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一種禾谷類作物單倍體群體的構建方法.pdf

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一種 禾谷 作物 單倍體 群體 構建 方法
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摘要
申請專利號:

CN201410710796.X

申請日:

20141128

公開號:

CN105684895A

公開日:

20160622

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01H4/00 主分類號: A01H4/00
申請人: 上海市農業科學院
發明人: 何婷,劉成洪,黃劍華,郭桂梅,陸瑞菊,王亦菲,陳志偉,高潤紅,徐紅衛
地址: 201106 上海市閔行區北翟路2901號
優先權: CN201410710796A
專利代理機構: 上海專利商標事務所有限公司 代理人: 韋東
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201410710796.X

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明提供一種禾谷類作物單倍體群體的構建/繁育方法,所述方法包括使用禾谷類作物的分蘗節基部分生組織產生叢生芽;和繁育叢生芽,從而獲得單倍性遺傳穩定的單倍體植株。本發明還包括用于所述方法的各培養基,以及含有所述培養基的試劑盒。采用本發明方法可以避免中間愈傷組織生長環節形成的無性變異,最大程度保持其原有遺傳基礎,使單倍體植株的擴繁群體保持單倍體的穩定性。

權利要求書

1.一種禾谷類作物單倍體植株的繁殖方法,所述方法包括:使用禾谷類作物的分蘗節基部分生組織產生叢生芽;和繁育叢生芽,從而獲得單倍性遺傳穩定的單倍體植株。2.如權利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法包括:(1)由禾谷類作物小孢子獲得單倍體植株;(2)培養步驟(1)獲得的單倍體植株,使其形成分蘗;(3)由步驟(2)所得分蘗節基部誘導產生叢生芽;以及(4)繁育所述叢生芽,獲得單倍體再生植株。3.如權利要求1或2所述的方法,其特征在于,將所述分蘗節基部接種到含0.3-0.8mg/L噻二唑苯基脲的1/2MS叢生芽誘導培養基誘導培養,培養溫度為20-26℃,光周期為8-14h·d,獲得由分蘗節基部誘導叢生芽。4.如權利要求3所述的方法,其特征在于,將由分蘗節基部長出的叢生芽轉移到叢生芽增殖培養基上培養,在叢生芽增殖的同時壯苗,其中,叢生芽增殖培養基以1/2MS培養基配制,除含有1/2MS培養基的成分外,還添加有300-500mg/L水解干酪素(CH)、10-30mg/L亞精胺(Spd)、0.3-0.8mg/LTDZ(噻二唑苯基脲)和0.8-1.2mg/L多效唑(MET)。5.如權利要求4所述的方法,其特征在于,將所述叢生芽轉移到1/2MS培養基培養,以降低植株的內源激素,然后轉到生根誘導培養基上誘導生根,形成完整再生植株,其中,所述生根誘導培養基以1/2MS培養基配制,除含有1/2MS培養基的成分外,還添加NAA0.03-0.08mg/L和MET0.8-1.2mg/L。