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一種抑制和/或破壞生物膜的方法.pdf

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一種 抑制 破壞 生物膜 方法
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摘要
申請專利號:

CN201710073483.1

申請日:

20170210

公開號:

CN106857504A

公開日:

20170620

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01N25/00,A01P1/00,A01P3/00 主分類號: A01N25/00,A01P1/00,A01P3/00
申請人: 中國科學院化學研究所
發明人: 王樹,張鵬博,劉禮兵,呂鳳婷
地址: 100190 北京市海淀區中關村北一街2號
優先權: CN201710073483A
專利代理機構: 北京潤平知識產權代理有限公司 代理人: 劉依云;嚴政
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201710073483.1

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及生物膜領域,公開了一種抑制和/或破壞生物膜的方法。所述該方法包括:將式(I)所示的化合物與樣品進行接觸,所述樣品為含有生物膜的樣品和/或能夠形成而未形成生物膜的樣品。采用本發明提供的方法,能夠抑制生物膜的形成,還能夠破壞成熟的生物膜。其中,R1#、R2#、R3#、R4#、R1*、R2*、R3*和R4*各自獨立地為C1?C12的烷基,X#和X*各自獨立地表示鹵素;n為8?15的整數;所述式(I)所示的化合物的數均分子量為5000?10000。

權利要求書

1.一種抑制和/或破壞生物膜的方法,其特征在于,該方法包括:將式(I)所示的化合物與樣品進行接觸,所述樣品為含有生物膜的樣品和/或能夠形成而未形成生物膜的樣品;其中,R、R、R、R、R、R、R和R各自獨立地為C-C的烷基,X和X各自獨立地表示鹵素;n為8-15的整數;所述式(I)所示的化合物的數均分子量為5000-10000。2.根據權利要求1所述的方法,其中,R、R、R、R、R和R相同,均為C-C的烷基;R和R相同,為C-C的烷基;X和X各自獨立地選自氯、溴和碘中的至少一種,優選均為溴;優選地,R、R、R、R、R和R均為甲基,所述R和R均為正己基;優選地,R、R、R、R、R和R均為乙基,所述R和R均為正己基;優選地,R、R、R、R、R和R均為甲基,所述R和R均為正戊基;優選地,R、R、R、R、R和R均為乙基,所述R和R均為正戊基;優選地,R、R、R、R、R和R均為甲基,所述R和R均為正丁基;優選地,R、R、R、R、R和R均為乙基,所述R和R均為正丁基;優選地,R、R、R、R、R和R均為甲基,所述R和R均為正丙基;優選地,R、R、R、R、R和R均為乙基,所述R和R均為正丙基。3.根據權利要求1所述的方法,其中,所述樣品為能夠形成而未形成生物膜的樣品時,所述接觸的條件包括:溫度為37±0.5℃,時間為10分鐘以上,優選為20-30小時。4.根據權利要求3所述的方法,其中,所述能夠形成而未形成生物膜的樣品為含有細菌的液體樣品,且所述接觸體系中,細菌的數量為10-10個/mL,式(I)所示的化合物的用量為1-100μM。5.根據權利要求4所述的方法,其中,所述細菌為金黃色葡萄球菌,優選為金黃色葡萄球菌ATCC6538、金黃色葡萄球菌ATCC25923、金黃色葡萄球菌ATCC29213、金黃色葡萄球菌V329和金黃色葡萄球菌SA113中的至少一種。6.根據權利要求1所述的方法,其中,所述樣品為含有生物膜的樣品時,所述方法還包括:將接觸之后的體系進行光照。7.根據權利要求6所述的方法,其中,所述接觸的條件包括:溫度為37±0.5℃,時間為10-30分鐘;所述光照的條件包括:溫度為15-30℃,時間為5-25分鐘,光強為20-100mW/cm,光照所使用的光為白光,光照的波長為400-800nm。8.根據權利要求6所述的方法,其中,所述含有生物膜的樣品為含有細菌形成的生物膜的液體樣品,所述含有生物膜的樣品是由包括以下步驟的方法制備得到的:控制細菌的起始數量為10-10個/mL,經過18-30小時的培養形成。9.根據權利要求8所述的方法,其中,所述接觸體系中,式(I)所示的化合物的用量為1-100μM。10.根據權利要求8或9所述的方法,其中,所述細菌為金黃色葡萄球菌,優選為金黃色葡萄球菌ATCC6538、金黃色葡萄球菌ATCC25923、金黃色葡萄球菌ATCC29213、金黃色葡萄球菌V329和金黃色葡萄球菌SA113中的至少一種。

