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多取代的胰島素.pdf

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取代 胰島素
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摘要
申請專利號:

CN201280029002.2

申請日:

20120614

公開號:

CN103596584A

公開日:

20140219

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K38/28,C07K1/107,C07K14/62,A61K38/00 主分類號: A61K38/28,C07K1/107,C07K14/62,A61K38/00
申請人: 諾沃—諾迪斯克有限公司
發明人: T.赫格-延森,P.馬德森,J.施佩茨勒,T.M.塔格莫塞
地址: 丹麥鮑斯韋
優先權: 11170009.2,61/499203
專利代理機構: 中國專利代理(香港)有限公司 代理人: 周李軍;楊思捷
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201280029002.2

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明關于一種包含至少兩個白蛋白結合部分的胰島素衍生物,其中所述白蛋白結合部分包含脂肪二酸取代;以及一種通過酰化和/或還原性烷基化用于制備所述胰島素衍生物的方法。本發明還涉及一種包含所述胰島素衍生物的藥物。

權利要求書

1.?一種以下通式的可溶性胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽:,其中a.?Ins代表包含B29賴氨酸或B29精氨酸殘基和/或A22賴氨酸殘基的胰島素,b.?X、X和X為脂肪二酸取代,并且X為任選,其中所述脂肪二酸取代包含14-20個碳原子,c.?Z、Z和Z分別為Ins與X、X和X之間的連接基,和d.?n、m和p為0或1。2.?權利要求1的可溶性胰島素衍生物或在藥學上可接受的鹽,其用作藥物的用途。3.?前述權利要求中任一項的以下通式的可溶性胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽:,其中a.?Ins代表包含B29賴氨酸或B29精氨酸殘基和/或A22賴氨酸殘基的胰島素,b.?X、X和X為脂肪二酸取代并且分別位于選自以下的位置:B29賴氨酸、A22賴氨酸、A鏈的N-末端、B鏈的N-末端,其中所述脂肪二酸取代包含14-20個碳原子,c.?Z、Z和Z分別為Ins與X、X和X之間的連接基,和d.?n、m和p為0或1。4.?前述權利要求中任一項的以下通式的可溶性胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽:,其中a.?Ins代表包含B29賴氨酸或B29精氨酸殘基和/或A22賴氨酸殘基的胰島素,b.?X、X和X為脂肪二酸取代并且分別位于選自以下的位置:A22賴氨酸、A鏈的N-末端、B鏈的N-末端,其中所述脂肪二酸取代包含14-20個碳原子,c.?Z、Z和Z分別為Ins與X、X和X之間的連接基,和d.?n、m和p為0或1。5.?前述權利要求中任一項的以下通式的可溶性胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中a.?Ins代表包含B29賴氨酸或B29精氨酸殘基和/或A22賴氨酸殘基的胰島素,b.?X、X和X為脂肪二酸取代并且分別位于選自以下的位置:B29賴氨酸、A22賴氨酸、B鏈的N-末端,其中所述脂肪二酸取代包含14-20個碳原子,c.?Z、Z和Z分別為Ins與X、X和X之間的連接基,和d.?n、m和p為0或1。6.?前述權利要求中任一項的通式XZ-Ins-ZX的可溶性胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中a.?Ins代表包含B29賴氨酸或B29精氨酸殘基和/或A22賴氨酸殘基的胰島素,b.?X和X為脂肪二酸取代,其中所述脂肪二酸取代包含14-20個碳原子,c.?Z和Z分別為Ins與X和X之間的連接基,和d.?n和m為0或1。7.?前述權利要求中任一項的通式XZ-Ins-ZX的可溶性胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中a.?Ins代表包含B29賴氨酸或B29精氨酸殘基和/或A22賴氨酸殘基的胰島素,b.?X和X為脂肪二酸取代并且分別位于選自以下的位置:B29賴氨酸、A22賴氨酸、A鏈的N-末端、B鏈的N-末端,其中所述脂肪二酸取代包含14-20個碳原子,c.?Z和Z分別為Ins與X和X之間的連接基,和d.?n和m為0或1。8.?前述權利要求中任一項的可溶性胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中所述脂肪酸取代選自從Chem.?1和Chem.?2選取的延伸部分:Chem?1:HOOC-(CH)-CO-*Chem?2:HOOC-CH-O-(CH)-CO-*其中x為10-20的整數,并且y為6-14的整數。9.?前述權利要求中任一項的可溶性胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中所述脂肪酸取代選自從Chem.?1和Chem.?2選取的延伸部分:Chem?1:HOOC-(CH)-CO-*Chem?2:HOOC-CH-O-(CH)-CO-*其中x為14、16或18,并且y為8、10或12。10.?前述權利要求中任一項的可溶性胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中所述脂肪二酸取代在選自A1、A22、B1和B29的位置,連接于所述胰島素中的氨基酸殘基。11.?前述權利要求中任一項的可溶性胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中所述脂肪二酸取代經由連接基與所述胰島素的氨基酸殘基連接。12.?前述權利要求中任一項的可溶性胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中所述連接基包含一個或多個選自以下的連接基組分:α-L-Glu、α-D-Glu、γ-L-Glu、γ-D-Glu、α-L-Asp、α-D-Asp、β-L-Asp、β-D-Asp、CPH、IDA和OEG。13.?前述權利要求中任一項的可溶性胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽用作藥物的用途,所述藥物用于治療或預防包括應激性高血糖癥的高血糖癥、2型糖尿病、葡萄糖耐量減低、1型糖尿病、燒傷、手術創傷、在治療中需要合成代謝作用的其它疾病或損傷、心肌梗塞、中風、冠心病、其它心血管病癥,治療重癥糖尿病患者和非糖尿病患者和多發性神經病。14.?