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一種有效的荸薺病毒脫毒方法.pdf

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一種 有效 荸薺 病毒 脫毒 方法
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摘要
申請專利號:

CN201710075170.X

申請日:

20170210

公開號:

CN106857253A

公開日:

20170620

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01H4/00 主分類號: A01H4/00
申請人: 臺州市農業科學研究院
發明人: 賴小芳,王伯誠,林太赟,唐興國,陳偉強,貝道正,王健康
地址: 317000 浙江省臺州市臨海市七一河路57號
優先權: CN201710075170A
專利代理機構: 臺州藍天知識產權代理有限公司 代理人: 苑新民
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201710075170.X

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明屬于植物組培技術領域,涉及一種有效的荸薺病毒脫毒方法,包括以下步驟:組培快繁生產組培增殖苗、對增殖苗進行熱處理、對熱處理后存活的芽苗進行莖尖切割,最后經檢測確定無病毒后方可應用到農業生產中。優點是:本發明采用荸薺組培增殖苗熱處理與莖尖切割培養相結合的方法進行脫毒,可剝取和切割較大的莖尖進行培養,提高莖尖培養成活率。熱處理的作用在于鈍化病毒活性,減緩病毒侵染(上行)到莖尖的速度,甚至使病毒失去感染能力;而且通過熱處理之后的莖尖生長速度加快,莖尖未被病毒侵染的區域擴大,就可剝取和切割更大的莖尖進行培養,再通過優勝劣汰,提純出生命力旺盛的株芽,使得荸薺莖尖脫毒的成功率提高10?15倍。

權利要求書

1.一種有效的荸薺病毒脫毒方法,其特征在于:包括以下步驟:(1)組培快繁生產組培增殖苗:選用芽頭健壯、大小均勻、無病無潰爛的荸薺種球,清洗后剝掉種球頂芽的葉鞘,先用小刀挖取帶一點種球果肉的頂芽,再剔除多余果肉,小心切出5mm左右的頂芽,放入每100ml含有1滴吐溫-80的0.1%升汞溶液中,浸泡攪拌9-10min,再用無菌水沖洗4-6遍,然后放在無菌接種盤上,用無菌的濾紙吸干表面的水分,先將頂芽接到誘導培養基中培養,成功后再轉接到增殖培養基中培養,培養室溫度為25±2℃,光照強度為1800lx,光照時間為10h/d,生產出組培增殖苗;誘導培養基配方為MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.01mg/L,增殖培養基配方為MS+6-BA1.2mg/L+NAA0.01mg/L;(2)熱處理:將步驟(1)生產出的2-3cm高的增殖苗,放進光溫培養箱中進行熱處理,熱處理溫度為38.1-39.0℃,光照強度2000Lx,光照時間13h/d,培養箱內的相對濕度為79-82%,每天隔著玻璃觀察,看著增殖苗因高溫強光逐漸死去變少,當芽苗存活率為2-3%時,將存活的芽苗從光溫培養箱中拿出,放回到常規培養室中存放3-5d,恢復成正常生長狀態的增殖苗;(3)莖尖切割培養:在經過消毒的解剖鏡下切取步驟(2)正常生長狀態的增殖苗的莖尖0.5-1.0mm,接種到配方為MS+6-BA1.2mg/L+NAA0.01mg/L的增殖培養基中培養,75d后分生出叢生芽,在此基礎上再進行增殖培養,培養出的叢苗均為脫毒增殖苗。2.根據權利要求1所述的一種有效的荸薺病毒脫毒方法,其特征在于:所述的清洗是用1.5%洗衣粉溶液浸泡10-15min,洗凈荸薺種球表面泥土及雜菌,再用自來水沖洗0.8-1.2h。3.根據權利要求1任一項所述的一種有效的荸薺病毒脫毒方法,其特征在于:所述的步驟(3)之后還有步驟(4)組培苗病毒檢測:將步驟(3)生產的脫毒組培增殖苗樣品采用超薄切片法制樣,在透射電子顯微鏡下觀察,細胞結構完好,各細胞器正常,在細胞質和細胞核內未觀察到病毒樣顆粒及異樣內含體結構;用負染色法電鏡觀察也未見病毒顆粒。只有經過正規的檢測部門確定無病毒后再進行規模化組培快繁生產。4.根據權利要求3所述的一種有效的荸薺病毒脫毒方法,其特征在于:所述的步驟(4)之后還有步驟(5)生根苗的培養:將經過檢測確定無病毒的增殖苗進行快繁,再進行生根培養,生根培養基的配方為1/2MS+NAA0.03mg/L+AC1000mg/L,然后可將生產出的生根脫毒苗應用到農業生產中;所述的誘導、增殖和生根培養基每升均添加瓊脂粉5g、蔗糖30g,pH值5.8。

