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一種微生物誘捕劑及應用.pdf

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一種 微生物 誘捕 應用
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摘要
申請專利號:

CN201510958305.8

申請日:

20151221

公開號:

CN105410032A

公開日:

20160323

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A01N63/02,A01P19/00,C12N1/20,C12R1/07 主分類號: A01N63/02,A01P19/00,C12N1/20,C12R1/07
申請人: 云南省微生物發酵工程研究中心有限公司
發明人: 何月秋,吳毅歆,何鵬搏,謝蘭芬,楊發祥
地址: 650217 云南省昆明市經濟技術開發區昌宏路49號
優先權: CN201510958305A
專利代理機構: 昆明合眾智信知識產權事務所 代理人: 康珉
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201510958305.8

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開一種微生物誘捕劑及應用。該誘捕劑的活性成分為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus?amyloliquefaciens)YN2010-KC?CGMCC?No.5722發酵液,有效活菌數含量≧3×109cfu/ml。該誘捕劑散發出的特殊氣味能引誘實蠅、果蠅和美洲斑潛蠅取食,雌雄同捕,作用周期長,成本低,不含有任何化學有毒藥劑,不殺死和不殺傷任何其他非靶標生物,屬環境友好型生物誘捕劑。對柑橘小實蠅的誘捕:比對照增加18.81~23.71%,比對照誘到的雌蟲增加37.78%~30倍。對柑橘大實蠅的誘捕:比對照增加64.43%,誘捕雌蟲數增加33.25倍。對美洲斑潛蠅的誘捕:雌蟲率占55~60%。

權利要求書

1.一種微生物誘捕劑,其特征在于:其活性成分為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722的發酵液。2.根據權利要求1所述的一種微生物誘捕劑,其特征在于,所述解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722的發酵液通過以下方法制備得到:(1)按5~10%接種量,將活化的所述解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722接種到種子培養基,在培養溫度35℃、轉速120rpm/min條件下,搖床培養36~48h,得到一級種子液,所述種子培養基為液體LB培養基,pH7.0~7.2;(2)按10~12%接種量,將一級種子液轉接到種子罐內的二級種子培養基,在28~37℃,轉速100rpm/min,通氣量為1000L/h,罐壓保持在0.02~0.03MPa條件下培養36~48h,得到二級種子液;所述二級種子培養基由以下質量分數的以下成分組成:玉米粉0.3~0.5%,黃豆粉1~1.5%,蔗糖0.2~0.5%,蛋白胨0.1~0.3%,魚粉0.1~0.3%,MgSO·7HO0.02~0.04%,CaCO0.4~0.8%,(NH)SO0.03~0.06%,余量為水,pH7.0~7.2;(3)按10~12%接種量,將二級種子液接種到發酵罐內的發酵培養基,在28~37℃,轉速100rpm/min,通氣量為10000L/h、罐壓保持在0.02~0.03MPa條件下培養48~72h,培養后的發酵液中解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722的有效活菌數≧3×10cfu/ml時,該發酵液即為所述解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722的發酵液,所述發酵培養基與步驟(2)所述二級種子培養基相同。3.權利要求1或2所述的微生物誘捕劑在防治實蠅類害蟲的應用。4.權利要求1或2所述的微生物誘捕劑在防治美洲斑潛蠅的應用。5.根據權利要求3所述的應用,其特征在于:所述的應用是將所述微生物誘捕劑裝入塑料瓶內,每瓶的裝入量為50~100mL,旋緊瓶蓋,在距離瓶內液面1~3cm的瓶壁上均布4個孔,所述各孔的孔徑為4~6mm;將塑料瓶懸掛于離地面0.5~1.5米處,每畝懸掛塑料瓶8~10個,相鄰的塑料瓶間隔5~7m;每隔20~30天向塑料瓶內添加一次所述微生物誘捕劑25~50mL。