說明書

技術領域

本發明涉及生物膜領域,具體地,涉及一種抑制和/或破壞生物膜的方法。

背景技術

生物膜是指微生物為了適應環境,粘附于非生物或活性組織表面,分泌大量的多糖、蛋白質和核酸等不均一的胞外基質,將菌體自身包裹在其中而形成的大量菌體聚集膜樣物,是菌體在自然界中一種常見的生存狀態。生物膜的形成分為以下幾個階段:1、初始粘附,游離的細菌粘附在固體基質表面,并分泌胞外核酸促進粘附。2、微菌落的形成,粘附的細菌經過繁殖擴增形成微菌落,并分泌胞外蛋白促進粘附。3、生物膜成熟,菌體進一步生長并分泌大量的胞外基質,主要成分為胞外多糖,蛋白質,胞外核酸和脂類,形成成熟的生物膜。4、生物膜凋亡,生物膜成熟后,膜內細菌仍然增殖,在微菌落生長后期,生物膜破裂,釋放出游離的細菌,可進入下一個生物膜形成周期。相對于游離細菌,生物膜內菌體被胞外基質包裹,形成一層厚厚的生物屏障,阻礙抗菌藥物的滲透,增強菌體對不良環境的耐受性。即使抗菌藥物滲透到生物膜內部,內部的細菌由于營養物質缺乏、氧氣不足等因素生長緩慢或處于休眠期,對抗生素極不敏感,這是導致生物膜無法根除的主要原因。基于耐藥性的原因,尋找新的治療策略以期抑制生物膜的形成同時破壞成熟生物膜是具有挑戰性的。

發明內容

為了克服現有技術中生物膜引發的耐藥性的缺陷,本發明提供了一種抑制和/或破壞生物膜的方法,采用本發明提供的方法,能夠抑制生物膜的形成,還能夠破壞成熟的生物膜。

具體的,本發明提供了一種抑制和/或破壞生物膜的方法,該方法包括:將式(I)所示的化合物與樣品進行接觸,所述樣品為含有生物膜的樣品和/或能夠形成而未形成生物膜的樣品;

其中,R1#、R2#、R3#、R4#、R1*、R2*、R3*和R4*各自獨立地為C1-C12的烷基,X#和X*各自獨立地表示鹵素;n為8-15的整數;所述式(I)所示的化合物的數均分子量為5000-10000。

本發明的方法能夠抑制和破壞生物膜的原因可能為:細菌表面的主要成分為多糖、蛋白質、脂類等,帶有負電荷,而式(I)所示化合物帶有正電荷,所以細菌通過靜電作用和疏水作用與化合物緊密結合。在抑制生物膜形成過程中,將式(I)所示化合物加入到稀釋后的細菌溶液中,式(I)所示化合物通過靜電作用和疏水作用與細菌結合到一起。當式I所示化合物濃度足夠高時,過量的式(I)所示化合物能夠包裹細菌,削弱細菌與細菌之間、細菌與基底之間的相互作用,導致生物膜形成能力變弱,達到抑制生物膜形成的效果。在破壞成熟生物膜過程中,將式(I)所示化合物加入到成熟的生物膜中,靜電作用和疏水作用使式(I)所示化合物結合到細菌及生物膜表面。這樣可以使式(I)所示化合物在光照條件下產生的活性氧與細菌及生物膜足夠近,進而有效地破壞生物膜。

