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一種利用抑菌培養基培育金線蓮的組培方法.pdf

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一種 利用 培養基 培育 金線蓮 方法
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摘要
申請專利號:

CN201710038507.X

申請日:

20170118

公開號:

CN106613995A

公開日:

20170510

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01H4/00 主分類號: A01H4/00
申請人: 福建農林大學
發明人: 葉乃興,林慶良,曹紅利,邱曉紅,鄭德勇,屈艷勤,楊江帆
地址: 350002 福建省福州市倉山區上下店路15號
優先權: CN201710038507A
專利代理機構: 福州市眾韜專利代理事務所(普通合伙) 代理人: 陳智雄;黃秀婷
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201710038507.X

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及一種利用抑菌培養基培育金線蓮的組培方法,包括培養容器消毒、培養基配制、無菌水制備、誘導培養、增殖培養、生根培養和瓶苗移栽。本發明的金線蓮抑菌組培過程中,培養容器和培養基都無需高溫高壓滅菌,減少了工作量和能源消耗,簡化了金線蓮組培技術環節,降低了金線蓮組培成本;而且操作簡單,只需按不同的培養基配方配制后即可使用,實用性強,推廣性好。本發明的金線蓮抑菌組培方法與常規的金線蓮組培方法相比,可以降低成本10%以上。

權利要求書

1.一種利用抑菌培養基培育金線蓮的組培方法,包括培養容器消毒、培養基配制、無菌水的制備、誘導培養、增殖培養、生根培養和瓶苗移栽,其特征在于:(1)培養容器消毒:將培養瓶、瓶蓋及接種用的塑料盤在100mg/L次氯酸鈉+10mg/L環絲氨酸+0.5mg/L十二烷基磺酸鈉的水溶液中浸泡不少于10h,保存備用;(2)培養基配制:誘導培養基為:MS+1~5mg/L6-BA+0.5~1.5mg/LNAA+40~100mg/L次氯酸鈉+1~5mg/L環絲氨酸+50~100mg/L丙酸鈣+25g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉,pH5.8;增殖培養基為:MS+1~3mg/L6-BA+0.5~1mg/LNAA+40~100mg/L次氯酸鈉+1~5mg/L環絲氨酸+50~100mg/L丙酸鈣+25g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉,pH5.8;生根培養基為:MS+0.5~2mg/LNAA+40~100mg/L次氯酸鈉+1~5mg/L環絲氨酸+50~100mg/L丙酸鈣+25g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉,pH5.8;所述MS,為1962年,Murashige和Skoog公開的MS培養基;所述6-BA,指6-芐氨基嘌呤;所述NAA,指α-萘乙酸;配制培養基時,先稱各培養基配方中蔗糖和瓊脂粉,加培養基總重量1/2的自來水,加熱至瓊脂粉完全溶解,再按各培養基配方配齊其他原料后,定容,然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl調pH值至5.8,分裝到消毒過的培養容器中,封口,冷卻凝固,備用;(3)無菌水的制備:采用次氯酸鈉、環絲氨酸、十二烷基磺酸鈉和水配制無菌水,終濃度為100mg/L次氯酸鈉、10mg/L環絲氨酸、0.5mg/L十二烷基磺酸鈉,現配現用;(4)誘導培養:取無病蟲害生長健壯的植株,剪去根和葉片后,用洗衣粉浸泡沖洗15min后,剪成2~3cm長的帶腋芽莖段,用體積比為75%酒精消毒30s,再用重量體積比為0.1%升汞浸泡消毒10min,再用無菌水反復沖洗不少于3次;消毒后的莖段在無菌條件下接種于誘導培養基上,培養30d~60d后長出新芽;培養室溫度為26℃,光照8h,光照強度為1000Lx;(5)增殖培養:將誘導出的新芽轉入增殖培養基中,45d后逐步誘導出叢生芽;將叢生芽切開接種到增殖培養基上,每45d轉接一次,可獲得大量幼芽;培養室溫度為26℃,光照8h,光照強度為1000Lx;(6)生根培養:取高度為3~5cm芽苗,接種到生根培養基上,培養25d后成為完整植株;培養室溫度為26℃,光照12h,光照強度為1500Lx;(7)瓶苗移栽:將生根培養獲得的完整植株取出,洗凈根部的培養基,用800倍的多菌靈浸泡30min后,移栽至水草中或直接水培,大棚上層用80%遮光網遮蓋,移栽的環境溫度為22~28℃。2.根據權利要求1所述的一種利用抑菌培養基培育金線蓮的組培方法,其特征在于所述誘導培養基為:MS+3mg/L6-BA+1mg/LNAA+60mg/L次氯酸鈉+3mg/L環絲氨酸+70mg/L丙酸鈣+25g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉,pH5.8。3.根據權利要求1所述的一種利用抑菌培養基培育金線蓮的組培方法,其特征在于所述增殖培養基為:MS+2mg/L6-BA+0.75mg/LNAA+60mg/L次氯酸鈉+3mg/L環絲氨酸+70mg/L丙酸鈣+25g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉,pH5.8。4.根據權利要求1所述的一種利用抑菌培養基培育金線蓮的組培方法,其特征在于所述生根培養基為:MS+1mg/LNAA+60mg/L次氯酸鈉+3mg/L環絲氨酸+70mg/L丙酸鈣+25g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉,pH5.8。

