鬼佬大哥大
  • / 10
  • 下載費用:30 金幣  

一種基于白木香細胞培養提取倍半萜的方法.pdf

關 鍵 詞:
一種 基于 木香 細胞培養 提取 倍半萜 方法
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
摘要
申請專利號:

CN201611267440.9

申請日:

20161231

公開號:

CN106613990A

公開日:

20170510

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01H4/00 主分類號: A01H4/00
申請人: 廣東國方醫藥科技有限公司
發明人: 陳躍華,盧續貞,李海燕
地址: 523000 廣東省東莞市松山湖高新技術產業開發區創新科技園8號樓305-310室
優先權: CN201611267440A
專利代理機構: 東莞市華南專利商標事務所有限公司 代理人: 李英華
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN201611267440.9

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及生物技術領域,具體涉及一種基于白木香細胞培養提取倍半萜的方法,包括如下步驟:取白木香果莢作為材料,進行消毒處理,備用;將消毒處理后的白木香果莢的種子取出,進行無菌苗的誘導培養,得到白木香無菌苗;將誘導出來的白木香無菌苗的幼葉取出,進行愈傷組織的誘導培養,得到白木香愈傷組織;將誘導出來的白木香愈傷組織取出,進行懸浮細胞培養,得到白木香懸浮細胞;取誘導的白木香懸浮細胞,處理后接入結香菌種進行共培養;白木香懸浮細胞在結香菌種的誘導下積累次生代謝產物倍半萜,提取倍半萜。本發明的方法提取率高,培養周期短,操作簡單化,成本低。

