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與玉米熱帶銹病(玉米殼銹菌)抗性相關聯的基因座.pdf

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玉米 熱帶 銹病 銹菌 抗性 相關 基因
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摘要
申請專利號:

CN201080060463.7

申請日:

20101103

公開號:

CN103108541B

公開日:

20150812

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A01H5/10,C12Q1/68 主分類號: A01H5/10,C12Q1/68
申請人: 納幕爾杜邦公司,先鋒國際良種公司
發明人: S·C·K·米拉赫,V·拉卡,M·G·布特勒伊勒,E·林伯格,E·D·O·阿爾貝斯
地址: 美國特拉華州
優先權: 61/257977
專利代理機構: 中國專利代理(香港)有限公司 代理人: 李慧惠;李炳愛
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201080060463.7

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及用于鑒定具有提高的或降低的熱帶銹病抗性的玉米植株的方法和組合物。所述方法使用分子標記以鑒定并選擇具有提高的熱帶銹病抗性的植株或鑒定并反選具有降低的熱帶銹病抗性的植株。通過本發明方法產生的玉米植株也是本發明的一個特征。用于關聯等位基因變異與受關注性狀的方法也是受關注的。

權利要求書

1.選擇具有增強的熱帶銹病抗性的玉米植株的方法,包括:a.????在所述玉米植株中檢測第一標記等位基因,所述第一標記等位基因與SEQ?ID?NO:156所示的序列連鎖并關聯;以及b.????選擇具有所述第一標記等位基因的所述玉米植株。2.權利要求1的方法,其中在單一減數分裂圖譜上,所述第一標記等位基因與SEQ?ID?NO:156所示的序列連鎖20cM。3.權利要求1的方法,其中在單一減數分裂圖譜上,所述第一標記等位基因與SEQ?ID?NO:156所示的序列連鎖2cM。4.選擇具有增強的熱帶銹病抗性的玉米植株的方法,包括:a.????在所述玉米植株中檢測SEQ?ID?NO:156所示的序列;以及b.????選擇具有SEQ?ID?NO:156所示的序列的所述玉米植株。5.選擇顯示增強的熱帶銹病抗性的玉米植株的方法,所述方法包括:a.????獲取第一玉米植株,所述第一玉米植株的基因組內包含SEQ?ID?NO:156所示的序列;b.????將所述第一玉米植株與第二玉米植株雜交;c.????對子代植株進行SEQ?ID?NO:156所示的序列的評價;以及d.???選擇具有SEQ?ID?NO:156所示的序列的子代植株。

說明書

相關申請的交叉引用

本專利申請要求提交于2009年11月4日的美國臨時申請61/257,977的優先權,該臨時申請全文以引用方式并入本文。

發明領域

本公開涉及用于提高植株對熱帶銹病抗性的組合物和方法和用于鑒定與受關注的性狀相關聯的等位基因變異的方法。

發明背景

熱帶銹病是由病原體玉米殼銹菌(Physopella?zeae(Mains)Cummins&Ramachar)(與Angiopsora?zeae?Mains同義)引起的真菌病害,其以前歸類為Angiopsora?zeae?Mains(Donald?G.White,編輯,1999.Compendium?of?corn?diseases.第三版.APS?Press,ISBN?0-89054-234-1)。熱帶銹病能夠快速發展,在短時間內殺死植株。

病害管理策略包括作物輪作、通過耕作破壞以前的玉米殘留、以及施用殺真菌劑,全部這些方法旨在減少真菌種菌。然而,控制熱帶銹病的最有效并且最優選的方法是種植抗病雜交種。

通過減少真菌種菌控制熱帶銹病的方法需要農民方面附加的時間和資源,并且此外可能對環境產生破壞效應。這使得種植抗病雜交種對農民和一般公眾來說甚至更有吸引力。因此,希望提供鑒定并選擇具有對熱帶銹病提高抗性的玉米植株的組合物和方法。

發明概述

提供了鑒定并選擇具有對熱帶銹病提高抗性的玉米植株的組合物和方法。還提供了標記輔助選擇具有對熱帶銹病提高抗性的植株的方法。

在一個實施方案中,提供了選擇對熱帶銹病具有提高抗性的玉米植株或種質的方法,所述方法檢測與PHMTR(SEQ?ID?NO:155)位點16處的“T”缺失或參考序列SEQ?ID?NO:167位點337-339處的“GAG”單倍型連鎖并關聯的第一標記基因座的至少一種等位基因的存在,并且選擇包含連鎖并關聯PHMTR(SEQ?ID?NO:155)的位點16處的“T”缺失或參考序列SEQ?ID?NO:167的位點337-339處的“GAG”單倍型的第一標記基因座的至少一種等位基因的玉米植株或種質。在單一減數分裂圖譜上,所述第一標記基因座的至少一個等位基因可與PHMTR(SEQ?ID?NO:155)位點16處的“T”缺失或參考序列SEQ?ID?NO:167位點337-339處的“GAG”單倍型連鎖并關聯至多20cM。

在另一個實施方案中,提供了選擇對熱帶銹病具有提高抗性的玉米植株或種質的方法,所述方法檢測PHMTR(SEQ?ID?NO:155)的位點16處的“T”缺失或參考序列SEQ?ID?NO:167的位點337-339處的“GAG”單倍型;并且選擇包含PHMTR(SEQ?ID?NO:155)的位點16處的“T”缺失或參考序列SEQ?ID?NO:167的位點337-339處的“GAG”單倍型的玉米植株或種質。

在另一個實施方案中,提供了鑒定對熱帶銹病具有提高抗性的玉米植株的方法,所述方法使用標記基因座序列、一部分標記基因座序列、或標記基因座序列的互補序列、或它們的一部分作為標記探針檢測玉米植株基因組中的標記基因座。所述標記探針在嚴格條件下雜交到介于下述序列之間并包括它們的連續DNA上:SEQ?ID?NO:89或基于Clustal?V比對方法與SEQ?ID?NO:89具有95%的同一性的核苷酸序列,和SEQ?ID?NO:96或基于Clustal?V比對方法與SEQ?ID?NO:96具有95%的同一性的核苷酸序列,并且所述標記基因座包含與對熱帶銹病的提高抗性相關聯的至少一個等位基因。

在另一個實施方案中,提供了鑒定對熱帶銹病具有提高抗性的玉米植株的方法,所述方法檢測與所述玉米植株的種質中提高的抗性相關聯的至少一個標記等位基因。標記基因座可選自任一個以下標記基因座:PHM1192-26-U、PHM1192-4-U、C00435-802-U、C00436-801-U、PHM187-7-U、C00423-801-U、PHM5028-24-U、PHM13818-15-U、PHM15721-39-U、PHM15721-180-U、C00441-801-U、C00441-802-U、PHM4370-19-U、?PHM731-107-U、C00071-01-U、PHM8249-21-U、C00428-801-U、PHM18427-13-U、PHM9535-10-U、PHM9535-6-U、PHM9535-7-U和PHM4003-13-U;PHM標記PHM15590、PHM13818、PHM1192、PHM187、PHM5028、PHM4370、PHM731和PHM15721;Sub2e、Sub9d、Sub19c、Sub23m、C06621-1-K2和C06621-1-K4;以及與這些標記連鎖的任何其它標記。標記基因座也存在于染色體10上的任何以下區間內,其包含并側接:

i.PHM15590和PHM9535;

ii.PHM15590和PHM15721;

iii.C00441和C00428;

iv.PHM731和PHM15721;和

v.C00071和PHM731。

標記基因座包含與增強的熱帶銹病抗性相關聯的至少一個等位基因。

在另一個實施方案中,提供了鑒定對熱帶銹病具有提高抗性的玉米植株的方法,所述方法檢測與對熱帶銹病的提高抗性相關聯的玉米植株種質中的單倍型。所述單倍型在一個或多個標記基因座上包含等位基因,其中所述一個或多個標記基因座存在于染色體10上的任何以下區間內,其包含并側接:

i.PHM15590和PHM9535;

ii.PHM15590和PHM15721;

iii.C00441和C00428;

iv.PHM731和PHM15721;和

v.C00071和PHM731。

所述單倍型可包含PHMTR的位點16處的“T”缺失或參考序列SEQ?ID?NO:167的位點337-339處的“GAG”。

在另一個實施方案中,提供了選擇對熱帶銹病具有提高抗性的玉米植株的方法。在該方法中,獲取第一玉米植株,其中所述玉米植株具有標記基因座的至少一個等位基因,所述標記基因座位于染色體10上的任何以下區間內,其包含并側接:

i.PHM15590和PHM9535;

ii.PHM15590和PHM15721;

iii.C00441和C00428;

iv.PHM731和PHM15721;和

v.C00071和PHM731;

并且所述等位基因與對熱帶銹病的提高抗性相關聯。所述第一玉米植株與第二玉米植株雜交,并且對所得子代植株進行第一玉米植株的等位基因的評價。然后選擇具有所述第一玉米植株的等位基因的子代植株作為對熱帶銹病具有提高抗性的植株。

在另一個實施方案中,提供了選擇對熱帶銹病具有提高抗性的玉米植株的方法。在該方法中,獲取第一玉米植株,其中所述玉米植株在其基因組中包含PHMTR的位點16處的“T”缺失或參考序列SEQ?ID?NO:167的位點337-339處的“GAG”單倍型。所述第一玉米植株與第二玉米植株雜交,并且對所得子代植株進行PHMTR的位點16處的“T”缺失或參考序列SEQ?ID?NO:167的位點337-339處的“GAG”單倍型的評價。然后選擇具有PHMTR的位點16處的“T”缺失或參考序列SEQ?ID?NO:167的位點337-339處的“GAG”單倍型的子代植株作為對熱帶銹病具有提高抗性的植株。

此外,通過上述方法鑒定或選擇的玉米植株是受關注的,其中所述植株不是CML339。此外,由上述方法鑒定或選擇的玉米植株的子代是受關注的。

在另一個實施方案中,提供了鑒定與期望的性狀形式相關聯的等位基因變異的方法。在這些方法中,比對開放:延伸代價比大于10的原始序列并通過修剪尾部除去背景噪音。然后修剪隨機的等位基因變異,并使用非加權配對組算數平均法(UPGMA)。重復進行隨機等位基因變異的修剪和應用UPGMA于比對直至鑒定出表型關系圖。然后可從表型關系圖中鑒定與受關注的表型相關聯的等位基因變異。

附圖和序列表說明

根據以下的詳細描述和附圖以及序列表,可更全面地理解本發明,以下的詳細描述和附圖以及序列表構成本專利申請的一部分。此序列表中以單個字母表示核苷酸,以三字母表示氨基酸,如Nucleic?Acids?Research?13:3021-3030(1985)和Biochemical?Journal?219(No.2):345-373(1984)所描述的IUPAC-IUBMB標準中所規定,2):345-373(1984),所述文獻全文以引用方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列數據的符號和格式符合如37C.F.R.§1.822所示的規則。

圖1示出定位BAC的物理圖譜排列(獲取自Maize?Genome?Browser,它在因特網上公開可用),它裝配到染色體10區域上,該區域由c0497L12和b0191E02定位并包括它們。示出了本文所述的PHM標記位點(由PHM15590和PHM15721定位并包括它們的區域),它們是位于所述區間內的公開標記位點。

圖2A和2B分別示出了熱帶和南方銹病評分的PH468x?PHS6Y?F2種群的頻率分布。

圖3示出了使用PH468x?PHS6Y?F2種群獲得的混合區間作圖結果。在染色體10的短臂上鑒定顯著性峰。在x軸上的標記位點對應于PHB基因圖譜。y軸代表LOD評分。

圖4(a)易感自交系和使用PHS6Y作為供體親本的對應抗性轉化。(b)用易感型自交系制得的雜交體。(c)用相同自交系的抗性(“轉化的”)型制得的雜交體。這顯示熱帶銹病基因在雜交水平上具有顯性效應。

圖5示出對熱帶銹病(左側)高度易感的雜交體和已經從PHS6Y轉化成具有提高抗性的相同雜交體(右側)。

圖6示出用作引物設計參考的公開BAC克隆,其用于對熱帶銹病抗性的和易感的基因型玉米品系。關于BAC重疊的內部信息用于進一步將2-2.5Mb區域的序列順序縮小至24個子區域。