說明書

技術領域 本發明涉及一種植物組織培養方法,具體涉及一種利用抑菌培養基培育金線蓮的組培方法,屬生物技術領域。

背景技術 金線蓮(Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl.),又名金線蘭、金絲草,為蘭科開唇蘭屬多年生名貴中藥材,主產于福建、浙江、臺灣、江西、貴州等地,具有清熱涼血、除濕解毒等功效,用于治療糖尿病、腎炎、急慢性肝炎等,在民間享有“藥王”的美稱。現代研究表明金線蓮中含有金線蓮苷等活性成分,具有修復受損胰島細胞,恢復正常胰島素分泌的藥理活性,以金線蓮為主要原料的中成藥,如復方金線蓮膠囊,在臨床上已用于糖尿病的治療。由于金線蓮種子微小,胚胎發育不完全,自然條件下繁殖率極低,經多年開發,目前野生資源已瀕臨枯竭。用組培快繁和移栽技術大量培育金線蓮,已成為保護及合理開發利用其野生資源的有效途徑。

金線蓮組織培養的成本主要包括組培苗生產所需的培養基、設施設備、供電成本、耗材和人工成本。常規的金線蓮組織培養方法要求外植體接種在高溫高壓滅菌后的無菌培養基中才能正常生長,耗能大,人工操作成本高。如果能通過藥物抑菌的方法來改造培養基,使培養基在不需要進行高溫高壓滅菌,就能夠獲得金線蓮的正常生長。然而,針對不同的植物品種要找到一種合適的抗菌劑是比較困難的,往往是當培養基抗菌時,植物組織的生長就受到抑制;而植物組織正常生長,就無法獲得滿意的抗菌效果。其原因,一是還沒有一種抗生素對所有的菌類都有效,而且抗生素的藥效期短;二是有些抗菌素、防腐劑在有效的濃度下,其殺菌、抗菌離子對植物組織直接產生傷害,有些則產生鹽害。必須選擇與植物組織親和、友好,藥效期長(至少一個生長周期),不產生鹽害并具有殺菌、抗菌活性的物質作為抗菌劑。因此,篩選合適的抗菌藥劑是抑菌組培技術得以應用的關鍵。

本發明就是為金線蓮組織培養提供一種抑菌培養方法。一方面可以降低金線蓮組織培養對設施設備的要求,尤其不需要高溫高壓滅菌所需配置的高壓鍋設備,縮減了投資成本,電能消耗也將大幅度降低;另一方面,采用這種培養基開展金線蓮組織培養,組培環節大為簡化,人工操作的速度大幅提高,從而降低了人工成本。此外,由于改造后的培養基自身具有殺菌、抗菌或抑菌作用,能有效控制組織培養過程中的污染問題,又不會對金線蓮生長產生毒害或抑制,即不影響金線蓮的正常生長,從根本上簡化了金線蓮組織培養。

發明內容 本發明的目的是提供一種利用抑菌培養基培育金線蓮的組培方法。

本發明的目的是通過以下方法實現的。

本發明的一種利用抑菌培養基培育金線蓮的組培方法,包括培養容器消毒、培養基配制、無菌水的制備、誘導培養、增殖培養、生根培養和瓶苗移栽,其特征在于:

1.培養容器消毒:將培養瓶、瓶蓋及接種用的塑料盤在100mg/L次氯酸鈉+10mg/L環絲氨酸+0.5mg/L十二烷基磺酸鈉的水溶液中浸泡不少于10h,保存備用;

2.培養基配制:誘導培養基為:MS+1~5mg/L 6-BA+0.5~1.5mg/L NAA+40~100mg/L次氯酸鈉+1~5mg/L環絲氨酸+50~100mg/L丙酸鈣+25g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉,pH5.8;增殖培養基為:MS+1~3mg/L 6-BA+0.5~1mg/L NAA+40~100mg/L次氯酸鈉+1~5mg/L環絲氨酸+50~100mg/L丙酸鈣+25g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉,pH5.8;生根培養基為:MS+0.5~2mg/L NAA+40~100mg/L次氯酸鈉+1~5mg/L環絲氨酸+50~100mg/L丙酸鈣+25g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉,pH5.8;所述MS,為1962年,Murashige和Skoog公開的MS培養基;所述6-BA,指6-芐氨基嘌呤;所述NAA,指α-萘乙酸;配制培養基時,先稱各培養基配方中蔗糖和瓊脂粉,加培養基總重量1/2的自來水,加熱至瓊脂粉完全溶解,再按各培養基配方配齊其他原料后,定容,然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl調pH值至5.8,分裝到消毒過的培養容器中,封口,冷卻凝固,備用;

3.無菌水的制備:采用次氯酸鈉、環絲氨酸、十二烷基磺酸鈉和水配制無菌水,終濃度為100mg/L次氯酸鈉、10mg/L環絲氨酸、0.5mg/L十二烷基磺酸鈉,現配現用;

4.誘導培養:取無病蟲害生長健壯的植株,剪去根和葉片后,用洗衣粉浸泡沖洗15min后,剪成2~3cm長的帶腋芽莖段,用體積比為75%酒精消毒30s,再用重量體積比為0.1%升汞浸泡消毒10min,再用無菌水反復沖洗不少于3次;消毒后的莖段在無菌條件下接種于誘導培養基上,培養30d~60d后長出新芽;培養室溫度為26℃,光照8h,光照強度為1000Lx;

5.增殖培養:將誘導出的新芽轉入增殖培養基中,45d后逐步誘導出叢生芽;將叢生芽切開接種到增殖培養基上,每45d轉接一次,可獲得大量幼芽;培養室溫度為26℃,光照8h,光照強度為1000Lx;

6.生根培養:取高度為3~5cm芽苗,接種到生根培養基上,培養25d后成為完整植株;培養室溫度為26℃,光照12h,光照強度為1500Lx;

7.瓶苗移栽:將生根培養獲得的完整植株取出,洗凈根部的培養基,用800倍的多菌靈浸泡30min后,移栽至水草中或直接水培,大棚上層用80%遮光網遮蓋,移栽的環境溫度為22~28℃。

本發明的應用效果:本發明的一種利用抑菌培養基培育金線蓮的組培方法,利用化學試劑添加到各種培養基中,達到滅菌或抑菌的作用。配制的培養基無需高溫高壓滅菌。因此,在金線蓮誘導培養、增殖培養、生根培養各個階段,除了要考慮常用的評價指標外,還要考慮外植體污染率的問題。

1.誘導培養:通過實驗證實,本發明的金線蓮抑菌組培方法與常規組培方法相比,結果如表1所示,在誘導培養階段的外植體培養的成活率差異不顯著。

表1 本發明的抑菌組培方法對金線蓮腋芽誘導培養的影響

組培方式 外植體數 外植體污染數 成活率(%) 常規組培方法 82 25 69.5 抑菌組培方法 80 22 72.5

2.增殖培養:本發明的金線蓮抑菌組培方法與常規組培的增殖倍數和污染率的比較,結果如表2所示,增殖倍數和污染率二個指標都沒有太大差異。在瓶苗的生長狀況看,本發明的抑菌組培方法的培養基由于不經過高溫高壓滅菌,激素和營養元素損失較少,其金線蓮組培苗更綠,更壯。

