其包括將含0.0005—30%(重量)L—谷氨酰—L—半胱氨酸和/或L—谷氨酰—L—半胱氨酸二硫化物與營養用栽體混合。

說明書

?

本發明涉及用于哺乳動物的營養組合物,如浸劑和運動飲料, 的制備方法。更具體地說,涉及的是含有L—谷氨酰—L—胱氨酸 (以下稱為Glu—Cys—Cys)和/或L—谷氨酰—L—半胱氨酸二硫化 物〔以下稱為(Clu—Cys)2〕的營養組合物的制備方法。

L—半胱氨酸(以下稱為半胱氨酸)被認為不是必須氨基酸,因 為半胱氨酸在生物體內可由L—蛋氨酸(以下稱為蛋氨酸)合成,因 此,含硫氨基酸如半胱氨酸的營養補充是利用蛋氨酸。但是,近幾年 來,已揭示出在新生兒以及肝硬化和有高胱氨酸血癥等病人的身體內, 蛋氨酸不能充分轉化為半胱氨酸。由此提出為了補充含硫氨基酸營養 源,不僅需要提供蛋氨酸,而且還需提供半胱氨酸〔新陳代謝,第 37卷,第8期,P796(1988)〕。

已經進一步揭示出,過度鍛煉和飲酒后,人體對含硫氨基酸的需 求量增加,并認識到使用半胱氨酸或具有一個半胱氨酸基的L—谷胱 甘肽(γ—L—谷氨酰—L—半胱氨酰—甘氨酸,本文后稱谷胱甘肽) 的有效性。

半胱氨酸在溶液中不穩定,因此很難將半胱氨酸直接加到浸劑之 類的液體營養組合物中。已對利用N—乙酰基—L—半胱氨酸代替半 胱氨酸進行了研究,而且已部分付諸實踐。然而,發現其穩定性存在 問題。另外,雖然具有一個半胱氨酸基的谷胱甘肽比半胱氨酸要穩 定,但當其被加熱滅菌時問題仍未解決。另一方面,從營養學觀點看, L—胱氨酸(本文后稱胱氨酸)被認為與半胱氨酸等價,由于L—胱 氨酸為半胱氨酸的氧化形式,所以它極其穩定,然而,胱氨酸在水中 的溶解性很低(小于0.11克/升,25℃),故它不能用于浸劑 等中。為此,最近巳試驗使用具有一個胱氨酸基(谷胱甘肽的氧化形 式)的谷胱甘肽二硫化物,但尚未提供實際用途。

作為改進半胱氨酸穩定性的一種方法,有已知的如上所述半胱氨 酸的乙酰化方法,該方法已部分實際用于浸劑處方。考慮到胱氨酸從 營養學觀點與半胱氨酸等價,研究了采用具有一個胱氨酸基的谷胱甘 肽二硫化物和將胱氨酸轉化為肽來改進溶解性的方法。作為包括含胱 氨酸的肽的營養組合物,已知的有:一種含N,N?′一雙-α-L-天門 冬氨酰—L—胱氨酸〔本文后稱(Asp—Cys)2〕的組合物(日 本特許公開151156/87);一種含N2—半胱氨酰—N6— L—半胱氨酰—L—賴氨酸〔本文后稱Cys—Lys(Cys)〕的 組合物(DE3206810);一種含有以(X—Cys)2為代表 的化合物(其中X是甘氨酰Gly,丙氨酰Ala,亮氨酰Leu,異亮 氨酰Ile或苯丙氨酰Phe)的組合物(EP264953);一種 含有雙(乙酰甘氨酰)—L,L—胱氨酸的組合物(日本特許公開 233999/88),以及等組合物。另外,在Clin.Nutr. SPec.Supp/.4,P116—123(1985)上有一篇關 于L—半胱氨酰—雙—L—丙氨酸〔本文后稱(Cys—Ala)2〕 溶解性的報導,在“營養雜志”118,P1470(1988)上 有一篇關于雙—α—L—丙氨酰—L—胱氨酸〔本文后稱(Ala— Cys)2〕和雙—甘氨酰—L—胱氨酸〔本文后稱(Gly—Cys)2〕 在血液中的情況的報導。