圖7示出通過對熱帶銹病抗性的和易感的玉米品系的基因分型獲得的部分參考序列(頂部),所述基因分型使用設計用于克隆ID?Ct9050c064G11c的PCR引物(SEQ?ID?NO:133和134)(表9)。SEQ?ID?NO:137-142示出獲取自抗性品系的擴增子,而SEQ?ID?NO:143-154示出獲?取自易感品系的擴增子。用灰色突出顯示的區域示出參考序列(稱為PHMTR;SEQ?ID?NO:155)的21bp區域。在bp16具有T-缺失的玉米品系(用箭頭示出)都顯示對熱帶銹病的提高抗性并具有序列SEQ?ID?NO:156。

圖8示出使用引物SEQ?ID?NO:135和SEQ?ID?NO:136獲得的擴增子序列的部分比對。發現“GAG”單倍型(框內)是全部具有提高熱帶銹病抗性的品系獨有的。

本文所附的序列描述和序列表遵循在37C.F.R.§1.821-1.825中所列出的用于專利申請公開中的核苷酸和/或氨基酸序列的規定。序列表包含遵循IUPAC-IUBMB標準的核苷酸序列的單字母編碼和氨基酸序列的三字母編碼,IUPAC-IUBMB標準描述于Nucleic?Acids?Res.13:3021-3030(1985)和Biochemical?J.219(2):345-373(1984),所述文獻以引用方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列數據的符號和格式符合如37C.F.R.§1.822所示的規則。

表1列出了本文所述與InvaderPlus產品標記相關聯的序列以及在所附序列表中的對應標識符(SEQ?ID?NO:)。

表1:InvaderPlus產品標記

表2列出了本文所述與PHM標記相關聯的序列以及在所附序列表中的對應標識符(SEQ?ID?NO:)。

表2:PHM標記序列:擴增子和引物信息

SEQ?ID?NO:129是被設計用于克隆ID?Ct9050c497L12e的L引物。

SEQ?ID?NO:130是被設計用于克隆ID?Ct9050c497L12e的R引物。

SEQ?ID?NO:131是被設計用于克隆ID?Ct9050c064G11d的L引物。

SEQ?ID?NO:132是被設計用于克隆ID?Ct9050c064G11d的R引物。

SEQ?ID?NO:133是被設計用于克隆ID?Ct9050c064G11c的L引物。

SEQ?ID?NO:134是被設計用于克隆ID?Ct9050c064G11c的R引物。

SEQ?ID?NO:135是被設計用于克隆ID?Ct9050b191E02m的L引物。

SEQ?ID?NO:136是被設計用于克隆ID?Ct9050b191E02m的R引物。

SEQ?ID?NO:137是使用SEQ?ID?NO:133和SEQ?ID?NO:134作為引物以及PHS6Y?DNA獲得的擴增子序列。

SEQ?ID?NO:138是使用SEQ?ID?NO:133和SEQ?ID?NO:134作為引物以及PH1JG22DNA獲得的擴增子序列。PH1JG22是抗熱帶銹病的玉米自交系。

SEQ?ID?NO:139是使用SEQ?ID?NO:133和SEQ?ID?NO:135作為引物以及PH1FT71?DNA獲得的擴增子序列。PH1FT71是抗熱帶銹病的玉米自交系。

SEQ?ID?NO:140是使用SEQ?ID?NO:133和SEQ?ID?NO:135作為引物以及PH1G3H1?DNA獲得的擴增子序列。PH1G3H1是抗熱帶銹病的玉米自交系。

SEQ?ID?NO:141是使用SEQ?ID?NO:133和SEQ?ID?NO:135作為引物以及PH1JG01?DNA獲得的擴增子序列。PH1JG01是抗熱帶銹病的玉米自交系。

SEQ?ID?NO:142是使用SEQ?ID?NO:133和SEQ?ID?NO:135作為引物以及PHS7W?DNA獲得的擴增子序列。PHS7W是抗熱帶銹病的玉米自交系。

SEQ?ID?NO:143是使用SEQ?ID?NO:133和SEQ?ID?NO:135作為引物以及PH7W3DNA獲得的擴增子序列。PH7W3是易感熱帶銹病的玉米自交系。

SEQ?ID?NO:144是使用SEQ?ID?NO:133和SEQ?ID?NO:135作為引物以及PH9VF?DNA獲得的擴增子序列。PH9VF是易感熱帶銹病的玉米自交系。

SEQ?ID?NO:145是使用SEQ?ID?NO:133和SEQ?ID?NO:135作為引物以及PHBNA?DNA獲得的擴增子序列。PHBNA是易感熱帶銹病的玉米自交系。

SEQ?ID?NO:146是使用SEQ?ID?NO:133和SEQ?ID?NO:135作為引物以及PH2JR?DNA獲得的擴增子序列。PH2JR是易感熱帶銹病的玉米自交系。

SEQ?ID?NO:147是使用SEQ?ID?NO:133和SEQ?ID?NO:135作為引物以及PH0TJ?DNA獲得的擴增子序列。PH0TJ是易感熱帶銹病的玉米自交系。

SEQ?ID?NO:148是使用SEQ?ID?NO:133和SEQ?ID?NO:135作為引物以及PH467DNA獲得的擴增子序列。PH467是易感熱帶銹病的玉米自交系。

SEQ?ID?NO:149是使用SEQ?ID?NO:133和SEQ?ID?NO:135作為引物以及PH48F?DNA獲得的擴增子序列。PH48F是易感熱帶銹病的玉米自交系。

SEQ?ID?NO:150是使用SEQ?ID?NO:133和SEQ?ID?NO:135作為引物以及PH7WC?DNA獲得的擴增子序列。PH7WC是易感熱帶銹病的玉米自交系。

SEQ?ID?NO:151是使用SEQ?ID?NO:133和SEQ?ID?NO:135作為引物以及625DNA獲得的擴增子序列。625是易感熱帶銹病的玉米自交系。

SEQ?ID?NO:152是使用SEQ?ID?NO:133和SEQ?ID?NO:135作為引物以及PHP3P1DNA獲得的擴增子序列。PHP3P1是易感熱帶銹病的玉米自交系。

SEQ?ID?NO:153是使用SEQ?ID?NO:133和SEQ?ID?NO:135作為引物以及PHY7M2DNA獲得的擴增子序列。PHY7M2是易感熱帶銹病的玉米自交系。

SEQ?ID?NO:154是使用SEQ?ID?NO:133和SEQ?ID?NO:135作為引物以及PH147G5DNA獲得的擴增子序列。PH147G5是易感熱帶銹病的玉米自交系。

SEQ?ID?NO:155是PHMTR區域的序列。

SEQ?ID?NO:156是PHMTR區域的序列,其在SEQ?ID?NO:155的位點16處無“T”。

SEQ?ID?NO:157-164是引物C06621-1-K2和C06621-1-K4(表3)的序列。

表3:C06621-1-K2和C06621-1-K4KASP標記信息

SEQ?ID?NO:165是FAM通用序列。

SEQ?ID?NO:166是VIC通用序列。

SEQ?ID?NO:167是Sub23M的參考序列。

發明詳述

本發明提供玉米等位基因組合物和鑒定并選擇具有提高的熱帶銹病抗性的玉米植株的方法。等位基因組合物和用于鑒定并反選具有降低的熱帶銹病抗性的玉米植株的方法也在本發明的范圍內。提供以下定義以利于理解本發明。

術語“增強的抗性”、“提高的抗性”或“新賦予的抗性”是可互換的并且指對特定病原體、廣譜病原體、或由所述病原體引起的感染的提高水平的抗性。對特定真菌病原體如熱帶銹病的提高水平的抗性例如形成“增強的”或改善的真菌抗性。本發明的實施方案將增強或改善植株病原真菌的抗性,使得植株對真菌病原體或病原體的抗性將提高,這繼而將提高對由所述真菌病原體引起的病害的抗性。術語“增強”指改善、提高、擴增、倍增、?提升、增加等。本文中將本發明的植株描述為具有對熱帶銹病感染的“增強抗性”,這是因為在本發明基因座上的特定等位基因。

顯示增強的熱帶銹病抗性的玉米植株是產量和/或活力或其它相關的農學量度當引入該病害的誘導劑時較少受影響的植株。抗性是一種相對性術語,它指示受感染的植株比另一種進行相似處理的較易感植株的玉米產量更高。即,病癥在抗性玉米植株中引起的玉米活力和/或產量的降低小于在易感玉米植株中引起的玉米活力和/或產量的降低。技術人員將會知道玉米植株的熱帶銹病抗性變化很大,能夠表現出較高抗性或較低抗性的表型,并且能夠取決于感染嚴重度而變化。然而通過簡單地觀察,技術人員能夠測定不同植株、植株品系或植株家族對熱帶銹病的相對抗性或易感性,并且此外也將認識到“抗性”的表型等級。如本領域所用,“抗性”有時稱為“一般抗性”、“降低發病率抗性”、或“部分抗性”。

“病害抗性”是植株的一個特性,其中植株避免植株病原體相互作用如玉米-熱帶銹病相互作用引起的病害癥狀。即,預防病原體引起植株病害以及相關聯的病害癥狀,或者把由該病原體引起的病害癥狀最小化或減輕。本領域的技術人員將會知道本文所公開的組合物和方法可與本領域可用的其它組合物和方法一起使用以保護植株免遭病原體侵襲。

如本文所用,“真菌抗性”指在與野生型植株進行比較時對真菌病原體增強的抗性或耐受性。效應可從對真菌病原體效應的耐受性輕微提高(例如部分抑制)到總體抗性使得植株不受存在的真菌病原體影響不等。

本文稱為“二倍體”的植株具有兩組染色體。

本文稱為“雙單倍體”的植株通過倍增單倍體染色體組進行生長。認為雙單倍體植株是純合植株。

“優良品系”是源自育種并選擇優異農學性能的任何品系。

術語“等位基因”指在特定基因座處存在的兩個或更多個不同核苷酸序列的其中一個。

“等位基因頻率”指種群內或一組品系內的等位基因的頻率(比例或百分比)。技術人員能夠通過平均該種群的個體樣本的等位基因頻率來預測種群內的等位基因頻率。

“擴增子”是被擴增的核酸,例如通過使用任何可用的擴增方法(例如PCR、LCR、轉錄等)擴增模板核酸制備的核酸。

在核酸擴增的情況下術語“擴增”是其中產生附加拷貝的選擇核酸(或其轉錄形式)的任何過程。典型的擴增方法包括基于多種聚合酶的復制方法包括聚合酶鏈反應(PCR)、連接酶介導的方法如連接酶鏈反應(LCR)、以及基于RNA聚合酶的擴增(例如通過轉錄)方法。

術語“裝配”應用于BAC以及它們聚集以形成連續的DNA片段的傾向。BAC基于序列比對“裝配”成重疊群,如果BAC進行測序,或者經由它的BAC指紋與其它BAC指紋的比對“裝配”成重疊群。可使用因特網上公開可用的Maize?Genome?Browser找到公開的裝配。

當等位基因是DNA序列的一部分或與DNA序列連鎖時,或者當等位基因影響性狀表達以及當存在的等位基因是期望的性狀或性狀形式將發生在包含等位基因的植株中的指示時,等位基因與性狀“關聯”。

“BAC”或細菌人工染色體是來源于大腸桿菌(Escherichia?coli)天然存在的F因子的克隆載體。BAC能夠接受DNA序列的較大插入序列。在玉米中,已經將許多BAC或細菌人工染色體裝配成重疊群(重疊的連續基因片段,或“連續DNA”),它們每個均包含玉米基因組DNA的較大插入序列。

“回交”指其中雜交子代反復與其中一個親本回交的過程。“供體”親本指具有將被滲入的期望單個基因/多個基因、單個基因座/多個基因座、或特定表型的親本植株。“受體”親本(使用一次或多次)或“輪回”親本(使用兩次或多次)指將基因或基因座滲入其中的親本植株。例如,參見Ragot,M.等人(1995)Marker-assisted?backcrossing:a?practical?example,in?Techniques?et?Utilisations?des?Marqueurs?Moleculaires?Les?Colloques,Vol.72,第45-56頁,以及Openshaw等人,(1994)Marker-assisted?Selection?in?Backcross?Breeding,Analysis?of?Molecular?Marker?Data,第41-43頁。初始雜交產生F1代;然后術語“BC1”指輪回親本的第二次使用,“BC2”指輪回親本的第三次使用等等。

厘摩(“cM”)是重組頻率的量度單位。一cM等于經過單代雜交在一個基因座上的標記將與在第二基因座上的標記分離的1%的概率。

如本文所用,術語“染色體區間”指位于植株單個染色體上的基因組DNA的連續線性區域。位于單個染色體區間內的遺傳因子在物理上連鎖。不特別限定染色體區間的大小。在一些方面,位于單個染色體區間內的遺傳因子在遺傳上連鎖,遺傳重組距離通常為例如小于或等于20cM,或者小于或等于10cM。即,位于單個染色體區間內的兩個遺傳因子以小于或等于20%或10%的頻率進行重組。

