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一種臍血造血干細胞凍存管.pdf

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一種 造血 干細胞 凍存管
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摘要
申請專利號:

CN201710155094.3

申請日:

20170314

公開號:

CN106665562A

公開日:

20170517

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01N1/02 主分類號: A01N1/02
申請人: 南京九壽堂醫藥科技有限公司
發明人: 郭守河,張康
地址: 210008 江蘇省南京市棲霞區仙林街道仙林大學城緯地路9號F7棟322室
優先權: CN201710155094A
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201710155094.3

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種臍血造血干細胞凍存管,包括凍存管主體,該凍存管主體的內壁設有包被層,包被層為γ聚谷氨酸材質。本發明提供的凍存管內壁含有γ聚谷氨酸包被層,使用本發明凍存管凍存臍血造血干細胞時,?80℃凍存6個月細胞數量和活性無明顯下降,顯著優于現有技術。因此,臍血造血干細胞6個月內的短期保存可以使用本發明提供的凍存管在?80℃凍存;超過6個月的長期凍存建議使用液氮保存。

權利要求書

1.一種臍血造血干細胞凍存管,包括凍存管主體,其特征在于:該凍存管主體的內壁設有包被層,包被層為γ聚谷氨酸材質。2.根據權利要求1所述的臍血造血干細胞凍存管,其特征在于:所述γ聚谷氨酸的分子量為70萬克/摩爾。3.根據權利要求1所述的臍血造血干細胞凍存管,其特征在于:γ聚谷氨酸包被層的厚度為0.2-0.4mm。4.一種制備權利要求1-3任一所述臍血造血干細胞凍存管的方法,其特征在于,包括:步驟S1,將無菌γ聚谷氨酸溶于無菌水中,制成濃度為0.1-0.2mg/mL的γ聚谷氨酸溶液,用0.22μm濾膜過濾,備用;步驟S2,取上述γ聚谷氨酸溶液加入市售凍存管中,置于35-45℃無菌條件靜置4-5小時;步驟S3,傾倒凍存管中剩余溶液,用無菌水清洗2-3次,置于無菌條件備用。

說明書

技術領域

本發明屬于干細胞領域,具體涉及一種臍血造血干細胞凍存管。

背景技術

臍血干細胞是臍血中的一種具有分化潛能的原始細胞,具備自我更新和增殖的能力,并能在特定因素的影響或誘導下,向各種細胞或組織分化。臍血造血干/祖細胞具有高度的自我更新能力或復制能力,能保持干細胞數量恒定,并能進一步分化為各系祖細胞及成熟細胞。CD34抗原是分離純化造血干/祖細胞的主要標志,臍血中的CD34+細胞群在數量、質量和增殖能力方面高于外周血,臍血中的造血干/祖細胞具有更原始、更強的增殖分化能力。近年來,臍血造血干細胞移植已發展為一種高科技生物治療手段,廣泛應用于許多疾病的治療,包括惡性血液病、自身免疫性疾病、嚴重免疫缺陷癥等,臨床證明具有一定的療效。

冷凍保存是臍血保存和造血干細胞移植的關鍵。已知,臍血干細胞在液氮中凍存6個月、1年、2年后的數量和活性無明顯變化,凍存效果較好,因而建議臍血干細胞長期保存應置于液氮中。鑒于-80℃凍存的方法方便、成本較低、應用廣泛,6個月以內的凍存采用-80℃凍存更為方便。徐長根等研究(-80℃下不同凍存時間對臍血造血干細胞保存效果的影響,臨床輸血與檢驗2010年4月第12卷第2期)發現,臍血細胞在-80℃下保存1、2、3、4、8周后,各組的有核細胞數和CD34+數的差異無統計學意義,而在凍存16、32周后較1周的差異有統計學意義(P<0.05)。臺盼藍拒染率在8、16、32周較1周的差異均有統計學意義(P<0.05)。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足,提供一種臍血造血干細胞凍存管,用于臍血造血干細胞在-80℃條件下6個月以內的有效凍存。

上述目的是通過如下技術方案實現的:

一種臍血造血干細胞凍存管,包括凍存管主體,該凍存管主體的內壁設有包被層,包被層為γ聚谷氨酸材質。

優選地,所述γ聚谷氨酸的分子量為70萬克/摩爾。

優選地,γ聚谷氨酸包被層的厚度為0.2-0.4mm。

一種制備上述臍血造血干細胞凍存管的方法,包括如下步驟:

步驟S1,將無菌γ聚谷氨酸溶于無菌水中,制成濃度為0.1-0.2mg/mL的γ聚谷氨酸溶液,用0.22μm濾膜過濾,備用;

步驟S2,取上述γ聚谷氨酸溶液加入市售凍存管中,置于35-45℃無菌條件靜置2-4小時;

步驟S3,傾倒凍存管中剩余溶液,用無菌水清洗2-3次,置于無菌條件備用。

本發明的有益效果:

本發明提供的凍存管內壁含有γ聚谷氨酸包被層,使用本發明凍存管凍存臍血造血干細胞時,-80℃凍存6個月細胞數量和活性無明顯下降,顯著優于現有技術。因此,臍血造血干細胞6個月內的短期保存可以使用本發明提供的凍存管在-80℃凍存;超過6個月的長期凍存建議使用液氮保存。

附圖說明

圖1為本發明凍存管結構示意圖,圖中1為γ聚谷氨酸包被層;

圖2為包被凍存組和常規凍存組6個月凍存期內臺盼藍拒染率變化。

具體實施方式

下面結合具體實施例和附圖詳細介紹本發明的技術方案和技術效果。未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規條件,例如教科書和實驗指南中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件,為本領域普通技術人員熟知或易于獲知。

實施例1本發明凍存管的制備

取市售2mL康寧凍存管自制本發明提供的凍存管,具體步驟如下:

步驟S1,將無菌γ聚谷氨酸(采用γ射線鈷60照射滅菌,分子量70萬克/摩爾)溶于無菌水中,制成濃度為0.15mg/mL的γ聚谷氨酸溶液,用0.22μm濾膜過濾,備用;

步驟S2,取2mLγ聚谷氨酸溶液加入2mL康寧凍存管中,于40℃無菌條件靜置3小時;

步驟S3,傾倒凍存管中剩余溶液,用無菌水清洗3次,置于無菌條件備用。

顯微鏡觀察顯示,凍存管內壁形成均勻的γ聚谷氨酸包被層,包被層厚度0.3mm。

γ聚谷氨酸溶液的濃度可以在0.1-0.2mg/mL之間調整,靜置溫度在35-45℃之間調整,靜置時間4-5小時,最終獲得的包被凍存管內壁的γ聚谷氨酸包被層厚度在0.2-0.4mm之間。

其他規格的凍存管制備方法類似。

當然,為了提高科研人員的工作效率,可以制備成預包被凍存管成品銷售給科研人員。

實施例2凍存管內壁包被對凍存效果的影響

一、實驗方法

1、臍血造血干細胞分離

肝素抗凝的臍血用Ficoll作密度梯度離心獲得臍血單個核細胞,洗滌后用RPMI 1640培養液制成細胞懸液,并調整細胞濃度為5×1010/L。

2、低溫凍存

采用含5%DMSO(二甲基亞砜,體積百分濃度)、3%HES(羥乙基淀粉,質量體積百分濃度)和4%HSA(人血白蛋白,質量體積百分濃度)的RPMI 1640培養液作為細胞冷凍保護劑,在試管中將等體積的細胞冷凍保護劑(4℃預冷)緩慢加入細胞懸液(4℃預冷)中,邊加邊混勻,然后分裝于2ml的凍存管中。在4℃冰箱中平衡30min后置于-80℃冰箱直接凍存,分別凍存0.5、1、3、6個月后42℃快速復溫并檢測各項指標。

實驗分為包被凍存組和常規凍存組,包被凍存組采用實施例1制備的γ聚谷氨酸包被凍存管,常規凍存組直接使用市售的常規凍存管。每組每個時間點設5個重復。

3、指標檢測

有核細胞計數:用白細胞稀釋液稀釋細胞懸液后,血細胞計數板計數,重復3次取均值。

流式細胞儀檢測CD34+:取50μl有核細胞懸液,加入20μl FITC標記的抗CD34+抗體,陰性對照加入20μl鼠IgG1-FITC,避光室溫孵育20min,用PBS洗3次,最后加0.5ml含0.1%多聚甲醛的PBS,上機分析。在FSC-SSC散點圖上,以陰性對照設門(淋巴細胞群),在FITC熒光參數直方圖上設定陰性。分析軟件為Cellquest。

采用臺盼藍拒染法進行活細胞計數:取0.5ml細胞懸液置于EP管,再加入約0.1ml 0.5%臺盼藍染液,混合2min后制片,鏡檢。采用血細胞計數板計數,計算臺盼藍拒染率。

應用SPSS 11.0軟件,采用單因素方差分析實驗數據。

二、實驗結果

包被凍存組和常規凍存組臍血造血干細胞凍存0.5、1、3、6個月后有核細胞數、CD34+陽性細胞數和臺盼藍拒染率(%)見表1和圖2。

表1各指標檢測結果(n=5)

表1和圖2表明,包被有γ聚谷氨酸的凍存管對臍血造血干細胞具有凍存保護作用,在6個月凍存期間,其有核細胞數、CD34+陽性細胞數和臺盼藍拒染率(細胞存活率)均沒有顯著變化。而使用常規無γ聚谷氨酸包被層的凍存管凍存臍血造血干細胞時,雖然0.5月、1月細胞數量和活性無明顯下降,但是3月細胞數量和活性顯著下降,6月下降更明顯。因此,臍血造血干細胞6個月內的短期保存可以使用本發明提供的凍存管在-80℃凍存;超過6個月的長期凍存建議使用液氮保存。

上述實施例的作用在于說明本發明的實質性內容,但并不以此限定本發明的保護范圍。本領域的普通技術人員應當理解,可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換,而不脫離本發明技術方案的實質和保護范圍。

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