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利用雄蜂聚集區評估東方蜜蜂野生種群數量的方法.pdf

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利用 雄蜂 聚集 評估 東方 蜜蜂 野生 種群 數量 方法
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摘要
申請專利號:

CN201710094486.3

申請日:

20170221

公開號:

CN106818641A

公開日:

20170613

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01K67/02 主分類號: A01K67/02
申請人: 中國農業科學院蜜蜂研究所
發明人: 丁桂玲,黃家興,張紅,劉彥杰,孫成,安建東
地址: 100000 北京市海淀區香山北溝1號
優先權: CN201710094486A
專利代理機構: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙) 代理人: 錢學宇
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201710094486.3

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明提供了利用雄蜂聚集區評估東方蜜蜂野生種群數量的方法,所述方法中,首先對雄蜂引誘確定聚集區,然后在雄蜂聚集區通過粘取獲得雄蜂樣本,最后對于雄蜂樣本進行DNA提取和遺傳分析,對雄蜂進行種群歸屬,再計算得出特定區域范圍內蜂群的數量。本發明方法具有操作步驟簡便,且能夠高效、準確定位東方蜜蜂DCA,這也為現有蜜蜂研究填補了空白;同時,本發明方法也能夠實現對于雄蜂的有效誘捕;進一步的,本發明中通過對于東方蜜蜂的多樣性位點進行系統分析、選擇以及遺傳性分析和計算,能夠有效確定特定區域范圍內的蜂群數量,這不僅填補了現有技術中對于東方蜜蜂多樣性位點研究的空白,同時也能夠有效的對于區域內蜜蜂種群數量進行有效的測算。

權利要求書

1.一種利用雄蜂聚集區評估東方蜜蜂野生種群數量的方法,其特征在于,所述方法包括如下步驟:a)在由樹木組成的封閉區域內,將下方拴有過濾嘴的充氣氣球置于所述封閉區域的露天地帶或較高的樹枝處,其中,所述過濾嘴中裝載有蜂王物質;然后,調整充氣氣球的高度,并確定雄蜂集中分布區域,即定位為雄蜂聚集區,并作為取樣點;b)將下方拴有過濾嘴的充氣氣球置于雄蜂聚集區,其中,拴繩上涂抹有膠水;然后,通過粘取捕獲雄蜂,并將采集到的雄蜂樣本保存;c)提取雄蜂樣本DNA,并篩選多態性豐富的位點,引物進行PCR擴增,然后對PCR產物進行遺傳分析,并評估雄蜂樣本所屬蜂群的數量;然后,根據雄蜂的平均飛行距離,計算出特定區域范圍內蜂群的種群數量。2.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,所述蜂王物質為9-ODA稀釋液。3.根據權利要求2所述的方法,其特征在于,所述9-ODA稀釋液是由9-ODA溶于異丙醇和超純去離子水中制備得到的。4.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,所述調整氣球高度為在5~15m的高度范圍內調整氣球的高度。5.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,所述充氣氣球的下方拴有1~3個過濾嘴;其中,當過濾嘴的數量大于一個時,多個過濾嘴采用等間距設置。6.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,雄蜂的捕獲集中于無風、溫暖的晴朗天氣進行;和,在12:00~14:00的時間范圍內。7.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,采集到的雄蜂樣本是放入乙醇溶液中進行保存的。8.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,所述提取雄蜂樣本DNA為:取下每只雄蜂的后足,然后進行DNA提取。9.根據權利要求8所述的方法,其特征在于,所述DNA提取為采用5~10%Chelex進行提取。10.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,所述對PCR產物進行遺傳分析為:將擴增后所得PCR產物稀釋10~20倍后,再使用遺傳分析儀進行遺傳分析。

說明書

技術領域

本發明涉及野生蜜蜂種群評估領域,具體而言,涉及利用雄蜂聚集區評估東方蜜蜂野生種群數量的方法。

背景技術

為了評估授粉昆蟲多樣性的變化情況以及授粉昆蟲是否達到特定區域內植物授粉所需的數量,常常需要統計蜂群特別是野生蜂群的密度。但野外蜂群一般較為隱蔽,不太容易發現,無法通過直接統計蜂群數量的方法獲得數據。

在蜜蜂的交配季節,來自多個蜂群的大量雄蜂匯集在一起形成雄蜂聚集區(Drone Congregation Areas,簡稱DCA),雄蜂在此區域與處女蜂王進行交配。來自周邊區域的大量蜂群的雄蜂在DCA聚集,使得DCA中雄蜂數量可達數百到上萬只。在DCA收集雄蜂樣品,根據蜜蜂的單倍二倍性生殖特點(即雄蜂基因全部來自蜂王),當使用具有足夠變異信息的微衛星位點時,便可以準確地把樣品中的雄蜂分配到不同的蜂王,從而可以利用多態性豐富的位點對雄蜂進行多樣性分析,即可評估特定區域范圍內的蜂群數量。目前,該方案已用于野生西方蜜蜂(Apis mellifera)的蜂群數量評估。