本發明提供的抑制生物膜形成及破壞成熟生物膜的方法,克服了現有的破壞生物膜方法容易產生耐藥性的難題。在抑制生物膜形成過程中,式(I)所示化合物通過靜電和疏水作用將細菌包裹起來,削弱細菌與細菌之間、細菌與基底之間的相互作用,而不是殺死細菌,從源頭抑制了耐藥性的產生。在破壞成熟生物膜過程中,利用式(I)所示化合物在光照條件下產生的活性氧直接破壞細菌細胞膜,同樣避免了耐藥性的產生。本發明為建立有效的生物膜去除和預防策略奠定了基礎。

本發明的其它特征和優點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。

附圖說明

附圖是用來提供對本發明的進一步理解,并且構成說明書的一部分,與下面的具體實施方式一起用于解釋本發明,但并不構成對本發明的限制。在附圖中:

圖1是實施例3中的生物膜形成能力曲線圖;

圖2是實施例4中熒光強度與時間的關系圖;

圖3是實施例5中的生物膜抑制率曲線圖;

圖4是實施例6中不同光照時間下死活菌染色熒光比率圖;

圖5是實施例7中不同光照時間下的電鏡成像圖。

具體實施方式

以下對本發明的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是,此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本發明,并不用于限制本發明。

在本文中所披露的范圍的端點和任何值都不限于該精確的范圍或值,這些范圍或值應當理解為包含接近這些范圍或值的值。對于數值范圍來說,各個范圍的端點值之間、各個范圍的端點值和單獨的點值之間,以及單獨的點值之間可以彼此組合而得到一個或多個新的數值范圍,這些數值范圍應被視為在本文中具體公開。

本發明提供了一種抑制和/或破壞生物膜的方法,該方法包括:將式(I)所示的化合物與樣品進行接觸,所述樣品為含有生物膜的樣品和/或能夠形成而未形成生物膜的樣品;

其中,R1#、R2#、R3#、R4#、R1*、R2*、R3*和R4*各自獨立地為C1-C12的烷基,X#和X*各自獨立地表示鹵素;n為8-15的整數;所述式(I)所示的化合物的數均分子量為5000-10000。

術語“生物膜”是微生物(特別是細菌)粘附于接觸的物體表面,分泌胞外多糖、蛋白質和核苷酸等物質,并將自身包被于其中的大量微生物群聚膜樣物。

根據本發明的一種優選的實施方式,在式(I)中,R2#、R3#、R4#、R2*、R3*和R4*相同,均為C1-C5的烷基;R1#和R1*相同,為C3-C8的烷基;X#和X*各自獨立地選自氯、溴和碘中的至少一種,優選均為溴。

根據本發明的一種具體的實施方式,R2#、R3#、R4#、R2*、R3*和R4*均為甲基,所述R1#和R1*均為正己基。

根據本發明的一種具體的實施方式,R2#、R3#、R4#、R2*、R3*和R4*均為乙基,所述R1#和R1*均為正己基。

根據本發明的一種具體的實施方式,R2#、R3#、R4#、R2*、R3*和R4*均為甲基,所述R1#和R1*均為正戊基。

根據本發明的一種具體的實施方式,R2#、R3#、R4#、R2*、R3*和R4*均為乙基,所述R1#和R1*均為正戊基。

根據本發明的一種具體的實施方式,R2#、R3#、R4#、R2*、R3*和R4*均為甲基,所述R1#和R1*均為正丁基。

根據本發明的一種具體的實施方式,R2#、R3#、R4#、R2*、R3*和R4*均為乙基,所述R1#和R1*均為正丁基。

根據本發明的一種具體的實施方式,R2#、R3#、R4#、R2*、R3*和R4*均為甲基,所述R1#和R1*均為正丙基。

根據本發明的一種具體的實施方式,R2#、R3#、R4#、R2*、R3*和R4*均為乙基,所述R1#和R1*均為正丙基。

本發明所述抑制和/或破壞生物膜的方法優選為體外和/或非治療目的的方法。

在本發明中,所述抑制和/或破壞生物膜的方法具體可以分為抑制生物膜的方法和破壞生物膜的方法。所述抑制生物膜的方法指的是抑制生物膜的形成的方法,所述破壞生物膜的方法指的是對于已經形成的成熟的生物膜的破壞方法。

