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一種控制生鮮乳中細菌總數的方法.pdf

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一種 控制 生鮮 乳中 細菌 總數 方法
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摘要
申請專利號:

CN201010270962.0

申請日:

20100831

公開號:

CN101999456B

公開日:

20121205

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A23C7/04 主分類號: A23C7/04
申請人: 華南理工大學
發明人: 蔡俊鵬,孫麗瀅
地址: 510640 廣東省廣州市天河區五山路381號
優先權: CN201010270962A
專利代理機構: 廣州市華學知識產權代理有限公司 代理人: 裘暉
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201010270962.0

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種控制生鮮乳中細菌總數的方法,采用蛭弧菌控制細菌總數,所述蛭弧菌菌株為蛭弧菌(Bdellovibrio?sp.)BDFM05,由中國典型培養物保藏中心保藏,其簡稱為CCTCC,保藏編號為:CCTCC?NO:M209172,保藏日期為2009年8月7日;具體步驟為:(1)將蛭弧菌CCTCC?209172制備成蛭弧菌游泳體菌液;(2)在生鮮乳中加入步驟(1)中制得的蛭弧菌游泳體菌液,其中的蛭弧菌游泳體的濃度至少達到102pfu/ml,靜置或攪拌1-8小時。本發明可有效控制生鮮乳細菌的增長,有利于保持牛乳原始的鮮味、品質,提高生鮮乳在收購中的評級,減少因細菌過快增長造成的原料奶浪費。

權利要求書

1.一種控制生鮮乳中細菌總數的方法,其特征在于,采用蛭弧菌控制細菌總數,所述蛭弧菌菌株為蛭弧菌(Bdellovibrio?sp.)BDFM05,由中國典型培養物保藏中心保藏,其簡稱為CCTCC,保藏編號為:CCTCC?NO:M?209172,保藏日期為2009年8月7日;具體步驟如下:(1)將蛭弧菌CCTCC?209172制備成蛭弧菌游泳體菌液;所述蛭弧菌游泳體菌液的制備方法如下:(a)制備乳鏈球菌:乳鏈球菌用MRS培養基搖床培養,160rpm~250rpm、25~32℃培養12~36h,培養物經過5000rpm、4℃離心15~20min,棄上清液,沉淀即為乳鏈球菌;(b)混合培養:將蛭弧菌CCTCC?NO?209172與上述制備得到的乳鏈球菌加入到DNB培養基中,恒溫搖床160rpm~250rpm、25~32℃培養12~36h;(c)制備菌液:混合培養物經過6000rpm、4℃離心20min,取上清液,再將上清液16000rpm、4℃條件下離心20min,棄上清液,向沉淀中加入DNB液體培養基重新懸浮蛭弧菌沉淀物,制得蛭弧菌游泳體菌液;(2)在生鮮乳中加入步驟(1)中制得的蛭弧菌游泳體菌液,其中的蛭弧菌游泳體的濃度至少達到10pfu/ml,靜置或攪拌1-8小時。2.根據權利要求1所述的控制生鮮乳中細菌總數的方法,其特征在于,所述蛭弧菌游泳體的濃度為10~10pfu/ml。3.根據權利要求1或2所述的控制生鮮乳中細菌總數的方法,其特征在于,所述生鮮乳經過步驟(2)處理后,還經過低溫巴氏殺菌或4℃低溫保藏。4.根據權利要求1所述的控制生鮮乳中細菌總數的方法,其特征在于,步驟(2)中溫度控制在4℃~30℃。

說明書

技術領域

本發明屬于生物技術領域,特別涉及一種控制生鮮乳中細菌總數的方法。?

背景技術

“生鮮牛乳”即為未經任何加工的牛乳。在生鮮乳中微生物的含量是評價生鮮乳質量的一個重要指標,對于所有乳制品來說,微生物含量對最終產品質量也是十分重要的。細菌總數高,其中的致病菌就容易產生非常耐熱的毒素,這些毒素經過超高溫處理后仍有少量殘留,消費者飲用后會導致中毒;而且大量的細菌繁殖會加速產酸,從而引起牛乳酸度增加,蛋白質熱穩定性下降。在國標“GB/T?6914-1986”中規定了Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級生鮮乳細菌總量應分別≤50萬個/mL、≤100萬個/mL、≤200萬個/mL、≤400萬個/mL。?

目前乳制品企業對原料奶收購時普遍采取直接冷藏方式,在加工前也只采取過濾法和離心凈乳法,不能從本質上減少其菌落總數。雖然多數奶業生產單位通過規范的牧場管理體系等而獲得質量較好的生鮮乳,但也有生產單位,如個體農戶等,因奶牛飼養環境條件差,以及部分奶站在原料奶降溫和冷藏貯運方面,缺乏很好的配套措施等,從而使得原料奶的微生物菌落總數達到較高的水平。因此,研究一種簡便易行且不會破壞牛乳品質的細菌控制方法和/或技術十分必要。?