說明書

技術領域

本發明屬于植物組培技術領域,特指一種有效的荸薺病毒脫毒方法。

背景技術

荸薺(Eleocharis tuberosa)屬莎草科荸薺屬宿根性多年生淺水草本植物,古稱芍,別名馬蹄、地栗、烏芋、鳧茈等,以其地下球莖作為食用器官,至今已有3000年左右栽培歷史。荸薺皮色暗紫紅,肉質潔白,味清甜多汁,松脆爽口消渣,自古有“地下雪梨”之美譽,北方人視之為“江南人參”。荸薺既可作為水果,又可作為蔬菜,是果蔬兼用型的經濟作物,具有豐富的營養和保健價值,還有清熱、化痰消積、利尿、降壓、防癌抗癌等功效,其提取物對細菌、酵母菌和霉菌具有較強抑制作用,是較好的保健食品,可加工成淀粉、罐頭、飴糖等,還可作釀酒原料,加工后的廢渣可用作飼料。

荸薺生長適應性較強,原產中國南方和印度。在國外,荸薺主要野生分布于東南亞、美洲、歐洲和大洋洲等國家的池沼、灘涂等低洼地帶;在中國,除高寒地區外,其分布幾乎遍及全國各個省區,而經濟栽培則主要在長江流域及其以南地區。目前,荸薺栽培已經形成了幾個著名產區,如廣西桂林、浙江余杭、江蘇高郵和蘇州、福建福州、湖北孝感、團風和沙洋、安徽廬江縣楊柳鄉和宣舟等。荸薺由于產量高,效益好,同時還可以起到輪作改良土壤的作用,因此備受農民青睞。目前,我國荸薺生產發展很快,面積和產量都逐年增加。據不完全統計,我國現有荸薺種植面積約為60多萬畝,年總產量96萬噸左右,主要供應國內市場,部分用于加工,制成罐頭、淀粉、荸薺凍、荸薺露、蜜餞等,產品在國內外市場十分暢銷。我國的清水荸薺罐頭在國際市場上占有重要的地位.其中2003年銷往歐美各國及港澳、東南亞市場達8.5萬噸,是世界最大的荸薺罐頭出口國家。

近年來,隨著農業種植業結構的調整,荸薺的栽培面積和產量不斷增加,但是單位面積產量則有逐年下降的趨勢。荸薺生產之所以會出現“兩高(栽培面積增加、總產量增加)一低(單位面積產量下降)”的現象,主要是由于長期采用傳統的無性繁殖方法,造成荸薺球莖中病菌毒素的累積和品質退化。主要表現為:球莖小而不圓整、大果率低、畸形果多、食味變差、常見下凹部花心變黑、底部開裂,在田間還常出現雄荸薺、植株矮化、叢生而不結球等,嚴重制約著當地荸薺產量和經濟效益的提高,也影響荸薺生產的進一步發展。同時目前對于荸薺的這些問題僅限于栽培層面的改變,即“優選留種、培育壯苗、適時移栽、合理密植、精細管理、適時采收”,雖能取得一定的成效,但不能從根本上解決荸薺種球中病菌毒素的累積和品質退化的實質性問題。我們采用實驗室植物組織培養的技術來實現荸薺除菌脫毒,可以長久保持優良荸薺種質資源的特有性狀,是對優良荸薺品種進行提純復壯、提高產量的最佳途徑。

荸薺一般采用莖尖切割培養進行脫毒,但莖尖脫毒要求切割長度在0.3-0.5mm之間,這樣的長度對荸薺來說是很難切取的,因為荸薺不同其它植物,因荸薺的葉片已退化,我們看到的一叢叢的蔥不是葉片,而是葉狀莖,荸薺的葉原基很難尋找,自然莖尖也很難切割,即使切取成功,培養過程也特別緩慢而且容易死亡,成功率微乎其微。