利用DCA準確推測特定區域的蜂群數量需要滿足三個條件:首先,可以在野外高效地定位到DCA的分布地點;其次,可以在DCA收集到大量樣品;最后,需要使用多態性較好的位點對樣品進行基因型數據的收集。

目前,蜜蜂屬的9個蜜蜂種中,對西方蜜蜂的研究最為詳細。西方蜜蜂雄蜂喜歡聚集在開闊的場地,周圍的樹木較矮,雄蜂聚集高度在10-30m。東方蜜蜂是飼養數量處于第二位的蜂種,分布范圍較廣,野生種群數量較多,但對于該蜂種的研究相對較少。

Punchihewa等(Congregation of Apis cerana indica Fabricius 1798drones in the canopy of trees in Sri Lanka,Apidologie,21,201-208)在斯里蘭卡發現東方蜜蜂的雄蜂聚集在靠近大樹的地方,在靠近樹冠的露天區域飛行,不會跟隨囚禁的蜂王飛到樹冠頂部或旁邊,飛行高度為4-8m。但在日本,Fujiwara等人(Drone congregation of Apis cerana japonica above large trees.Apidologie,25,331-337)發現東方蜜蜂雄蜂聚集在突出的樹木上方的露天區域,雄蜂外出飛行高峰時間為13:20-16:00,估計雄蜂聚集的高度在30-70m,在櫸樹之外的其他樹上方未發現雄蜂聚集。

由于關于東方蜜蜂雄蜂聚集區的數據較少,并且不同的報道內容很不一致,目前對于東方蜜蜂DCA的分布特點尚無定論,導致DCA的發現屬于隨機事件。在找到DCA后進行收集雄蜂樣品時,仍按照西方蜜蜂的方法,尚未形成針對東方蜜蜂雄蜂飛行特點的高效取樣方法。對收集的樣品進行分析時,亦尚未篩選出多態性豐富的多個位點。

有鑒于此,特提出本發明。

發明內容

本發明的第一目的在于提供一種利用雄蜂聚集區評估東方蜜蜂野生種群數量的方法,所述方法中,首先對雄蜂引誘確定DCA,然后在DCA通過粘取獲得雄蜂樣本,最后對于雄蜂樣本進行DNA提取和遺傳分析、對雄蜂進行種群歸屬,然后再計算得出特定區域范圍內蜂群的數量。本發明方法具有操作步驟簡便,且能夠高效、準確定位東方蜜蜂DCA的優點,這也為現有蜜蜂研究填補了空白;同時,本發明方法也能夠實現對于雄蜂的有效誘捕;進一步的,本發明中通過對于東方蜜蜂的多樣性位點進行系統分析、選擇以及遺傳性分析和計算,能夠有效確定特定區域范圍內的蜂群數量,這不僅填補了現有技術中對于東方蜜蜂多樣性位點研究的空白,同時也能夠有效的對于特定區域內東方蜜蜂種群數量進行有效的測算。

為了實現本發明的上述目的,特采用以下技術方案:

一種利用雄蜂聚集區評估東方蜜蜂野生種群數量的方法,所述方法包括如下步驟:

a)在由樹木組成的封閉區域內,將下方拴有過濾嘴的充氣氣球置于所述封閉區域的露天地帶或較高的樹枝處,其中,所述過濾嘴中裝載有蜂王物質;

然后,調整氣球高度,根據被吸引的雄蜂數量確定雄蜂集中分布區域,即定位為雄蜂聚集區,并作為取樣點;

b)將下方拴有過濾嘴的充氣氣球置于雄蜂聚集區,其中,拴繩上涂抹有膠水;然后,通過粘取捕獲雄蜂,并將采集到的雄蜂樣本保存;

c)提取雄蜂樣本DNA,并篩選多態性豐富的位點引物進行PCR擴增,然后對PCR產物進行遺傳分析,并評估雄蜂樣本所屬蜂群的數量;最后,根據雄蜂的平均飛行距離,計算出特定區域范圍內蜂群的種群數量。

可選的,本發明中,所述蜂王物質為9-ODA稀釋液。

可選的,本發明中,所述9-ODA稀釋液是由9-ODA溶于異丙醇和超純去離子水中制備得到的。

可選的,本發明中,所述調整氣球高度為在5~15m的高度范圍內調整氣球的高度。

可選的,本發明中,所述充氣氣球的下方拴有1~3個過濾嘴;

