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白芨體細胞胚誘導及成苗方法.pdf

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白芨 體細胞 誘導 方法
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摘要
申請專利號:

CN201710072668.0

申請日:

20170210

公開號:

CN106818483A

公開日:

20170613

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01H4/00 主分類號: A01H4/00
申請人: 玉溪市祥馨農業技術開發有限公司
發明人: 黃衡宇,李繼祥,肖文俊,王淑蘭,金鵬程,李培源
地址: 653100 云南省玉溪市紅塔區北城街道蓮池社區九組三十二幢六號
優先權: CN201710072668A
專利代理機構: 代理人:
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201710072668.0

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

白芨體細胞胚誘導及成苗方法,步驟包括種子準備、培養基準備、實驗室培養、大棚煉苗培養。有益效果是:白芨的培養基營養成份搭配比例合理,營養價值高,符合白芨生長的需要,白芨在培養過程中,分別定期追加了白砂糖、甲硫達嗪和激動素,大大促進了白芨胚性愈傷組織的生長、分裂和體細胞胚形成效率;白芨種苗的培養,從繁殖到大棚內煉苗培養只需8個月,縮短了培養周期,降低了生產成本;本發明培養工序較為簡單,培養的白芨幼苗為無性第一代,克服了利用地下假鱗莖和地上莖等外植進行組培育苗時容易滋生真菌和積累病毒的問題,培養出來的種苗適應性及抗逆性極強,幼苗成活率可達到100%,降低了組培苗污染率,提高了品種種性的穩定性。

權利要求書

1.白芨體細胞胚誘導及成苗方法,其特征在于,具體方案包括以下步驟:(1)種子準備:選用未開裂的白芨新鮮蒴果里的種子作為體細胞胚誘導體,蒴果用洗衣粉或肥皂洗凈,洗干凈后,將蒴果放于超凈工作臺上的燒杯中,燒杯中加入75%的乙醇浸泡5min,浸泡結束后,用無菌水沖洗蒴果3~4遍,沖洗結束后,將蒴果放到滅菌的培養皿中進行吹風,待蒴果被吹干后,剖開蒴果,留取種子,得到白芨體細胞胚誘導體,備用;(2)培養基準備:在容量為1L的容量瓶中加入0.7L蒸餾水,20000~30000mg的硫代硫酸鈉,100~150mg的維生素C,1.0~5.0mg的活性炭,1.0~10mg的氯化鈉和30000mg的蔗糖,60~80g的香蕉,100~120mL的椰乳,最后再加蒸餾水使容量瓶的液體體積達到1L,配制成培養基,培養基的pH值在5.4~5.8之間;將配好的培養基按250mL/瓶分裝至培養瓶中,放入高溫滅菌鍋中滅菌25min,溫度控制在121℃,備用;(3)實驗室培養:在超凈工作臺里按無菌操作要求打開(2)步驟中經過高溫滅菌的培養瓶的瓶蓋,用鑷子夾取(1)步驟中得到種子并伸進培養瓶口,用鑷子尖后部在瓶口輕輕敲擊,使得種子均勻撒落在培養基上,蓋好瓶蓋,將培養瓶拿出超凈工作臺,將裝有種子的培養瓶放于細胞振蕩培養箱中進行振蕩暗培養,振蕩速度為100r/min,培養的溫度控制在20~25℃之間,培養到第5d,種子吸水、種皮充脹,此時,向培養瓶中添加5g/L的白砂糖溶液20~25mL;此后,每間隔10d向培養基中添加同量的白砂糖溶液;培養到種子的種皮脹裂時,向培養瓶中添加0.1~0.5mg/L甲硫達嗪浸泡種皮,進行愈傷組織上分化出體細胞胚的誘導,即原球莖的誘導;此后進行光培養,光照強度為2500lx,光照時間為12h/d;培養到50d,種皮破裂處可見大量的愈傷組織,愈傷組織上分化出體細胞胚,即原球莖;培養到60d,原球莖胚芽開始萌發,可見胚芽生長點時,停止振蕩培養,得到培養物;(4)大棚煉苗培養:將實驗室培養60d的培養物和培養基倒入食物攪拌器中,低頻攪拌打散20~30min,轉速控制在300r/min,然后用孔徑為0.3cm×0.3cm的噴壺將攪拌后的培養物和培養基均勻噴撒于苗盤內進行培養,每間隔7d,向噴撒有外植體的苗盤內噴曬0.01~0.1mg/L的激動素,噴曬至基質潮濕;苗盤培養到30d,可見白芨幼苗長出一對綠色真葉;苗盤培養到60~90d,白芨幼苗長出3~4對真葉,此時將幼苗取出,按5cm×5cm間距的間距移至大棚內進行栽種;大棚內栽種90d,白芨幼苗莖壯根粗,此時可移栽到大田。