如本文所用,術語“染色體區間”指位于植株單個染色體上的基因組DNA的連續線性區域。位于單個染色體區間內的遺傳因子在物理上連鎖。不特別限定染色體區間的大小。在一些方面,位于單個染色體區間內的遺傳因子在遺傳上連鎖,遺傳重組距離通常為例如小于或等于20cM,或者小于或等于10cM。即,位于單個染色體區間內的兩個遺傳因子以小于或等于20%或10%的頻率進行重組。

“染色體”是包含多個基因的螺旋DNA單片段,所述基因在細胞分裂期間作為一個單位發揮作用并移動,因此可稱為連鎖的。也可稱為“連鎖群”。

在本專利申請中短語“緊密連鎖的”指兩個連鎖基因座之間的重組發生頻率等于或小于約10%(即,在基因圖譜上分開不超過10cM)。換句話說,緊密連鎖的基因座在至少90%的情況下共分離。當標記基因座展示與期望性狀(例如病原體抗性)顯著的共分離(連鎖)概率時,它們在本發明中是尤其有用的。緊密連鎖的基因座如標記基因座和第二基因座可顯示10%或更低,優選約9%或更低,更優選約8%或更低,更優選約7%或更低,更優選約6%或更低,更優選約5%或更低,更優選約4%或更低,更優選約3%或更低,更優選約2%或更低的基因座內重組頻率。在高度優選的實施方案中,關聯基因座顯示約1%或更低的重組頻率,例如約0.75%或更低,更優選約0.5%或更低,更優選約0.25%或更低的重組頻率。位于相同染色體上,并且它們間的距離使得兩個基因座間的重組發生頻率小于10%(例如約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.75%、0.5%、0.25%、或更低)的兩個基因座也稱為彼此“接近”。在一些情況下,兩個不同的標記可具有相同的基因圖譜坐標。在該情況下,兩個標記彼此是如此接近以至于它們間的重組頻率低至無法檢測。

在生物信息學中,“聚類”指將以某種方式連鎖的序列分類并常用于制備一組非冗余的代表性序列。所述序列可為基因組、“轉錄組”(EST)或本質上為蛋白。

術語“互補序列”指與給定核苷酸序列互補的核苷酸序列,即所述序列通過堿基配對原則連鎖。

術語“連續DNA”指重疊的連續基因片段。“連續DNA”指未中斷的基因組DNA片段,它們由部分重疊的片段或重疊群表示。

當涉及兩個遺傳因子間的關系時,如一個遺傳因子產生抗性和接近的標記,“相引”相連鎖指示其中在抗性基因座上的“有利”等位基因物理上與相同染色體鏈上的對應連鎖標記基因座的“有利”等位基因關聯的狀態。在相引相中,兩個有利等位基因均由遺傳了該染色體鏈的子代一起繼承。

術語“雜交的”或“雜交”指經由授粉產生子代的配子融合(例如細胞、種子或植株)。該術語包括有性雜交(一株植株被另一株植株授粉)和自交(自花授粉,例如當花粉和胚珠來自相同植株時)。術語“雜交”指經由授粉產生子代的配子融合行為。

本文稱為“二倍體”的植株具有兩組染色體(基因組)。

本文稱為“雙單倍體”的植株通過倍增單倍體染色體組進行開發(即,正常染色體數目的一半)。雙單倍體植株具有兩組相同的染色體,并且認為全部基因座是純合的。

“優良品系”是源自育種并選擇優異農學性能的任何品系。

“外來的玉米株”或“外來的玉米種質”是來源于不屬于可利用優良玉米品系或種質株的玉米株的植株或種質。在兩個玉米植株或種質株雜交的情況下,外來種質不通過遺傳到與它雜交的優良種質中緊密連鎖。最常見的是,外來種質不來源于任何已知的優良玉米品系,而是經選擇以將新遺傳因子(通常新等位基因)導入育種程序。

“有利等位基因”是在特定位點的等位基因,它賦予或導致農學上所期望的表型如對熱帶銹病的增強抗性并允許鑒定具有農學上所期望表型的植株。標記的“有利等位基因”是與有利表型共分離的標記等位基因。

“片段”旨在表示核苷酸序列的一部分。使用本文所公開的方法,片段可用作雜交探針或PCR引物。

“基因圖譜”是對給定物種中一個或多個染色體(或連鎖群)上的基因座間的基因連鎖關系的描述,一般以圖表或表格形式描述。就每個基因圖譜而言,基因座之間的距離通過它們的等位基因在種群中一起出現的頻率進行測量(即它們的重組頻率)。可使用DNA或蛋白標記或能夠觀察到的表型檢測等位基因。基因圖譜是作圖的種群、使用的標記的類型、以及不同種群間各個標記的多態性潛力的產物。不同基因圖譜的基因座間的基因距離可不同。然而,使用常見標記能夠將一個圖譜與另一個圖譜的信息關聯。本領域的普通技術人員可使用常見標記的位點來鑒定在各個個體基因圖譜上的標記位置和受關注的其它基因座。圖譜間的基因座順序將不發生變化,但是很多情況下標記順序發生小的改變,這是由于例如標記在不同種群中檢測到替代的重復基因座、用于定位標記的統計學方法上的差異、新突變或實驗室誤差。

“基因圖譜位置”是在相同連鎖群上,相對于圍繞的遺傳標記在基因圖譜上的位置,其中能夠在給定種群中發現指定標記。

“基因作圖”是限定基因座的連鎖關系的方法,該方法通過使用遺傳標記、標記的種群分離、以及重組頻率的標準遺傳原則進行。

術語“遺傳標記”將指任何類型的核酸基標記,包括但不限于限制性片段長度多態性(RFLP)、簡單重復序列(SSR)、隨機擴增多態性DNA(RAPD)、酶切擴增多態性序列(CAPS)(Rafalski和Tingey,1993,Trends?in?Genetics?9:275-280)、擴增片段長度多態性(AFLP)(Vos等人,1995,Nucleic?Acids?Res.23:4407-4414)、單核苷酸多態性(SNP)(Brookes,1999,Gene?234:177-186)、序列特異性擴增區域(SCAR)(Paran和Michelmore,1993,Theor.Appl.Genet.85:985-993)、序列標簽位點(STS)(Onozaki等人,2004,Euphytica?138:255-262)、單鏈構象多態性(SSCP)(Orita等人,1989,Proc?Natl?Acad?Sci?USA?86:2766-2770)、簡單重復序列區間(ISSR)(Blair等人,1999,Theor.Appl.Genet.98:780-792)、反轉錄轉座子位點間擴增多態性(IRAP)、反轉錄轉座子微衛星擴增多態性(REMAP)(Kalendar等人,1999,Theor.Appl.Genet.98:704-711)、RNA裂解產物(如Lynx標記)等。

“遺傳重組頻率”是兩個基因座之間的交換事件(重組)的頻率。在標記和/或減數分裂后性狀的分離后可觀察到重組頻率。

“基因組”指總DNA或整組基因,由染色體或染色體組攜帶。

術語“基因型”是個體(或個體組)在一個或多個基因座上的基因組成,它與可觀察到的性狀(表型)形成對照。基因型由一個或多個已知基因座的一種或多種等位基因限定,個體已經從其親本中繼承了所述基因座。術語基因型可被用于指個體在單個基因座上的基因組成,在多個基因座上的基因組成,或者更一般的,術語基因型可被用于指個體在其基因組中的全部基因的基因組成。

“種質”指個體(例如一個植株)、一組個體(例如一個植株品系、品種或家族)、或來源于一個品系、品種、物種、或培養物的克隆的或從其中得到的遺傳物質。種質可為生物或細胞的部分,或者可從生物或細胞中分離得到。種質通常提供遺傳物質與特異性分子構成,該分子構成提供生物或細胞培養物的一些或全部遺傳性狀的物理基礎。如本文所用,種質包括可從中生長出新植株的細胞、種子或組織,或者植株部分如葉、莖、花粉、或細胞,它們能夠被培養成整個植株。

“單倍型”是個體在多個基因座上的基因型,即等位基因組合。單倍型描述的基因座通常是物理上和遺傳上連鎖的,即在相同染色體片段上。術語“單倍型”可指特定序列如標記基因座的一系列多態性,或者沿多個序列如多個標記基因座的一系列多態性。

“雜種優勢群”包含一組基因型,它們在與來自不同雜種優勢群的基因型雜交時表現良好(Hallauer等人(1998),Corn?breeding,第463-564頁。在G.F.Sprague和J.W.Dudley(ed.)Corn?and?corn?improvement中)。將自交系歸類為雜種優勢群,并且將其進一步細分為雜種優勢群內的家族,所述分類基于若干個標準如家譜、基于分子標記的關聯、以及雜交體組合的性能(Smith等人(1990)Theor.Appl.Gen.80:833-840)。美國兩個最廣泛使用的雜種優勢群稱為“Iowa?Stiff?Stalk?Synthetic”(BSSS)和“Lancaster”或“Lancaster?Sure?Crop”(有時稱為NSS或非Stiff?Stalk)。

術語“雜合子”指其中不同等位基因位于同源染色體上的對應基因座的基因條件。

術語“純合子”指其中相同等位基因位于同源染色體上的對應基因座的基因條件。

術語“雜交體”指至少兩個基因相異的親本間雜交獲得的子代。

“雜交”或“核酸雜交”指互補RNA和DNA鏈配對以及互補DNA單鏈配對。

術語“雜交”指核酸鏈的互補區域之間形成堿基對。

“IBM基因圖譜”指任何以下圖譜:IBM、IBM2、IBM2?neighbors、IBM2?FPC0507、IBM2?2004?neighbors、IBM2?2005?neighbors、或IBM2?2005連續框。IBM基因圖譜基于B73x?Mo17種群,其中來自初始雜交的子代在構建重組自交系用于作圖前隨機交配產生多代。較新的版本反映了基因和BAC作圖基因座的加入以及由于包含來自其它基因圖譜的信息帶來的圖譜精細度的提高。

術語“自交”指已經進行育種以獲得遺傳同質性的品系。

術語“插入缺失(indel)”指插入或缺失,其中相對于第二品系可將一個品系稱為插入,或者相對于第一品系可將第二品系稱為具有缺失。

術語“滲入”指基因座的期望等位基因從一種遺傳背景傳遞到另一種遺傳背景的現象。例如在特定基因座的期望等位基因通過滲入、經由相同物種的兩個親本間的有性雜交可被傳遞到至少一個子代,其中至少一個親本在其基因組中具有期望的等位基因。作為另外一種選擇,例如等位基因的傳遞能夠通過兩個供體基因組之間的重組而發生,例如在融合原生質體中,其中至少其中一個供體原生質體在其基因組中具有期望的等位基因。期望的等位基因可為例如標記的選擇等位基因、QTL、轉基因等。在任何情況下,能夠將包含期望等位基因的子代與具有期望遺傳背景的品系反復回交并選擇期望的等位基因以產生固定在選擇遺傳背景中的等位基因。

當重復“滲入”過程兩次或更多次時,該過程常被稱為“回交”。在滲入或回交中,“供體”親本指具有將被滲入的期望單個基因或基因座的親本植株。“受體”親本(使用一次或多次)或“輪回”親本(使用兩次或多次)指將基因或基因座滲入其中的親本植株。例如,參見Ragot,M.等人(1995)Marker-assisted?backcrossing:a?practical?example,in?Techniques?et?Utilisations?des?Marqueurs?Moleculaires?Les?Colloques,Vol.72,第45-56頁,?以及Openshaw等人,(1994)Marker-assisted?Selection?in?Backcross?Breeding,Analysis?of?Molecular?Marker?Data,第41-43頁。初始雜交產生F1代;于是術語“BC1”是指輪回親本的第二次使用,“BC2”是指輪回親本的第三次使用,以此類推。