具體的,所述樣品為能夠形成而未形成生物膜的樣品時,所述抑制生物膜的方法可以包括:將式(I)所示的化合物與能夠形成而未形成生物膜的樣品進行接觸。所述能夠形成而未形成生物膜的樣品指的是具有形成生物膜的能力而還未形成生物膜的樣品,例如可以為含有細菌的液體樣品和/或含有真菌的液體樣品。所述含有細菌的液體樣品和/或含有真菌的液體樣品中還未形成生物膜。本發明所述的細菌指的是能夠形成生物膜的細菌,具體種類沒有特別的限定,例如可以為革蘭氏陰性菌和/或革蘭氏陽性菌,具體可以為金黃色葡萄球菌,進一步優選為金黃色葡萄球菌ATCC 6538、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、金黃色葡萄球菌V 329和金黃色葡萄球菌SA 113(金黃色葡萄球菌V 329和金黃色葡萄球菌SA 113的來源可參考Di Poto A,Sbarra M S,Provenza G,et al.The effect of photodynamic treatment combined with antibiotic action or host defence mechanisms on Staphylococcus aureus biofilms[J].Biomaterials,2009,30(18):3158-3166)中的至少一種。本發明所述的真菌指的是能夠形成生物膜的真菌,具體種類也沒有特別的限定,例如可以為白色念珠菌,具體可以為白色念珠菌3153A或SC5314(上述兩種白色念珠菌的來源可參考Ramage G,Saville S P,Wickes B L,et al.Inhibition of Candida albicans biofilm formation by farnesol,a quorum-sensing molecule[J].Applied and environmental microbiology,2002,68(11):5459-5463)。

優選地,所述能夠形成而未形成生物膜的樣品為含有細菌的液體樣品。所述接觸體系中,細菌的數量可以為104-107個/mL。此時進行接觸的所述式(I)所示的化合物的用量可以在較大范圍內變動,例如,可以為1-100μM(μmol/L),優選為20-50μM。

在本發明中,所述樣品為能夠形成而未形成生物膜的樣品時,所述接觸的條件包括:溫度可以為37±0.5℃,時間可以10分鐘以上,優選為20-30小時。

本發明對上述抑制生物膜的作用強度可以通過結晶紫染色法進行定量檢測,并根據式(II)計算生物膜的存活率(VR):

其中,A0為未與式(I)所示的化合物接觸的細菌樣品在590nm處的吸光值(空白對照),A為與式(I)所示的化合物接觸過的細菌樣品在590nm處的吸光值。

在本發明中,所述結晶紫染色法可以為本領域的常規選擇。所述結晶紫是一種三苯甲烷類染料。電離后,該分子的染色部分帶正電荷,可與帶負電荷的分子,包括細菌細胞膜表面的分子以及成熟生物膜分泌的胞外基質中的多糖、核酸、蛋白質等結合,使生物膜染色,所以可以用來定量生物膜。

在本發明中,所述樣品為含有生物膜的樣品時,所述方法還包括:將接觸之后的體系進行光照,可以破壞生物膜。此時所述接觸的條件沒有特別的限定,例如可以包括:溫度可以為37±0.5℃;時間可以為10分鐘以上,優選10-30分鐘。所述光照的條件可以包括:溫度可以為15-30℃,時間可以為5-25分鐘,光強可以為20-100mW/cm2,光照所使用的光為白光,光照的波長可以為400-800nm。由于白光為復合光,所以波長并不是一個固定數值。