為了將不穩定的半胱氨酸或與半胱氨酸在營養學上等價的胱氨酸 作為營養組合物供給由加熱滅菌而制備的液體物中,提出要求開發一 項技術。

本發明提供了能將半胱氨酸引入體內系統,但不合半胱氨酸的營 養組合物,該組合物含有Clu—Cys—Cys和/或(Glu—Cys)2, 其含量足以增加上述系統中的半胱氨酸水平。利用這種營養組合物, 可將不能包含在通過加熱滅菌而制備的液體營養組合物中的半胱氨酸 或胱氨酸作為營養成份供給。

本發明還提供了使上述肽通過口服、非腸道或腸內給藥而將半胱 氨酸引入體內系統的方法。

圖1表示對鼠注射γ—Glu—Cys—Cys后,經過一段時間, 血液中γ—Glu—Cys—Cys及其氨基酸組分的濃度變化,符 號 和 分別代表γ—Glu—Cys—Cys 谷氨酸和胱氨酸。

圖2表示對鼠注射(γ—Glu—Cys)2后,經過一段時間, 血液中(γ—Glu—Cys)2,γ—Glu—Cys—Cys及 其氨基酸組分的濃度變化,符號 和 分 別代表(γ—Glu—Cys)2和γ—Glu—Cys—Cys,谷 氨酸和胱氨酸。

圖3表示對鼠注射(Ala—Cys)2后經過一段時,血液中 (Ala—Cys)2、丙氨酰胱氨酸〔本文后稱Ala—(Cys)2〕 及其氨基酸組分的濃度變化,符號 和 分別代表(Ala—Cys)2,Ala—(Cys)2,丙氨酸和胱氨 酸,

圖4表示對鼠注射γ—Glu—Cys—Cys,(γ—Glu— Cys)2和(Ala—Cys)2后,經過一段時間,腎中谷氨酸和 丙氨酸的濃度變化,符號 和 分別代表由γ— Glu—Cys—Cys衍生的谷氨酸,由(γ—Glu—Cys)2衍生的谷氨酸和由(Ala—Cys)2衍生的丙氨酸。

下面詳細說明本發明。

Glu—Cys—Cys和(Glu—Cys)2分成兩類,α和γ, 兩種類型都可用于本發明,但優選使用γ型。

Glu—Cys—Cys和(Glu—Cys)2可按照“酶學方 法”〔113,P555—564(1985))中介紹的方法制備。

通常以溶液,膏狀體和粉末等形式與其它組分如氨基酸和營養 物一起使用,但也可以以不含其它組分的溶液形式使用。

Glu—Cys—Cys和(Glu—Cys)2可單獨或作為混合 物加入,營養組合物既可含有這些化合物;又可含混合物,其量為 0.0005—30%(重量)。

從營養學角度看,為補充胱氨酸或半胱氨酸,優選的營養組合物 實例包括Glu—Cys—Cys和/或(Glu—Cys)2的水溶 液,生理鹽水或緩沖溶液以及含有Glu—Cys—Cys和/或 (Glu—Cys)2與氨基酸或蛋白質水解物(肽)和如下所述營養 添加劑等的組合物,如氨基酸浸劑。為補充營養的口服營養制劑和膠 狀營養制劑。

在口服或腸內給藥的情況下,可將營養添加劑如易消化的碳水化 合物,脂肪,維生素和礦物質如入到組合物中以調節平衡營養。另外, 還可以加入增味劑如人工增味劑、甜味劑、香料和染料、增香劑以及 外觀改善劑等,從而改進口服給藥組合物的味道。營養添加剎的具體 例子包括淀粉、糊精、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、脫脂乳、蛋黃粉、蛋 黃油、麥芽提取物、中鏈脂肪酸、維生素A、維生素B1、維生素 B2、維生素B6、煙堿酸、泛酸、維生素B12、L—抗壞血酸、 α—生育酚、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣和乳酸鐵。