如本文所用,術語“連鎖”用于描述一個標記基因座與另一個標記基因座或一些其它基因座(例如熱帶銹病基因座)相關聯的程度。分子標記和表型(例如增強的熱帶銹病抗性)之間的連鎖關系用“概率”或“調整概率”表示。連鎖可以用期望的限度或范圍表達。例如在一些實施方案中,當標記分離距離為小于50、40、30、25、20、或15圖譜單位(或cM)時,任何標記與任何其它標記連鎖(基因上和物理上)。在一些方面,限定加括號的連鎖范圍是有利的,例如介于10cM和20cM之間,介于10cM和30cM之間,或者介于10cM和40cM之間。標記與第二基因座的連鎖越緊密,標記對第二基因座的指示效果越好。因此,“緊密連鎖的基因座”如標記基因座和第二基因座顯示10%或更低,優選約9%或更低,更優選約8%或更低,更優選約7%或更低,更優選約6%或更低,更優選約5%或更低,更優選約4%或更低,更優選約3%或更低,更優選約2%或更低的基因座內重組頻率。在高度優選的實施方案中,關聯基因座顯示約1%或更低的重組頻率,例如約0.75%或更低,更優選約0.5%或更低,更優選約0.25%或更低的重組頻率。位于相同染色體上,并且它們間的距離使得兩個基因座間的重組發生頻率小于10%(例如約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.75%、0.5%、0.25%、或更低)的兩個基因座也稱為彼此“接近”。因為一cM是顯示出1%的重組頻率的兩個標記之間的距離,任何標記與接近的任何其它標記緊密連鎖(基因上和物理上),例如等于或小于10cM的距離。相同染色體上的兩個緊密連鎖的標記可被彼此定位于9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.75、0.5或0.25cM或更小。

術語“連鎖不平衡”指基因座或性狀(或者兩者都有)非隨機地分離。在任一情況下,連鎖不平衡意味著相關的基因座沿著一段染色體在物理上足夠接近,以便它們以大于隨機(即非隨機)的頻率一起分離(在共分離性狀的情況下,產生該性狀的基因座彼此足夠接近)。顯示連鎖不平衡的標記被認為是連鎖的。連鎖基因座在超過50%的情況下共分離,例如約51%?至約100%的情況。換句話說,共分離的兩個標記具有小于50%(并且根據定義,在相同連鎖群上分離距離小于50cM)的重組頻率。如本文所用,連鎖可存在于兩個標記或者標記和表型之間。標記基因座可與性狀“相關聯”(連鎖),例如對熱帶銹病的抗性。測量分子標記與表型性狀的連鎖程度,例如分子標記與表型共分離的統計學概率。

連鎖不平衡最常見地用量度r2測量,它通過Hill,W.G.和Robertson,A,Theor.Appl.Genet.38:226-231(1968)。當r2=1時,兩個標記基因座間存在完全的LD,意味著標記還未進行重組分離并且具有相同的等位基因頻率。r2值大1/3指示足夠強的LD將被用于作圖(Ardlie等人,Nature?Reviews?Genetics?3:299-309(2002))。因此,當成對標記基因座間的r2值大于或等于0.33、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、或1.0時,等位基因處于連鎖不平衡。

如本文所用,“連鎖平衡”描述其中兩個標記獨立地分離的情況,即,在子代中隨機分離。認為顯示連鎖平衡的標記不連鎖(無論它們是否位于相同染色體上)。

“基因座”是基因或標記位于染色體上的位點。

“優勢對數(LOD)值”或“LOD評分”(Risch,Science?255:803-804(1992))用于區間作圖以描述兩個標記基因座之間的連鎖程度。兩個標記間LOD評分為三指示連鎖概率比無連鎖的概率高1000倍,而LOD評分為二指示連鎖概率比無連鎖的概率高100倍。大于或等于二的LOD評分可用于檢測連鎖。

“玉米”指玉米屬(Zea?mays?L.ssp.mays)植株,也稱為玉蜀黍。

術語“玉米植株”包括:整個玉米植株、玉米植株細胞、玉米植株原生質體、可從其中再生玉米植株的玉米植株細胞或玉米組織培養物、玉米植株愈傷組織和玉米植株中的完整玉米植株細胞或玉米植株部分,如玉米種子、玉米芯、玉米花、玉米子葉、玉米葉、玉米莖、玉米芽、玉米根、玉米根尖等。

“標記”是用作參考點的核苷酸序列或其編碼產物(例如蛋白)。標記能夠來源于基因組核苷酸序列或表達的核苷酸序列(例如來源于剪接的?RNA或cDNA),或來源于編碼的多肽。該術語也指與標記序列互補或側接標記序列的核酸序列,如用作探針或能夠擴增標記序列的引物對的核酸。

對應于種群成員之間的遺傳多態性的標記能夠通過本領域已建立的方法進行檢測。這些方法包括例如DNA測序、基于PCR的序列特異性擴增方法、限制性片段長度多態性檢測(RFLP)、同功酶標記檢測、通過等位基因特異性雜交(ASH)進行的多核苷酸多態性檢測、植株基因組的擴增可變序列檢測、自主序列復制檢測、簡單重復序列檢測(SSR)、單核苷酸多態性檢測(SNP)、或擴增片段長度多態性檢測(AFLP)。已經建立的方法也已知用于檢測表達序列標簽(EST)和來源于EST序列的SSR標記以及隨機擴增的多態性DNA(RAPD)。

“標記等位基因”或者“標記基因座的等位基因”可以指種群中位于標記基因座的多個多態性核苷酸序列的其中一個,它就標記基因座而言是多態的。

“標記輔助選擇”(MAS)是基于標記基因型選擇個體植株的方法。

“標記輔助反選”是一種通過它將標記基因型用于鑒定植株的方法,所述植株將不被選擇,使得它們被從育種程序或種植中除去。

“標記基因座”是物種基因組中的特定染色體位點,其中可存在特定標記。“標記基因座”可用于追蹤存在的第二連接基因座,例如編碼或有助于表達表型性狀的連接的基因座。例如標記基因座能夠用于監控等位基因在某一基因座的分離,如基因或QTL,它們與標記基因座在遺傳上或在物理上連鎖。

“標記探針”是可用于通過核酸雜交鑒定標記基因座存在與否的核酸序列或分子,例如與標記基因座序列互補的核酸分子探針。包含標記基因座的30個或更多連續的核苷酸(“全部或部分”標記基因座序列)的標記探針可用于核酸雜交。作為另外一種選擇,在某些方面標記探針指能夠區別(即基因型)存在于標記基因座上的特定等位基因的任何類型的探針。當核酸在溶液中特異性“雜交”或配對時,例如根據Watson-Crick堿基配對原則雜交,核酸是“互補的”。

如上所述,當鑒定連鎖基因座時,術語“分子標記”可用于指遺傳標記,或其用作參照點的編碼產物(例如,蛋白質)。標記能夠來源于基因組?核苷酸序列或表達的核苷酸序列(例如來源于剪接的RNA、cDNA等),或來源于編碼的多肽。該術語也指與標記序列互補或側接標記序列的核酸序列,如用作探針或能夠擴增標記序列的引物對的核酸。“分子標記探針”是可用于通過核酸雜交鑒定標記基因座存在與否的核酸序列或分子,例如與標記基因座序列互補的核酸分子探針。作為另外一種選擇,在某些方面分子探針指能夠區別(即基因型)存在于標記基因座上的特定等位基因的任何類型的探針。當核酸在溶液中特異性“雜交”時,例如根據Watson-Crick堿基配對原則雜交,核酸是“互補的”。本文所述的一些標記當位于插入缺失區域例如本文所述的非共線區域時也稱為雜交標記。這是因為插入區域根據定義是相對無插入序列的植株的多態性。因此,所述標記僅需要指示插入缺失區域是否存在。任何合適的標記檢測技術可用于鑒定此類雜交標記,例如在本文提供的實例中使用SNP技術。

“熱帶銹病”是由病原體玉米殼銹菌(Physopella?zeae(Mains)Cummins&Ramachar)(與Angiopsora?zeae?Mains同義)引起的病害。該病害特征在于在玉米葉片上形成小的黃色圓形膿皰。這些夏孢子階段膿皰常常以小群存在并且葉片表皮層覆蓋發展中的夏孢子。倒卵球形至橢圓形的夏孢子通過在表皮層中形成的小縫或小孔釋放。雖然夏孢子是幾乎無色的,它們的釋放使得膿皰具有白色或奶油色的外觀。一些玉米基因型顯示具有較暗顏色(紅色至略帶紫色的顏色)的膿皰,其與較傳統的白色/奶油色夏孢子不同。在夏孢子階段形成后也可發展成具有水泡狀外觀的冬孢子階段。冬孢子(褐色至黑色)可在冬孢子堆內發育,所述冬孢子堆圍繞著現有的夏孢子膿皰形成。(Donald?G.White,ed.1999.Compendium?of?corn?diseases。第三版,APS?Press,ISBN?0-89054-234-1)。

“南方銹病”是由病原體多堆柄銹菌(Puccinia?polysora?Underw)引起的病害。該病害特征在于主要在葉片上表面上、但是偶爾會在葉片下表面上形成小的黃色圓形膿皰,夏孢子最常見地在靠近葉中脈處形成。這些夏孢子膿皰包含倒卵球形至橢圓形的夏孢子,其顏色通常為橙色至橙紅色。膿皰通常為圓形至橢圓形并且在葉片上非常多。這種病原體也可在穗殼、穗柄和葉鞘上形成夏孢子膿皰。已知存在冬孢子階段,在冬孢子堆中形成暗褐色至黑色的冬孢子,所述冬孢子堆存在于圍繞現有夏孢子堆的半圓至圓形內。

“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“核酸序列”和“核酸片段”可互換使用,并且指作為單鏈或雙鏈的RNA或DNA聚合物,任選含有合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。“核苷酸”是構成DNA或RNA聚合物的單體單元,它由嘌呤或嘧啶堿基、戊糖和磷酸基組成。核苷酸(通常以它們的5′-單磷酸形式存在)通過它們下述的單字母命名法指:“A”指腺苷酸或脫氧腺苷酸(分別用于RNA或DNA),“C”指胞苷酸或脫氧胞苷酸,“G”指鳥苷酸或脫氧鳥苷酸,“U”指尿苷酸,“T”指脫氧胸苷酸,“R”指嘌呤(A或G),“Y”指嘧啶(C或T),“K”指G或T,“H”指A或C或T,“I”指肌苷,“N”指任何核苷酸。

表型關系圖是基于許多特性的總體相似度、不考慮進化史或特定特性的假定顯著性來描繪生物體間的分類學關系的圖,通常由計算機產生。

術語“表型”或“表型性狀”或“性狀”指生物的一個或多個性狀。表型能夠用肉眼或者本領域已知的任何其它評價手段觀察到,例如顯微鏡法、生物化學分析、或電裝置檢測分析法。在某些情況下,表型由單個基因或基因座直接控制,即“單基因性狀”。在其它情況下,表型是若干個基因的結果。

“系統發育樹”是顯示不同生物物種或實體間的推斷進化關系的圖,所述推斷基于它們的物理和/或基因特性的相似度和差異。可使用多種方法構建它們,包括但不限于距離-矩陣法如連續法或UPGMA,它們從多重序列比對中計算遺傳距離。

基因組的“物理圖譜”是顯示染色體DNA上可辨認的界標(包括基因、標記等)的線性順序的圖譜。然而與基因圖譜相比,界標間的距離是絕對的(例如以堿基對測量的或分離的或重疊的連續基因片段)并且不基于基因重組。

“植株”可為整個植株、其任何部分、或來源于植株的細胞或組織培養物。因此,術語“植株”可指代以下任何一種材料:整個植株、植株部分或器官(例如葉片、莖、根等)、植株組織、種子、植株細胞、和/或子代的相同材料。植株細胞是從植株中獲取的細胞或來源于從植株中所獲取細胞經培養出的細胞。

“多態性”是DNA中的變型,它過于常見而不僅僅由突變產生。多態性在種群中必須具有至少1%的頻率。多態性可以是單核苷酸多態性或SNP、或插入/缺失多態性,所述插入/缺失多態性本文也稱為“插入缺失”。

“概率值”或“p值”是表型的特定組合和特定標記等位基因的存在或不存在是否隨機的統計學概率。因此,概率評分越低,表型和特性標記將共分離的可能性越大。在某些方面,認為概率評分是“顯著的”或“不顯著的”。在一些實施方案中,認為隨機分離的概率評分為0.05(p=0.05,或5%的概率)是共分離的顯著性指示。然而,可接受的概率可為小于50%(p=0.5)的任何概率。例如,顯著概率可小于0.25、小于0.20、小于0.15、小于0.1、小于0.05、小于0.01、或小于0.001。

每個“PHM”標記代表當用于擴增特定DNA片段的巢式PCR時的兩組引物(外部引物和內部引物)。一組外部引物用于第一輪PCR,之后內部序列用于對第一輪PCR的產物進行第二輪PCR。這提高了反應的特異性。本文所述的全部PHM標記在表2中列出,并且這些引物的退火溫度為55℃。

