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一種以外種皮為外植體獲得胡椒體細胞胚胎的方法.pdf

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一種 以外 種皮 外植體 獲得 胡椒 體細胞 胚胎 方法
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摘要
申請專利號:

CN201710078362.6

申請日:

20170214

公開號:

CN106818485A

公開日:

20170613

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A01H4/00 主分類號: A01H4/00
申請人: 中國熱帶農業科學院香料飲料研究所
發明人: 胡麗松,范睿,伍寶朵,郝朝運,譚樂和
地址: 571533 海南省萬寧市興隆鎮香料飲料研究所
優先權: CN201710078362A
專利代理機構: 北京集佳知識產權代理有限公司 代理人: 趙青朵
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201710078362.6

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及組織培養技術領域,公開了一種以外種皮為外植體獲得胡椒體細胞胚胎的方法。本發明所述方法將成熟胡椒種子滅菌,然后培養成胡椒幼苗,從幼苗子葉處分離出外種皮;將外種皮依次進行愈傷誘導培養和分化培養,獲得胡椒體細胞胚胎。本發明所述方法選擇外種皮作為外植體,調整愈傷誘導培養基和分化培養基的配方,以MS為基礎培養基添加活性炭、聚乙烯吡咯烷酮和2,4?D等成分,實現了高達20%的胡椒體細胞胚胎分化率,對高通量胡椒種苗繁育研究及轉基因育種體系建立具有重要意義。

權利要求書

1.一種以外種皮為外植體獲得胡椒體細胞胚胎的方法,其特征在于,包括:步驟1、將成熟胡椒種子滅菌,然后培養成胡椒幼苗,從幼苗子葉處分離出外種皮;步驟2、將外種皮進行愈傷誘導培養獲得愈傷組織,愈傷誘導培養基以MS為基礎培養基,包含活性炭、聚乙烯吡咯烷酮和2,4-D;步驟3、將愈傷組織進行體細胞胚胎分化培養,獲得胡椒體細胞胚胎,分化培養基以MS為基礎培養基,包含活性炭和聚乙烯吡咯烷酮。2.根據權利要求1所述方法,其特征在于,步驟1為:將成熟胡椒種子滅菌,然后置于無菌培養基中,28±2℃、避光培養至胡椒幼苗長出,子葉完全展開后,將外種皮從子葉頂端剝離,無菌培養基配方為1/2MS+2g/L活性炭。3.根據權利要求1或2所述方法,其特征在于,所述滅菌具體為:將完整的成熟胡椒種子在75%酒精中浸泡2分鐘,然后無菌水清洗5次;在超凈臺無菌環境下去除果肉,將去除果肉的種子在75%酒精中浸泡2分鐘,然后無菌水清洗5次,接著將去除果肉的種子置于0.1%的升汞中浸泡10分鐘滅菌,最后轉移至新的無菌容器中,無菌水清洗5次。4.根據權利要求1所述方法,其特征在于,所述愈傷誘導培養基中活性炭濃度為2g/L、聚乙烯吡咯烷酮濃度為1g/L,2,4-D濃度為0.5mg/L。5.根據權利要求1所述方法,其特征在于,所述分化培養基中活性炭濃度為2g/L、聚乙烯吡咯烷酮濃度為1g/L。6.根據權利要求1、4或5所述方法,其特征在于,所述聚乙烯吡咯烷酮為聚乙烯吡咯烷酮40。7.根據權利要求1所述方法,其特征在于,所述愈傷誘導培養為在28±2℃下避光培養90天,每隔30天更換新愈傷誘導培養基。8.根據權利要求1所述方法,其特征在于,所述分化培養為在28±2℃下避光培養90天,每隔30天更換新分化培養基。9.根據權利要求1所述方法,其特征在于,所述成熟胡椒種子為成熟的熱引1號(Pipernigrumc.v.Reyin-1)種子。10.根據權利要求1或9所述方法,其特征在于,所述種子完全成熟且無病蟲害和機械損傷。