6.如權利要求1-5中任一項所述的方法,其特征在于,所述分蘗節基部獲自來源于小孢子的單倍體植株,其中,用0.2-0.5M的甘露醇提取液收集禾谷類作物的小孢子,將其置于誘導培養基中進行誘導培養,獲得愈傷組織后,將愈傷組織轉移至分化培養基,獲得單倍體植株,然后再在生根壯苗培養基上培養所述單倍體植株。7.如權利要求1-6中任一項所述的方法,其特征在于,將所獲得的單倍體植株放置溫室中漂浮培養1-2天,進行煉苗;煉苗結束后,將所得植株轉移到1/2Hoagland溶液中培養至形成多個分蘗。8.如權利要求6所述的方法,其特征在于,所述誘導培養基以N培養基為基礎,所不同的是含有0-2500mg/L的KNO和0-400mg/L的(NH)SO,并添加有400-2500mg/L的水解干酪素和400-2500mg/L的谷氨酰胺;所述分化培養基以2/3MS為基本培養基,其中加有6-BA0.3-1.2mg/L、KT0.5-2.0mg/L、NAA0.01-0.1mg/L、麥芽糖10-50g/L以及肌醇95-105mg/L,pH為5.5-6.2;以及所述生根壯苗培養基以1/2MS為基礎,含有1/2MS培養基的成分外,還添加有NAA0.02-0.08mg/L、多效唑(MET)2.0-10.0mg/L和蔗糖10-40g/L,pH5.6-6.0。9.如權利要求3-5中任一項所述的方法,其特征在于,所述1/2MS叢生芽誘導培養基含0.4-0.6mg/L噻二唑苯基脲;所述叢生芽增殖培養基中,水解干酪素為400mg/L,亞精胺為20mg/L,噻二唑苯基脲為1.0mg/L和多效唑為1.0mg/L;所述生根誘導培養基中,萘乙酸為0.04-0.06mg/L和多效唑為0.8-1.0mg/L。10.一種試劑盒,其特征在于,所述試劑盒含有:(1)含0.3-0.8mg/L噻二唑苯基脲的1/2MS叢生芽誘導培養基;和(2)以1/2MS培養基配制的叢生芽增殖培養基,所述叢生芽增殖培養基除含有1/2MS培養基的成分外,還添加有300-500mg/L水解干酪素、10-30mg/L亞精胺、0.6-1.2mg/L噻二唑苯基脲和0.8-1.2mg/L多效唑;和任選的以下一種或多種培養基:(3)生根誘導培養基,該培養基以1/2MS培養基配制,除含有1/2MS培養基的成分外,還添加萘乙酸0.03-0.08mg/L和多效唑0.8-1.2mg/L;(4)N誘導培養基,該培養基以N培養基為基礎,所不同的是含有0-2500mg/L的KNO和0-400mg/L的(NH)SO,并添加有400-2500mg/L的水解干酪素和400-2500mg/L的谷氨酰胺;(5)分化培養基,具體是以2/3MS為基本培養基,其中加有6-芐氨基腺嘌呤0.3-1.2mg/L、6-糠氨基嘌呤0.5-2.0mg/L、萘乙酸0.01-0.1mg/L、麥芽糖10-50g/L以及肌醇95-105mg/L,pH為5.5-6.2;以及(6)生根壯苗培養基,該培養基以1/2MS為基礎,含有1/2MS培養基的成分外,還添加有萘乙酸0.02-0.08mg/L、多效唑2.0-10.0mg/L和蔗糖10-40g/L,pH5.6-6.0。