說明書

技術領域

本發明屬于農業科學害蟲控制技術領域,具體涉及一種微生物誘捕劑,以及在誘捕雌雄果實蠅、斑潛蠅中的應用。

背景技術

雙翅目(Diptera)是節肢動物門(Arthropoda)、有顎亞門(Mandibulata)、昆蟲綱(Insecta)、有翅亞綱(Pterygota)的1目,是昆蟲綱中僅次于鞘翅目、鱗翅目、膜翅目的第四大目。世界已知85000種,全球分布。中國已知4000余種。雙翅目昆蟲有一對翅膀和一對平衡棒,包括蚊、蠅、虻。常見雙翅目一些類群如種蠅、葉潛蠅、果實蠅、麥癭蚊等的幼蟲,都是農業的重要害蟲。潛蠅科為害多種豆科植物;實蠅科的許多種類為害柑橘、梨、桃等。

實蠅類害蟲屬于雙翅目實蠅科(Tephritidae),是對果蔬類作物造成嚴重損失的一類重要害蟲。實蠅科迄今為止已知約500屬,4500余種,其中,果蔬類有害實蠅的類群達15屬、22亞屬、150余種,我國以柑橘小實蠅關[Bactroceradorsalis(Hendel)],瓜實蠅[Bactroceracucurbitae(CoqilLett)],柑橘大實蠅[Bactroceraminax(Enderlein)]等較為常見,主要分布于湖南、湖北、四川、重慶、貴州、福建、廣東、廣西、海南、云南、臺灣等省。有害實蠅的寄主范圍很廣,涉及經濟水果類植物共計24科、42個屬:蔬菜類植物4科、16屬(野生寄主植物未包括在內)。實蠅類害蟲繁殖力強、危害性大。在實蠅分布或流行區,寄主果實被害率平均為25-45%,嚴重時高達80%,甚至絕產,給果蔬類作物帶來了重大經濟損失,嚴重影響了農民增產創收。

目前,防治實蠅類害蟲的方法主要有農業防治、化學防治、物理防治和生物防治等。其中農業防治包括定期清除種植園內的帶蟲果實、果實套袋和冬季翻耕滅蛹等;化學防治措施主要是噴施毒餌殺滅實蠅;物理防治措施采用實蠅誘捕劑和毒餌相結合的技術,目前,用于防治實蠅的誘捕劑主要是化學合成誘捕劑,如引誘酮(cuelure)、甲基丁香酚(methyleugenol)等。由于農業防治措施費時費工,效果不好;化學防治不僅容易使實蠅產生抗藥性,而且對人、畜有害,易產生農藥殘留等環境污染的問題;在實際應用中性誘捕劑又存在揮發快、持效期短、用藥頻繁等問題,達不到控制蛀果率的防治目的,而且目前應用最廣泛誘捕劑甲基丁香酚只引誘雄蟲等等,其應用受到限制。

國內外針對實蠅有糖醋液、雌性激素、蛋白質三大類誘劑。糖醋液費時、費力,成本較高;雌性激素只能誘雄蟲,由于雄蟲能行多次交配,防效常不太理想;蛋白質類誘捕劑可以引誘雌雄蟲,效果好。但目前國外市場上的蛋白質誘劑為純凈動物蛋白,生產成本高。

美洲斑潛蠅(LiriomyzasativaeBlanchard)也屬于雙翅目潛蠅科(Agromyzidae)斑潛蠅屬(Liriomyza),俗稱蔬菜斑潛蠅、地圖蟲、鬼畫符等,是潛葉為害的危險性害蟲。我國最早于1993年12月在海南省三亞市首次發現,隨后美洲斑潛蠅逐漸向北擴散,1994年在云南昆明發生為害,1995年在上海、南京等地出現,1996年在山東、北京暴發成災,1997年在河南、山西出現,1998年在東北、內蒙古成災,除西藏外,全國均有分布。它的寄主植物多達200余種,其中蔬菜以茄果類(甜椒、辣椒除外)、豆類、瓜類、傘形花科等受害最重。