權利要求書

1.一種基于白木香細胞培養提取倍半萜的方法,其特征在于:包括如下步驟:(1)取材消毒:取白木香果莢作為材料,進行消毒處理,備用;(2)無菌苗誘導:將消毒處理后的白木香果莢的種子取出,進行無菌苗的誘導培養,得到白木香無菌苗;(3)愈傷組織誘導:將誘導出來的白木香無菌苗的幼葉取出,進行愈傷組織的誘導培養,得到白木香愈傷組織;(4)懸浮細胞培養:將誘導出來的白木香愈傷組織取出,進行懸浮細胞培養,得到白木香懸浮細胞;(5)共培養:取誘導的白木香懸浮細胞,處理后接入結香菌種進行共培養;(6)提取倍半萜:白木香懸浮細胞在結香菌種的誘導下積累次生代謝產物倍半萜,提取倍半萜。2.根據權利要求1所述的一種基于白木香細胞培養提取倍半萜的方法,其特征在于:所述步驟(1)具體為:取成熟的白木香果莢作為材料,先用洗潔精水中浸泡15-25min,清洗表面污漬,流水沖洗2-4h;再用質量分數為0.08-0.12%的升汞溶液浸泡處理10-20min,無菌水沖洗3-7次,用無菌吸水紙吸干表面水分,備用。3.根據權利要求1所述的一種基于白木香細胞培養提取倍半萜的方法,其特征在于:所述步驟(2)具體為:將消毒處理過的白木香果莢的種子取出,接種在添加有0.4-0.6mg/L6-BA的改良MS培養基中進行無菌苗的誘導培養,每個培養皿倒入18-22mL培養基接種8-10粒種子。4.根據權利要求1所述的一種基于白木香細胞培養提取倍半萜的方法,其特征在于:所述步驟(2)中,誘導培養的條件為:光照強度700-900lx,光照時間9-11h/d,溫度26-28℃,培養13-17d。5.根據權利要求3所述的一種基于白木香細胞培養提取倍半萜的方法,其特征在于:所述步驟(3)中,將誘導出來的白木香無菌苗的幼葉取出,葉片大小0.4-0.6cm×0.4-0.6cm,接入在18-22mL添加有1.5-1.9mg/LNAA和1.1-1.5mg/L6-BA的改良MS培養基中進行愈傷組織的誘導培養,培養溫度23-25℃,暗培養18-22d后繼代。6.根據權利要求5所述的一種基于白木香細胞培養提取倍半萜的方法,其特征在于:所述步驟(4)中,取繼代5次的白木香愈傷組織用鑷子夾碎后放入添加有1.5-1.9mg/LNAA、1.1-1.5mg/LKT和400.0-600.0mg/LCH的改良MS培養基中進行懸浮細胞培養,每230-270mL錐形瓶放入80-100mL培養基,接種量為1.3-1.7g,用無菌紗布過濾,取濾液進行培養,繼代4次后獲得細胞活性均一的培養物,得到白木香懸浮細胞。7.根據權利要求1所述的一種基于白木香細胞培養提取倍半萜的方法,其特征在于:所述步驟(4)中,懸浮細胞培養的條件為:水平震蕩培養,轉速100-120r/min,光照強度400-600lx,光照時間8-10h/d,溫度26-28℃,培養6-8d。8.根據權利要求1所述的一種基于白木香細胞培養提取倍半萜的方法,其特征在于:所述步驟(5)具體為:取誘導的白木香懸浮細胞180-220mL加入25-35μM的茉莉酸甲酯處理20-28h后,接入結香菌種2-4g,水平震蕩培養,轉速100-120r/min,共培養13-17d。9.根據權利要求1所述的一種基于白木香細胞培養提取倍半萜的方法,其特征在于:所述步驟(6)具體為:白木香懸浮細胞在結香菌種的誘導下積累次生代謝產物倍半萜,精密稱取于55-65℃溫度下干燥至恒重的樣品,回流提取,定容過濾后,得到次生代謝產物倍半萜。10.根據權利要求6所述的一種基于白木香細胞培養提取倍半萜的方法,其特征在于:所述步驟(2)-(4)中,改良MS培養基包括如下組分:KNO900-1000mg/LNHNO800-850mg/LMgSO?7HO170-200mg/LKHPO75-95mg/LCaCl?2HO200-240mg/LMnSO?4HO10-12mg/LZnSO?7HO3.8-4.8mg/LHBO2.6-3.6mg/LKI0.40-0.44mg/LNaMO?7HO0.11-0.15mg/LCuSO·5HO0.011-0.015mg/LCoCL·6H2O0.011-0.015mg/LNa-EDTA35-40mg/LFeSO·4HO25-30mg/L甘氨酸1.5-2.5mg/L鹽酸吡哆醇0.3-0.7mg/L鹽酸硫銨素0.05-0.15mg/L煙酸0.3-0.7mg/L肌酸80-120mg/L。

說明書

技術領域

本發明涉及生物技術領域,具體涉及一種基于白木香細胞培養提取倍半萜的方法。

背景技術

白木香(Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg)別名土沉香、女兒香、牙香樹、莞香、六麻樹,為瑞香科(Thymelaeaceae)沉香屬植物,是一種熱帶、亞熱帶常綠喬木。但因過度采伐,遭到了毀滅性打擊,野生白木香已所剩無幾,現已被列為國家珍稀瀕危三級保護植物及國家二級重點保護野生植物。

現有技術中懸浮細胞系的誘導多采用莖尖作為外植體,消毒過程不充分,會導致愈傷組織誘導存活率低,污染率高等問題。其次現有技術中采用的誘導培養基以及懸浮細胞的培養基存在誘導率較低以及懸浮細胞細胞活性較低等問題。

現有的技術方法中沉香的誘導多數在白木香樹木上結合真菌、化合物等進行誘導,存在操作困難,誘導時間長等缺點。誘導獲得的沉香再經過加工后提取獲得沉香倍半萜,增加了成本。

發明內容

為了克服現有技術中存在的缺點和不足,本發明的目的在于提供一種基于白木香細胞培養提取倍半萜的方法,該方法提取率高,培養周期短,操作簡單化,成本低。

本發明的目的通過下述技術方案實現:一種基于白木香細胞培養提取倍半萜的方法,包括如下步驟:

(1)取材消毒:取白木香果莢作為材料,進行消毒處理,備用;