說明書

技術領域

本發明屬于生物技術領域,具體涉及一種禾谷類作物單倍體植株快繁的方法及用途。

背景技術

單倍體技術是現代育種中一種非常重要的技術手段,它通過花藥/小孢子培養可以獲得單倍體植株,但是由于單倍體植株的不育性,這些植株不能長期存活,通常是通過染色體加倍成二倍體植株加以利用。單倍體植株由于本身只具備一套染色體,在誘變、轉化、細胞雜交等遺傳改良研究上具有特殊優勢:單倍體材料對外界刺激敏感,易于產生突變;外源基因易于插入;單倍體水平上的突變或轉基因經染色體加倍后可以獲得目標基因以等位純合狀態穩定遺傳的加倍單倍體植株,隱性基因控制的性狀也可以得到表現;單倍體(N)細胞融合雜交,易于獲得的雜交再生植株(2N)。

對已獲得的單倍體植株進行離體擴繁,快速構建單倍體群體是對單倍體資源進行種質保存,開展有效利用的一個材料來源基礎。目前利用組織培養技術對單倍體植株進行離體繁殖,已在一些雙子葉植物中取得成功,如利用油菜單倍體植株的節間莖段誘導不定芽再生植株(劉成洪,王亦菲,孫月芳,等.甘藍型油菜單倍體植株群體的構建[J].上海農業學報,2006,21(4):23-25.),利用青花菜單倍體莖尖誘導再生植株(陸瑞菊,王亦菲,孫月芳,等.利用青花菜單倍體莖尖篩選耐熱變異體[J].核農學報,2006,20(5):388-391.),利用亞麻的單倍體葉片誘導再生植株等(康慶華,徐涵,吳廣文,等.利用亞麻多胚性狀建立單倍體群體并實現離體擴繁[J].農業生物技術學報,2007,15(增刊):249-252),在單子葉植物玉米中通過胚芽鞘節誘導愈傷組織分化形成了再生植株(杜何為,劉志鵬,嚴建兵,等.玉米單倍體胚芽鞘節組織培養特性研究[J].中國農業科學,2010,43(15):3098-3105)。但對于禾谷類作物如大麥、小麥、水稻等,還未見在單倍體植株的基礎上建立系統有效的離體繁殖體系,也未見利用從單倍體植株分蘗節直接誘導叢生芽的報道。

因此,本領域仍需要一種禾谷類作物單倍體植株快繁的方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種禾谷類作物單倍體植株系統有效的離體繁殖方法,通過利用禾谷類作物的分蘗節基部分生組織,采用適宜的激素和添加物直接獲得叢生芽,壯苗和誘導生根,建立倍性穩定、生長迅速的單倍體離體繁殖群體。

本發明方法可通過以下方式實現:通過游離小孢子(花藥)培養技術,獲得來源于小孢子的再生植株,經倍性鑒定獲得單倍體植株,單倍體植株利用培養基或水培形成多個分蘗的植株,剝取分蘗節基部,使用適宜的激素和其他添加物進行誘導培養,從分蘗節基部分生組織直接誘導叢生芽,叢生芽進一步增殖、壯苗和生根,獲得完整的再生植株,經倍性鑒定獲得單倍性遺傳穩定的單倍體群體。

本發明建立的方法,可以用于禾谷類作物單倍體種質的保存,單倍體誘變,單倍體的遺傳轉化,細胞融合雜交,以及單倍體發育遺傳機制的研究,本發明的用途包含但不僅限于上述應用。

因此,本發明提供一種禾谷類作物單倍體植株的離體繁殖方法,所述方法包括:使用禾谷類作物的分蘗節基部分生組織產生叢生芽;和繁育叢生芽,獲得單倍性遺傳穩定的單倍體植株。

在一個具體實施例中,所述分蘗節基部獲自來源于小孢子的單倍體植株。

在一個具體實施例中,用0.2-0.5M的甘露醇提取液收集禾谷類作物的小孢子。

在一個具體實施例中,將提取獲得的游離小孢子置于誘導培養基中進行誘導培養。

在一個具體實施例中,誘導培養基以N6培養基為基礎,所不同的是含有0-2500mg/L的KNO3和0-400mg/L的(NH4)SO4,并添加有400-2500mg/L的水解干酪素和400-2500mg/L的谷氨酰胺。

在一個具體實施例中,將誘導培養所得愈傷組織轉移至分化培養基上。

在一個具體實施例中,分化培養基以2/3MS為基本培養基,其中加有6-BA0.3-1.2mg/L、KT0.5-2.0mg/L、NAA0.01-0.1mg/L、麥芽糖10-50g/L以及肌醇95-105mg/L,pH為5.5-6.2。

在一個具體實施例中,在25±1℃,每天10~12小時光照的條件下分化脅迫培養25~30天,直至分化出綠色再生植株。

在一個具體實施例中,將分化出的再生植株轉入添加有NAA0.02-0.08mg/L、多效唑(MET)2.0-10.0mg/L和蔗糖10-40g/L,pH5.6-6.0的1/2MS生根壯苗培養基,在25±1℃,每天10~12小時光照的條件下進行25~30天的生根壯苗培養。

在一個具體實施例中,將所獲得的單倍體植株放置溫室中漂浮培養1-2天,進行煉苗。

在一個具體實施例中,溫室溫度為白天20-25℃,晚上16-20℃,10-16小時光照。

在一個具體實施例中,煉苗結束后,將所得植株轉移到1/2Hoagland溶液中培養,每3-4天更換一次培養液,培養約1個月,形成多個分蘗。

在一個具體實施例中,獲取再生植株分蘗節部位1cm左右,接種到含0.3-0.8mg/LTDZ的1/2MS的叢生芽誘導培養基直接誘導培養,培養溫度為20-26℃,優選23±1℃,光周期約8-14h·d-1,優選約10h·d-1。