將上述組分摻混,與水混合并分散,形成的組合物作為飲料或糊 狀物封裝于防濕的袋、瓶、罐等之中,然后力加熱滅菌,儲存,銷售和 使用。另一種方法是,將上述組分以粉末狀均勻混合,該粉狀組合物 可以在貯存或銷售或使用前再與水混合并分散。Glu—Cys— Cys和(Glu—Cys)2可以隨意進行處理,如加熱蒸煮和滅菌, 因為它們對熱高度穩定,并能在溶液中穩定很長時間。

含有Glu—Cys—Cys和/或(Glu—Cys)2的氨基 酸浸劑具有如下所列成份,其中單位為毫克/分升:

L—異亮氨酸??????????????????160—1070

L—亮氨酸????????????????????180—1720

L—賴氨酸鹽酸鹽??????????????180—2400

L—苯丙氨酸??????????????????130—1400

L—蛋氨酸?????????????????????50—1200

L—蘇氨酸?????????????????????80—720

L—色氨酸?????????????????????30—350

L—纈氨酸?????????????????????70—1130

L—精氨酸鹽酸鹽??????????????120—1500

L一組氨酸鹽酸鹽???????????????50—900

甘氨酸???????????????????????200—2500

L—丙氨酸?????????????????????70—1130

L—天門冬氨酸鈉???????????????0—1300

L—谷氨酸鈉?????????????????0—1300

Glu—Cys—Cys???????????????1—7000

和/或(Glu—Cys)2

L—脯氨酸???????????????????90—1080

L—絲氨酸???????????????????60—1200

L—酪氨酸???????????????????3—90

按照制備氨基酸浸劑的常規方法,例如根據以下實施例1所示方 法,本發明的氨基酸浸劑能從上述氨基酸組合物獲得。

如下述比較例1所示,已證實了Glu—Cys—Cys和 (Glu—Cys)2比胱氨酸具有高得多的溶解性,而且甚至在加熱 滅菌時,或者以營養組合物形式保存很長時間后也極其穩定。例如, 這些物質在濃度為10毫摩爾(mM),PH=6.5時,于110 ℃加熱20分鐘難于分解,進一步說,這些物質在濃度為10mM, PH=6.5時,于40℃下保持60天不會分解。 比較例1

對γ—Glu—Cys—Cys和(γ—Glu—Cys)2與胱氨酸 和已知的含胱氨酸的肽的溶解性進行比較,可以證實γ—Glu Cys—Cys和(γ—Glu—Cys)2的溶解性比胱氨酸有顯著 提高。

表1

??????????????在1000毫升水中的溶解性(克) γ—Glu—Cys—Cys????????????????>70 (γ—Glu—Gys)2?????????????????>70 Cys—Lys(Cys)????????????????????>50 (Asp—Cys)2?????????????????????>50 (Gly—Cys)2?????????????????????>50 (Ala—Cys)2?????????????????????>50 (Cys—Ala)2?????????????????????8.1 胱氨酸???????????????????????????0.1???????????

???????????????????????PH=6.5,25℃

γ—Glu—Cys—Cys和(γ—Glu—Cys)2為天然 存在的肽,因此可以有效地在體內利用。事實上,有報導說當單獨將 這些化合物對鼠進行皮下注射時,它們能用來合成腎谷胱甘肽 〔Prcc.Natl.Acad.Sci.作者:M.E.Anderson 和A.Meister,美國,第80卷,P707(1983)〕。另 外,可以假設γ—Glu—Cys—Cys和(γ—Glu—Cys)2是體內γ—谷酰基轉移酶的底物,并且能在體內有效地利用。