說明書

技術領域

本發明涉及組織培養技術領域,具體涉及一種以外種皮為外植體獲得胡椒體細胞胚胎的方法。

背景技術

胡椒(Piper nigrum L.)為胡椒科(Piperaceae)胡椒屬(Piper)多年生木質藤本植物,其果實具有辛辣香氣,素有“香料之王”的美譽,是世界重要的香辛料作物,也是人們喜愛的調味品。在醫學領域,胡椒可被用作健胃劑、解熱劑和支氣管粘膜刺激劑等。在食品工業上,可被用作抗氧化劑、防腐劑和保鮮劑等。作為一種深受人們喜愛的調味品和具有眾多用途的熱帶農產品,胡椒已遍及亞州、非州、拉丁美洲三大洲近20個國家和地區。其中我國主要分布在海南、云南、廣東、福建等地,種植面積近3×104hm2、年產量超過3.6×105t,居世界第五位。我國胡椒市場長期存在供不應求的局面,每年需進口約1.0×104t滿足內需。隨著我國人民生活水平的不斷提高和飲食結構的變化,胡椒消費量還將大幅增加。市場需求的不斷擴大給胡椒產業提供了廣闊的發展前景。

胡椒為多年生藤本植物,生產上胡椒種苗繁育以插條苗為主,該方法具有種苗與母本性狀一致、后代發病率低等優點,但它對苗圃規劃、母株選擇、苗期培育等環節有著嚴格的要求,成本較高,且無法滿足產業快速推進高通量種苗培育的要求,高通量種苗培育技術的缺乏限制了產業的進一步發展。體細胞再生是基于細胞全能型理論、以母本組織為外植體,在體外環境下通過愈傷誘導、分化等一系列過程獲得組培苗的技術體系。胡椒體細胞再生體系的建立可以為種苗的高通量、規模化、商業化生產以及種植業的快速推廣提供技術支撐。

盡管體細胞再生技術已廣泛應用于種苗培育、轉基因育種等領域,但不同作物的再生體系與外植體選擇、培養基類型、培養環境等因素密切相關。現有研究《胡椒組織培養研究》以胡椒實生苗芽尖、胚軸、葉片為外植體開展了胡椒體細胞再生研究,并提供了種子滅菌、體細胞再生培養方法,但其文獻公布的方法種子萌發污染率高達30%-60%,而體細胞分化率不到1%(劉進平等,熱帶農業科學,2002,22(3):18-22.)。目前胡椒生產上還未有一種適合于胡椒體細胞胚胎發生的培育方法。

發明內容

有鑒于此,本發明的目的在于提供一種以外種皮為外植體獲得胡椒體細胞胚胎的方法,使得所述方法能夠顯著提高胡椒體細胞胚胎的分化率。

本發明的另外一個目的在于提供一種以外種皮為外植體獲得胡椒體細胞胚胎的方法,使得所述方法能夠顯著降低種子萌發污染率。

為了實現上述目的,本發明提供如下技術方案:

一種以外種皮為外植體獲得胡椒體細胞胚胎的方法,包括:

步驟1、將成熟胡椒種子滅菌,然后培養成胡椒幼苗,從幼苗子葉處分離出外種皮;

步驟2、將外種皮進行愈傷誘導培養獲得愈傷組織,愈傷誘導培養基以MS為基礎培養基,包含活性炭(AC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和2,4-D;

步驟3、將愈傷組織進行體細胞胚胎分化培養,獲得胡椒體細胞胚胎,分化培養基以MS為基礎培養基,包含活性炭和聚乙烯吡咯烷酮。

針對現有胡椒組織培養方法中種子萌發污染率較高以及分化率較低的問題,本發明從外植體的選擇和培養基配方調整兩個方面入手,實現了較高體細胞分化率的目的,在此基礎上進行適宜的消毒措施,降低了種子萌發的污染率。

作為優選,步驟1為:

將成熟胡椒種子滅菌,然后置于無菌培養基中,28±2℃、避光培養至胡椒幼苗長出,子葉完全展開后,將外種皮從子葉頂端剝離,無菌培養基配方為1/2MS+2g/L活性炭。

其中,所述滅菌具體為:

將完整的成熟胡椒種子在75%酒精中浸泡2分鐘,然后無菌水清洗5次;在超凈臺無菌環境下去除果肉,將去除果肉的種子在75%酒精中浸泡2分鐘,然后無菌水清洗5次,接著將去除果肉的種子置于0.1%的升汞中浸泡10分鐘滅菌,最后轉移至新的無菌容器中,無菌水清洗5次。

作為優選,所述愈傷誘導培養基中活性炭濃度為2g/L、聚乙烯吡咯烷酮濃度為1g/L,2,4-D濃度為0.5mg/L;所述分化培養基中活性炭濃度為2g/L、聚乙烯吡咯烷酮濃度為1g/L。在本發明具體實施中,所述聚乙烯吡咯烷酮為聚乙烯吡咯烷酮40(PVP-40)。