在一個具體實施例中,將所述再生植株分蘗節部位接種到含有0.5mg/LTDZ的1/2MS叢生芽誘導培養基中。

在一個具體實施例中,將由分蘗節基部長出的新芽轉移到叢生芽增殖培養基上。

在一個具體實施例中,叢生芽增殖培養基以1/2MS培養基配制,除含有1/2MS培養基的成分外,還添加有300-500mg/L水解干酪素(CH)、10-30mg/L亞精胺(Spd)、0.6-1.2mg/LTDZ(噻二唑苯基脲)和0.8-1.2mg/L多效唑(MET)。

在一個具體實施例中,叢生芽增殖培養基中,CH為400mg/L,Spd為20mg/L,TDZ為1.0mg/L,MET為1.0mg/L。

在一個具體實施例中,將叢生芽增殖培養基上培養獲得的叢生芽轉移到1/2MS培養基培養,以降低植株的內源激素,然后轉到生根誘導培養基上誘導生根,形成完整再生植株。

在一個具體實施例中,叢生芽在1/2MS培養基培養中培養約3-6周,優選4周左右。

在一個具體實施例中,生根誘導培養基以1/2MS培養基配制,除含有1/2MS培養基的成分外,還添加NAA0.03-0.08mg/L和MET0.8-1.2mg/L。

在一個具體實施例中,所述生根誘導培養基中,萘乙酸為0.05mg/L,多效唑(MET)為1.0mg/L。

在一個具體實施例中,本發明的方法包括:

(1)由禾谷類作物小孢子獲得單倍體植株;

(2)培養步驟(1)獲得的單倍體植株,使其形成分蘗;

(3)由步驟(2)所得分蘗節基部誘導產生叢生芽;以及

(4)繁育所述叢生芽,獲得單倍體再生群體。

本發明還包括用于上述各步驟的培養基及其任意組合,以及含有所述培養基及其任意組合的試劑盒。

本發明的試劑盒還包括指導如何使用所述培養基的說明書。

本發明還包括采用本發明方法獲得的禾谷類作物的單倍體群體。

本發明利用分蘗節基部的分生組織進行叢生芽誘導,可以避免中間愈傷組織生長環節形成的無性變異,最大程度保持其原有遺傳基礎,使單倍體植株的擴繁群體保持單倍體的穩定性。

具體實施方式

本發明利用游離小孢子(花藥)培養技術獲得單倍體植株,對單倍體植株培養使其形成多個分蘗,然后利用分蘗節基部分生組織直接誘導叢生芽(這不同于其他報道單倍體誘導再生方式),進行增殖、壯苗、生根獲得單倍體再生群體。還可對群體的穩定性進行評價。因此,本發明的方法具有系統性。

具體而言,本發明提供一種禾谷類作物單倍體植株的離體繁殖方法,所述方法包括使用誘導培養禾谷類作物的分蘗節基部分生組織,產生叢生芽;和繁育叢生芽,獲得單倍性遺傳穩定的單倍體植株。

1、由禾谷類作物游離小孢子獲得單倍體植株

禾谷類作物的單倍體植株可通過花藥或游離小孢子培養獲得。由禾谷類作物小孢子獲得再生植株的方法可參見,例如陸瑞菊,《大麥游離小孢子培養技術的優化及單倍體耐鹽、耐低氮脅迫篩選體系的建立》,南京農業大學2012博士論文。

具體而言,通常,可從大田或溫室選取禾谷類作物中部小花,其小孢子發育處于單核早期、中期的穗子,放入冰箱冷藏10-30天,通常是15-25天,例如15天左右。冷藏的溫度可以在0-8℃范圍之間,例如可以為3-8℃。通常可在約5℃冷藏。