在本發明中,所述含有生物膜的樣品可以為含有細菌形成的生物膜的液體樣品和/或含有真菌形成的生物膜的液體樣品。本發明所述的細菌指的是能夠形成生物膜的細菌,具體種類沒有特別的限定,例如可以為革蘭氏陰性菌和/或革蘭氏陽性菌,具體可以為金黃色葡萄球菌,進一步優選為金黃色葡萄球菌ATCC 6538、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、金黃色葡萄球菌V 329和金黃色葡萄球菌SA 113中的至少一種。本發明所述的真菌指的是能夠形成生物膜的真菌,具體種類也沒有特別的限定,例如可以為白色念珠菌,具體可以為白色念珠菌3153A或SC5314。

將接觸的時間控制在上述范圍內再配合以光照,特別有利于實現破壞生物膜的目的。對于破壞效果,可以通過培養計數的方式進行定量。例如,對細菌而言,所述破壞生物膜的效果可以通過將光照后的體系中的細菌進行培養計數,根據式(III)計算生物膜的抑制率IR:

其中,C為與式(I)所示的化合物接觸的細菌培養后形成的菌落數,C0為未與式(I)所示的化合物接觸的細菌培養后形成的菌落數。

根據本發明一種具體的實施方式,所述破壞生物膜的效果檢測步驟可以為:將式(I)所示的化合物與含有生物膜的樣品(例如菌液)進行接觸并光照之后,超聲震蕩使生物膜分散;將分散后的細菌稀釋一定倍數后,取100μL稀釋液鋪在固體培養基上,37℃培養20h后數平板上的菌落數;然后根據式(III)計算生物膜的抑制率IR。稀釋倍數可以根據細菌數目進行確定,使得固體培養基上的菌落數便于統計。

在本發明中,與式(I)所示的化合物接觸的含有生物膜的樣品的量可以在較大范圍內變動,當所述含有生物膜的樣品為含有細菌的液體樣品時,所述含有生物膜的樣品是由包括以下步驟的方法制備得到的:控制細菌的起始數量為104-107個/mL,經過18-30小時的培養形成。溫度可以為37±0.5℃。所述接觸體系中,式(I)所示的化合物的用量可以在較大范圍內變動,例如,可以為1-100μM,優選為20-50μM。

在本發明中,所述式(I)所述的化合物在光照條件下產生活性氧,可以通過活性氧探針進行檢測,所述活性氧探針的種類可以為本領域的常規選擇,例如具體可以為還原態2,7-二氯熒光素(DCFH)。

本發明還可以通過熒光顯微成像實驗對式(I)所示的化合物對生物膜的破壞作用進行檢測。根據本發明的一種的具體實施方式,可以通過BacLight死活菌染色試劑盒(購自Invitrogen廠家,貨號為L13152)進行染色。BacLight死活菌染色試劑盒包含兩種染料:PI和SYTO9。檢測原理為:SYTO9可以同時對死菌和活菌染色,而PI只能對死菌染色,同時淬滅SYTO9的熒光。最終結果為死菌發紅光,活菌發綠光。通過對與式(I)所示的化合物接觸和光照之后的生物膜樣品進行檢測,就可以得出對細菌生物膜的破壞作用的變化情況。例如,未光照組視野中全為綠色,表明細菌全為活菌。隨著光照時間的延長,視野中紅色增多,則表明式(I)所示的化合物產生的活性氧對生物膜中細菌的破壞作用增強。

另外需要說明的是,對式(I)所示的化合物與能夠形成而未形成生物膜的樣品進行接觸后,也可以再進行光照進一步破壞細菌和/或真菌的細胞膜。光照的條件與和式(I)所示的化合物與含有生物膜的樣品接觸之后的光照的條件可以相同。

以下將通過實施例對本發明進行詳細描述。

在以下實施例中,

金黃色葡萄球菌ATCC 6538購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC),編號為:CGMCC No.1.2386。