說明書

技術領域

本發明屬于中藥材組培技術領域,涉及一種白芨體細胞胚誘導及成苗方法。

背景技術

白芨又名白根、地螺絲、白雞娃、羊角七、紫蘭、刀口藥、連及草等,為蘭科白芨屬植物白芨的干燥塊莖。白芨性溫、味苦、甘、辛,藥用價值較高,具有補肺、止血、散風除濕、通竅止痛、消腫排膿、生肌、斂瘡的功能,主要用于治療感冒頭痛、眉棱骨痛、 鼻塞、鼻淵、牙痛、白帶、肺傷咳血、衄血、金瘡出血、癰疽腫毒、潰瘍疼痛、湯火灼傷、手足皺裂等, 是我國民間的傳統中藥。白芨除了具有重要的藥用價值外,還應用于保健食品、紡織印染、特種涂料、日用化工等各行業領域,需求量日趨增多,現已被列入《瀕危動植物種國際貿易公約》予以保護。

白芨的繁殖有有性繁殖和無性繁殖兩種,在有性繁殖中,由于白芨種子培育過程煩瑣,生長速度慢,出苗率低,在自然狀態下極少能萌發成苗。白芨的無性繁殖主要利用地下假鱗莖和地上莖進行繁殖,但是長期的無性假鱗莖和地上莖繁殖,假鱗莖和地上莖中容易滋生真菌和積累病毒,在進行組培苗時,組培苗容易被污染,導致繁殖速度減慢,成苗率低,品種種性退化的問題。

白芨除了利用假鱗莖和地上莖進行無性繁殖外,還可以利用莖尖生長點和無菌實生苗進行無性繁殖,該繁殖方法取材料較難,且該方法從脫分化、原球莖增殖、分化、煉苗至大田移栽周期至少需要24個月,培養周期過長,且培養期間需要更換8-10次培養基,工作量大,成本高,一般的藥材種植企業和藥農無法承擔高昂的種植成本。

發明內容

針對現有技術中白芨的無性繁殖存在繁殖速度慢、培養周期長、成本高、地下假鱗莖和地上莖等外植體中容易滋生真菌和積累病毒,造成品種種性退化的問題,本發明提供一種白芨體細胞胚誘導及成苗方法,具體方案包括以下步驟:

(1)種子準備:選用未開裂的白芨新鮮蒴果里的種子作為體細胞胚誘導體,蒴果用洗衣粉或肥皂洗凈,洗干凈后,將蒴果放于超凈工作臺上的燒杯中,燒杯中加入75%的乙醇浸泡5 min,浸泡結束后,用無菌水沖洗蒴果3~4遍,沖洗結束后,將蒴果放到滅菌的培養皿中進行吹風,待蒴果被吹干后,剖開蒴果,留取種子,得到白芨體細胞胚誘導體,備用;

(2)培養基準備:在容量為1 L的容量瓶中加入0.7 L蒸餾水,20000~30000 mg的硫代硫酸鈉,100~150 mg的維生素C,1.0~5.0 mg的活性炭,1.0~10 mg的氯化鈉和30000 mg的蔗糖,60~80 g的香蕉,100~120 mL的椰乳,最后再加蒸餾水使容量瓶的液體體積達到1 L,配制成培養基,培養基的pH值在5.4~5.8之間;將配好的培養基按250 mL/瓶分裝至培養瓶中,放入高溫滅菌鍋中滅菌25 min,溫度控制在121 ℃,備用;

(3)實驗室培養:在超凈工作臺里按無菌操作要求打開(2)步驟中經過高溫滅菌的培養瓶的瓶蓋,用鑷子夾取(1)步驟中得到種子并伸進培養瓶口,用鑷子尖后部在瓶口輕輕敲擊,使得種子均勻撒落在培養基上,蓋好瓶蓋,將培養瓶拿出超凈工作臺,將裝有種子的培養瓶放于細胞振蕩培養箱中進行振蕩暗培養,振蕩速度為100 r/min,培養的溫度控制在20~25 ℃之間,培養到第5 d,種子吸水、種皮充脹,此時,向培養瓶中添加5 g/L的白砂糖溶液20~25 mL;此后,每間隔10 d向培養基中添加同量的白砂糖溶液;培養到種子的種皮脹裂時,向培養瓶中添加0.1~0.5 mg/L甲硫達嗪浸泡種皮,進行愈傷組織上分化出體細胞胚的誘導,即原球莖的誘導;此后進行光培養,光照強度為2500 lx,光照時間為12 h/d;培養到50 d,種皮破裂處可見大量的愈傷組織,愈傷組織上分化出體細胞胚,即原球莖;培養到60 d,原球莖胚芽開始萌發,可見胚芽生長點時,停止振蕩培養,得到培養物;