穗子先消毒,例如用飽和的漂白粉溶液消毒10-20min,無菌水沖洗2-4次。每個離心管中接入10個穗子的花藥,倒入15-20ml0.2-0.5M的甘露醇提取液,用高速分散器超速(例如3000-4000rpm)旋切,150目篩網過濾,濾液低速(例如800-1000rpm)離心,重復2-3次,收集小孢子。

提取獲得的游離小孢子可置于本發明的誘導培養基中進行誘導培養。培養前可先用該誘導培養基洗滌小孢子1到2次,然后用培養基將小孢子密度調節至1.0~1.2×105個/ml,取大約1.5-3ml小孢子懸浮液接種于培養皿(30×15mm),Parafilm封口,室溫下(例如約25-28℃)暗培養15-25天。通常情況下是在25℃暗培養大約21天左右。由此可獲得愈傷組織。

誘導培養后,可將所得愈傷組織轉移至分化培養基上。

通常在25±1℃,每天10~12小時光照的條件下分化培養25~30天,直至分化出綠色再生植株。分化培養可使用本發明的分化培養基進行。

分化出的再生植株可轉入添加有NAA0.02-0.08mg/L、多效唑(MET)2.0-10.0mg/L和蔗糖10-40g/L,pH5.6-6.0的1/2MS生根壯苗培養基。在25±1℃,每天10~12小時光照的條件下進行25~30天的生根壯苗培養。

生根壯苗培養基中,NAA的優選濃度范圍為0.03-0.06mg/L,更優選為0.04-0.05mg/L;MET的優選濃度范圍為3.0-8.0mg/L,更優選為4.0-6.0mg/L。在一具體實施例中,MET的濃度為5.0mg/L;蔗糖的優選濃度范圍為20-30g/L。在一具體實施例中,蔗糖的濃度為20g/L。

生根壯苗培養基的pH優選為5.8-5.9。

適用于由禾谷類作物游離小孢子獲得單倍體植株的誘導培養基尤其可選用CN201310596632.4中披露的改造的N6誘導培養基。具體而言,該誘導培養基以表1所示的N6培養基為基礎,所不同的是含有0-2500mg/L的KNO3和0-400mg/L的(NH4)SO4,并添加有400-2500mg/L的水解干酪素和400-2500mg/L的谷氨酰胺:

表1:N6培養基的配方(單位:mg/L):

N6大量元素: (NH4)2SO4 463 KNO3 2830 CaCl2·2H2O 166 MgSO4·7H2O 185 KH2PO4 400 N6微量元素: H3BO3 1.6 KI 0.83 MnSO4·4H2O 4.4 ZnSO4·7H2O 1.5 N6鐵鹽: Na2EDTA 37.3 FeSO4·7H2O 27.8 N6有機元素: 鹽酸硫胺素 1.0 鹽酸吡多辛 0.5 甘氨酸 2.0 煙酸 0.5

更優選地,使用CN201310596632.4表2所披露的誘導培養基。本文將該文獻全部內容以引用的方式納入本文。

適用于此處的分化培養基優選為CN201310596632.4中披露的分化培養基,具體是以2/3MS為基本培養基,其中加有6-BA0.3-1.2mg/L、KT0.5-2.0mg/L、NAA0.01-0.1mg/L、麥芽糖10-50g/L以及肌醇95-105mg/L,pH為5.5-6.2。

分化培養基中,6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)的優選濃度為0.4-0.8mg/L,更優選為0.5-0.6mg/L;KT(6-糠氨基嘌呤)的優選濃度為1.0-1.8mg/L,更優選為1.2-1.5mg/L;NAA(萘乙酸)的優選濃度0.02-0.08mg/L,更優選為0.03-0.06mg/L;麥芽糖的優選濃度為20-40g/L,更優選為20-30g/L。

MS培養基的配方如下表2所示(單位:mg/L):

表2

MS大量元素: NH4NO4 1650 KNO3 1900 CaCl2·2H2O 440 MgSO4·7H2O 370 KH2PO4 170 MS微量元素: H3BO3 6.2 KI 0.83 MnSO4·4H2O 22.3 ZnSO4·7H2O 8.6 Na2MoO4·2H2O 0.25 CuSO4·5H2O 0.025 CoCl2·6H2O 0.025 MS鐵鹽: Na2EDTA 37.3 FeSO4·7H2O 27.8