美洲斑潛蠅成蟲為小型蠅類,體黑色,體長1.3~2.3毫米,壽命8.7~12.6天,每雌一生產卵70~125枚,孵化率高達90%以上。幼蟲乳白色至淡黃色,長3毫米左右,年繁殖15~20代。冬季進入日光溫室內,可四季危害,主要有2次危害高峰,分別出現在5~6月和9~10月,年世代可達20代以上。成蟲、幼蟲均可危害,雌成蟲在寄主葉片上刺孔并在其中取食和產卵,幼蟲在葉片表皮下孵化后潛食葉肉或葉柄,產生不規則的蛇形白色蟲道,破壞葉片葉綠素,影響光合作用,嚴重時葉片枯黃脫落甚至整株枯死;苗期造成毀苗。危害嚴重田塊受害株100%,葉片受害70%。盛產期西葫蘆,在發現危害后,7天左右吃盡葉肉,15天左右毀滅。幼蟲和成蟲通過取食還可傳播某些病毒病。

目前,隨著耕作制度的變化,持續暖冬現象和露地及保護地蔬菜面積的不斷擴大,潛葉蠅已成為多種蔬菜上危害特大、防治特困難的災害性害蟲之一,全年發生世代多而重疊混亂,傳播蔓延快,大田春末夏初秋季保護地全年發生尤其嚴重。蔬菜的保護地栽培為蔬菜斑潛蠅提供了良好的越冬場所。該蟲不但可在大棚內越冬,而且可在棚內發生危害,成為露地蔬菜田的重要蟲源。因此,搞好大棚內的防治可有效地防止該蟲在揭棚后向露地蔬菜擴散危害。

因該蟲世代重疊現象嚴重,抗藥性強,生產中較難防治。目前,生產上對美洲斑潛蠅的防治仍主要是以化學防治為主,為了解決多年來化學農藥帶來的食品安全問題,應利用生物防治措施來控制蟲害,但生物防治技術還沒有真正在生產上應用和發揮效益,尋找針對性強,防效高,以及對人、畜安全,沒有環境污染的一種新誘劑迫在眉睫。

發明內容

針對現有技術的需要,本發明的目的是提供一種適用于誘捕實蠅和果蠅類害蟲、可雌雄同捕的新型微生物誘捕劑。

為實現上述發明目的,本發明的技術方案如下:

1.一種微生物誘捕劑,其活性成分為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722的發酵液。

2.根據技術方案1所述的一種微生物誘捕劑,所述解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722的發酵液通過以下方法制備得到:

(1)將解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722活化后,按5~10%接種量,將活化的所述解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722接種到種子培養基,在培養溫度35℃、轉速120rpm/min條件下,搖床培養36~48h,得到一級種子液,所述種子培養基為液體LB培養基,pH7.0~7.2;

(2)按10~12%接種量,將一級種子液轉接到種子罐內的二級種子培養基,在28~37℃,轉速100rpm/min,通氣量為1000L/h,罐壓保持在0.02~0.03MPa條件下培養36~48h,得到二級種子液;所述二級種子培養基由以下質量分數的以下成分組成:玉米粉0.3~0.5%,黃豆粉1~1.5%,蔗糖0.2~0.5%,蛋白胨0.1~0.3%,魚粉0.1~0.3%,MgSO4·7H2O0.02~0.04%,CaCO30.4~0.8%,(NH4)2SO40.03~0.06%,余量為水,pH7.0~7.2;

(3)按10~12%接種量,將二級種子液接種到發酵罐內的發酵培養基,在28~37℃,轉速100rpm/min,通氣量為10000L/h、罐壓保持在0.02~0.03MPa條件下培養48~72h,培養后的發酵液中解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722的有效活菌數≧3×109cfu/ml時,該發酵液即為所述解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722的發酵液,所述發酵培養基與步驟(2)所述二級種子培養基相同。