其中,當過濾嘴的數量大于一個時,多個過濾嘴采用等間距設置。

可選的,本發明中,雄蜂的捕獲集中于無風、溫暖的晴朗天氣進行;和,在12:00~14:00的時間范圍內。

可選的,本發明中,采集到的雄蜂樣本是放入乙醇溶液中進行保存的。

可選的,本發明中,所述提取雄蜂樣本DNA為:取下每只雄蜂的后足,然后進行DNA提取。

可選的,本發明中,所述DNA提取為采用5~10%Chelex進行提取。

可選的,本發明中,所述對PCR產物進行遺傳分析為:將擴增后所得PCR產物稀釋10~20倍后,再使用遺傳分析儀進行遺傳分析。

與現有技術相比,本發明的有益效果為:

本發明中,針對于野生東方蜜蜂的種群特性,通過采用特定的方法進行DCA定位、樣品誘捕以及多樣性位點統計分析,從而能夠有效評估特定區域內野生東方蜜蜂的種群數量,不僅方法簡便有效,而且還填補了對于野生東方蜜蜂種群的空白,也為對野生蜜蜂的進一步研究提供了新的技術手段與參考。

具體實施方式

下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述,但是本領域技術人員將會理解,下列實施例僅用于說明本發明,而不應視為限制本發明的范圍。實施例中未注明具體條件者,按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者,均為可以通過市售購買獲得的常規產品。

雖然對于野生西方蜜蜂蜂群數量的研究方法較為成熟,但由于西方蜜蜂和東方蜜蜂習性有所不同,采用相同的方法無法準確得出野生東方蜜蜂的蜂群數量信息,目前,野生東方蜜蜂種群研究的主要問題在于:

(1)尋找DCA:目前對于東方蜜蜂DCA的描述和研究較少,根據已有資料不能高效確定雄蜂聚集地的環境特點;

(2)捕捉雄蜂:誘捕網掛在氣球下進行收集雄蜂不可行,即使蜂王物質置于網內,東方蜜蜂的雄蜂只是在誘捕網周圍飛行,并不進入,無法獲取雄蜂樣品;

(3)樣品分析:目前未針對東方蜜蜂多樣性位點進行過系統選擇。

為了解決上述技術問題,并為特定區域內野生東方蜜蜂種群數量的評估提供確實、有效的計算方法,本發明針對野生東方蜜蜂種群的特性,采用了如下的評估測算方法:

a)DCA定位:

在由樹木組成的封閉區域內,將下方拴有過濾嘴的充氣氣球置于所述封閉區域的露天地帶或較高的樹枝處,其中,所述過濾嘴中裝載有蜂王物質;然后,調整氣球高度,并確定雄蜂集中分布區域,即定位為雄蜂聚集區,并作為取樣點;

由于通過野外實驗發現,雄蜂聚集區通常分布在相對封閉的環境,因而可以選擇在由樹木形成的半圓形或三角形的封閉空間內進行DCA的篩選和定位;

作為實驗工具的充氣氣球優選的為氫氣或氦氣氣球,由于氦氣使用更為安全,故而優選的使用氦氣氣球進行實驗;

優選的,氦氣氣球以白色尼龍扎繩封口,扎繩上連接透明魚線作為拴繩使用,用長度約為10-20cm的透明魚線拴在拴繩上作出枝杈狀,其端部拴住裝載有蜂王物質(用以引誘雄蜂)的過濾嘴,同時,第一個連接過濾嘴的枝杈狀結點與氦氣氣球的底部保持一定的距離;

優選的,過濾嘴的數量為3個,且在拴繩上等距分布;

優選的,本發明所述蜂王物質為9-ODA稀釋液,所述稀釋液優選的是由21mg 9-ODA、1ml異丙醇以及1%超純去離子水混合而成;進一步的,每個過濾嘴中都通過注射裝載20μl的蜂王物質;

優選的,本發明中,將充氣氣球置于篩選好的、由樹木形成的半圓形或三角形的封閉空間內,可以置于該封閉空間的露天區域,或者是置于該封閉空間四周較高的樹枝處,樹枝的高度優選的為8~23m;然后,通過抖動卷線器,將氣球的高度在5~15m內不斷調整,觀測雄蜂集中分布地,并定位DCA及取樣地點;

b)將下方拴有過濾嘴的充氣氣球置于雄蜂聚集區,其中,拴繩上涂抹有膠水;然后,通過上下抖動拴繩、粘取捕獲雄蜂,并將采集到的雄蜂樣本保存;