蛭弧菌為寄生性革蘭氏陰性菌,具有寄生、進而裂解其它細菌的作用,是一種優良的微生物控制劑。目前,對于生鮮乳中細菌總數的控制只有零星報道,且多集中在高壓,輻照等物理加工處理方式;在利用生物技術控制方面,特別是蛭弧菌控制牛乳中細菌總數方面在國內外均尚無報道。?

已有的研究表明,作為一種有益微生物制劑,無論是在食品工業還是在(海洋)水產養殖等領域,蛭弧菌的應用均是安全的。例如:在國外,Lenz?and?Hespell(1978)研究發現,蛭弧菌及對動物及人的細胞不具侵染性[Lenz?R.W.,HespellR.B.Attempts?to?grow?bedellovibrios?micurgically-injected?into?animal?cells.Archives?of?Microbiology,1978,119(3):245-248]。在國內,林茂等(2006)研究了蛭弧菌對魚類細胞的作用,發現它對魚類細菌沒有侵染作用[林茂,楊先樂,薛暉,曹海鵬,邱軍強。蛭弧菌BDH21?02對魚類細胞及病原菌的作用。?

微生物學通報,2006,33(1):7-11]。?

發明內容

為了克服現有技術存在的不足,本發明的首要目的在于提供一種高效、無毒無副作用的控制生鮮牛乳中細菌總數的方法,解決了目前物理、化學殺菌方法造成的殘留和牛乳口味改變的問題。?

本發明的目的通過下述技術方案實現:?

一種控制生鮮乳中細菌總數的方法,采用蛭弧菌控制細菌總數,所述蛭弧菌菌株為蛭弧菌(Bdellovibrio?sp.)BDFM05,由中國典型培養物保藏中心保藏,其簡稱為CCTCC,保藏編號為:CCTCC?NO:M?209172,保藏地址:湖北省武漢市珞珈山武漢大學內,保藏日期為2009年8月7日;具體步驟如下:?

(1)將蛭弧菌CCTCC?209172制備成蛭弧菌游泳體菌液;?

(2)在生鮮乳中加入步驟(1)中制得的蛭弧菌游泳體菌液,其中的蛭弧菌游泳體的濃度至少達到102pfu/ml,靜置或攪拌1-8小時后細菌總數會得到有效控制和減少。?

優選地,所述蛭弧菌游泳體的濃度為104~108pfu/ml。?

所述生鮮乳經過步驟(2)處理后,還經過低溫巴氏殺菌或4℃低溫保藏可達到更好的殺菌效果。?

優選地,步驟(2)中溫度控制在4℃~30℃。?

優選地,所述蛭弧菌游泳體菌液的制備方法如下:?

(1)制備乳鏈球菌:乳鏈球菌用MRS培養基搖床培養,160rpm~250rpm、25~32℃培養12~36h,培養物經過5000rpm、4℃離心15~20min,棄上清液,沉淀即為乳鏈球菌;?

(2)混合培養:將蛭弧菌CCTCC?209172與上述制備得到的乳鏈球菌加入到DNB培養基中,恒溫搖床160rpm~250rpm、25~32℃培養12~36h;?

(3)制備菌液:混合培養物經過6000rpm、4℃離心20min,取上清液,再將上清液16000rpm、4℃條件下離心20min,棄上清液,向沉淀中加入DNB液體培養基重新懸浮蛭弧菌沉淀物,制得蛭弧菌游泳體菌液(濃度108~109pfu/mL)。該菌液可以用無菌水、生理鹽水或0.2mol/L?pH值為7.2~?7.6的磷酸鹽緩沖液稀釋成不同濃度的蛭弧菌游泳體菌液,備用。?

本發明相對于現有技術,具有如下的優點及效果:?

1.本發明所述的使用蛭弧菌游泳體菌液控制生鮮乳中細菌總數的方法效果顯著。如圖1所示,細菌總數在8小時無冷藏的狀況下很好的控制甚至減少了細菌總數,提升了生鮮乳的等級。?

2.本發明所述的控制生鮮乳細菌總數的方法安全性好,已有研究證明,蛭弧菌對人無毒,且普通的低溫巴氏殺菌既能將其完全殺滅,不存在諸如輻照或抗生素殺菌等存在的輻射或藥物殘留問題。?

3.采用生物殺菌可有效避免物理殺菌方法對食品口味、品質等的改變,更有利于保持牛乳最原始的鮮味、品質。?

