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一種白及種苗的組織培養方法.pdf

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一種 白及 種苗 組織培養 方法
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摘要
申請專利號:

CN201610248177.2

申請日:

20160420

公開號:

CN105660422A

公開日:

20160615

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A01H4/00 主分類號: A01H4/00
申請人: 遵義醫學院
發明人: 李林,徐德林,錢剛,鄭明輝,王蕾,葛華順
地址: 563000 貴州省遵義市大連路201號
優先權: CN201610248177A
專利代理機構: 重慶強大凱創專利代理事務所(普通合伙) 代理人: 黃書凱
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201610248177.2

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本專利公開了藥用植物組織培養技術領域的一種白及種苗的組織培養方法,包括萌發培養基、繼代培養基和生根培養基的制備;紙膜或無紡布的準備:將紙膜或無紡布剪圓片或方塊;將萌發培養基轉移至一號培養皿中,在萌發培養基表面平鋪紙膜或無紡布;將繼代培養基轉移至二號培養皿中;將生根培養基轉移至三號培養皿中;將白及蒴果剪開獲得白及種子,均勻播種在一號培養皿中,密封培養;使用無菌鑷子夾持一號培養皿中紙膜或無紡布,將組培苗連同紙膜或無紡布直接在二號培養皿和三號培養皿間繼代培養;煉苗、移栽。本發明相對現有技術效率高、勞動量小;獲得的組培苗生長勢態良好。

權利要求書

1.一種白及種苗的組織培養方法,其特征在于,包括以下步驟:步驟一、培養基的配置:萌發培養基:1/2MS+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L;繼代培養基:MS+NAA0.2mg/L+6-BA1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L;生根培養基:MS+NAA0.2mg/L+6-BA1mg/L+1‰碳粉+8%香蕉+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L;調節所述萌發培養基、繼代培養基和生根培養基的pH值為5.70~6.00,分別將三種培養基轉移至濕熱高壓滅菌鍋內,進行加熱加壓滅菌,加熱溫度為121℃,壓力為0.1~1.0MPa,滅菌20min后備用;步驟二、準備紙膜或無紡布:將紙膜或無紡布剪切成<9×9cm的圓片或方塊,121℃滅菌后備用;步驟三、白及蒴果的準備:在無菌環境中將成熟、完整、無霉變的白及蒴果用濃度75%的酒精浸泡25~35s后,用無菌水清洗2~4次,再用濃度0.1%的升汞浸泡15~25min,無菌水清洗3~7次;步驟四、準備培養皿:準備三個無菌的空培養皿,分別標注一號培養皿、二號培養皿和三號培養皿;將步驟一的萌發培養基轉移至一號培養皿中,在萌發培養基表面平鋪步驟二制備的紙膜或無紡布;將繼代培養基轉移至二號培養皿中;生根培養基轉移至三號培養皿中;步驟五、接種:培養皿準備完成1~5min后,使用無菌處理后的剪刀,將步驟三的白及蒴果剪開獲得白及種子,將白及種子均勻播種在步驟四的一號培養皿中,利用封口膠封住一號培養皿,在24±1℃的光照條件下培養25~35d;步驟六、萌發培養:步驟五的培養期滿后,白及種子萌發得到組培苗,使用無菌處理的鑷子夾持一號培養皿中的紙膜或無紡布,將組培苗連同紙膜或無紡布直接轉移至二號培養皿中,在24±1℃的光照條件下培養;步驟七、繼代培養:待二號培養皿中白及種子萌發至組培苗長度>2cm后,使用無菌處理的鑷子夾持二號培養皿中紙膜或無紡布,將組培苗連同紙膜或無紡布直接轉移至三號培養皿中,在24±1℃的光照條件下培養;步驟八、待組培苗生長至長度5~6cm后,進行煉苗后獲得種苗,將種苗移栽即可。2.如權利要求1所述的白及種苗的組織培養方法,其特征在于:步驟五中在24±1℃的光照條件下培養30d。

說明書

技術領域

本發明涉及藥用植物組織培養技術領域,具體涉及一種白及種苗的組織培養方法。

背景技術

白及(Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.)為蘭科白及屬多年生草本植物,亦稱“白芨”,其塊莖是我國傳統的名貴中草藥,具有收斂止血,消腫生肌,清熱利濕的功效,通常用于肺結核、咯血、肝癌、胃癌、十二指腸潰瘍、內外出血等疾病的治療;現代藥理學研究表明白芨對結核桿菌、炎癥細胞等有明顯的抑制作用,具有代血漿、骨髓造血、延緩衰老、增加機體免疫力等保健作用,其合成的大量超氧化物(SOD)還具有抗菌鎮痛和抗腫瘤活性(張永為等,2012;王紅英,2009;王光輝等,2007;Jiangetal.2007)。此外,白及還被廣泛用作飲片、護膚美白化妝品、煙蒂膠、糊料、漿絲綢、漿紗、涂料等的工業原料和基因遞送的載體材料,且白及花色艷麗,也是一種很好的園林花卉。這些廣泛用途,導致其市場需求急劇增加,價格飛速上漲,前景十分廣闊。