MS有機元素: 鹽酸硫胺素 0.1 鹽酸吡多辛 0.5 煙酸 0.5 甘氨酸 2.0 肌醇 100.0

MS可自行按上述配方配制,也可向Sigma等化學試劑公司購買成品。2/3MS培養基則是將MS培養基的大量元素減少1/3,而微量元素、鐵鹽和有機元素不變。然后根據本文所述配方配制本文的2/3MS誘導培養基。1/2MS培養基則是將MS培養基的大量元素減少1/2,而微量元素、鐵鹽和有機元素不變。然后根據本文所述配方配制本文的1/2MS誘導培養基。本領域技術人員將理解,可對上述表1所示的濃度做出適當的變動,例如有大約5%或更低(例如3%左右、2%左右、1%左右,或更低的變動范圍)的變動,由此配制得到的培養基仍然具有所需的生物學功能,仍能用于實施本發明。例如,以肌醇為例,每升MS培養基中可含有大約95-105mg的肌醇(5%的變動幅度)。其它成分的濃度也如此變動。此外,1/2MS誘導培養基中的成分也可使用功能和性質相同或相似的成分加以替換。

可采用氣孔保衛細胞長度(何婷、郭桂梅、陳志偉等,大麥小孢子再生植株氣孔保衛細胞長度與倍性的相關性[J],麥類作物學報,2014,2:007)結合流式細胞術對所獲得的再生植株是否為單倍體植株進行鑒定。

具體而言,可剪取取小孢子培養再生苗葉尖(約1-2cm長),放入卡諾氏固定液(無水乙醇∶冰乙酸=3∶1體積比)中,浸泡至葉片完全褪色,在蒸餾水中漂洗后置于40倍顯微鏡下觀察,氣孔保衛細胞長度值在37μm以下基本可以判定是單倍體苗。

流式細胞術鑒定方法:剪取小孢子培養再生苗葉尖(約1-2cm長),放入1.5ml離心管中,浸入液氮速凍后用磨樣杵研磨成細小顆粒,加入LB01緩沖溶液0.5ml,重懸,加入熒光染料PI(碘化丙啶)和RNA酶(使用BD公司PI/RNaseDNA染色試劑),混勻靜置15min,采用40μm篩網過濾,濾液使用BDAccuriC6流式細胞儀檢測倍性,利用二倍體種子發芽苗作為二倍體對照峰,檢出小孢子培養再生植株中的單倍體植株。

2、單倍體植株分蘗節基部叢生芽誘導

單倍體植株在1/2MS生根壯苗培養基上誘導生根后,移出培養瓶,洗凈根部培養基,用海綿固定在泡沫板上,轉移到盛有自來水的中轉箱里,放置溫室中漂浮培養1-2天,進行煉苗。溫室溫度為白天20-25℃,晚上16-20℃,10-16小時光照。煉苗結束后轉移到1/2Hoagland溶液中培養,每3-4天更換一次培養液,約1個月可形成多個分蘗。

剝除單倍體植株外部葉片,保留基部長度為8cm左右的莖段,將收集的莖段用自來水快速沖洗,洗凈表面灰塵,再用酒精漂洗,無菌水沖洗,對莖段表面進行殺菌,瀝干水分加入30%NaClO溶液邊浸泡邊振蕩10~15min后用無菌水沖洗3~4次,瀝干。在超凈臺上用解剖刀剝去外部較大葉片和多余部分,保留基部分蘗節部位1cm左右,接種到含0.3-0.8mg/LTDZ的1/2MS叢生芽誘導培養基上培養誘導出芽,培養溫度為20-26℃,優選23±1℃,光周期為8-14h·d-1,優選約10h·d-1。