BacLight死活菌染色試劑盒購自Invitrogen廠家,貨號為L13152。

2,7-二氯熒光素二乙酯(DCFH-DA)購自Sigma-Aldrich廠家,貨號為D6883。

TSB培養基購自美國BD公司,貨號為211825。TSBg培養基為TSB培養基中添加0.25質量%的葡萄糖的培養基。

PBS為購自Hyclone廠家的貨號為SH30256.01的產品。

結晶紫購自Sigma-Aldrich廠家,貨號為C0775。

熒光成像在激光共聚焦掃描顯微鏡(購自Olympus廠家,型號為FV1000-IX81)儀器上進行。

電鏡成像在掃描電子顯微鏡(購自Hitachi廠家,型號為S-4800)上進行。

其余的化學和生物試劑均為商購獲得。

NB液體培養基組成成分按質量體積比(質量體積比指的是質量與體積的比值,單位g/mL,下同)計:1.0%胰蛋白胨(100mL的NB液體培養基中含有1.0g胰蛋白胨),0.3%牛肉浸取物,0.5%氯化鈉,98.2%蒸餾水;NB固體培養基配方為:向NB液體培養基中加入1.5重量%的瓊脂。

實施例1

本實施例用于說明式(I)所示化合物PFP的合成

PFP的具體結構為:

9,9-二(6′-溴己基)-2,7-二溴芴:1,6-二溴己烷(97.6g,400mmol)加入100ml50%的氫氧化鉀溶液中,加入1.28g相轉移催化劑四丁基溴化銨(TBAB),反應液溫度升至75℃,然后加入2,7-二溴芴(12.96g,40mmol)攪拌15min。反應停止并冷卻至室溫后,二氯甲烷萃取(100ml×3),合并有機相,并分別用1M鹽酸溶液和蒸餾水洗滌,無水硫酸鎂干燥,過濾,濃縮。粗產物硅膠柱層析分離純化,展開劑為二氯甲烷/石油醚(v/v=1/9),得白色固體產物9,9-二(6′-溴己基)-2,7-二溴芴21.4g,產率82%。1H-NMR:(300MHz,CDCl3,ppm)δ:0.58(m,4H),1.08(m,4H),1.21(m,4H),1.66(m,4H),1.91(m,4H),3.29(m,4H),7.43(s,4H),7.53(s,2H);13C-NMR:(100MHz,CDCl3,ppm)δ:23.53,27.80,29.00,32.67,33.92,40.06,55.06,121.30,126.17,130.38,139.09,152.23.EI(m/z):650(100%)[M+]Anal.Calcd for C25H30Br4(650.15):C,46.14,H,4.614.Found:C,45.95,H,4.61.

氮氣保護下,將9,9-二(6′-溴己基)-2,7-二溴芴(260mg,0.4mmol)與2′,2′-二甲基-1′,3′-丙二醇-1,4-苯二硼酸酯(120mg,0.4mmol)加入到6.4mL的THF中,溶解后加入1.6mL碳酸鉀溶液(2M)與催化量的鈀催化劑PdCl2(dppf)(20mg),混合液升溫至80℃反應2d。反應液冷卻至室溫后,將THF減壓除去,加入氯仿,洗滌兩次,將有機相濃縮,滴加到甲醇中沉淀,離心、干燥后得固體產物(115mg,52%)。

1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.83(m,6H),7.74-7.62(m,4H),3.30(m,4H),2.10(b,4H),1.81(m,4H),1.39-1.13(m,8H),0.79(b,4H)。

PFP:將上一步得到的固體產物(57mg,0.1mmol)溶解在5mL的二氯甲烷溶液中,加入過量的三甲胺的甲醇溶液,室溫反應5h。將反應生成的沉淀過濾、洗滌,干燥后得目標產物(60mg,88%)。