下面涉及的比較例2—6描述了在注射后,γ—Glu—Cys —Cys和(γ—Glu—Cys)2在γ—谷酰基轉移酶作用下的水 解,在人體和鼠的血漿中它們的體外水解作用,以及從血液中消失而 由腎吸收的作用。 比較例2

按照下述試驗方法,將γ—Glu—Cys—Cys Glu—Cys—Cys和(γ—Glu—Cys)2在γ—谷酰基轉 移酶作用下的水解與(Asp—Cys)2,(Gly—Cys)2和 (Ala—Cys)2的水解進行比較,用于本發明的前兩個化合物幾 乎完全水解,而后三個已知化合物不發生水解,因此認識到這些肽之 間對于體內的利用存在差別。

〔試驗方法〕

將肽以5mM濃度溶解于三羥甲基氨基甲烷—鹽酸緩沖溶液 (PH7)中,并將由豬腎制取的γ—谷酰基轉移酶加入該溶液中, 于37℃下反應120分鐘,測定殘留的肽量。

比較例3

按照下述試驗方法,將γ—Glu—Cys—Cys和(γ— Glu—Cys)2在人體血漿中的體外水解作用與如表2所示的已知 的含胱氨酸肽的水解進行比較,正如表2所顯示的,用于本發明的前 兩個化合物與后三個已知化合物相比。前者在血漿中的水解困難,因 此認識到這些肽之間對于體內的利用存在著明顯的差別。

〔試驗方法〕

從人體采集并制取100微升血漿,向其中加入10微升24 mM濃度的含肽生理鹽水溶液,于37℃下反應30分鐘,測定殘留 的肽量。

表2

?????????????????????????血漿中殘留量(%)

γ—Glu—Cys—Cys???????????????67

(γ—Glu—Cys)2????????????????85

(Asp—Cys)2????????????????????30

(Gly—Cys)2????????????????????35

(Ala—Cys)2????????????????????26

比較例4

按照下述試驗方法,γ—Glu—Cys—Cys和(γ— Glu—Cys)2于鼠血漿中在體外的水解與(Ala—Cys)2的 水解進行比較。

如表3所示,用于本發明的前兩個化合物與(Ala—Cys)2相比,前者在血漿中的水解困難。

〔試驗方法〕

從C3H/He鼠(6周齡,雄性,重22克)采集并制取50 微升血漿,向其中加入5微升27.1mM濃度的含肽生理鹽水溶液, 然后于37℃下反應30分鐘,以5只鼠作為一個試驗組,結果用平 均值表示。

表3

???????????????????????????血漿中殘留量(%)

γ—Glu—Cys—Cys????????????????53

(γ—Glu—Cys)2?????????????????84

(Ala—Cys)2?????????????????????0

比較例5

按照下述試驗方法。比較γ—Glu—Cys—Cys和(γ— Glu—Cys)2與(Ala—Cys)2從鼠血液中消失的情況, (Ala—Cys)2給藥后非常迅速地從血液中消失,并且同時能觀 察到有丙氨酸迅速釋放到血液中,另一方面,分別接受γ—Glu— Cys—Cys和(γ—Glu—Cys)2的試驗組,其肽量減少和 谷氨酸增加則是平緩的。由此認識到肽從血液的消失情況存在著很大 的差異。

〔試驗方法〕

將含γ—Glu—Cys—Cys,(γ—Glu—Cys)2和 (Ala—Cys)2的生理鹽水溶液分別通過尾靜脈注射到C3HC3H/He 鼠試驗組(6周齡,雄性,重22克),用藥劑量為 250微摩爾/每千克體重,然后于30分鐘內采集血樣,測定出在 這段時間內血液中肽濃度的變化和它們的氨基酸組成濃度變化。以5 只鼠作為一個試驗組,結果用平均值±SEM表示,見表4。

表4

??????????????????????????????????????????????????????????單位:μM

????????????????????????????????注射肽后的時間(分鐘) 血液中濃度???0????????1??????????2???????5???????10???????20???????30 ?GCC????????????????217.8??????190.0????88.7????50.5?????10.5?????2.8