發明內容

本發明的目的是提供一種有效的荸薺病毒脫毒方法。

本發明的目的是這樣實現的:

一種有效的荸薺病毒脫毒方法,其特征在于:包括以下步驟:

(1)組培快繁生產組培增殖苗:選用芽頭健壯、大小均勻、無病無潰爛的荸薺種球,清洗后剝掉種球頂芽的葉鞘,先用小刀挖取帶一點種球果肉的頂芽,再剔除多余果肉,小心切出5mm左右的頂芽,放入每100ml含有1滴吐溫-80的0.1%升汞溶液中,浸泡攪拌9-10min,再用無菌水沖洗4-6遍,然后放在無菌接種盤上,用無菌的濾紙吸干表面的水分,將頂芽先接到誘導培養基中培養,再接到增殖培養基中培養,培養室溫度為25±2℃,光照強度為1800lx,光照時間為10h/d,生產出組培增殖苗;誘導培養基配方為MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.01mg/L,增殖培養基配方為MS+6-BA1.2mg/L+NAA0.01mg/L;

(2)熱處理:將步驟(1)生產出的2-3cm高的增殖苗,放進光溫培養箱中進行熱處理,熱處理溫度為38.1-39.0℃,光照強度2000Lx,光照時間13h/d,培養箱內的相對濕度為79-82%,每天隔著玻璃觀察,看著增殖苗因高溫強光逐漸死去變少,當芽苗存活率為2-3%時,再將存活的芽苗從光溫培養箱中拿出,放回到常規培養室中存放3-5d,恢復成正常生長狀態的增殖苗;

(3)莖尖切割培養:在經過消毒的解剖鏡下切取步驟(2)正常生長狀態的增殖苗的莖尖0.5-1.0mm,接種到配方為MS+6-BA1.2mg/L+NAA0.01mg/L的增殖培養基中培養,75d后分生出叢生芽,在此基礎上再進行增殖培養,培養出的叢苗均為脫毒增殖苗。

上述的清洗是用1.5%洗衣粉溶液浸泡10-15min,洗凈荸薺種球表面泥土及雜菌,再用自來水沖洗0.8-1.2h。

上述的步驟(3)之后還有步驟(4)組培苗病毒檢測:將步驟(3)生產的脫毒組培增殖苗樣品采用超薄切片法制樣,在日本JEOL公司JEM-1230型透射電子顯微鏡下觀察,細胞結構完好,各細胞器正常,在細胞質和細胞核內未觀察到病毒樣顆粒及異樣內含體結構;用負染色法電鏡觀察也未見病毒顆粒。只有經過正規的檢測部門確定無病毒后再進行規模化組培快繁生產。

上述的步驟(4)之后還有步驟(5)生根苗的培養:將經過檢測確定無病毒的增殖苗進行快繁,再進行生根培養,生根培養基的配方為1/2MS+NAA0.03mg/L+AC1000mg/L,然后可將生產出的生根脫毒苗應用到農業生產中;所述的誘導、增殖和生根培養基每升均添加瓊脂粉5g、蔗糖30g,pH值5.8。

本發明相比現有技術突出且有益的技術效果是:

1、本發明采用荸薺組培增殖苗熱處理與莖尖切割培養相結合方法進行脫毒,可剝取和切割較大的莖尖進行培養,大大地提高莖尖培養的成活率。

2、本發明步驟(2)的熱處理的作用:熱處理的作用在于鈍化病毒活性,減緩病毒侵染(上行)到莖尖的速度,甚至使病毒失去感染能力;而且通過熱處理之后的莖尖生長速度加快(分生組織的細胞分裂加速)。這樣經過熱處理之后,莖尖未被病毒侵染的區域擴大,就可剝取和切割更大的莖尖進行培養,大大提高莖尖培養成活率,再通過優勝劣汰,提純出生命力旺盛的株芽,使得荸薺莖尖脫毒的成功率提高10-15倍。這是本發明成功的關鍵和獨到之處。

3、本發明步驟(3)的莖尖培養原理是:病毒在植物體內是通過維管束輸導組織進行傳播的,而莖尖分生組織還未形成維管束,加上熱處理后莖尖劇烈的新陳代謝活動,激素含量高,抑制了病毒的傳播復制,多次的實驗經驗告訴我們,愈靠近莖尖病毒濃度愈低,從而獲得無毒苗的可能性就愈大。