3.技術方案1或2所述的微生物誘捕劑在防治實蠅類害蟲的應用。

4.技術方案1或2所述的微生物誘捕劑在防治美洲斑潛蠅的應用。

5.根據技術方案3所述的微生物誘捕劑在防治實蠅類害蟲的應用,所述的應用是將所述微生物誘捕劑裝入塑料瓶內,每瓶的裝入量為50~100mL,旋緊瓶蓋,在距離瓶內液面1~3cm的瓶壁上均布4個孔,所述各孔的孔徑為4~6mm;將塑料瓶懸掛于離地面0.5~1.5米處,每畝懸掛塑料瓶8~10個,相鄰的塑料瓶間隔5~7m;每隔20~30天向塑料瓶內添加一次所述微生物誘捕劑25~50mL。

與現有技術相比,本發明具有以下有益效果:

1、本發明產品散發出的特殊氣味能引誘實蠅和果蠅取食,可雌雄同捕,作用周期長,一次性投料可以兩周內持效,且成本低,具有較強的競爭力。對柑橘小實蠅誘捕:比果瑞特果蠅引誘劑增加23.71%,比甲基丁香酚增加18.81%。比果瑞特果蠅引誘劑誘到的雌蟲增加37.78%,比甲基丁香酚誘到的雌蟲增加30倍。對柑橘大實蠅誘捕:比甲基丁香酚增加64.43%,誘捕的柑橘大實蠅雌蟲數量比甲基丁香酚增加33.25倍。對美洲斑潛蠅的誘捕:雌蟲率占55~60%,產生了預料不到的技術效果。甲基丁香酚誘不到斑潛蠅,只能用糖醋液為對照,而后者也能誘到雌雄蟲,只是總蟲量比本產品低很多。

2、本發明產品中不含有任何化學有毒藥劑,不殺死和不殺傷任何其他非靶標生物,屬于環境友好型果實蠅誘捕劑。

3、本發明產品完全可以取代化學殺蟲藥劑,大大減少化學農藥用量,從而減少化學農藥對天敵昆蟲的負面影響,無抗藥性。

4、本發明產品可提高農產品質和產量,對生態安全,生態效益顯著,使用簡單。

本發明所述的解淀粉芽孢桿菌BacillusamyloliquefaciensYN2010-KC于2012年1月12日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱:CGMCC),保藏號為CGMCCNo.5722,并于2012年1月12日檢測為存活。該普通微生物中心地址:中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號,郵編:100101。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明提供的一種微生物誘捕劑進行詳細說明,但并不對本發明構成限制,本領域技術人員在此基礎上改進工藝參數,改變具體的輔料類型等替換和改動,依舊屬于本發明的保護范圍。各實施例無特殊說明的為常規方法。

實施例1解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KC的獲得、鑒定和保藏

1、本發明解淀粉芽孢桿菌YN2010-KC的獲得

1.1材料

采自云南農業大學后山農場玉米根際周圍的土壤。

1.2培養基制備

將LB固體培養基和PSA培養基(馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基)融化,分別倒入滅菌培養皿,冷卻,制成LB和PSA平板。

1.3分離培養

采用稀釋平皿分離法和平板劃線分離,將分離純化所得的一菌株命名為YN2010-KC。

2、解淀粉芽孢桿菌YN2010-KC的鑒定

2.1、形態學鑒定

取菌株YN2010-KC在LB培養基上培養,37℃培養36小時,進行形態觀察鑒定,菌體為桿狀、端圓,周生鞭毛、具運動性,產生橢圓形芽孢;在LB和PSA平板上菌落圓形、淡茶褐色、菌落中央顏色略深、隆起、表面干燥有褶皺。與《常見細菌系統鑒定手冊》(東秀珠等編著,科學出版社,2001年)中描述的芽孢桿菌屬形態特征基本一致,初步判斷菌株YN2010-KC屬于芽孢桿菌(Bacillusspp.)。