?????????0??????±19.7?????±9.3????±6.7???±5.7????±3.7????±1.8 ?Glu???????64.5?????86.2???????94.0?????97.2????110.4????93.4?????86.9

???????±1.7????±2.7??????±7.6????±4.1???±5.7????±7.4????±6.2 ?CysCys????6.84?????37.8???????39.0?????58.5????56.9?????34.0?????24.3

???????±1.6????±2.3??????±2.0????±2.9???±5.3????±1.0????±1.6 ?GCCG???????????????376.7??????249.9????90.6????32.3?????5.3

?????????0??????±30.1?????±22.5???±9.9???±2.1????±0.5????0 ?GCC????????????????26.8???????31.5?????46.4????46.0?????21.1?????9.0

?????????0??????±1.8??????±2.4????±2.1???±2.3????±1.2????±0.4

表4(續)

???????????????????????????????????????????????????????單位:μM

?????????????????????????????????注射肽后的時間(分鐘) 血液中濃度?????0???????1????????2????????5?????10????????20???????30 ?Glu?????????64.5????118.8????121.8????99.0???104.5?????87.5?????90.7

?????????±1.7???±1.3????±10.1???±6.1??±1.1?????±4.9????±8.6 ?CysCys??????6.84????10.5?????13.1?????23.1????27.9?????30.1?????23.6

?????????±1.6???±0.3????±2.3????±0.9???±1.3????±1.2????±0.6 ?ACCA????????????????70.1?????24.9???????

???????????0?????±5.7????±10.8?????0???????0????????0????????0 ?ACC?????????18.0????5.7??????????????????

???????????0?????±1.4????±2.3??????0???????0????????0????????0 ?Ala?????????241.6???615.9????471.1????387.6???267.1????240.3????220.4

?????????±19.7??±31.4???±11.9???±5.8???±9.3????±11.6???±0.1 ?CysCys??????6.84????42.6?????43.4?????44.8????35.1?????19.6?????18.4

?????????±1.6???±3.1????±7.1????±4.0???±1.2????±1.5????±1.5

GCC:γ—Glu—Cys—Cys?GCCG:(γ-Glu-Cys)2ACCA:(Ala-Cys)2

ACC:Ala—(Cys)2

比較例6

按照下述試驗方法,比較γ—Glu—Cys—Cys和(γ—Glu —Cys)2與(Ala—Cys)2被鼠腎的吸收。

在分別接受了γ—Glu—Cys—Cys和(γ—Glu—Cys)2的試驗組中,谷氨酸濃度極其高,這說明肽被腎吸收并且有效利用了。 另一方面,對任何試驗的肽,未在腎中檢測到胱氨酸。 〔試驗方法〕

將含γ—Glu—Cys—Cys,(γ—Glu—Cys)2和 (Ala—Cys)2的生理鹽水溶液分別通過尾靜脈注射到C3H/ He鼠試驗組(6周令、雄性、重22克),用藥劑量為250微摩 爾/每千克體重,在用藥1,5和20分鐘后切開腎,然后測定腎中 的谷氨酸、丙氨酸和胱氨酸。以5只鼠為一試驗組,結果用平均值 ±SEM表示,見表5。

表5 單位微摩爾/克腎濕重 施用肽后的時間(分鐘)

????0??????????1????????5????????20 Glu????5.54??????13.09????20.32?????15.1 (GCC)??±0.3?3???±0.23???±1.18????±1.23 Glu????5.54??????14.82????22.5??????18.14 (GCCG)?±0.3?????±0.75???±1.00????±3.37 Ala????2.33??????2.87?????2.59??????2.16 (ACCA)?±0.11????±0.18???±0.28????±0.31