(4)大棚煉苗培養:將實驗室培養60 d的培養物和培養基倒入食物攪拌器中,低頻攪拌打散20~30 min,轉速控制在300 r/min,然后用孔徑為0.3 cm × 0.3 cm的噴壺將攪拌后的培養物和培養基均勻噴撒于苗盤內進行培養,每間隔7 d,向噴撒有外植體的苗盤內噴曬0.01~0.1 mg/L的激動素,噴曬至基質潮濕;苗盤培養到30 d,可見白芨幼苗長出一對綠色真葉;苗盤培養到60~90 d,白芨幼苗長出3~4對真葉,此時將幼苗取出,按5 cm × 5 cm間距的間距移至大棚內進行栽種;大棚內栽種90 d,白芨幼苗莖壯根粗,此時可移栽到大田。

采用本技術方案的有益效果是:

1、白芨的培養基中含有硫代硫酸鈉、維生素C、活性炭、氯化鈉、蔗糖、香蕉、椰乳、蒸餾水,其營養成份搭配比例合理,營養價值高,符合白芨生長的需要,同時,白芨的原球莖培養物在實驗室內培養和大棚內煉苗培養的過程中,分別定期追加了白砂糖、甲硫達嗪和激動素,大大促進了白芨胚性愈傷組織的生長、分裂和體細胞胚形成效率,提高了繁殖效率;

2、一般白芨的組織培養育苗到大田移栽需要24個月,培養周期較長,生產成本較高,本發明利用種子的種皮破裂處產生的胚性愈傷組織形成體細胞胚,即原球莖,培養白芨種苗,從繁殖到大棚內煉苗培養只需8個月,有效縮短了培養周期,降低了生產成本,幼苗的培養成本低至0.2~0.3元;

3、本發明培養工序較為簡單,且培養的白芨幼苗為無性第一代,克服了利用地下假鱗莖和地上莖等外植進行組培育苗時容易滋生真菌和積累病毒的問題,培養出來的種苗適應性及抗逆性極強,幼苗成活率可達到100%,降低了組培苗污染率,提高了品種種性的穩定性。

具體實施方式

實施例1:一種白芨體細胞胚誘導及成苗方法,包括以下步驟:

(1)種子準備:選用未開裂的白芨新鮮蒴果里的種子作為體細胞胚誘導體,蒴果用洗衣粉或肥皂洗凈,洗干凈后,將蒴果放于超凈工作臺上的燒杯中,燒杯中加入75%的乙醇浸泡5 min,浸泡結束后,用無菌水沖洗蒴果3遍,沖洗結束后,將蒴果放到滅菌的培養皿中進行吹風,待蒴果被吹干后,剖開蒴果,留取種子,得到白芨體細胞胚誘導體,備用;

(2)培養基準備:在容量為1 L的容量瓶中加入0.7 L蒸餾水,20000 mg的硫代硫酸鈉,100 mg的維生素C,1.0 mg的活性炭,1.0 mg的氯化鈉和30000 mg的蔗糖,60 g的香蕉,100 mL的椰乳,最后再加蒸餾水使容量瓶的液體體積達到1 L,配制成培養基,培養基的pH值為5.4;將配好的培養基按250 mL/瓶分裝至培養瓶中,放入高溫滅菌鍋中滅菌25 min,溫度控制在121 ℃,備用;

(3)實驗室培養:在超凈工作臺里按無菌操作要求打開(2)步驟中經過高溫滅菌的培養瓶的瓶蓋,每瓶培養瓶中加入的種子量為5個蒴果里面的種子量,加入種子時,用鑷子夾取(1)步驟中得到的種子并伸進培養瓶口,用鑷子尖后部在瓶口輕輕敲擊,使得種子均勻撒落在培養基上,蓋好瓶蓋,將培養瓶拿出超凈工作臺,將裝有種子的培養瓶放于細胞振蕩培養箱中進行振蕩暗培養,振蕩速度為100 r/min,培養的溫度控制在20 ℃之間,培養到第5 d,種子吸水、種皮充脹,此時,向培養瓶中添加5 g/L的白砂糖溶液20 mL;此后,每間隔10 d向培養基中添加同量的白砂糖溶液;培養到種子的種皮脹裂時,向培養瓶中添加0.1 mg/L甲硫達嗪浸泡種皮,進行愈傷組織上分化出體細胞胚的誘導,即原球莖的誘導;此后進行光培養,光照強度為2500 lx,光照時間為12 h/d;培養到50 d,種皮破裂處可見大量的愈傷組織,愈傷組織上分化出體細胞胚,即原球莖;培養到60 d,原球莖胚芽開始萌發,可見胚芽生長點時,停止振蕩培養,得到培養物;