2.2、生理生化鑒定

菌株革蘭氏染色、芽孢染色、淀粉水解、葡萄糖利用、檸檬酸鹽利用、V-P反應、接觸酶反應、硝酸鹽還原、明膠液化等均呈陽性。

3、解淀粉芽孢桿菌YN2010-KC的保藏

經上述鑒定表明所分離獲得的菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens),其代號為YN2010-KC,所述的解淀粉芽孢桿菌BacillusamyloliquefaciensYN2010-KC于2012年1月12日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱:CGMCC),保藏號為CGMCCNo.5722,并于2012年1月12日檢測為存活。該普通微生物中心地址:中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號,郵編:100101。

實施例2本發明微生物誘捕劑的制備方法,包括以下步驟:

(1)將-80℃保存的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722接種在液體LB培養基上,35℃培養24h,得活化的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722,按10%接種量,將活化的所述解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722接種到種子培養基,在培養溫度35℃、轉速120rpm/min條件下,搖床培養36h,得到一級種子液,所述種子培養基為液體LB培養基,pH7.0~7.2;

(2)按10%接種量,將一級種子液轉接到種子罐內的二級種子培養基,在35℃,轉速100rpm/min,通氣量為1000L/h,罐壓保持在0.02~0.03MPa條件下培養36~48h,得到二級種子液;得到二級種子液;所述二級種子培養基由以下質量分數的以下成分組成:玉米粉0.5%,黃豆粉1%,蔗糖0.5%,蛋白胨0.3%,魚粉0.1%,MgSO4·7H2O0.02%,CaCO30.4%,(NH4)2SO40.03%,余量為水,pH7.0~7.2;所述二級種子培養基于121℃滅菌30min,待降溫至30℃,接入一級種子液;

(3)按10%接種量,將二級種子液接種到發酵罐內的發酵培養基,在35℃,轉速100rpm/min,通氣量為10000L/h、罐壓保持在0.02~0.03MPa條件下培養48~72h,培養后的發酵液中解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722的有效活菌數≧3×109cfu/ml時,將發酵液用醫用塑料瓶包裝,即為所述微生物誘捕劑,所述發酵培養基與步驟(2)所述二級種子培養基相同。

本發明微生物誘捕劑通過實施例2所述的微生物誘捕劑的制備方法制備得到。

實施例3本發明微生物誘捕劑與其它誘劑對柑橘小實蠅誘捕的對比試驗

在云南省元江縣柑橘園內進行誘捕效果試驗,同時與“果瑞特”果蠅引誘劑,(屬蛋白餌劑,市售)、甲基丁香酚(屬性誘劑,市售)和水(空白對照)進行對比。本發明微生物誘捕劑用量50ml/瓶,果瑞特果蠅引誘劑用量50ml/瓶,甲基丁香酚用量3ml/瓶。

每個塑料瓶裝上述一種引誘劑,旋緊瓶蓋,在距離瓶內液面2cm的瓶壁上均布4個孔,所述各孔的孔徑為5mm。于2015年5月16日中午進行田間釋放,將塑料瓶懸掛于離柑橘地0.5-1.5米處。兩天后誘到柑橘小實蠅數量(頭)見表1。可見,本發明微生物誘捕劑誘蟲數量均高于果瑞特果蠅引誘劑和甲基丁香酚,且雌蟲率高達51.67%。本發明微生物誘捕劑誘蟲數量比果瑞特果蠅引誘劑增加23.71%,比甲基丁香酚增加18.81%。本發明微生物誘捕劑比果瑞特果蠅引誘劑誘到的雌蟲增加37.78%,比甲基丁香酚誘到的雌蟲增加30倍。