“產品標記”或“生產SNP標記”是已經為高通量目的而開發的標記。開發生產SNP標記以使用PHM標記和巢式PCR分析鑒定特定多態性(參見例如表1中的PHM1192-26-U)。設計生產SNP標記以與Invader?Plus(Third?Wave?Technologies)平臺一起使用。

“參考序列”是用作序列比對基準的限定序列。參考序列通過基因分型在該基因座的多個品系、在序列比對程序中比對核苷酸序列(例如Sequencher)、然后獲取比對的共有序列而獲得。因此,參考序列鑒定在基因座等位基因中的多態性。參考序列可以不是實際DNA序列的拷貝;然而,設計引物和探針用于基因座中的實際多態性是有用的。

術語“子代”指雜交產生的后代。

“子代植株”從兩個植株間的雜交生成。

術語“數量性狀基因座”或“QTL”指在至少一種遺傳背景下(例如在至少一個育種種群中),具有與表型性狀的差異表達關聯的DNA區域。QTL與基因或引起所討論的性狀的基因緊密連鎖。

“頂交測試”是用來源于每個親本與相同測試者(通常是純合品系)雜交的子代進行的測試。測試親本可為自由授粉的品種、雜交品系或自交系。

短語“在嚴格條件下”指在該條件下探針或多核苷酸將與特定核酸序列雜交,雜交通常在核酸混合物中進行,但是基本上無其它序列。嚴格條件是序列依賴性的并將因不同的環境而異。

標記的“不利等位基因”是與不利植株表型共分離的標記等位基因,因此提供鑒定能從育種程序或栽培中移除的植株的有益效果。

較長序列具體地在較高溫度下雜交。特定序列在限定離子強度、pH的情況下,嚴格條件通常選擇比熱解鏈溫度(Tm)低約3-5℃。Tm是(在限定離子強度、pH和核酸濃度的情況下)50%與靶互補的探針平衡雜交到靶序列上(因為存在的靶序列過多,在Tm?50%的探針被平衡占用)的溫度。嚴格條件將是如下那些條件:在pH為7.0-8.3下鹽濃度低于約1.0M鈉離子,通常約0.01-1.0M鈉離子濃度(或其它鹽),并且對于短探針(例如10-50個核苷酸)溫度為至少約30℃,而對于長的探針(例如多于50個核苷酸)溫度為至少約60℃。嚴格條件也可以通過加入諸如甲酰胺之類的去穩定劑來實現。就選擇性雜交或特異性雜交而言,陽性信號是至少兩倍于背景,優選10倍于背景雜交。示例性的嚴格雜交條件通常是:50%的甲酰胺,5x?SSC,和1%的SDS,在42℃下孵育,或者5x?SSC,1%的SDS,在65℃下孵育,并用0.2x?SSC以及0.1%的SDS在65℃下洗滌。就PCR而言,約36℃的溫度是典型的低嚴格擴增,而退火溫度取決于引物長度,其可介于約50℃和65℃之間。決定雜交參數的附加準則在多個參考文獻中被提供。

序列比對和百分比同一性可用設計用于檢測同源序列的多種比較方法來測定,這些方法包括但不限于LASERGENE生物信息計算包(DNASTARInc.,Madison,WI)的MEGALIGN程序。除非另行指出,本文提供的序列的多重比對用Clustal?V比對方法(Higgins和Sharp,CABIOS.5:151-153(1989))采用默認參數(空位罰分=10,空位長度罰分=10)執行。成對比對和使用Clustal?V方法的蛋白序列百分比同一性計算的默認參數是KTUPLE=1,空位罰分=3,窗=5,DIAGONALS?SAVED=5。就?核酸而言,這些參數為KTUPLE=2,空位罰分=5,窗=4,DIAGONALSSAVED=4。在使用Clustal?V程序的序列比對后,觀看相同程序上的“序列距離”表可能獲得“百分比同一性”和“趨異度”值;除非另行指出,本文提供的和申明的百分比同一性和趨異度是以該方式計算。

“Clustal?V序列比對方法”對應于Clustal?V標記的比對方法(描述于Higgins?and?Sharp,CABIOS.5:151-153(1989);Higgins,D.G.等人(1992)Comput.Appl.Biosci.8:189-191)并存在于LASERGENE生物信息計算包(DNASTAR?Inc.,Madison,WI)的MegAlignTM程序中。對于多重比對,默認參數對應于空位罰分=10和空位長度罰分=10。成對比對和使用Clustal?V方法的蛋白序列百分比同一性計算的默認參數是KTUPLE=1,空位罰分=3,窗=5,DIAGONALS?SAVED=5。就核酸而言,這些參數是KTUPLE=2,空位罰分=5,窗=4,DIAGONALS?SAVED=4。在使用Clustal?V程序的序列比對后,觀看相同程序中的“序列距離”表可能獲得“百分比同一性”值。

本文使用的標準重組DNA和分子克隆技術是本領域所熟知的并且在如下文獻中有更全面的描述:Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.“Molecular?Cloning:A?Laboratory?Manual”;Cold?Spring?Harbor?Laboratory?Press:Cold?Spring?Harbor,1989(下文稱為“Sambrook”)。

在詳述本發明之前,應當了解本發明不受特定實施方案的限制。也應當了解本文所用的術語僅是為了描述特定實施方案,而不旨在進行限制。當在本文和所附權利要求中使用時,除非內容清楚地表明,單數和單數形式的術語包括復數指代。因此,例如術語“一個植株”也包括多個植株;取決于上下文,使用的術語“植株”也可包括該植株遺傳相似或相同的子代;使用的術語“核酸”任選地包括該核酸分子的多個拷貝。

熱帶銹病抗性

熱帶銹病是由病原體玉米殼銹菌(Physopella?zeae)引起的玉米真菌病害。與熱帶銹病抗性相關聯的分子標記和等位基因的鑒定僅基于子代的基因組成進行選擇。本文提供了通過評價基因組成(使用分子標記和它們的等位基因進行評價)鑒定并選擇具有增強熱帶銹病抗性的玉米植株的方法。

基因作圖

在相當一段時間內已經認識到生物基因組中與特定表型如熱帶銹病抗性相關聯的特定基因座可進行基因作圖。有利的是,植株育種人員可使用分子標記通過鑒定標記等位基因鑒定期望的個體,所述標記等位基因顯示與期望表型共分離的統計意義上顯著的概率,表現為連鎖不平衡。通過鑒定與受關注性狀共分離的分子標記或分子標記簇,育種人員能夠通過選擇合適的分子標記等位基因迅速選擇期望的表型(一種稱為標記輔助選擇或MAS的方法)。育種人員也可使用此類標記通過計算機設計基因型并實施全基因組選擇。

本領域熟知的多種方法可用于檢測與定量性狀如熱帶銹病抗性共分離的分子標記或分子標記簇。這些方法的基本原理是檢測具有顯著不同平均表型的供選擇基因型(或等位基因)的標記。因此,比較標記基因座之間的供選擇基因型(或等位基因)之間的差異大小或差異顯著性水平。推斷性狀基因位于最靠近一個或多個標記的位置,所述標記與基因型差異具有最大的關聯性。

用于檢測受關注基因座的兩種此類方法是:1)基于種群的關聯分析和2)基于家譜的關聯分析(或傳統的連鎖作圖)。在基于種群的關聯分析中,從具有多個創始者(例如優良育種品系)的已有種群中獲取品系。基于種群的關聯分析依靠連鎖不平衡(LD)的弱化和以下觀點:在非結構化的種群中,在如此多代隨機交配之后,僅有控制受關注性狀的基因和與那些基因緊密連鎖的標記之間的關聯將保存下來。實際上,大多數已有種群具有種群亞結構。因此,通過把個體分配到種群中,使用得自隨機分布于基因組的標記的數據,采用結構關聯方法有助于控制種群結構,從而最小化由于單個種群(也稱為亞種群)內的種群結構帶來的不平衡。表型值與在亞群中每個品系的每個標記基因座上基因型(等位基因)進行比較。顯著的標記-性狀關聯指示標記基因座和涉及該性狀表達的一個或多個基因座極為接近。

基于家譜的關聯分析(也稱為傳統的連鎖分析)使用相同的原則;然而,LD通過從少量創始者產生種群生成。選擇創始者以最大化結構化種群內的多態性水平,并且評價多態性位點與給定表型的共分離水平。許多統計學方法已經用于鑒定顯著的標記-性狀關聯。一種此類方法是區間作圖方法(Lander和Botstein,Genetics?121:185-199(1989),其中測試沿基因圖譜?(1cM的區間)的許多位點中的每一個位點控制受關注性狀的基因位于該位點的概率。基因型/表型數據用于計算每個測試位點的LOD評分(概率比率的對數)。當LOD評分大于閾值時,存在控制受關注性狀的基因在基因圖譜上的該位點的顯著證據(它將位于兩個特定標記基因座之間)。

本發明提供證明與熱帶銹病抗性共分離的分子標記基因座,這通過傳統的關聯分析(圖3)測定。這些標記基因座或附加連鎖標記基因座的檢測可用于標記輔助的玉米育種程序以產生具有有利增強熱帶銹病抗性的植株或用于從育種程序或栽培過程中除去具有不利的熱帶銹病表型的植株。

與熱帶銹病抗性相關聯的標記

本文鑒定了與熱帶銹病抗性相關聯的標記,它們是或者與提高的(增強的)熱帶銹病抗性或者與降低的熱帶銹病抗性相關聯的標記等位基因。所述方法涉及檢測與玉米植株或種質的增強抗性相關聯的一種或多種標記等位基因的存在。玉米植株可為雜交體或自交體。

所述標記基因座可選擇本文提供的任何標記基因座,包括但不限于SNP產品標記PHM1192-26-U、PHM1192-4-U、C00435-802-U、C00436-801-U、PHM187-7-U、C00423-801-U、PHM5028-24-U、PHM13818-15-U、PHM15721-39-U、PHM15721-180-U、C00441-801-U、C00441-802-U、PHM4370-19-U、PHM731-107-U、C00071-01-U、PHM8249-21-U、C00428-801-U、PHM18427-13-U、PHM9535-10-U、PHM9535-6-U、PHM9535-7-U和PHM4003-13-U;PHM標記PHM15590、PHM13818、PHM1192、PHM187、PHM5028、PHM4370、PHM731和PHM15721;Sub2e、Sub9d、Sub19c、Sub23m、C06621-1-K2和C06621-1-K4、以及與這些標記連鎖的任何其它標記。

包含熱帶銹病抗性基因的區間的物理圖譜位置

遺傳因子或位于單個染色體上的基因組DNA的連續線性片段上的基因是物理上連鎖的。

本發明提供在染色體10區域上的分子標記基因座,所述染色體10區域由PHM15590和PHM15721定位并包括它們,從而表述了包含賦予熱帶銹病抗性的基因的區域。PHM15590位于BAC?c0497L12上,而PHM15721位于b0191E02上。能與介于以下序列之間并包括它們的連續DNA雜交并?裝配到其上的與熱帶銹病抗性相關聯的任何多核苷酸可用作熱帶銹病的標記:SEQ?ID?NO:89(PHM15590的參考序列)、或基于Clustal?V比對方法與SEQ?ID?NO:89具有95%同一性的核苷酸序列,和SEQ?ID?NO:96(PHM15721的參考序列或基于Clustal?V比對方法與SEQ?ID?NO:96具有95%同一性的核苷酸序列。這個物理區域包括本文顯示與熱帶銹病抗性性狀相關聯的標記基因座。

圖1示出定位B73BAC的物理圖譜排列,所述BAC構成介于BACc0497L12和BAC?c0352E09之間并包括它們的DNA連續片段。空位(用空白表示)本身不是DNA連續片段中的空位,而是其中基因組定位信息不完全的區域。

連鎖關系

連鎖的常見量度是性狀共分離的頻率。其能夠以共分離百分比(重組頻率)表示,或者以厘摩(cM)表示。cM是基因重組頻率的量度單位。一cM等于由于在一代中的交換導致的在一個基因座上的性狀將與在另一個基因座上的性狀分離的概率為1%(意味著性狀99%的情況下共分離)。因為染色體距離與性狀間交換事件的頻率大約成比例,有與重組頻率關聯的近似物理距離。

標記基因座本身是性狀,并且在分離期間能夠通過跟蹤標記基因座、根據標準連鎖分析進行評價。因此,一cM等于經過單代雜交的標記基因座將與在另一個基因座分離的1%的概率。