1H NMR(400MHz,DMSO-6):δ(ppm)7.91-7.79(m,10H),3.18(b,4H),2.96(b,>15H),2.18-1.91(m,4H),1.47(b,4H),1.09(b,8H),0.67(b,4H)。

實施例2

本實施例用于說明金黃色葡萄球菌的復蘇培養

以金黃色葡萄球菌ATCC 6538為模板,在超凈工作臺中用75體積%酒精脫脂棉對所購裝有金黃色葡萄球菌ATCC 6538的安瓿瓶外表面進行消毒后,用火焰加熱其頂端,滴400μL無菌水至加熱的安瓿瓶頂端使之破裂。吸取300μL適宜的液體培養基(可用無菌水代替),滴入安瓿瓶內,輕輕振蕩吹打,使凍干菌體溶解呈懸浮狀,吸取全部菌懸液,分別移植于兩個NB固體培養基中,37℃培養20小時。用接種環刮取適量菌體畫Z型接種到新的NB固體培養基中,37℃繼續培養,如此連續傳3-4代培養,獲得穩定的菌株,放4℃作菌種備用。

實施例3

本實施例用于說明抑制生物膜的方法

(1)生物膜的形成和抑制

挑取固體培養基中適量ATCC 6538菌體于NB液體培養基中,37℃下轉速180rpm震蕩培養10h。用NB培養基調OD600值為1.0,取少量菌液(10μL)稀釋100倍于TSBg培養基中。取90μL稀釋后的菌液與10μL不同濃度的PFP混合,置于96孔板中,孔板中PFP的終濃度分別為1μM、5μM、10μM、20μM、50μM和100μM。37℃培養箱中放置24小時。空白對照為加入10μL滅菌水,其余操作與實驗組一致。

(2)抑制生物膜效果的檢測

取出96孔板,棄去培養基,并用PBS洗三次除去游離的細菌。加入100μL的95體積%乙醇固定15分鐘,除去乙醇后,放置至板干。加入100μL的0.1質量體積%結晶紫染色5分鐘,除去結晶紫,用滅菌水洗三次。加入110μL的10體積%乙酸溶解結晶紫,檢測每孔590nm處吸收值。空白對照記為A0,加入不同濃度PFP的記為A,金黃色葡萄球菌生物膜存活率(VR)根據式(II)計算,并繪制生物膜形成能力曲線,如圖1所示。

從圖1中可以看出,加入PFP后,金黃色葡萄球菌形成生物膜的能力減弱,且隨著PFP濃度的升高,PFP對金黃色葡萄球菌生物膜形成的抑制作用增強。說明PFP能有效抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成。

實施例4

本實施例用于說明PFP光照后產生的活性氧的檢測方法

還原態2,7-二氯熒光素(DCFH)的活化:在500μL的2,7-二氯熒光素二乙酯(DCFH-DA)中加入2mL的0.01M的NaOH后室溫放置30min,再加入10mL磷酸緩沖液(25mM,pH=7.4),混勻冰上暗處儲存待用。

向90μL活化后的DCFH溶液(40μM)加入10μL不同濃度PFP(終濃度分別為5μM、10μM和20μM),用光密度為3mW/cm2白光光源照射樣品5min,每隔1min測525nm處的熒光值,激發波長為488nm。空白對照為90μL活化后的DCFH溶液加入10μL滅菌水在光密度為3mW/cm2的白光光源照射5min,每隔1min測525nm處的熒光值,激發波長為488nm,所得525nm處熒光強度與時間的關系見圖2。

從圖2中可以看出,PFP有很強的產生活性氧的能力,并且隨著PFP濃度的升高,產生活性氧的能力變強,可用于光照殺傷周圍細菌。

實施例5

本實施例用于說明PFP破壞生物膜的方法

(1)生物膜的形成

挑取固體培養基中適量ATCC 6538菌體于NB液體培養基中,37℃下轉速180rpm震蕩培養10h。用NB培養基調OD600值為1.0,取少量菌液(10μL)稀釋100倍于TSBg培養基中。取100μL稀釋后的菌液置于96孔板中,37℃培養箱中放置24小時。