由于野生東方蜜蜂無法通過誘捕網進行捕獲,因而必須采用新的技術手段解決這一問題,本發明中采用膠水粘取的方法就能夠很好的解決問題,由蜂王物質所引誘過來的雄蜂可以較為容易的被膠水粘附于拴繩之上,這就能夠快速的進行樣本的采集;

優選的,本發明中,所用膠水為粘蠅膠,可以將粘蠅膠直接涂抹于拴繩上,涂抹的區間為氣球底部至最下方的過濾嘴處;

由于雄蜂在聚集區出現的時間較短,因而,為了能夠在短時間內獲取大量樣品,因而優選的集中在無風、溫暖的晴朗天氣,于12:00~14:00,更優選的于12:45~13:30進行樣本的捕獲與收集,進而提高采樣的效率;

優選地,通過誘捕收集到的雄蜂樣本置于盛有100%酒精的樣品管中進行保存。

c)提取雄蜂樣本DNA,并篩選多態性豐富的位點引物進行PCR擴增,然后對PCR產物進行遺傳分析,并評估雄蜂樣本所屬蜂群的數量;然后,根據雄蜂的平均飛行距離,計算出特定區域范圍內蜂群的種群數量。

對于雄蜂樣本的提取,優選的是取下樣本中每只雄蜂的一個后足,以5%Chelex進行DNA的提取,然后篩選出多態性豐富的位點;

優選的,所述遺傳性分析是將PCR產物稀釋10~20倍后,利用ABI3130xl遺傳分析儀進行檢測,并收集整理雄蜂基因型數據;標準群體遺傳參數可以使用軟件分析,并進一步可以使用相關軟件統計分析樣本雄蜂所屬蜂群;進一步的,還可以通過利用雄蜂的平均飛行距離,計算出特定區域范圍內的蜂群數量。

實施例1

(1)DCA定位

通過野外的試驗發現,雄蜂聚集區通常分布在相對封閉的環境,在有相對明顯的樹木作為標記物的地方,周圍還需要有其他樹木與其形成一個半圓形或三角形的封閉空間,應以此為標準篩選DCA分布地;

將氣球充滿氦氣,用白色尼龍扎繩系住充滿氦氣的氣球,把透明漁線系在尼龍扎繩上作為拴繩,在氣球下方的拴繩上間隔地系上3個長度為10cm的透明魚線作出枝杈狀,在枝杈狀端部系上過濾嘴,在每個過濾嘴上注射20微升的蜂王物質(9-ODA)(把21mg 9-ODA溶于1ml異丙醇和1%超純去離子水的稀釋液),放到篩選好的DCA分布地的露天區域或高度為8~23m的樹枝處,抖動卷線器,在5~15m的高度范圍內,不斷調整氣球高度,可很快看到雄蜂集中分布的地方,以此定位DCA及取樣地點;

此外,2015年及2016年在3個DCA的同一個地點均收集到大量雄蜂,說明東方蜜蜂的DCA可在同一地點反復出現;

由此可見,特定的DCA在多個繁殖季節可穩定出現在同一地點;進一步的,這一特性使得我們可以多次利用已找到的DCA進行相關研究。

(2)捕捉雄蜂

雄蜂集中出現在DCA的時間較短,為了能在短時間內獲取大量樣品,應集中在無風、溫暖的晴朗天氣于12:45-13:30期間進行收集。收集雄蜂時,應用粘蠅膠直接涂抹漁線,涂抹區間為氣球下方至最下面一個過濾嘴處,在雄蜂飛行的集中地點半小時內可以收集300只以上。收集的雄蜂放入盛有100%酒精的樣品管中進行保存;

(3)樣品分析

取下每只雄蜂的一個后足,使用5%Chelex進行DNA提取。選取來自不同群體的8個蜜蜂個體,利用其DNA進行PCR擴增,PCR產物10~20倍稀釋后利用ABI3130xl遺傳分析儀進行檢測,使用其對應的GeneMapper軟件收集整理雄蜂基因型數據。通過這些樣品對75個微衛星位點進行篩選,可挑選出22個多態性較好的位點,以確保位點的穩定性和多樣性。位點詳細信息如下表1所示:

表1 篩選出的多態性位點

對從不同DCA收集的雄蜂樣品使用篩選出的多態性豐富的位點進行基因型數據的收集。數據分析時,標準群體遺傳參數可使用軟件Excel Microsatellite Toolkit以及Fstat進行分析,為估計這些雄蜂來自多少蜂群,可使用Colony軟件進行分析,之后,利用雄蜂的平均飛行距離,即可計算出特定區域范圍內的蜂群數量。

盡管已用具體實施例來說明和描述了本發明,然而應意識到,在不背離本發明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此,這意味著在所附權利要求中包括屬于本發明范圍內的所有這些變化和修改。

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