表1本發明微生物誘捕劑對柑橘小實蠅引誘試驗

實施例4本發明微生物誘捕劑對柑橘果實蠅誘捕試驗

在云南省河口縣南溪農場進行果實蠅誘捕試驗,試驗試劑:本發明微生物誘捕劑。裝試劑的塑料瓶及操作與實施例3相同,本發明微生物誘捕劑用量50ml/瓶,于2014年7月5日中午裝有試劑的塑料瓶懸掛于離柑橘地0.5-1.5米處,自投料后1天、2天和3天調查各瓶中蟲量見表2,可見,本發明誘捕劑發酵產生揮發性蛋白質類等化合物引誘果實蠅食用,效果顯著,且雌雄同誘。

表2本發明微生物誘捕劑誘捕果實蠅(柑橘大實蠅、小實蠅、番石榴實蠅、瓜實蠅等)的效果

實施例5本發明微生物誘捕劑對柑橘大實蠅防治效果的對比試驗

在云南省蒙自縣柑橘園內進行誘捕柑橘大實蠅試驗,同時與甲基丁香酚進行對比。本發明微生物誘捕劑用量50ml/瓶,甲基丁香酚用量50ml/瓶。

裝各試劑的塑料瓶及操作與實施例3相同,于2014年12月4日中午將裝有試劑的塑料瓶懸掛于離柑橘地0.5-1.5米處,自投料后1天、2天和3天調查各瓶中蟲量見表3,可見,用本發明微生物誘捕劑發酵產生揮發性蛋白質類等化合物引誘柑橘大實蠅食用,除第一天誘蟲量低于性誘劑甲基丁香酚外,其它時間內誘捕大實蠅的效果均優于性誘劑甲基丁香酚,且雌雄同誘。三天內,本發明微生物誘捕劑誘捕柑橘大實蠅數量比甲基丁香酚增加64.43%,誘捕的柑橘大實蠅雌蟲數量比甲基丁香酚增加33.25倍。

表3本發明微生物誘捕劑誘捕柑橘大實蠅的效果

實施例6本發明微生物誘捕劑與黃板田間誘蟲對比試驗

在云南省蒙自縣番茄蔬菜基地上進行誘捕效果試驗,同田與30×30cm黃板進行了對比。每個黃色塑料瓶裝50ml本發明微生物誘捕劑,旋緊瓶蓋,在距離瓶內液面2cm處的瓶壁上均布4個孔,所述各孔的孔徑為5mm。于2015年6月16日中午進行田間釋放,將塑料瓶懸掛于距地面0.5~0.8米高,每畝懸掛塑料瓶8個,相鄰的塑料瓶間隔5~10m;在同田,將黃板懸掛于距地面0.5-0.8米高,每畝懸掛黃板8個,相鄰的黃板間隔5~10m。每兩天后誘到美洲斑潛蠅數量(頭)見表4。可見,本發明微生物誘捕劑平均每天誘蟲數量均高于黃板,8天內,本發明微生物誘捕劑誘蟲1988頭,黃板誘蟲379頭,是黃板誘蟲量的5.2倍。

表4本發明微生物誘捕劑和黃板對美洲斑潛蠅引誘的對比試驗

實施7本發明微生物誘捕劑對美洲斑潛蠅雌雄數量誘捕試驗

在云南省江川縣牛魔村蔬菜基地進行豇豆美洲斑潛蠅誘捕試驗,將50ml本發明微生物誘捕劑直接加入外壁貼有黃色膠帶塑料瓶中,旋緊瓶蓋,在距離瓶內液面2cm處的瓶壁上均布4個孔,所述各孔的孔徑為5mm。于2015年2月3日中午懸掛于距離地面0.5~0.8米高,自投料后1天、2天和3天調查各瓶中蟲量見表5,可見,用本發明微生物誘捕劑發酵產生的揮發性蛋白質類等化合物引誘美洲斑潛蠅食用,效果顯著,且雌雄同誘,雌蟲率達55~60%。

表5本發明微生物誘捕劑捕雌雄美洲斑潛蠅統計

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