一個標記與控制受關注性狀的基因連鎖越緊密,該標記越會更有效地和更有利地成為期望性狀的指示物。緊密連鎖的基因座顯示約10%或更低,優選約9%或更低,更優選約8%或更低,更優選約7%或更低,更優選約6%或更低,更優選約5%或更低,更優選約4%或更低,更優選約3%或更低,更優選約2%或更低的基因座內交換頻率。在高度優選的實施方案中,相關基因座(例如標記基因座和靶基因座)顯示約1%或更低的重組頻率,例如約0.75%或更低,更優選約0.5%或更低,或更優選的約0.25%或更低的重組頻率。因此,所述基因座分開距離為約10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.75cM、0.5cM或0.25cM或更低。換句話說,位于相同染色體上,并且它們間的距離使得兩個基因座間?的重組發生頻率小于10%(例如約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.75%、0.5%、0.25%、或更低)的兩個基因座稱為彼此“接近”。

盡管特定標記等位基因可顯示與熱帶銹病抗性表型共分離,但重要的是注意到標記基因座不一定是負責表達熱帶銹病抗性表型的基因或QTL基因座部分。例如不需要標記多核苷酸序列是賦予熱帶銹病抗性的基因部分(例如基因開放閱讀框部分)。在祖先玉米品系中,特定標記等位基因與有利或不利熱帶銹病抗性表型的關聯是由于標記等位基因和創始等位基因之間的最初“相引”相連鎖。最后通過反復重組,標記和基因座間的交換事件能夠改變這種取向。正是因為這個原因,有利標記等位基因可根據存在于耐受性親本中的相連鎖發生改變,所述耐受性親本用于制備分離種群。這不改變可使用標記監控表型分離的事實。它僅僅改變在給定分離種群中認為哪個標記等位基因是有利的。

本文提供的標記可用于預測玉米植株中的熱帶銹病抗性性狀的狀態。這包括在任何SNP產品標記PHM1192-26-U、PHM1192-4-U、C00435-802-U、C00436-801-U、PHM187-7-U、C00423-801-U、PHM5028-24-U、PHM13818-15-U、PHM15721-39-U、PHM15721-180-U、C00441-801-U、C00441-802-U、PHM4370-19-U、PHM731-107-U、C00071-01-U、PHM8249-21-U、C00428-801-U、PHM18427-13-U、PHM9535-10-U、PHM9535-6-U、PHM9535-7-U和PHM4003-13-U;PHM標記PHM15590、PHM13818、PHM1192、PHM187、PHM5028、PHM4370、PHM731和PHM15721;以及本文鑒定的其它標記Sub2e、Sub9d、Sub19c、Sub23m、C06621-1-K2和C06621-1-K4的20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、或0.1cM內的任何標記。

染色體區間

本領域熟知的多種方法可用于鑒定染色體區間。擴展此類染色體區間的邊界以包含將與控制受關注性狀的基因連鎖的標記。換句話說,擴展染色體區間使得位于區間內的任何標記(包括限定區間邊界的末端標記)可用作熱帶銹病抗性標記。

提供了包含與熱帶銹病抗性共分離的標記的染色體區間。這些區間位于染色體10上并且可由以下標記限定并包括它們:

(i)PHM15590和PHM9535;

(ii)PHM15590和PHM15721;

(iii)C00441和c00428;

(iv)PHM731和PHM15721;或

(v)c00071和PHM731。

發現位于任何這些區間內的任何標記可用作熱帶銹病抗性的標記。

染色體區間也可通過與QTL標記連鎖(顯示與其的連鎖不平衡)的標記限定,并且r2是關聯性研究中連鎖不平衡(LD)的常見量度。例如如果在位于PHM15590和PHM9535區間內的染色體10與非常接近的另一個染色體10標記基因座之間的LD的r2值大于1/3(Ardlie等人,Nature?Reviews?Genetics?3:299-309(2002)),所述基因座是彼此連鎖不平衡的。

標記等位基因和單倍型組合

本發明的標記也可為一個或多個標記基因座上的特定等位基因的組合(即,單倍型)。下述等位基因也可用于單獨地或組合地鑒定并選擇具有增強熱帶銹病抗性的玉米植株。

本文已經鑒定了與增強熱帶銹病抗性相關聯的有利等位基因。一個此類等位基因是PHMTR(SEQ?ID?NO:155)的位點16處的“T”缺失。圖7示出通過對熱帶銹病抗性的和易感的玉米品系的基因分型獲得的部分參考序列(頂部),所述基因分型使用設計用于克隆ID?Ct9050c064G11c的PCR引物(SEQ?ID?NO:133和134)(表9)。SEQ?ID?NO:137-142示出獲取自抗性品系的擴增子,而SEQ?ID?NO:143-154示出獲取自易感品系的擴增子。用灰色突出顯示的區域示出參考序列(稱為PHMTR;SEQ?ID?NO:155)的21bp區域。在PHMTR的bp16具有T-缺失的玉米品系(用箭頭示出)都顯示對熱帶銹病的提高抗性。具有完整PHMTR區域玉米品系都顯示對熱帶銹病的敏感性。

表7和8也示出使用PHS6Y作為來源,已經成功地組合使用染色體10標記以將易感自交體轉化成抗性自交體。PHS6Y在各個標記上具有的等位?基因可組合使用(作為單倍型)以鑒定并選擇具有增強的熱帶銹病抗性的植株。

雖然與對熱帶銹病的增強抗性相關聯的單倍型可包含本文所述的任何有利等位基因(包括PHMTR的位點16處的“T”缺失和表7和8中的抗性品系PHS6Y具有的任何標記等位基因),參考序列SEQ?ID?NO:167的位點337-339處的“GAG”單倍型顯示與增強的熱帶銹病抗性相關聯并可用于標記輔助選擇程序以選擇具有增強的熱帶銹病抗性的玉米植株。

技術人員將期望可能存在附加的多態性位點,所述位點位于本文鑒定的染色體10標記內部的及其周圍的標記基因座上,其中一個或多個多態性位點與單倍型的一個或多個多態性位點上的等位基因連鎖不平衡(LD)。在不同多態性位點上的兩個特定等位基因據稱是LD,如果在其中一個位點上存在等位基因,則易于推測相同染色體上的其它位點上存在等位基因(Stevens,Mol.Diag.4:309-17(1999))。

技術人員將理解一個種質庫的等位基因頻率(以及由此的單倍型頻率)可能與另一個種質庫的等位基因頻率不同。種質庫的不同是由于成熟度差異、雜種優勢群、地理分布等。因此,SNP和其它多態性在一些種質庫中可能不會提供信息。

標記輔助選擇

分子標記可用于多種植株育種應用(如參見Staub等人(1996)Hortscience?31:729-741;Tanksley(1983)Plant?Molecular?Biology?Reporter.1:3-8)。受關注的主要領域之一是使用標記輔助選擇(MAS)增加回交和基因滲入的效率。顯示與影響期望表型性狀的基因座連鎖的分子標記提供了選擇植株種群中的性狀的有用工具。在其中表型難以測定的情況下(例如多種抗病害性狀)或者在植株發育晚期階段發生的情況下(例如核的特性)尤其如此。因為DNA標記測定更省力并且占用的物理空間比田間表型更少,可測定大得多的種群,提高了找到靶片段從供體品系轉移到受體品系的重組的概率。連鎖越緊密,標記越有用,因為重組在標記和引起性狀的基因間發生的可能性較小,這可導致假陽性。具有側接標記降低了假陽性選擇將發生的概率,因為這將需要雙重組事件。理想的情況是基因自身具有一個標記以便在標記和基因間不能發生重組。此類標記稱為‘完美標記’。

當基因通過MAS滲入時,不僅引入基因而且引入側接區域(Gepts.(2002).Crop?Sci;42:1780-1790)。這將稱為“連鎖累贅”。在該情況下其中供體植株與受體植株高度不連鎖,這些側接區域攜帶可能編碼農學上不可取性狀的附加基因。這種“連鎖累贅”甚至在多輪回交到優良玉米品系后也可能導致產量降低或其它不良農學特性。有時這也稱為“產量抑制”。側接區域的大小可通過附加的回交減小,但是這不總是成功的,因為育種人員無法控制重組斷點的區域大小(Young等人(1998)Genetics?120:579-585)。在經典的育種中這通常僅僅是偶然現象:選擇的重組有助于減小供體片段的大小(Tanksley等人(1989).Biotechnology?7:257-264)。甚至在20輪這種類型的回交后,技術人員可期望找到仍舊與選擇基因連鎖的供體染色體的相當大的片段。然而關于標記,選擇那些經歷過接近受關注基因的重組的罕見個體是可能的。在150個回交植株中,基于單一減數分裂圖譜距離,至少一個植株將已經發生過基因1cM內的雜交的概率為95%。標記將允許這些個體的明確鑒定。在一次附加回交的300個植株中,在所述基因另一側的1cM單一減數分裂圖譜距離內發生雜交的概率將為95%,生成圍繞基于單一減數分裂圖譜距離小于2cM的目標基因的片段。使用標記這可在兩代中完成,而不使用標記它將需要平均100代來完成(參見Tanksley等人,同上)。當已知基因的確切位置時,可利用圍繞該基因的一系列側接標記選擇不同種群規模的重組。例如,在較小的種群規模中,可期望重組遠離該基因,這樣將需要較多的遠端側接標記來檢測重組。

包含增強密度的公開玉米標記的玉米基因組整合連鎖圖譜的可用性促進了玉米基因作圖和MAS。參見如IBM2?Neighbors圖譜,該圖譜可在MaizeGDB網站上在線獲取。

MAS具體實施的關鍵部分為:(i)限定種群,在該種群中將確定標記-性狀關聯,該種群可以是分離種群、或隨機或結構化種群;(ii)監控相對于性狀的多態性標記的分離或關聯,并且使用統計方法確定連鎖或關聯;(iii)基于統計分析的結果限定一組所期望的標記,以及(iv)將該信息用于和/或外推出當前組育種種質,使基于標記的選擇決定得以作出。在這個公開中描述的標記以及其它標記類型如SSR和FLP可用于標記輔助選擇規程。

可將SSR定義為串聯重復DNA的相對短的片段,其長度為6bp或更少(Tautz(1989)Nucleic?Acid?Research?17:6463-6471;Wang等人(1994)Theoretical?and?Applied?Genetics,88:1-6)多態性由多個重復單位的變異引起,可能由DNA復制期間的滑動引起(Levinson和Gutman(1987)Mol?Biol?Evol4:203-221)。重復長度中的變異可通過設計保守非重復側接區域的PCR引物進行檢測(Weber和May(1989)Am?J?Hum?Genet.44:388-396)。SSR非常適于作圖和MAS,因為它們是多等位基因的、共顯性的、可再現的并適于高通量自動化(Rafalski等人(1996)Generating?and?using?DNA?markers?in?plants.In:Non-mammalian?genomic?analysis:a?practical?guide.Academic?press,第75-135頁)。

可生成多種類型的SSR標記,并且來自抗性品系的SSR特征可通過擴增產物的凝膠電泳獲得。基于擴增片段的尺寸給標記基因型評分。玉米的SSR服務可根據合同由DNA?Landmarks?in?Saint-Jean-sur-Richelieu,Quebec,Canada提供。

也可生產多種類型的FLP標記。最常見的是擴增引物用于生成片段長度多態性。此類FLP標記在多個方面類似于SSR標記,不同的是通過引物擴增的區域通常不是高度重復的區域。此外擴增區域或擴增子在種質中將具有足夠的可變性,這通常是由于插入或缺失,使得可在多態性個體中識別出通過擴增引物生成的片段,并且已知此類插入缺失在玉米中頻繁發生(Bhattramakki等人(2002).Plant?Mol?Biol?48,539-547;Rafalski(2002b),同上文)。

SNP標記檢測單堿基對核苷酸取代。在全部分子標記類型中,SNP是最豐富的,因此具有提供最高的基因圖譜分辨率的潛力(Bhattramakki等人,2002?Plant?Molecular?Biology?48:539-547)。SNP可在甚至比SSR更高的通量水平上以所謂的‘超高-通量’模式進行測定,因為它們不需要大量DNA并且測定的自動化可為直接的。SNP也具有成為相對低成本系統的潛力。這三個因素一起使得SNP在MAS的應用具有高度的吸引力。多個方法可用于SNP基因分型,包括但不限于雜交、引物延伸、寡核苷酸連接、核酸酶裂解、微測序和球形編碼。此類方法已在以下文獻中描述:Gut(2001)Hum?Mutat?17,第475-492頁;Shi(2001)Clin?Chem?47,第164-?172頁;Kwok(2000)Pharmacogenomics?1,第95-100頁;Bhattramakki和Rafalski(2001)Discovery?and?application?of?single?nucleotide?polymorphism?markers?in?plants.In:R.J.Henry,Ed,Plant?Genotyping:The?DNA?Fingerprinting?of?Plants,CABI?Publishing,Wallingford。多種可商購獲得的技術利用這些方法和其它方法檢查SNP,包括Masscode.TM.(Qiagen),Invader.RTM.(Third?Wave?Technologies),SnapShot.RTM.(Applied?Biosystems),Taqman.RTM.(Applied?Biosystems),Kbioscience的KASPar測定法和Beadarrays.TM.(Illumina)。