表2 本發明的抑菌組培方法對金線蓮增殖倍數和污染率的影響

組培方式 增殖倍數 污染率(%) 生長狀況 常規組培方法 3,2 1.2 苗弱、葉色淺綠。 抑菌組培方法 3,4 0.8 苗壯、葉色綠。

3本發明的抑菌組培方法對金線蓮生根率和污染率的影響:在生根過程中,本發明的抑菌組培方法與常規的金線蓮組培方法相比,結果如表3所示,生根率和污染率都沒有太大差異;從瓶苗的生長狀況看,用本發明的方法,金線蓮組培苗莖更粗,葉片更大。

表3 本發明金線蓮抑菌組培的瓶苗生根情況

4.成本分析:本發明的抑菌組培方法與常規組培的成本分析見表4。本發明組培省去了高壓滅菌環節,簡化了組培程序,提高了工作效率。從直接費用計算,每年可以節約5.5萬元左右(以每天配制50L培養基計算)。常規組培還需要添置高壓鍋等設備及日常維護,此外,常規組培還存在實驗室安全等問題。

表4 本發明的金線蓮簡便組培方法與常規組培的成本分析表

本發明具有如下有益效果:

1.本發明的金線蓮抑菌組培方法中,培養容器和培養基都無需高溫高壓滅菌,減少了工作量和能源消耗,簡化了金線蓮組培環節,降低了金線蓮組培成本。

2.本發明的金線蓮抑菌組培方法,操作簡單,只要按不同的培養基配方配制后即可,實用性強,推廣性好。

3.本發明的金線蓮抑菌組培方法與常規的金線蓮組培方法對比,可以降低成本10%以上。

具體實施方式 為了進一步闡明本發明而不是限制本發明,以下結合實施例加以說明。

實施例一:一種利用抑菌培養基培育金線蓮的組培方法

一種利用抑菌培養基培育金線蓮的組培方法,包括以下步驟:

1.培養容器消毒:將培養瓶、瓶蓋及接種用的塑料盤在100mg/L次氯酸鈉+10mg/L環絲氨酸+0.5mg/L十二烷基磺酸鈉的水溶液中浸泡10h,保存備用;

2.培養基配制:誘導培養基為:MS+3mg/L 6-BA+1mg/L NAA+60mg/L次氯酸鈉+3mg/L環絲氨酸+70mg/L丙酸鈣+25g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉,pH5.8;增殖培養基為:MS+2mg/L 6-BA+0.75mg/L NAA+60mg/L次氯酸鈉+3mg/L環絲氨酸+70mg/L丙酸鈣+25g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉,pH5.8;生根培養基為:MS+1mg/L NAA+60mg/L次氯酸鈉+3mg/L環絲氨酸+70mg/L丙酸鈣+25g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉,pH5.8;配制培養基時,先稱各培養基配方中的蔗糖和瓊脂粉,加培養基總重量1/2的自來水,加熱至瓊脂粉完全溶解,再按各培養基配方配齊其他原料后,定容,然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl調pH值至5.8,分裝到消毒過的培養容器中,封口,冷卻凝固,備用。

3.無菌水的制備:采用次氯酸鈉、環絲氨酸、十二烷基磺酸鈉和水配制無菌水,終濃度為100mg/L次氯酸鈉、10mg/L環絲氨酸、0.5mg/L十二烷基磺酸鈉,現配現用;

4.誘導培養:取無病蟲害生長健壯的植株,剪去根和葉片后,用洗衣粉浸泡沖洗15min后,剪成2~3cm長的帶腋芽莖段,用體積比為75%酒精消毒30s,再用重量體積比為0.1%升汞浸泡消毒10min,再用無菌水反復沖洗3次。消毒后的莖段在無菌條件下接種于誘導培養基上,培養30d~60d后長出新芽;培養室溫度為26℃,光照8h,光照強度為1000Lx。

5.增殖培養:將誘導出的新芽轉入增殖培養基中,45d后逐步誘導出叢生芽。將叢生芽切開接種到增殖培養基上;每45d轉接一次,可獲得大量幼芽;培養室溫度為26℃,光照8h,光照強度為1500Lx;

6.生根培養:取高度為3~5cm芽苗,接種到生根培養基上,培養25d后成為完整植株;培養室溫度為26℃,光照12h,光照強度為1500Lx;

7.瓶苗移栽:將生根培養獲得的完整植株取出,洗凈根部的培養基,用800倍的多菌靈浸泡30min后,移栽至水草中或直接水培,大棚上層用80%遮光網遮蓋,移栽的環境溫度為22~28℃。

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