(2)無菌苗誘導:將消毒處理后的白木香果莢的種子取出,進行無菌苗的誘導培養,得到白木香無菌苗;

(3)愈傷組織誘導:將誘導出來的白木香無菌苗的幼葉取出,進行愈傷組織的誘導培養,得到白木香愈傷組織;

(4)懸浮細胞培養:將誘導出來的白木香愈傷組織取出,進行懸浮細胞培養,得到白木香懸浮細胞;

(5)共培養:取誘導的白木香懸浮細胞,處理后接入結香菌種進行共培養;

(6)提取倍半萜:白木香懸浮細胞在結香菌種的誘導下積累次生代謝產物倍半萜,提取倍半萜。

優選的,所述步驟(1)具體為:取成熟的白木香果莢作為材料,先用洗潔精水中浸泡15-25min,清洗表面污漬,流水沖洗2-4h;再用質量分數為0.08-0.12%的升汞溶液浸泡處理10-20min,無菌水沖洗3-7次,用無菌吸水紙吸干表面水分,備用。

優選的,所述步驟(2)具體為:將消毒處理過的白木香果莢的種子取出,接種在添加有0.4-0.6mg/L 6-BA的改良MS培養基中進行無菌苗的誘導培養,每個培養皿倒入18-22mL培養基接種8-10粒種子。

優選的,所述步驟(2)中,誘導培養的條件為:光照強度700-900lx,光照時間9-11h/d,溫度26-28℃,培養13-17d。

優選的,所述步驟(3)中,將誘導出來的白木香無菌苗的幼葉取出,葉片大小0.4-0.6cm×0.4-0.6cm,接入在18-22mL添加有1.5-1.9mg/L NAA和1.1-1.5mg/L 6-BA的改良MS培養基中進行愈傷組織的誘導培養,培養溫度23-25℃,暗培養18-22d后繼代。

優選的,所述步驟(4)中,取繼代5次的白木香愈傷組織用鑷子夾碎后放入添加有1.5-1.9mg/L NAA、1.1-1.5mg/L KT和400.0-600.0mg/L CH的改良MS培養基中進行懸浮細胞培養,每230-270mL錐形瓶放入80-100mL培養基,接種量為1.3-1.7g,用無菌紗布過濾,取濾液進行培養,繼代4次后獲得細胞活性均一的培養物,得到白木香懸浮細胞。

優選的,所述步驟(4)中,懸浮細胞培養的條件為:水平震蕩培養,轉速100-120r/min,光照強度400-600lx,光照時間8-10h/d,溫度26-28℃,培養6-8d。

優選的,所述步驟(5)具體為:取誘導的白木香懸浮細胞180-220mL加入25-35μM的茉莉酸甲酯處理20-28h后,接入結香菌種2-4g,水平震蕩培養,轉速100-120r/min,共培養13-17d。

優選的,所述步驟(6)具體為:白木香懸浮細胞在結香菌種的誘導下積累次生代謝產物倍半萜,精密稱取于55-65℃溫度下干燥至恒重的樣品,回流提取,定容過濾后,得到次生代謝產物倍半萜。

優選的,所述步驟(2)-(4)中,改良MS培養基包括如下組分:

KNO3 900-1000mg/L

NH4NO3 800-850mg/L

MgSO4?7H2O 170-200mg/L

KH2PO4 75-95mg/L

CaCl2?2H2O 200-240mg/L

MnSO4?4H2O 10-12mg/L

ZnSO4?7H2O 3.8-4.8mg/L

H3BO3 2.6-3.6mg/L

KI 0.40-0.44mg/L

Na2MO4?7H2O 0.11-0.15mg/L

CuSO4·5H2O 0.011-0.015mg/L

CoCL2·6H2O 0.011-0.015mg/L

Na2-EDTA 35-40mg/L

FeSO4·4H2O 25-30mg/L

甘氨酸 1.5-2.5mg/L

鹽酸吡哆醇 0.3-0.7mg/L

鹽酸硫銨素 0.05-0.15mg/L

煙酸 0.3-0.7mg/L

肌酸 80-120mg/L。

更為優選的,改良MS培養基包括如下組分:

KNO3 950mg/L

NH4NO3 825mg/L

MgSO4?7H2O 185mg/L

KH2PO4 85mg/L

CaCl2?2H2O 220mg/L

MnSO4?4H2O 11.15mg/L

ZnSO4?7H2O 4.3mg/L

H3BO3 3.1mg/L

KI 0.42mg/L

Na2MO4?7H2O 0.13mg/L

CuSO4·5H2O 0.013mg/L

CoCL2·6H2O 0.013mg/L

Na2-EDTA 37.3mg/L

FeSO4·4H2O 27.8mg/L

甘氨酸 2.0mg/L

鹽酸吡哆醇 0.5mg/L

鹽酸硫銨素 0.1mg/L

煙酸 0.5mg/L

肌酸 100mg/L。

本發明的有益效果在于:本發明的方法以白木香果莢為外植體,經消毒后,接種在萌發培養基上面誘導種子發芽,得到無菌苗。隨后取無菌苗幼嫩組織進行愈傷組織誘導。接入篩選出的培養基中進行愈傷組織誘導,得到形態結構優良、活力良好的愈傷組織后。將愈傷組織放入液體培養基進行液體懸浮細胞培養,得到高效的白木香懸浮細胞系。將白木香懸浮細胞系與結香菌共同培養,在結香真菌的誘導下積累白木香次生代謝產物倍半萜。

本發明的方法中白木香外植體在不同種類及不同濃度植物激素的培養條件下進行離體培養。篩選出最佳的激素種類和濃度配比,建立高效的白木香懸浮細胞系誘導方法。隨后白木香懸浮細胞系與結香菌(色二孢菌、黃綠墨耳菌)共同培養,誘導次生代謝產物的積累,為利用白木香懸浮細胞的生產和應用奠定基礎。

本發明的方法具有如下優點:

1、在使用白木香果莢作為材料,消毒誘導得到愈傷組織的過程中,污染率大大降低,且愈傷組織誘導率達到了86%。

2、通過本發明選出的培養基以及誘導方法可以得到高細胞活性的白木香懸浮細胞,在結香菌種和茉莉酸甲酯處理下,可以短時間內刺激次生代謝產物的大量積累。

3、白木香懸浮細胞系與結香菌共同培養后提取次生代謝產物存在培養周期短、操作簡單化、成本低等優點,共培養后其次生代謝產物的提取率達到2.3%。

具體實施方式

為了便于本領域技術人員的理解,下面結合實施例對本發明作進一步的說明,實施方式提及的內容并非對本發明的限定。

實施例1

一種基于白木香細胞培養提取倍半萜的方法,包括如下步驟:

(1)取材消毒:取成熟的白木香果莢作為材料,先用洗潔精水中浸泡15min,清洗表面污漬,流水沖洗2h;在超凈工作臺上用質量分數為0.08%的升汞溶液浸泡處理10min,無菌水沖洗3次,用無菌吸水紙吸干表面水分,備用。

(2)無菌苗誘導:將消毒處理過的白木香果莢用鑷子把種子取出,接種在添加有0.4mg/L 6-BA的改良MS培養基中進行無菌苗的誘導培養,每個培養皿倒入18mL培養基接種8粒種子;誘導培養的條件為:光照強度700lx,光照時間9h/d,溫度26℃,培養13d。

(3)愈傷組織誘導:將誘導出來的白木香無菌苗的幼葉取出,葉片大小0.4cm×0.4cm,接入在18mL添加有1.5mg/L NAA和1.1mg/L 6-BA的改良MS培養基中進行愈傷組織的誘導培養,培養溫度23℃,暗培養18d后繼代。

(4)懸浮細胞培養:取繼代5次的白木香愈傷組織用鑷子夾碎后放入添加有1.5mg/L NAA、1.1mg/L KT和400.0mg/L CH的改良MS培養基中進行懸浮細胞培養,每230mL錐形瓶放入80mL培養基,接種量為1.3g,用無菌紗布過濾,取濾液進行培養,繼代4次后獲得細胞活性均一的培養物,得到白木香懸浮細胞;懸浮細胞培養的條件為:水平震蕩培養,轉速100r/min,光照強度400lx,光照時間8h/d,溫度26℃,培養6d。