(2)破壞生物膜效果的檢測

形成生物膜后,棄去96孔板中培養基,用PBS洗3次除去游離的細菌。加入100μL的PFP溶液(終濃度20μM),放入37℃培養箱中放置15min。空白對照為加入100μL的PBS溶液,其余操作與實驗組一致。將96孔板于75mW/cm2光強下光照5-25min,超聲震蕩使生物膜分散。將分散后的細菌稀釋3000倍后,取100μL稀釋液鋪在NB固體培養基上,37℃培養20h后數平板上的菌落數。空白對照組記為C0,實驗組記為C,抑制率(IR)根據式(III)計算,并繪制曲線,如圖3所示,

從圖3中可以看出,隨著光照時間的延長,PFP對生物膜的破壞作用增強。

實施例6

本實施例通過熒光顯微成像法證明PFP對生物膜破壞作用

生物膜的形成過程與實施例5的方法相同。

形成生物膜后,棄去96孔板中培養基,用PBS洗3次除去游離的細菌。加入100μL的PFP溶液(終濃度20μM),放入37℃培養箱中放置15min。空白對照為加入100μL的PBS溶液,其余操作與實驗組一致。將96孔板于75mW/cm2光強下光照5-25min后,棄去PFP溶液,用PBS洗兩次后,用BacLight死活菌染色試劑盒進行染色。最后進行CLSM表征,采集樣品的明場和熒光場,對于SYTO9激發波長為488nm,PI為559nm。統計每個視野中綠色熒光和紅色熒光的數值,用綠色熒光值除以紅色熒光值得到活菌與死菌的比率,結果如圖4所示。

從圖4中可以看出,加入PFP后,隨著光照時間的延長,活菌數逐漸減少,死菌數逐漸增多,表明PFP對生物膜的破壞作用于光照時間呈正相關。

實施例7

本實施例通過電鏡說明PFP對生物膜破壞作用

(1)生物膜的形成

挑取固體培養基中適量ATCC 6538菌體于NB液體培養基中,37℃下轉速180rpm震蕩培養10h。用NB培養基調OD600值為1.0,取少量菌液稀釋100倍于TSBg培養基中。取500μL稀釋后的菌液于24孔板中(提前放置好Thermanox塑料蓋玻片),37℃培養箱中放置24小時。

(2)電鏡成像

形成生物膜后,棄去24孔板中培養基,用PBS洗3次除去游離的細菌。加入500μL的PFP溶液(終濃度20μM),放入37℃培養箱中放置15min。空白對照為加入500μL的PBS溶液,其余操作與實驗組一致。將24孔板于75mW/cm2光強下光照5-25min后,棄去PFP溶液,用PBS洗兩次后,加入含有0.5體積%戊二醛的PBS溶液,4℃固定過夜。樣品用超純水洗滌2次后,依次用體積百分含量分別為20%、40%、50%、70%、90%和100%乙醇梯度脫水,每次5min。待樣品自然干燥后,真空冷凍干燥2h,樣品噴金處理后可進行表征。結果如圖5所示。

從圖5中可以看出,沒有光照條件下,可以看到細菌成團且被胞外基質緊密包裹。隨著光照時間的延長,細菌團塊變小,并且能觀察到明顯的細菌脫落,進一步證明了PFP產生的活性氧對生物膜有破壞作用。

以上詳細描述了本發明的優選實施方式,但是,本發明并不限于上述實施方式中的具體細節,在本發明的技術構思范圍內,可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型,這些簡單變型均屬于本發明的保護范圍。

另外需要說明的是,在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術特征,在不矛盾的情況下,可以通過任何合適的方式進行組合。為了避免不必要的重復,本發明對各種可能的組合方式不再另行說明。

此外,本發明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合,只要其不違背本發明的思想,其同樣應當視為本發明所公開的內容。

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