(4)大棚煉苗培養:將實驗室培養60 d的培養物和培養基倒入食物攪拌器中,低頻攪拌打散20 min,轉速控制在300 r/min,然后用孔徑為0.3 cm × 0.3 cm的噴壺將攪拌后的培養物和培養基均勻噴撒于苗盤內進行培養,每間隔7 d,向噴撒有外植體的苗盤內噴曬0.01 mg/L的激動素,噴曬至基質潮濕;苗盤培養到30 d,可見白芨幼苗長出一對綠色真葉;苗盤培養到60 d,白芨幼苗長出3對真葉,此時將幼苗取出,按5 cm × 5 cm間距的間距移至大棚內進行栽種;大棚內栽種90 d,白芨幼苗莖壯根粗,此時可移栽到大田。

實施例2:一種白芨體細胞胚誘導及成苗方法,具體方案包括以下步驟:

(1)種子準備:選用未開裂的白芨新鮮蒴果里的種子作為體細胞胚誘導體,蒴果用洗衣粉或肥皂洗凈,洗干凈后,將蒴果放于超凈工作臺上的燒杯中,燒杯中加入75%的乙醇浸泡5 min,浸泡結束后,用無菌水沖洗蒴果4遍,沖洗結束后,將蒴果放到滅菌的培養皿中進行吹風,待蒴果被吹干后,剖開蒴果,留取種子,得到白芨體細胞胚誘導體,備用;

(2)培養基準備:在容量為1 L的容量瓶中加入0.7 L蒸餾水,30000 mg的硫代硫酸鈉,150 mg的維生素C,5.0 mg的活性炭10 mg的氯化鈉和30000 mg的蔗糖,80 g的香蕉,120 mL的椰乳,最后再加蒸餾水使容量瓶的液體體積達到1 L,配制成培養基,培養基的pH值在5.8之間;將配好的培養基按250 mL/瓶分裝至培養瓶中,放入高溫滅菌鍋中滅菌25 min,溫度控制在121 ℃,備用;

(3)實驗室培養:在超凈工作臺里按無菌操作要求打開(2)步驟中經過高溫滅菌的培養瓶的瓶蓋,每瓶培養瓶中加入的種子量為5個蒴果里面的種子量,加入種子時,用鑷子夾取(1)步驟中得到種子并伸進培養瓶口,用鑷子尖后部在瓶口輕輕敲擊,使得種子均勻撒落在培養基上,蓋好瓶蓋,將培養瓶拿出超凈工作臺,將裝有種子的培養瓶放于細胞振蕩培養箱中進行振蕩暗培養,振蕩速度為100 r/min,培養的溫度控制在25 ℃,培養到第5 d,種子吸水、種皮充脹,此時,向培養瓶中添加5 g/L的白砂糖溶液20 mL;此后,每間隔10 d向培養基中添加同量的白砂糖溶液;培養到種子的種皮脹裂時,向培養瓶中添加0.5 mg/L甲硫達嗪浸泡種皮,進行愈傷組織上分化出體細胞胚的誘導,即原球莖的誘導;此后進行光培養,光照強度為2500 lx,光照時間為12 h/d;培養到50 d,種皮破裂處可見大量的愈傷組織,愈傷組織上分化出體細胞胚,即原球莖;培養到60 d,原球莖胚芽開始萌發,可見胚芽生長點時,停止振蕩培養,得到培養物;

(4)大棚煉苗培養:將實驗室培養60 d的培養物和培養基倒入食物攪拌器中,低頻攪拌打散30 min,轉速控制在300 r/min,然后用孔徑為0.3 cm × 0.3 cm的噴壺將攪拌后的培養物和培養基均勻噴撒于苗盤內進行培養,每間隔7 d,向噴撒有外植體的苗盤內噴曬0.1 mg/L的激動素,噴曬至基質潮濕;苗盤培養到30 d,可見白芨幼苗長出一對綠色真葉;苗盤培養到90 d,白芨幼苗長出4對真葉,此時將幼苗取出,按5 cm × 5 cm間距的間距移至大棚內進行栽種;大棚內栽種90 d,白芨幼苗莖壯根粗,此時可移栽到大田。

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