然而,市場的巨大需求致使野生白及幾乎被采挖殆盡,成為瀕臨滅絕的名貴中藥材,被國家列為重點保護的野生藥用植物之一,還被國際貿易公約(CITES)附錄二錄入加以保護,如何保護白及種質資源和為人工馴化栽培提供大量種苗是亟待解決的現實問題。通過建立人工繁育的方法來保護白及野生資源和為大田的規模化種植提供大量種苗是中藥材研究中被通常采用的行之有效的方法。由于白及的種子非常細小且無胚乳,在自然狀況下很難萌發和生長,因而傳統繁育白及種苗的方法主要依靠分株繁殖,但分株繁殖周期長,繁殖效率低,而且耗種量大,成本高,很難滿足規模化種植的需要。采用組織培養技術提高白及種子萌發率,進而進行生根和壯苗培養誘導再生苗,是解決白及種質資源保護和快速繁殖大量種苗最經濟、高效的方法。然而由于組培技術的操作繁瑣,耗時繁多,不僅增加了勞動力成本,也增加了經濟成本,且在種苗的轉移過程中,種苗極易受到細菌的感染而降低組培苗的成活率。故本發明目的是建立一套省時、省力獲取白及種苗的技術體系,為白及的種質資源保護和種苗快繁奠定實驗基礎。

發明內容

本發明針對上述存在的技術問題,本發明旨在建立一套效率高、省力的獲取白及種苗的技術體系。

為實現上述目的,本發明提供如下技術方案:一種白及種苗的組織培養方法,包括以下步驟:

步驟一、培養基的配置:萌發培養基:1/2MS+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L;繼代培養基:MS+NAA0.2mg/L+6-BA1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L;生根培養基:MS+NAA0.2mg/L+6-BA1mg/L+1‰碳粉+8%香蕉+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L;調節所述萌發培養基、繼代培養基和生根培養基的pH值為5.70~6.00,分別將三種培養基轉移至濕熱高壓滅菌鍋內,進行加熱加壓滅菌,加熱溫度為121℃,壓力為0.1~1.0MPa,滅菌20min后備用;

步驟二、準備紙膜或無紡布:將紙膜或無紡布剪切成<9×9cm的圓片或方塊,121℃滅菌后備用;

步驟三、白及蒴果的準備:在無菌環境中將成熟、完整、無霉變的白及蒴果用濃度75%的酒精浸泡25~35s后,用無菌水清洗2~4次,再用濃度0.1%的升汞浸泡15~25min,無菌水清洗3~7次;

步驟四、準備培養皿:準備三個無菌的空培養皿,分別標注一號培養皿、二號培養皿和三號培養皿;將步驟一的萌發培養基轉移至一號培養皿中,在萌發培養基表面平鋪步驟二制備的紙膜或無紡布;將繼代培養基轉移至二號培養皿中;生根培養基轉移至三號培養皿中;

步驟五、接種:培養皿準備完成1~5min后,使用無菌處理后的剪刀,將步驟三的白及蒴果剪開獲得白及種子,將白及種子均勻播種在步驟四的一號培養皿中,利用封口膠封住一號培養皿,在24±1℃的光照條件下培養25~35d;

步驟六、萌發培養:步驟五的培養期滿后,白及種子萌發得到組培苗,使用無菌處理的鑷子夾持一號培養皿中的紙膜或無紡布,將組培苗連同紙膜或無紡布直接轉移至二號培養皿中,在24±1℃的光照條件下培養;

步驟七、繼代培養:待二號培養皿中白及種子萌發至組培苗長度>2cm后,使用無菌處理的鑷子夾持二號培養皿中紙膜或無紡布,將組培苗連同紙膜或無紡布直接轉移至三號培養皿中,在24±1℃的光照條件下培養;

步驟八、待組培苗生長至長度5~6cm后,進行煉苗后獲得種苗,將種苗移栽即可。

本發明的有益效果為:(1)本發明相對現有技術效率高、勞動量小。因為在培養皿中培養基的表面添加紙膜或無紡布后,整個培養過程的轉接中只需要將整個紙膜或無紡布轉入,所有的白及種子或組培苗也隨之同時轉入新培養基中,這省去了大量的轉接時間,大大的減少了勞動量,降低了生產成本,尤其是不需要復雜的儀器與技術,不需要改變一貫的培養條件;(2)本方法培養的組培苗生長勢態良好。與未添加紙膜或無紡布的培養基上的白及相比:在萌發階段,萌發時間和萌發率無顯著性差異,均能達到100%;在繼代階段,在紙膜或無紡布上的白及生長旺盛,根系更發達;同時轉入生根培養基中,紙膜或無紡布上生長的白及苗更加的粗壯。