4.本方法采用的蛭弧菌游泳體菌液不僅能殺滅生鮮乳中常見的大腸桿菌,沙門氏菌等,對常因牛得乳腺炎而感染的金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、無乳鏈球菌和停乳鏈球菌都有清除的能力。?

附圖說明

圖1為實施例蛭弧菌游泳體菌液控制生鮮乳中細菌總數的效果圖。?

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明作進一步具體詳細描述,但本發明的實施方式不限于此,對于未特別注明的工藝參數,可參照常規技術進行。?

實施例?

(1)控制生鮮乳中細菌總數的蛭弧菌游泳體菌液的制備?

使用的蛭弧菌菌株為蛭弧菌(Bdellovibrio?sp.)BDFM05,由中國典型培養物保藏中心保藏,其簡稱為CCTCC,保藏編號為:CCTCC?NO:M?209172,保藏日期為2009年8月7日。?

對蛭弧菌BDFM05進行負染后于電子顯微鏡下形態觀察:BDFM05呈單細胞,橢圓形,大小為1.43×0.53μm,端生鞭毛,鞭毛長度至少2μm;所述蛭弧菌(Bdellovibrio?sp.)BDFM05以雙層平板法于28℃培養三天可形成直徑2~3mm的透明圓形噬菌斑。?

蛭弧菌游泳體通過申請號“200710031166.X”的發明專利公開的高密度蛭弧菌游泳體的發酵方法進行發酵:在裝有100mL?MRS液體培養基(蛋白胨10g,牛肉膏粉8g,酵母膏粉4g,葡萄糖20g,磷酸氫二鉀2g,檸檬酸三氨2g,乙酸鈉5g,硫酸鎂0.2g,硫酸錳0.05g,1g吐溫80,pH值6.0~6.4)的?錐形瓶中接種0.5mL107cfu/mL乳鏈球菌(購自廣東省微生物菌種保藏中心,編號GIM?1.156),200rpm、28℃搖床培養18小時,培養液于4℃、5000rpm離心15min,棄上清。將沉淀加入到裝有100mL?DNB(dilute?nutrient?broth)液體培養基(營養肉湯0.8g,酪蛋白酸水解物0.5g,酵母精提物0.1g,溶于1000ml蒸餾水中,pH值為7.2~7.6)的錐形瓶中,再加入1mL含103pfu/mL的蛭弧菌CCTCC?209172。恒溫搖床250rpm、28℃培養36h。培養液分別于4℃6000rpm離心20min,取上清液,再將上清液于4℃16000rpm離心20min,保留沉淀,加入DNB液體培養基(營養肉湯0.8g,酪蛋白酸水解物0.5g,酵母精提物0.1g,溶于1000ml蒸餾水中,pH值為7.2~7.6)重新懸浮蛭弧菌沉淀物,即制得濃度為108pfu/ml的蛭弧菌游泳體菌液。?

用無菌水稀釋上述蛭弧菌游泳體菌液,得到不同濃度的菌液,其中:?

菌液A含有的蛭弧菌濃度為108pfu/mL;?

菌液B含有的蛭弧菌濃度為106pfu/mL;?

菌液C含有的蛭弧菌濃度為104pfu/mL;?

(2)將蛭弧菌菌液應用于控制生鮮乳細菌總數?

本實驗取新鮮的12L鮮牛乳(山東,荷斯坦奶牛),將其分為12份,其中3份為對照系列,另9份為實驗系列。實驗系列中分別加入步驟(1)制好的菌液A、B、C,在25℃下分別靜置8小時。每30分鐘用無菌移液管吸取10mL牛乳樣品,以營養瓊脂(蛋白胨10g,牛肉膏3g,氯化鈉5g,瓊脂15~20g,蒸餾水1000mL)為培養基,采用涂布平板法對細菌進行計數(單位為cfu/mL)。所有數據均為三個平行樣的平均值。?

檢測結果如圖1所示。圖中所有數據均為三個平行樣的平均值。實驗結果表明,對照系列在8h后細菌總數增長到9.2×108cfu/mL,而實驗系列中3小時后細菌總數均控制在105cfu/mL以下,在5小時后A組甚至降至7.1×102cfu/mL次方,B組C組也分別降至7.8×103cfu/mL和9.8×104cfu/mL。8小時結束實驗時A組細菌總數為3.2×102cfu/mL,B組為3.4×103cfu/mL,C組2.76×104cfu/mL。可見蛭弧菌游泳體菌液控制生鮮乳中細菌總數效果顯著,且高濃度蛭弧菌游泳體菌液效果要優于低濃度。?

上述實施例為本發明較佳的實施方式,但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制,其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化,均應為等效的置換方式,都包含在本發明的保護范圍之內。?

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