如上所示,γ—Glu—Cys—Cys和(γ—Glu—Cys)2與其它含胱氨酸的肽相比,前者在血漿中難于水解,并且只能由γ— 谷酰基轉移酶水解。γ—谷酰基轉移酶廣泛分布在腎、小腸、肝等的 生命組織中。當γ—Glu—Cys—Cys和/或(γ—Glu—Cys)2施用于血液時,與已知的含胱氨酸的肽對照,它們能在腎、肝等內被 利用而幾乎不在血液中水解。另一方面,當γ—Glu—Cys—Cys 和/或(γ—Glu—Cys)2口服或腸內給藥時,認為它們在小腸 內通過谷酰基轉移酶進行水解,而且經腸道被有效利用。此外,認為 γ—Glu—Cys—Cys和(γ—Glu—Cys)2也被細胞吸收。

本發明的一些實施方式由下列有代表性的實施例給出。 實施例1

在下述氨基酸組合物中,于70℃下,加入1升注射用蒸餾水以 溶解這些成份。用NaOH溶液調節PH至6.5,該溶液經過微孔 過濾器過濾,濾液按200毫升一份裝入玻璃瓶,接著用無菌氮吹掃 30秒鐘,然后封口,將瓶子于110℃下加熱60分鐘滅菌,從而 制得氨基酸浸劑。

L—異亮氨酸??????????????????????4.6克

L—亮氨酸????????????????????????7.7克

L—賴氨酸鹽酸鹽??????????????????5.0克

L—苯丙氨酸??????????????????????4.3克

L—蛋氨酸????????????????????????2.1克

L—蘇氨酸????????????????????????2.9克

L—色氨酸????????????????????????1.0克

L—纈氨酸????????????????????????4.9克

L—精氨酸鹽酸鹽????????????????6.1克

L—組氨酸鹽酸鹽????????????????2.6克

甘氨酸?????????????????????????3.4克

L—丙氨酸??????????????????????4.6克

L—天門冬氨酸鈉????????????????0.3克

L—谷氨酸鈉????????????????????0.3克

γ—Glu—Cys—Cys??????????????3.0克

L—脯氨酸??????????????????????3.9克

L—絲氨酸??????????????????????2.3克

L—酪氨酸??????????????????????0.3克 實施例2

在下述氨基酸組合物中,于70℃下,加入1升注射用蒸餾水以 溶解這些成份。用NaOH溶液調節PH至6.5,該溶液經過微孔 過濾器過濾,濾液按200毫升一份裝入玻璃瓶,接著用無菌氮氣吹 掃30秒鐘,然后封口,將瓶子于110℃下加熱60分鐘滅菌,從 而制得氨基酸浸劑。

L—異亮氨酸?????????????????????5.6克

L—亮氨酸???????????????????????12.5克

L—賴氨酸???????????????????????11.0克

L—苯丙氨酸?????????????????????9.5克

L—蛋氨酸???????????????????????3.7克

L—蘇氨酸???????????????????????6.5克

L—色氨酸???????????????????????1.0克

L—纈氨酸???????????????????????4.9克

L—精氨酸鹽酸鹽???????????????9.5克

L—組氨酸鹽酸鹽???????????????8.0克

甘氨酸????????????????????????10.4克

L—丙氨酸?????????????????????6.5克

L—天門冬氨酸?????????????????3.8克

L—谷氨酸鈉???????????????????2.5克

(γ—Glu—Cys)2??????????????3.0克

L—脯氨酸?????????????????????3.9克

L—絲氨酸?????????????????????2.3克

L—酪氨酸?????????????????????0.3克 實施例3

酪蛋白水解產物????????????????10克

明膠??????????????????????????8克

γ—Glu—Cys—Cys?????????????2.5克

糊精??????????????????????????20克

還原麥芽糖????????????????????20克

水????????????????????????????300毫升

上述組合物于100℃加熱30分鐘并分散后,將分散液冷卻成 膠狀營養制劑。γ—Glu—Cys—Cys在加工條件下可穩定地保留 下來。

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