進一步,本發明方案步驟五中在24±1℃的光照條件下培養30d,獲得的組培苗根系更發達健壯,成活率更高。

附圖說明

圖1為實施例1中白及組培苗的繁育過程圖;

圖2為對比例1的白及組培苗的繁育過程圖。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發明技術方案進一步說明:

附圖標記:本發明接種狀態a1、本發明萌發狀態a2、本發明萌發培養狀態a3、本發明繼代培養狀態a4、本發明生根狀態a5、對比例接種狀態b1、對比例萌發狀態b2、對比例萌發培養狀態b3、對比例繼代培養狀態b4、對比例生根狀態b5。

實施例1:一種白及種苗的組織培養方法,包括以下步驟:

步驟一、培養基的配置:萌發培養基:1/2MS+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L;繼代培養基:MS+NAA0.2mg/L+6-BA1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L;生根培養基:MS+NAA0.2mg/L+6-BA1mg/L+1‰碳粉+8%香蕉+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L;調節所述萌發培養基、繼代培養基和生根培養基的pH值為5.70~6.00,分別將三種培養基轉移至濕熱高壓滅菌鍋內,進行加熱加壓滅菌,加熱溫度為121℃,壓力為0.1~1.0MPa,滅菌20min后備用;

步驟二、準備紙膜或無紡布:將無紡布剪切成<9×9cm的圓片或方塊,121℃滅菌后備用;

步驟三、白及蒴果的準備:在無菌環境中將成熟、完整、無霉變的白及蒴果用濃度75%的酒精浸泡30s后,用無菌水清洗2次,再用濃度0.1%的升汞浸泡20min,無菌水清洗5次;

步驟四、準備培養皿:準備三個空的培養皿,分別標注一號培養皿、二號培養皿和三號培養皿;將步驟一的繼代培養基轉移至一號培養皿中,在繼代培養基表面平鋪步驟二制備的紙膜或無紡布;將繼代培養基轉移至二號培養皿中;將生根培養基轉移至三號培養皿中;

步驟五、接種:培養皿準備完成1~5min后,紙膜或無紡布吸滿水分,使用無菌處理后的剪刀,將步驟三的白及蒴果剪開獲得白及種子,將白及種子均勻播種在步驟四的一號培養皿中,利用封口膠封住一號培養皿,在24±1℃的光照條件下培養30d;

步驟六、萌發培養:步驟五的培養期滿后,白及種子萌發得到組培苗,使用無菌處理的鑷子夾持一號培養皿中紙膜或無紡布,將組培苗連同紙膜或無紡布直接轉移至二號培養皿中,在24±1℃的光照條件下培養;

步驟七、繼代培養:待二號培養皿中白及種子萌發至組培苗長度>2cm后,使用無菌處理的鑷子夾持二號培養皿中紙膜或無紡布,將組培苗連同紙膜或無紡布直接轉移至三號培養皿中,在24±1℃的光照條件下培養;

步驟八、待組培苗生長至長度5~6cm后,進行煉苗后獲得種苗,將種苗移栽即可。

實施例2:一種白及種苗的組織培養方法,包括以下步驟:

步驟一、培養基的配置:萌發培養基:1/2MS+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L;繼代培養基:MS+NAA0.2mg/L+6-BA1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L;生根培養基:MS+NAA0.2mg/L+6-BA1mg/L+1‰碳粉+8%香蕉+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L;調節所述萌發培養基、繼代培養基和生根培養基的pH值為5.70~6.00,分別將三種培養基轉移至濕熱高壓滅菌鍋內,進行加熱加壓滅菌,加熱溫度為121℃,壓力為0.1~1.0MPa,滅菌20min后備用;

步驟二、準備紙膜或無紡布:將紙膜剪切成<9×9cm的圓片或方塊,121℃滅菌后備用;

步驟三、白及蒴果的準備:在無菌環境中將成熟、完整、無霉變的白及蒴果用濃度75%的酒精浸泡35s后,用無菌水清洗4次,再用濃度0.1%的升汞浸泡15min,無菌水清洗7次;

步驟四、準備培養皿:準備三個空的培養皿,分別標注一號培養皿、二號培養皿和三號培養皿;將步驟一的繼代培養基轉移至一號培養皿中,在繼代培養基表面平鋪步驟二制備的紙膜或無紡布;將繼代培養基轉移至二號培養皿中;將生根培養基轉移至三號培養皿中;