約1個月可見基部有新芽生出,當新芽伸展至1-2cm長時,切除新芽轉移到叢生芽增殖培養基上。培養條件同前,可培養大約4-6周。

叢生芽增殖培養基以1/2MS培養基配制,除含有1/2MS培養基的成分外,還添加有300-500mg/L水解干酪素(CH)、10-30mg/L亞精胺(Spd)、0.6-1.2mg/LTDZ(噻二唑苯基脲)、0.8-1.2mg/L多效唑(MET)。

在一個具體實施例中,所述從分蘗節基部直接誘導叢生芽培養基中,TDZ(噻二唑苯基脲)為0.5mg/L。

在一優選實施例中,叢生芽增殖培養基中,CH為400mg/L,Spd為20mg/L,TDZ為1.0mg/L,MET為1.0mg/L。

3、完整單倍體植株的獲得

對于叢生芽增殖培養基上生長達到6周左右的叢生芽,分割成單芽,轉移到1/2MS空白培養約4周后,使植株內源激素下降到一個低水平后,再轉移到生根誘導培養基上誘導生根,形成完整再生植株。

生根誘導培養基以1/2MS培養基配制,除含有1/2MS培養基的成分外,還添加NAA0.03-0.08mg/L和MET0.8-1.2mg/L。

在一個具體實施例中,所述從生根誘導培養基中,萘乙酸為0.05mg/L,多效唑(MET)為1.0mg/L。

4、單倍體植株擴繁群體的穩定性評價

對于從分蘗節基部分生組織直接誘導叢生芽,經過增殖、壯苗和生根培養獲得的再生植株群體,對繼代3-4代后的植株的生長速度和外部形態特征(包括葉色和葉片粗壯程度)進行觀察。

應理解,適用于本發明方法的禾谷類作物包括但不限于大麥、小麥、水稻等。

本發明也包括用于實施上述方法的試劑盒,所述試劑盒尤其含有:

(1)以1/2MS培養基配制的叢生芽誘導培養基,所述叢生芽誘導培養基除含有1/2MS培養基的成分外,還添加有0.3-0.8mg/LTDZ;和

(2)以1/2MS培養基配制的叢生芽增殖培養基,所述叢生芽增殖培養基除含有1/2MS培養基的成分外,還添加有300-500mg/L水解干酪素(CH)、10-30mg/L亞精胺(Spd)、0.6-1.2mg/LTDZ(噻二唑苯基脲)、0.8-1.2mg/L多效唑(MET)。

在一個具體實施例中,所述試劑盒還含有:

(3)生根誘導培養基,該培養基以1/2MS培養基配制,除含有1/2MS培養基的成分外,還添加NAA0.03-0.08mg/L和MET0.8-1.2mg/L。

在一個具體實施例中,所述試劑盒還含有:

(4)N6誘導培養基,該培養基以N6培養基為基礎,所不同的是含有0-2500mg/L的KNO3和0-400mg/L的(NH4)SO4,并添加有400-2500mg/L的水解干酪素和400-2500mg/L的谷氨酰胺;

(5)分化培養基,具體是以2/3MS為基本培養基,其中加有6-BA0.3-1.2mg/L、KT0.5-2.0mg/L、NAA0.01-0.1mg/L、麥芽糖10-50g/L以及肌醇95-105mg/L,pH為5.5-6.2;以及

(6)生根壯苗培養基,該培養基以1/2MS為基礎,含有1/2MS培養基的成分外,還添加有NAA0.03-0.08mg/L、多效唑(MET)0.8-1.2mg/L和蔗糖10-40g/L,pH5.6-6.0。

上述(1)到(6)中所述的各培養基中的各成分的濃度均可適當改變,其優選的濃度范圍可如本說明書上下文所述。

以下將以具體實施例的方式描述本發明。應理解,本發明并不限于具體實施例所描述的方案。實施例中所采用到的方法、試劑,除非另有說明,否則按常規的方法實施所述方法、使用所述試劑。

實施例

1.游離小孢子培養獲得再生植株

取大田或溫室種植的大麥幼穗,進行2-3周的低溫預處理,按已報道程序游離小孢子,進行小孢子培養,獲得再生植株(具體方法見陸瑞菊,南京農業大學2012博士論文,或見CN201310596632.4)。