具體實施方式

下面以具體實施的例子對本發明作進一步描述:

本方法是將荸薺組培增殖苗先進行熱處理,再剝取和切割較大的莖尖進行培養,達到脫毒增殖目的。

一種有效的荸薺病毒脫毒方法,包括以下步驟:

(1)組培快繁生產組培增殖苗:培養材料為地方品種‘店頭荸薺’,選用芽頭健壯、大小均勻、無病無潰爛的荸薺種球,先用1.5%洗衣粉浸泡12min,洗凈種球表面泥土與雜菌,再用自來水沖洗1h;清洗后把球莖頂芽的葉鞘剝掉,用小刀挖取帶一點球莖果肉的頂芽,小心剔除多余果肉,切出5mm左右的頂芽,放入每100ml含有1滴吐溫-80的0.1%升汞溶液中,浸泡攪拌9min,再用無菌水沖洗5遍,然后放在無菌接種盤上,用無菌的濾紙吸干表面的水分,先將頂芽接到誘導培養基中培養,成功后再轉接到增殖培養基中培養,培養室溫度為25±2℃,光照強度為1800lx,光照時間為10h/d,生產出組培增殖苗;誘導培養基配方為MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.01mg/L,增殖培養基配方為MS+6-BA1.2mg/L+NAA0.01mg/L;

(2)熱處理:將步驟(1)生產出的2-3cm高度的組培增殖苗(所述的組培增殖苗一般有50-100株以上)放進光溫培養箱中進行熱處理,數量12瓶,每瓶3株,共36株,熱處理溫度為38.1-39.0℃,光照強度2000Lx,光照時間13h/d,培養箱內的相對濕度為79-82%,每天隔著玻璃觀察,看著組培苗逐漸死去,直至僅有1-3芽存活(成活率2-3%)時,將僅存活1-3芽的組培增殖苗從光溫培養箱中拿出,放回到常規培養室中存放4d,恢復成一株正常生長狀態的組培增殖苗;

(3)莖尖切割培養:在經過消毒的解剖鏡下切取步驟(2)正常生長狀態的組培增殖苗的莖尖0.5-1.0mm,接種到配方為MS+6-BA1.2mg/L+NAA0.01mg/L的增殖培養基中培養,75d后分生出3個叢生芽,此階段切下的莖尖的培養成活率為33.3%,在此基礎上進行增殖擴繁,培養出的叢苗均為脫毒增殖苗。

上述的步驟(3)之后還有步驟(4)組培苗病毒檢測:將步驟(3)培養的組培增殖苗,經浙江大學分析測試中心檢測,送檢的增殖苗樣品達到完全脫毒要求。檢測結論為:送檢荸薺脫毒組培苗樣品采用超薄切片法制樣,在日本JEOL公司JEM-1230型透射電子顯微鏡下觀察,細胞結構完好,各細胞器正常,在細胞質和細胞核內未觀察到病毒樣顆粒及異樣內含體結構;用負染色法電鏡觀察也未見病毒顆粒。只有經過正規的檢測部門確定無病毒后再進行規模化組培快繁生產。

上述的步驟(4)之后還有步驟(5)生根苗的培養:將經過檢測確定為無病毒的增殖苗后進行快速快繁,然后再進行生根培養,生根培養基的配方為1/2MS+NAA0.03mg/L+AC1000mg/L,最后可將生產出的生根脫毒苗應用到農業生產中。所述的誘導、增殖和生根培養基每升均添加瓊脂粉5g、蔗糖30g,pH值5.8。

實驗結果表明:適宜的誘導培養基配方為MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.01mg/L;增殖培養基配方為MS+6-BA1.2mg/L+NAA0.01mg/L,增殖系數達11.2;生根培養基配方為1/2MS+NAA0.03mg/L+AC1000mg/L,生根率達100%,每升培養基內均添加瓊脂粉5g、蔗糖30g,pH值5.8。

上述實例僅為本發明的較佳實施例子,并非依此限制本發明的保護范圍,故:凡依本發明的結構、形狀、原理所做的等效變化,均應涵蓋于本發明的保護范圍之內。

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