在序列內或跨越連鎖序列的許多SNP可一起用于描述任何特定基因型的單倍型(Ching等人(2002),BMC?Genet.3:19pp?Gupta等人,2001,Rafalski(2002b),Plant?Science?162:329-333)。單倍型可提供比單個SNP更多的信息并且可更多地描述任何特定的基因型。例如單個SNP可為特定品系的等位基因‘T’或具有增強的熱帶銹病抗性的品種,但是等位基因‘T’也可發生在輪回親本利用的玉米育種種群中。在這種情況下,一個單倍型例如一系列位于連鎖SNP標記上的等位基因可提供較多的信息。一旦一個獨特的單倍型已經被轉讓給供體的染色體區域,該單倍型可在那個種群或其任何亞群中使用以測定個體是否具有特定基因。參見例如WO2003054229。使用本領域普通技術人員已知的自動化高通量標記檢測平臺使得這種方法高度有效率并有效。

表2列出的多個引物可容易地用作FLP標記以選擇在控制熱帶銹病抗性的染色體10上的基因座或QTL,這歸因于插入/缺失多態性的存在。這些引物也可用于將這些標記轉化成SNP或其它結構上類似的或功能上等同的標記(SSR、CAP、插入缺失等),它們處于相同區域內。Rafalski(2002a)Current?opinion?in?plant?biology?5(2):94-100和Rafalski(2002b)Plant?Science?162:329-333描述了一個非常有效的SNP轉化方法。使用PCR,所述引物用于擴增來自個體(優選自交體)的DNA片段,所述個體提供了受關注種群中的多樣性。PCR產物直接在一個或兩個方向上進行測序。所得序列進行比對并且鑒定多態性。所述多態性不限于單核苷酸多態性(SNP),而是也包括插入缺失、CAP、SSR和VNTR(可變數量的串聯重復序列)。具體地,針對本文所述的精細圖譜信息,技術人員能夠?通過這一公開中列出的引物輕易地使用本文提供的信息獲得在擴增區域內的附加多態性SNP(以及其它標記)。在所述圖譜區域內的標記可雜交到BAC或其它基因組文庫上或者與基因組序列進行電子比對以找到在與所述標記相同的近似位置上的新序列。

除了如上所述的SSR、FLP和SNP以外,其它類型的分子標記也廣泛使用,包括但不限于表達序列標簽(EST)、來源于EST序列的SSR標記、隨機擴增多態性DNA(RAPD)和其它基于核酸的標記。

在一些情況下,同功酶特征和連鎖的形態學特性也可間接用作標記。即使它們不直接檢測DNA差異,它們常受特定基因差異的影響。然而,檢測DNA變異的標記比同功酶或形態學標記的數量和形態要多的多(Tanksley(1983)Plant?Molecular?Biology?Reporter?1:3-8)。

序列比對或重疊群也可用于尋找本文列出的特定標記的序列上游或下游。這些新序列接近本文所述的標記,它們然后用于發現并開發功能上等同的標記。例如,不同的物理和/或基因圖譜與本公開內未描述但位于相似區域內的位置等同標記進行比對。這些圖譜可位于玉米物種內,或者甚至位于已經與玉米基因上或物理上比對的其它物種內,例如稻、小麥、大麥或高粱。

MAS通常使用多態性標記,所述標記已經被鑒定為具有與熱帶銹病抗性共分離的顯著可能性的標記。推測此類標記在圖譜上接近產生植株熱帶銹病抗性表型的一個或多個基因,并且認為此類標記是期望性狀的指示或標記。測試植株是否在標記中存在期望的等位基因,并且期望在一個或多個基因座上包含期望基因型的植株將期望基因型與期望表型一起轉移到它們的子代。

本文提供的標記和區間在MAS中用于選擇展示增強的熱帶銹病抗性的植株。

選擇方法可涉及檢測在玉米植株或種質中是否存在鑒定的標記等位基因或者與鑒定的標記等位基因連鎖并相關聯的未知標記等位基因、然后基于檢測的等位基因選擇玉米植株或種質。本文鑒定的能在MAS中檢測到的有利等位基因包括:PHMTR的位點16處的“T”缺失和表7和8中任何通過PHS6Y具有的標記等位基因。此外,有利的單倍型如在參考序列SEQ?ID??NO:167的337-339位點處的“GAG”單倍型也可用于MAS以將增強的熱帶銹病抗性導入易感玉米品系或品種。

MAS在玉米的增強熱帶銹病抗性中的用途

玉米植株育種人員期望所需基因座的組合,例如那些與增強的熱帶銹病抗性相關聯的標記等位基因與高產量以及其它期望性狀的基因的組合以開發改善的玉米品種。通過非分子方法(例如玉米植株性狀評價)篩選大量樣品可能是昂貴的、耗時的、并且不可靠的。當與熱帶銹病抗性基因座基因連鎖時,使用本文所述的多態性標記提供在育種程序中選擇具有增強的熱帶銹病抗性的有效方法。例如標記輔助選擇對田間評價具有增強的熱帶銹病抗性的選擇植株的一個優點是MAS能夠在一年中的任何時間進行,不受生長季節的限制。此外環境效應很大程度上與標記輔助選擇無關。

MAS在植株育種中的另一個用途是輔助通過回交育種恢復輪回親本基因型。回交育種是將子代與其它的其中一個親本或親本品系回交的方法。回交通常用于將來自供體親本(例如包含增強的熱帶銹病抗性標記基因座的親本)的一個或一些基因座滲入來自輪回親本(例如另外的高產量玉米品系)的其它期望的遺傳背景中。回交進行的次數越多,輪回親本對所得滲入品種的遺傳貢獻越大。這常常是必需的,因為植株否則可為非期望的,例如因為低產量、低結實率等。與之相反,品種是多次育種程序的結果,它可具有優異的產量、結實率等,僅僅缺乏一個期望性狀如熱帶銹病抗性。

MAS能夠提高滲入或回交的效率,上述嘗試目的在于將增強的熱帶銹病抗性導入期望的(通常高產量)背景。在特定標記的標記輔助回交中,例如從供體來源回交到優良的或外來的遺傳背景,技術人員在回交子代中選擇供體性狀,然后重復回交到優良的或外來的品系以重構盡可能多的優良/外來背景的基因組。

多階段集群方法

可使用多階段集群方法以指導非隨機變異的引物設計。這種方法使用系統發育樹和連續比對方法以鑒定包含具有期望性狀的品系獨有的等位基因變異的獨特區域。如果BAC集合中的任何給定序列包含將連鎖性狀的DNA中的變異,這個變異可被相同BAC內的其它獨立的和隨機的變異遮蔽/混淆,因此單一比對在目標變異的檢測中可能無效。這個方法的第一階段涉及?比對開放:延伸代價比大于10的原始序列。第二階段包括修剪尾部(噪音)并再比對原始序列,其集群將已經指示BAC包含受關注區域的可能性。隨后的階段由隨機等位基因變異的上游或下游修剪組成,即,序列內的等位基因顯示跨任何表型的多樣性。然后可將UPGMA(非加權配對組算數平均法,Unweighted?Pair?Group?Method?with?Arithmetic?Mean)應用于所得比對直至表型關系圖鑒定具有期望性狀或表型的品系獨有的集群。然后最終的集群可用于鑒定將用于引物設計以生成性狀特異性標記的特定變異。

實施例

以下實施例用于示出但不限于所附權利要求。應當理解本文所述的實施例和實施方案僅用于例證性的目的,并且本領域的技術人員將認識到在不脫離本發明精神或所附權利要求范圍的情況下可改變多種試劑或參數。

實施例1

對熱帶銹病和南方銹病增強抗性的表型評價

玉米植株在田間用玉米殼銹菌(Physopella?zeae)接種以誘發熱帶銹病癥狀。在V10期開始時進行三次接種(每次接種用~500,000孢子每毫升至每公頃總體積為200升)。

基于Itumbiara,Brazil的田間天然感染病癥評價玉米植株對南方銹病的增強抗性(病原體多堆柄銹菌(Puccinia?polysora))。

熱帶銹病從植株頂部向植株底部發展,而南方銹病從植株頂部向頂部發展。因此,在相同植株中,可能既觀察到熱帶銹病的癥狀,又觀察到南方銹病的癥狀。

使用兩個系統給田間的R2期(大約在授粉時期后20天)植株評分。第一個系統為標度1至9,其中1=最易感的,并且9=最有抗性的,而第二個系統對應于銹菌的修改國際標準標度(Modified?International?Standard?Scale?for?Rust)(表4)。

表4:熱帶銹病和南方銹病的評分標度

實施例2

PHS6Y自交種群的開發

使用家譜選擇方案在巴西的Itumbiara?Research?Center開發PHS6Y。從來自PH7W3和CML339間的雜交的F2代中選擇單個穗。CML339(Makumbi等人,Combining?Ability?and?Heterosis?in?Tropical?Maize?Inbreds?under?Stress?and?Optimal?Conditions.The?ASA-CSSA-SSSA?International?Annual??Meetings(2005年11月6-10日),Salt?Lake?City,UT.2005)是具有增強的熱帶銹病抗性的品系,其獲取自International?Maize?and?Wheat?Improvement?center(CIMMYT)。每個選擇的F2穗在下一代種植成F3排。然后種植來自下一代的每個選擇F3排的三個穗,并且選擇最好的F4排并將種子稱為PHS6Y自交體種子。全部選擇基于熱帶銹病抗性表型進行。

實施例3

熱帶銹病抗性的分離指示單個顯性基因負責賦予熱帶銹病抗性

從易感熱帶銹病的自交體PH468和在實施例2中鑒定的自交體PHS6Y間的雜交中開發一個F2種群。圖2A和2B分別示出了顯示PH468x?PHS6YF2種群中個體的熱帶銹病和南方銹病評分的頻率分布。每個分布指示3個抗性的分離比率(在1-9的標度上評分≥為5):1易感的(評分<5,評分標度1-9),熱帶銹病(圖2A)和南方銹病(圖2B)。

表5示出卡方測試,該測試提供賦予熱帶銹病抗性的單個顯性基因存在的證據,其中在PHS6Y自交體中存在有利基因型。結果也顯示單個顯性基因賦予南方銹病抗性。然而,基于兩個F2種群(其中PHS6Y是親本)中熱帶銹病和南方銹病抗性間的基因重組頻率,熱帶銹病和南方銹病賦予抗性的基因似乎是不同的(表6)。

表5:

PH468xPHS6Y?F2種群的卡方測試結果

表6示出具有PHS6Y的兩個F2種群中的熱帶銹病和南方銹病抗性間的基因重組頻率。對照物是另一個F2種群,其中熱帶銹病和南方銹病性狀也是分離的,但是以一種獨立的方式分離。

表6:

具有作為親本的PHS6Y的兩個F2種群中的熱帶銹病和南方銹病抗性間的基因重組

468=PH468;S6Y=PHS6Y;467=PH467

實施例4

混合區間作圖

使用將區間作圖與線性回歸相結合的混合區間作圖方法鑒定玉米染色體區間和與熱帶銹病抗性相關聯的標記。在區間作圖方法中(Lander和Botstein,Genetics?121:185-199(1989)),測試沿基因圖譜(1cM的區間)的許多位點中的每一個位點上基因或控制受關注性狀的QTL位于該位點的概率。基因型/表型數據用于計算每個測試位點的LOD評分(概率比率的對數)。當LOD評分大于閾值(本文閾值為2.5)時,存在基因或QTL位點位于基因圖譜上的該位點上的顯著證據(它將位于兩個特定標記基因座之間)。

使用Windows?QTL?Cartographer(該軟件的最新版本被用于QTL作圖)進行混合區間作圖。根據標準QTL作圖程序預測基因組的LOD評分(優勢對數比率)。

圖3示出使用PH468x?PHS6Y?F2種群的熱帶銹病抗性的混合區間作圖結果。混合區間作圖分析檢測位于C00441-801和C00428-801標記之間的染色體10(圖3)上的強效應QTL。用于混合區間作圖的連鎖圖譜是內源的?專有基因圖譜(本文稱為“PHB”),其基因距離對應于單個減數分裂的重組部分。在x軸上的標記位點對應于PHB基因圖譜。y軸代表LOD評分。