步驟五、接種:培養皿準備完成1~5min后,紙膜或無紡布吸滿水分,使用無菌處理后的剪刀,將步驟三的白及蒴果剪開獲得白及種子,將白及種子均勻播種在步驟四的一號培養皿中,利用封口膠封住一號培養皿,在24±1℃的光照條件下培養25d;

步驟六、萌發培養:步驟五的培養期滿后,白及種子萌發得到組培苗,使用無菌處理的鑷子夾持一號培養皿中紙膜或無紡布,將組培苗連同紙膜或無紡布直接轉移至二號培養皿中,在24±1℃的光照條件下培養;

步驟七、繼代培養:待二號培養皿中白及種子萌發至組培苗長度>2cm后,使用無菌處理的鑷子夾持二號培養皿中紙膜或無紡布,將組培苗連同紙膜或無紡布直接轉移至三號培養皿中,在24±1℃的光照條件下培養;

步驟八、待組培苗生長至長度5~6cm后,進行煉苗后獲得種苗,將種苗移栽即可。

實施例3:一種白及種苗的組織培養方法,包括以下步驟:

步驟一、培養基的配置:萌發培養基:1/2MS+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L;繼代培養基:MS+NAA0.2mg/L+6-BA1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L;生根培養基:MS+NAA0.2mg/L+6-BA1mg/L+1‰碳粉+8%香蕉+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L;調節所述萌發培養基、繼代培養基和生根培養基的pH值為5.70~6.00,分別將三種培養基轉移至濕熱高壓滅菌鍋內,進行加熱加壓滅菌,加熱溫度為121℃,壓力為0.1~1.0MPa,滅菌20min后備用;

步驟二、準備紙膜或無紡布:將無紡布剪切成<9×9cm的圓片或方塊,121℃滅菌后備用;

步驟三、白及蒴果的準備:在無菌環境中將成熟、完整、無霉變的白及蒴果用濃度75%的酒精浸泡25s后,用無菌水清洗3次,再用濃度0.1%的升汞浸泡10-20min,無菌水清洗3-5次;

步驟四、準備培養皿:準備三個空的培養皿,分別標注一號培養皿、二號培養皿和三號培養皿;將步驟一的繼代培養基轉移至一號培養皿中,在繼代培養基表面平鋪步驟二制備的紙膜或無紡布;將繼代培養基轉移至二號培養皿中;將生根培養基轉移至三號培養皿中;

步驟五、接種:培養皿準備完成1~5min后,紙膜或無紡布吸滿水分,使用無菌處理后的剪刀,將步驟三的白及蒴果剪開獲得白及種子,將白及種子均勻播種在步驟四的一號培養皿中,利用封口膠封住一號培養皿,在24±1℃的光照條件下培養35d;

步驟六、萌發培養:步驟五的培養期滿后,白及種子萌發得到組培苗,使用無菌處理的鑷子夾持一號培養皿中紙膜或無紡布,將組培苗連同紙膜或無紡布直接轉移至二號培養皿中,在24±1℃的光照條件下培養;

步驟七、繼代培養:待二號培養皿中白及種子萌發至組培苗長度>2cm后,使用無菌處理的鑷子夾持二號培養皿中紙膜或無紡布,將組培苗連同紙膜或無紡布直接轉移至三號培養皿中,在24±1℃的光照條件下培養;

步驟八、待組培苗生長至長度5~6cm后,進行煉苗后獲得種苗,將種苗移栽即可。

對比例1:

與實施例1的區別在于:刪除步驟二,整個過程不使用紙膜或無紡布,三個培養皿間直接使用無菌鑷子夾持組培苗進行轉移。

將上述實施例1與對比例1培養白及種苗的過程中,組培苗的生長勢態進行對比,拍攝圖片見圖1及圖2。結合圖1及圖2對比分析實施例1和對比例1白及種子接種到成苗的過程,分析結果見表1。

表1:

通過表1對比可以得出,本發明方法因在培養基上鋪放無紡布或紙膜后,繼代培養和生根過程中,幼苗的轉移可以直接通過轉移無紡布或紙膜,而對比例1的培養基上無無紡布或紙膜,幼苗轉移時,需要每株逐漸進行轉移,工作量大,且幼苗容易感染細菌,生長發育不良,這樣在幼苗的萌發和生根均不如本發明方法的白及幼苗旺盛。本發明具有效率高、勞動量小;組培苗生長勢態好的有益技術效果。

對于本領域的技術人員來說,在不脫離本發明結構的前提下,還可以作出若干變形和改進,這些也應該視為本發明的保護范圍,這些都不會影響本發明實施的效果和專利的實用性。

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