作為優選,所述愈傷誘導培養和分化培養均在28±2℃下避光培養90天,每隔30天更換新培養基進行繼代培養。

在本發明具體實施方式中,本發明方法中的成熟胡椒種子以成熟的熱引1號(Piper nigrumc.v.Reyin-1)種子為材料,選擇的種子完全成熟且無病蟲害和機械損傷。

本發明以不同外植體和培養基作為對照方法,與本發明方法在相同環境條件下進行培養,結果顯示,本發明方法的種子萌發污染率僅為5%左右,而文獻《胡椒組織培養研究》中的方法的污染率高達50%以上;在愈傷組織誘導率和體細胞分化率方面,本發明的效果也是顯著高于各對照方法。

由以上技術方案可知,本發明所述方法選擇外種皮作為外植體,調整愈傷誘導培養基和分化培養基的配方,以MS為基礎培養基添加活性炭、聚乙烯吡咯烷酮和2,4-D等成分,實現了高達20%的胡椒體細胞胚胎分化率,對高通量胡椒種苗繁育研究及轉基因育種體系建立具有重要意義。

具體實施方式

本發明公開了一種以外種皮為外植體獲得胡椒體細胞胚胎的方法,本領域技術人員可以借鑒本文內容,適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是,所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的,它們都被視為包括在本發明。本發明所述方法已經通過較佳實施例進行了描述,相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法進行改動或適當變更與組合,來實現和應用本發明技術。

以下就本發明所提供的一種以外種皮為外植體獲得胡椒體細胞胚胎的方法做進一步說明。

實施例1:本發明所述方法

取5年生、生長正常且無病蟲害影響的熱引1號植株成熟果實;將種子從果穗剝離,無菌環境下75%(V/V)酒精中浸泡2分鐘,然后無菌水清洗5次;在無菌環境下去除果肉,將去除果肉的種子在75%酒精中浸泡2分鐘,然后無菌水清洗5次,再將種子置于0.1g/L的升汞中浸泡10分鐘滅菌,最后將種子轉移至新的無菌容器中,無菌水清洗5次,獲得無菌種子。

無菌環境下,將無菌種子置于無菌培養基中萌發,(28±2)℃、避光培養60天。培養基配方為1/2MS+2g/LAC(活性炭)。待胡椒幼苗完全長出后,將外種皮從子葉頂端剝離。

將外種皮置于愈傷誘導培養基中,(28±2)℃、避光培養90天。培養基配方為MS+2g/L AC+1g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)+0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)。培養期間,每隔30天將材料轉移至新的培養基中繼代培養,90天后可誘導出愈傷組織。

將愈傷組織轉移至分化培養基中,(28±2)℃、避光培養。培養基配方為MS+2g/LAC+1g/L PVP-40,每隔30天將材料轉移至新的培養基中繼帶培養,連續培養90天后可得到胡椒體細胞胚胎。

實施例2:對照方法1(以葉片、胚軸為外植體采用實施例1中培養方法)

取5年生、生長正常且無病蟲害影響的熱引1號植株成熟果實;將果實從果穗剝離,無菌環境下75%(V/V)酒精中浸泡2分鐘,然后無菌水清洗5次;在無菌環境下去除果肉,將去除果肉的種子在75%酒精中浸泡2分鐘,然后無菌水清洗5次,再將種子置于0.1g/L的升汞中浸泡10分鐘滅菌,最后將胡椒種子轉移至新的無菌容器中,無菌水清洗5次,獲得無菌種子。

無菌環境下,將無菌種子置于無菌培養基中萌發,(28±2)℃、避光培養60天。培養基配方為1/2MS+2g/L AC。待胡椒幼苗完全長出后,切取無菌實生苗的胚軸(1.5厘米長)、葉片為外植體。

將胚軸、葉片置于愈傷誘導培養基中,(28±2)℃、避光培養90天。培養基配方為MS+2g/LAC+1g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)+0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)。培養期間,每隔30天將材料轉移至新的培養基中繼代培養,90天后統計愈傷誘導率。

將愈傷組織轉移至分化培養基中,(28±2)℃、避光培養。培養基配方為MS+2g/LAC+1g/L PVP-40,每隔30天將材料轉移至新的培養基中繼代培養,連續培養90天后可得到胡椒體細胞胚胎。

實施例3:對照方法2(將實施例1中MS培養基更換為無激素SH培養基)