實施例5

來自PHS6Y的熱帶銹病抗性基因座回交到易感自交系中

選擇熱帶銹病抗性自交系PHS6Y作為回交程序的供體親本。這個自交系在包含熱帶銹病基因的染色體10片段內攜帶有利的等位基因。在初始回交程序中,選擇四個自交系(PH9VF、PHDGA、PH467和PH0TJ)用來自PHS6Y的熱帶銹病抗性基因座轉化。

每個自交系(PH9VF、PHDGA、PH467和PH0TJ)均與PHS6Y雜交。在獲得每個雜交的F1種子后,隨后進行五次回交,其中易感的親本用作輪回親本。評價一年兩代以加速該過程,一個位于巴西北方的Balsas?Winter?Nursery,另一個位于Itumbiara?Research?Center。在第一次回交中,僅僅在Itumbiara中心進行表型選擇。在隨后的回交中,進行標記輔助選擇。回交過程后進行兩代自交以固定每個自交體中的抗性等位基因。

在轉化每個自交體的過程中使用三個至六個標記(表7)。所述標記在回交2(BC2)代至BC4代中使用,以及用于鑒定BC4F2上攜帶抗性等位基因的純合植株。

表7示出用于將來自PHS6Y的抗性基因座滲入自交體PH9VF、PHDGA、PH467和PH0TJ的染色體10上的標記,以及各個易感自交體和PHS6Y之間的多態性。

轉化其它自交體以具有來自PHS6Y的熱帶銹病抗性基因座。如上所述進行相似的轉化,不同的是轉化使用較多的標記。表8示出用于將來自PHS6Y的抗性基因座滲入18個自交體的染色體10上的標記以及各個易感自交體和PHS6Y之間的多態性。

表7:

用于四個自交體轉化的染色體10標記

1=“A”,2=“C”,3=“G”,4=“T”,5=“I”或插入,6=“D”或缺失

表8:

用于八個自交體轉化的染色體10標記

1=“A”,2=“C”,3=“G”,4=“T”,5=“I”或插入,6=“D”或缺失

實施例6

制備具有增強的熱帶銹病抗性的雜交體

轉化過的自交體用于制備雜交體,并且田間試驗結果已經顯示在轉化過的自交體中具有優異水平的抗性(例如圖4),該水平在用轉化自交體制備的雜交體中保持(圖5;例如雜交GEID6170295)。

實施例7

基因分型具有熱帶銹病抗性的玉米品系并鑒定與增強熱帶銹病抗性相關聯的多態性

基因分型具有熱帶銹病抗性的玉米品系

通過目標基因組的Sanger再測序基因分型抗性品系和易感品系。所述目標是來自熱帶銹病QTL區域的單拷貝基因組片段的PCR擴增產物,所述QTL區域在圖譜上位于染色體10的短臂上。

公開可用的基因組序列用作引物設計的參考。公開序列對應于自交系B73并通過BAC最少覆蓋途徑方法(在Maize?Genome?Browser上可用,它在因特網上是公開可用的)。以下定位BAC的克隆已經對受關注的區域作圖:c0497l12、c0284b01、c0446l10、c0340m14、c0178k23、c0332e10、c0009k11、c0281e11、c0230k24、b0286c12、c0044b04、c0149n21、c0064g11、c0118o03、b0191e02、c0462j05。而在覆蓋途徑中的BAC的順序和取向已經通過指紋法進行測定(Nelson等人,2005.Whole-Genome?Validation?of?High-Information-Content?Fingerprinting.Plant?Physiology.139:27-38),在每個克隆內的序列重疊群的順序和取向尚未被完全測定。對于這個工作,使用BAC重疊的內部信息進一步將2-2.5Mb區域的序列順序縮小至24個子區域(圖6)。

所述序列包括大部分高度重復的DNA,大多數是反轉錄轉座子樣序列。使用Cross-match(http://www.phrap.org),通過遮蔽重復序列從該序列中鑒定并移除多拷貝序列路徑。通過BLAST分析進一步鑒定并移除低拷貝序列。

PCR引物初始設計用于擴增在單拷貝路徑的270-720-bp的擴增子,所述路徑跨越染色體10目標區域內的24個子區域(表9)。使用專有工具基于Primer3(Rozen,S.和Skaletsky,2000,Primer3?on?the?WWW?for?general?users?and?forbiologist?programmers,Methods?Mol?Biol.132:365-386.)設計引物組。分別將測序引物M13R(5-GGAAACAGCTATGACCATG)和M13F(5-TGTAAAACGACGGCCAGT)加到L和R引物上作為尾部以利于測序。PCR測定的質量和唯一性通過進行并分析預備PCR以及對來自品系B73和Mo17的對照DNA樣品的測序進行驗證。玉米-燕麥添加品系擴增用于進一步驗證測定。棄去在多個添加品系中產生擴增產物或僅在染色體10玉米-燕麥添加品系中不產生擴增產物的PCR引物。

表9:

設計用于擴增染色體10目標區域中的產物的PCR引物

使用HotStar?Taq?Polymerase?Master?Mix(Qiagen),根據制造商的推薦,采用一些修改對10-30ng?DNA進行PCR。總反應體積為10μl并且包含5U?HotStar?Taq?DNA聚合酶,1.5mM?MgCl2,200μM?dNTP和5pM各種加尾引物。如下進行PCR擴增:1)在95℃下進行15-分鐘的初始步驟;2)40個如下循環:95℃30秒,60℃30秒,72℃下1分鐘;以及3)在72℃下進行10分鐘的最終延伸步驟。通過凝膠電泳確認PCR產物。PCR反應產物的五分之一(2μl)在17μl無菌蒸餾水中稀釋并用0.5-0.75μl?ExoSAP-IT(USB?Corporation)清潔,在37℃下孵育25分鐘,然后在80℃下孵育25分鐘。

PCR擴增子的雙向循環測序使用Big?Dye?Terminator循環測序規程進行,并且毛細管測序在Applied?Biosystems?3730XL?DNA分析儀中進行。3-5μl清潔DNA使用M13F和M13R寡核苷酸和BigDye?Prism測序試劑盒(ABI;version?3.1),根據制造商的條件進行測序。在測序循環后,反應產物通過乙醇沉淀進行清潔并在ABI3730xl自動測序儀(ABI)上根據標準規程進行處理。

使用基于Phrap,Phred軟件的內部工具裝配序列(Ewing等人,1998,Basecalling?of?automated?sequencer?traces?using?phred.I.Accuracy?assessment.Genome?Research.8:175-185;Ewing?and?Green,1998,Basecalling?of?automated?sequencer?traces?using?phred.II.Error?probabilities.Genome?Research.8:186-194)。使用Consed?sequence?viewer鑒定并標記多態性(單核苷酸和插入-缺失)(Gordon,2003,Viewing?and?Editing?Assembled?Sequences?Using?Consed,in?Current?Protocols?in?Bioinformatics,A.D.Baxevanis和D.B.Davison(eds),New?York:John?Wiley&Co.,2004,11.2.1-11.2.43)。生成的SNP表、裝配組和共有序列用于選擇合適的多態性以開發標記。

鑒定與增強的熱帶銹病抗性相關聯的多態性

具有高水平的內部多樣性的DNA片段比較可能包含受關注的基因。然而,在這些區域中設計引物可能是困難的,因為引物設計應用具有選擇隨機變異用于引物設計的趨勢。測試多階段集群方法以指導非隨機變異的引物設計。這種方法使用系統發育樹和連續比對方法以鑒定包含具有增強的熱帶銹病抗性的品系獨有的等位基因變異的獨特區域。這個方法的第一階段涉及比對開放:延伸代價比大于10的原始序列。第二階段包括修剪尾部(噪音)。隨后的階段由隨機等位基因變異的修剪組成,即,序列內的等位基因顯示跨任何表型的多樣性。然后可將UPGMA(非加權配對組算數平均法,Unweighted?Pair?Group?Method?with?Arithmetic?Mean)應用于所得比對直至表型關系圖鑒定抗性品系獨有的集群。

一個引物對(SEQ?ID?NO:133和SEQ?ID?NO:134)產生一個擴增子,其具有參考序列(SEQ?ID?NO:155),該序列本文稱為PHMTR。顯示熱帶銹病抗性的全部品系包含PHMTR的16bp?T-缺失(PHMTR-T區域的序列是?SEQ?ID?NO:156),而全部易感熱帶銹病的玉米品系包含完整的PHMTR區域(SEQ?ID?NO:155)。

圖7示出通過對熱帶銹病抗性的和易感的玉米品系的基因分型獲得的部分參考序列(頂部),所述基因分型使用設計用于克隆IDCt9050c064G11c的PCR引物(SEQ?ID?NO:133和134)(表9)。SEQ?ID?NO:137-142示出獲取自抗性品系的擴增子,而SEQ?ID?NO:143-154示出獲取自易感品系的擴增子。用灰色突出顯示的區域示出參考序列(SEQ?ID?NO:155)的21bp區域。

擴增子序列也使用引物SEQ?ID?NO:135和SEQ?ID?NO:136(SEQ?ID?NO:167是這個區域的參考系列)以及八個獨立的集獲得。表10示出評價集分析的21個品系。發現GAG單倍型(參考序列SEQ?ID?NO:167的位點337-339上;參見圖8)是全部具有增強熱帶銹病抗性的品系獨有的(表10和圖8)。開發兩個新的存在/缺失標記,使用kbioscience網站上所述的KASPar測定技術測定這個單倍型,所述存在/缺失標記是C06621-1-K2和C06621-1-K4(表3;SEQ?ID?NO:157-164)。C06621-1-K2和C06621-1-K4是X/P型標記,其中X指示缺失而P指示存在。P標記檢測GAG多態性而X標記檢測ADH(一個內部對照基因,它用于顯示反應進行)。用C06621-1-K2和C06621-1-K4標記評價十八個品系。進行集分析的全部品系符合兩個標記的期望(除了一個具有缺失數據的樣品外)。

表10:

具有增強熱帶銹病抗性的品系中的專用單倍型

多階段集群方法證明是用于鑒定包含具有增強的熱帶銹病抗性的品系獨有的等位基因變異的獨特區域的有效方法,并且這個方法可應用于受關注的任何性狀。

實施例8

在標記輔助選擇具有增強熱帶銹病抗性的玉米植株中使用的標記和/或單部型

一組常見標記可用于輔助可用于選擇具有增強熱帶銹病抗性的玉米植株的其它標記的鑒定。表11顯示本文鑒定的標記,所述標記限定包含賦予熱帶銹病抗性的基因的區間。標記在物理圖譜順序上(如圖1所示)。也顯示了在PHB內部來源的圖譜(基于單一減數分裂)和IBM2?neighbors基因圖譜(高分辨率B73/Mo17基因圖譜)上的標記位點。

表11:

PHB圖譜和IBM2Neighbors圖譜上的分子標記位點

na=不適用

側接受關注基因座的緊密連鎖標記可有效地用于選擇具有增強的熱帶銹病抗性的子代植株,所述基因座具有與在該基因座處的抗性等位基因連鎖不平衡的等位基因。因此,本文所述的標記如表11中列出的那些、以及與相同染色體片段基因上或物理上連鎖的其它標記可用于選擇具有增強熱帶銹病抗性的玉米植株。通常將使用在基因上的側接區域中的一組這些標記(例如2個或更多個,3個或更多個,4個或更多個,5個或更多個)并在基因下?的側接區域中使用相似的一組標記。任選地也可使用在實際基因和/或基因座內的標記。篩選親本和它們的子代的這些標記組,并且兩個親本間的多態性標記被用于選擇。最接近基因或基因座的多態性標記用于選擇基因或基因座,并且較遠端的多態性標記用于反選基因或基因座。在一個滲入程序中,這允許選擇在較接近多態性標記上的基因或基因座基因型以及選擇在較遠端多態性標記上的輪回親本基因型。

單倍型或等位基因的組合也可用于選擇育種程序中的植株。單倍型可提供比單個多態性更多的信息并且可更多地描述任何特定基因型。一旦一個獨特的單倍型已經被轉讓給供體的染色體區域,例如在染色體10的短臂上的PHS6Y的單倍型,該單倍型可在那個種群或其任何亞群中使用以測定個體是否具有特定基因。使用本領域普通技術人員已知的自動化高通量標記檢測平臺使得這種方法高度有效率并有效。本文公開的標記等位基因可單獨地或組合地使用以通過使用標記輔助選擇來選擇具有增強熱帶銹病抗性的植株。

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