2.再生植株倍性鑒定

剪取取小孢子培養再生苗葉尖(約1-2cm長),放入卡諾氏固定液(無水乙醇∶冰乙酸=3∶1體積比)中,浸泡至葉片完全褪色,在蒸餾水中漂洗后置于40倍顯微鏡下觀察,氣孔保衛細胞長度值在37μm以下基本可以判定是單倍體苗(方法參見前述何婷等2014年公開發表論文)。

流式細胞術鑒定方法:剪取取小孢子培養再生苗葉尖(約1-2cm長),放入1.5ml離心管中,浸入液氮速凍后用磨樣杵研磨成細小顆粒,加入LB01緩沖溶液0.5ml,重懸,加入熒光染料PI(碘化丙啶)和RNA酶(使用BD公司PI/RNaseDNA染色試劑),混勻靜置15min,采用40μm篩網過濾,濾液使用BDAccuriC6流式細胞儀檢測倍性,利用二倍體種子發芽苗作為二倍體對照峰,檢測出小孢子培養再生植株中的單倍體植株。

3.單倍體再生植株的培養和分蘗節取材

單倍體植株在含0.05mg/L萘乙酸的1/2MS培養基上誘導生根后,移出培養瓶,洗凈根部培養基,用海綿固定在泡沫板上,轉移到盛有自來水的中轉箱里,放置溫室中漂浮培養1-2天,進行煉苗。溫室溫度為白天22℃,晚上18℃,12小時光照。

煉苗結束后轉移到1/2Hoagland溶液中培養,每4天更換一次培養液,約1個月可形成多個分蘗。

4.單倍體植株的分蘗節的剝取和消毒接種

剝除外部葉片保留基部長度為8cm左右的莖段,將收集的莖段用自來水快速沖洗5min洗凈表面灰塵,再用75%酒精漂洗30s,無菌水沖洗3~4次,對莖段表面進行殺菌,瀝干水分加入30%NaClO溶液邊浸泡邊振蕩10~15min后用無菌水沖洗3~4次,瀝干。在超凈臺上用解剖刀剝去外部較大葉片和多余部分,保留基部分蘗節部位1cm左右,接種到誘導培養基中啟動叢生芽的萌發。

5.分蘗節基部分生組織直接誘導叢生芽和增殖

對于接種的分蘗節基部,置于含0.5mg/LTDZ的1/2MS培養基直接誘導培養,培養溫度(23±1℃),光周期10h·d-1。約1個月可見基部有新芽生出,當新芽伸展至1-2cm長時,切除新芽轉移到增殖培養基上(1/2MS+CH400mg/L,Spd20mg/L,TDZ1.0mg/L,MET1.0mg/L),培養條件同前。通過上述增殖培養,增殖系數可達4.1以上,再生叢生芽生長健壯,葉色常綠。

6.單芽的生根誘導

對于增殖培養基上生長達到6周的叢生芽,分割成單芽,轉移到1/2MS空白培養4周后,使植株內源激素下降到一個低水平后,再轉移到生根誘導培養基上(1/2MS+NAA0.05mg/L,MET1.0mg/L)誘導生根,形成完整再生植株。

7.單倍體植株經叢生芽誘導再生植株的穩定性評價

對于從分蘗節基部分生組織直接誘導叢生芽,經過增殖、壯苗和生根培養獲得的再生植株群體,對繼代3-4代后的植株的生長速度和外部形態特征(包括葉色和葉片粗壯程度)進行觀察,參照上述倍性鑒定方法進行倍性分析,結果表明,上述單倍體群體經過繼代3-4代后仍能保持原有植株的正常生長特性,倍性檢測表明,97%以上的植株仍然保持其單倍性。

雖然以具體實施例的方式闡述了本發明,但因理解,本發明并不限于具體實施例中所采取的具體步驟、條件和參數。在不偏離本發明精神和范圍的前提下對本發明作出的各種修改和變動都應落入在本發明的保護范圍之內。

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