取5年生、生長正常且無病蟲害影響的熱引1號植株成熟果實;將種子從果穗剝離,無菌環境下75%(V/V)酒精中浸泡2分鐘,然后無菌水清洗5次;在無菌環境下去除果肉,將去除果肉的種子在75%酒精中浸泡2分鐘,然后無菌水清洗5次,再將種子置于0.1g/L的升汞中浸泡10分鐘滅菌,最后將種子轉移至新的無菌容器中,無菌水清洗5次,獲得無菌種子。

無菌環境下,將無菌種子置于無菌培養基中萌發,(28±2)℃、避光培養60天。培養基配方為SH+2g/L AC。待胡椒幼苗完全長出后,將外種皮從子葉頂端剝離。

將外種皮置于愈傷誘導培養基中,(28±2)℃、避光培養90天。培養基配方為SH+2g/L AC。培養期間,每隔30天將材料轉移至新的培養基中繼代培養,90天后可誘導出愈傷組織。

將愈傷組織轉移至分化培養基中,(28±2)℃、避光培養。培養基配方為SH+2g/L AC+1g/L PVP-40,每隔30天將材料轉移至新的培養基中繼代培養,連續培養90天后可得到胡椒體細胞胚胎。

實施例4:對照方法3(文獻《胡椒組織培養研究》中的方法)

取5年生、生長正常且無病蟲害影響的熱引1號植株成熟果實;將果實從果穗剝離置于飽和洗衣粉溶液中去皮,然后用流水沖洗干凈,再依次用75%的酒精浸泡2分鐘,0.1%的升汞消毒15分鐘,2%的次氯酸鈉消毒10分鐘,無菌水清洗3-5次,然后接種到1/2MS培養基上萌發。種子在(28±2)℃、避光條件下萌發60天后,切取無菌實生苗的胚軸、葉片為外植體。

將胚軸、葉片置于誘導培養基中培養,培養期間,每隔30天將材料轉移至新的培養基中繼代培養,培養基配方為1/2MS+5mg/L萘乙酸(NAA)+2mg/L 6-芐氨基嘌呤(6-BA)。培養條件為溫度(28±2)℃,光照時間10小時/天,連續培養90天后可誘導出愈傷組織。

將愈傷組織轉移至體細胞胚胎分化培養基,培養基配方為1/2MS+100mg/L腺嘌呤+3mg/L 6-BA。培養期間,每隔30天將材料轉移至新的培養基中繼代培養,培養條件為溫度(28±2)℃,光照時間10小時/天,連續培養90天后統計胡椒體細胞胚胎。

實施例5:對照方法4(文獻《胡椒組織培養研究》中的方法)

取5年生、生長正常且無病蟲害影響的熱引1號植株成熟果實;將果實從果穗剝離置于飽和洗衣粉溶液中去皮,然后用流水沖洗干凈,再依次用75%的酒精浸泡2分鐘,0.1%的升汞消毒15分鐘,2%的次氯酸鈉消毒10分鐘,無菌水清洗3-5次,然后接種到1/2MS培養基上萌發。種子在(28±2)℃、避光條件下萌發60天后,切取無菌實生苗的胚軸、葉片為外植體。

將胚軸、葉片置于誘導培養基中培養,培養期間,每隔30天將材料轉移至新的培養基中繼代培養,培養基配方為1/2MS+3mg/L 2,4-D+100mg/L腺嘌呤。培養條件為溫度(28±2)℃,光照時間10小時/天,連續培養90天后可誘導出愈傷組織。

將愈傷組織轉移至體細胞胚胎分化培養基,培養基配方為1/2MS+100mg/L腺嘌呤+3mg/L 6-BA。培養期間,每隔30天將材料轉移至新的培養基中繼代培養,培養條件為溫度(28±2)℃,光照時間10小時/天,連續培養90天后統計胡椒體細胞胚胎。

實施例6:對比試驗

按照實施例1-實施例5的方法進行試驗,統計種子萌發污染率、愈傷組織誘導率以及體細胞胚胎分化率,結果見表1。

表1不同培養方法污染率、體細胞胚胎分化率對比

由表1可以看出,采用本發明的以外種皮為外植體獲得胡椒體細胞胚胎的方法,污染率為5%,遠遠低于現有文獻公布的培育方法。采用本發明所提供的愈傷誘導、分化培養基和培育方式,愈傷誘導率在95%以上、體細胞分化率高達20%左右,相比其他對照方法,為最優的培育方法。

以上所述僅是本發明的優選實施方式,應當指出,對于本技術領域的普通技術人員來說,在不脫離本發明原理的前提下,還可以做出若干改進和潤飾,這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。

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