(5)共培養:取誘導的白木香懸浮細胞180mL加入25μM的茉莉酸甲酯處理20h后,接入結香菌種2g,水平震蕩培養,轉速100r/min,共培養13d。

(6)提取倍半萜:白木香懸浮細胞在結香菌種的誘導下積累次生代謝產物倍半萜,精密稱取于55℃溫度下干燥至恒重的樣品,回流提取,定容過濾后,得到次生代謝產物倍半萜4.8g,提取率2.3%。

所述步驟(2)-(4)中,改良MS培養基包括如下組分:

KNO3 900mg/L

NH4NO3 800mg/L

MgSO4?7H2O 170mg/L

KH2PO4 75mg/L

CaCl2?2H2O 200mg/L

MnSO4?4H2O 10mg/L

ZnSO4?7H2O 3.8mg/L

H3BO3 2.6mg/L

KI 0.40mg/L

Na2MO4?7H2O 0.11mg/L

CuSO4·5H2O 0.011mg/L

CoCL2·6H2O 0.011mg/L

Na2-EDTA 35mg/L

FeSO4·4H2O 25mg/L

甘氨酸 1.5mg/L

鹽酸吡哆醇 0.3mg/L

鹽酸硫銨素 0.05mg/L

煙酸 0.3mg/L

肌酸 80mg/L。

實施例2

一種基于白木香細胞培養提取倍半萜的方法,包括如下步驟:

(1)取材消毒:取成熟的白木香果莢作為材料,先用洗潔精水中浸泡20min,清洗表面污漬,流水沖洗3h;在超凈工作臺上用質量分數為0.10%的升汞溶液浸泡處理15min,無菌水沖洗5次,用無菌吸水紙吸干表面水分,備用。

(2)無菌苗誘導:將消毒處理過的白木香果莢用鑷子把種子取出,接種在添加有0.5mg/L 6-BA的改良MS培養基中進行無菌苗的誘導培養,每個培養皿倒入20mL培養基接種9粒種子;誘導培養的條件為:光照強度800lx,光照時間10h/d,溫度27℃,培養15d。

(3)愈傷組織誘導:將誘導出來的白木香無菌苗的幼葉取出,葉片大小0.5cm×0.5cm,接入在20mL添加有1.7mg/L NAA和1.3mg/L 6-BA的改良MS培養基中進行愈傷組織的誘導培養,培養溫度24℃,暗培養20d后繼代。

(4)懸浮細胞培養:取繼代5次的白木香愈傷組織用鑷子夾碎后放入添加有1.7mg/L NAA、1.3mg/L KT和500.0mg/L CH的改良MS培養基中進行懸浮細胞培養,每250mL錐形瓶放入90mL培養基,接種量為1.5g,用無菌紗布過濾,取濾液進行培養,繼代4次后獲得細胞活性均一的培養物,得到白木香懸浮細胞;懸浮細胞培養的條件為:水平震蕩培養,轉速110r/min,光照強度500lx,光照時間9h/d,溫度27℃,培養7d。

(5)共培養:取誘導的白木香懸浮細胞200mL加入30μM的茉莉酸甲酯處理24h后,接入結香菌種3g,水平震蕩培養,轉速110r/min,共培養15d。

(6)提取倍半萜:白木香懸浮細胞在結香菌種的誘導下積累次生代謝產物倍半萜,精密稱取于60℃溫度下干燥至恒重的樣品,回流提取,定容過濾后,得到次生代謝產物倍半萜5.0g,提取率2.4%。

所述步驟(2)-(4)中,改良MS培養基包括如下組分:

KNO3 950mg/L

NH4NO3 825mg/L

MgSO4?7H2O 185mg/L

KH2PO4 85mg/L

CaCl2?2H2O 220mg/L

MnSO4?4H2O 11.15mg/L

ZnSO4?7H2O 4.3mg/L

H3BO3 3.1mg/L

KI 0.42mg/L

Na2MO4?7H2O 0.13mg/L

CuSO4·5H2O 0.013mg/L

CoCL2·6H2O 0.013mg/L

Na2-EDTA 37.3mg/L

FeSO4·4H2O 27.8mg/L

甘氨酸 2.0mg/L

鹽酸吡哆醇 0.5mg/L

鹽酸硫銨素 0.1mg/L

煙酸 0.5mg/L

肌酸 100mg/L。

實施例3

一種基于白木香細胞培養提取倍半萜的方法,包括如下步驟:

(1)取材消毒:取成熟的白木香果莢作為材料,先用洗潔精水中浸泡25min,清洗表面污漬,流水沖洗4h;在超凈工作臺上用質量分數為0.12%的升汞溶液浸泡處理20min,無菌水沖洗7次,用無菌吸水紙吸干表面水分,備用。

(2)無菌苗誘導:將消毒處理過的白木香果莢用鑷子把種子取出,接種在添加有0.6mg/L 6-BA的改良MS培養基中進行無菌苗的誘導培養,每個培養皿倒入22mL培養基接種10粒種子;誘導培養的條件為:光照強度900lx,光照時間11h/d,溫度28℃,培養17d。

(3)愈傷組織誘導:將誘導出來的白木香無菌苗的幼葉取出,葉片大小0.6cm×0.6cm,接入在22mL添加有1.9mg/L NAA和1.5mg/L 6-BA的改良MS培養基中進行愈傷組織的誘導培養,培養溫度25℃,暗培養22d后繼代。

(4)懸浮細胞培養:取繼代5次的白木香愈傷組織用鑷子夾碎后放入添加有1.9mg/L NAA、1.5mg/L KT和600.0mg/L CH的改良MS培養基中進行懸浮細胞培養,每270mL錐形瓶放入100mL培養基,接種量為1.7g,用無菌紗布過濾,取濾液進行培養,繼代4次后獲得細胞活性均一的培養物,得到白木香懸浮細胞;懸浮細胞培養的條件為:水平震蕩培養,轉速120r/min,光照強度600lx,光照時間10h/d,溫度28℃,培養8d。

(5)共培養:取誘導的白木香懸浮細胞220mL加入35μM的茉莉酸甲酯處理28h后,接入結香菌種4g,水平震蕩培養,轉速120r/min,共培養17d。

(6)提取倍半萜:白木香懸浮細胞在結香菌種的誘導下積累次生代謝產物倍半萜,精密稱取于65℃溫度下干燥至恒重的樣品,回流提取,定容過濾后,得到次生代謝產物倍半5.2g,提取率2.5%。

所述步驟(2)-(4)中,改良MS培養基包括如下組分:

KNO3 1000mg/L

NH4NO3 850mg/L

MgSO4?7H2O 200mg/L

KH2PO4 95mg/L

CaCl2?2H2O 240mg/L

MnSO4?4H2O 12mg/L

ZnSO4?7H2O 4.8mg/L

H3BO3 3.6mg/L

KI 0.44mg/L

Na2MO4?7H2O 0.15mg/L

CuSO4·5H2O 0.015mg/L

CoCL2·6H2O 0.015mg/L

Na2-EDTA 40mg/L

FeSO4·4H2O 30mg/L

甘氨酸 2.5mg/L

鹽酸吡哆醇 0.7mg/L

鹽酸硫銨素 0.15mg/L

煙酸 0.7mg/L

肌酸 120mg/L。

上述實施例為本發明較佳的實現方案,除此之外,本發明還可以其它方式實現,在不脫離本發明構思的前提下任何顯而易見的替換均在本發明的保護范圍之內。

關于本文
本文標題:一種基于白木香細胞培養提取倍半萜的方法.pdf
鏈接地址:http://www.wwszu.club/p-6924338.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 zhuanlichaxun.net網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開
鬼佬大哥大