前述權利要求中任一項的可溶性胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其選自A22N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基B29N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基A22K?desB30人胰島素、A22N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A22K?desB30人胰島素、A22N-十四烷二酰基-γ-L-谷氨酰基B29N-十四烷二酰基-γ-L-谷氨酰基A22K?desB30人胰島素、A22N-十八烷二酰基-γ-D-谷氨酰基B29N-十八烷二酰基-γ-D-谷氨酰基A22K?desB30人胰島素、A22N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基B29N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基A14E?A22K?B25H?desB30人胰島素、A22N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?A22K?B25H?desB30人胰島素、A1N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基B29N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基A14E?B25H?desB30人胰島素、A1N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基B29N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基desB30人胰島素、A1N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB30人胰島素、A1N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-氨基甲基-芐基B1N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB27?desB30人胰島素、A1N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-氨基甲基-芐基B1N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB30人胰島素、A1N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-氨基甲基-芐基B1N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB27?desB30人胰島素、A1N-十四烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-氨基甲基-芐基B1N-十四烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB27?desB30人胰島素、A1N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG4-氨基甲基-芐基B1N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB30人胰島素、B1N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-氨基甲基-芐基B29N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB30人胰島素、A1N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B1N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B29N十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB30人胰島素、A1N-十八烷二酰基-N-羧甲基-β-丙氨酰基B29N-十八烷二酰基-N-羧甲基-β-丙氨酰基A14E?B25H?desB30人胰島素、A1N十八烷二酰基-N-2-羧乙基-甘氨酰基B29N-十八烷二酰基-N-2-羧乙基-甘氨酰基A14E?B25H?desB30人胰島素、A1N-十八烷二酰基-N-羧甲基-β-丙氨酰基A22N-N-十八烷二酰基-N-羧甲基-β-丙氨酰基A22K?B29R?desB30人胰島素、A22N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB30人胰島素、A1N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB30人胰島素、A1N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29N-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B16H?B25H?desB30人胰島素、A1N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B1N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?B29R?desB30人、A22N-二十烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29N-二十烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?A22K?B25H?desB30人胰島素、B1N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B29N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B16H?B25H?desB30人胰島素、B1N-(十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?B29N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?desB30人胰島素、B1N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-氨基甲基-芐基B29N-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB27?desB30人胰島素、A22N-4-羧基苯氧基-癸酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29N-4-羧基苯氧基-癸酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?A22K?B25H?desB30人胰島素。15.?一種用于制備上述權利要求中任一項的胰島素衍生物的方法,所述方法包括酰化或烷基化的步驟。

說明書

技術領域

本發明涉及可用于治療糖尿病和相關方面的新的胰島素衍生物。

背景

在哺乳動物中,胰島素降低血糖,并且用于治療1型和2型糖尿病,目的是調節血糖朝向健康水平。在健康的人體中,在禁食狀態期間血糖水平被調節至接近5?mM,而在餐后幾小時內,可出現升高到10?mM的值。血糖水平受到許多因素的影響,例如進餐時間和特征,以及胰島素服用、鍛煉、感染等。在糖尿病患者中,血糖可寬泛地波動并且不可預測,并且可在一名患者中在1-30?mM范圍內波動。

糖尿病患者受益于基礎胰島素藥物的恒定供應,因為天然胰島素從身體快速清除。為了限制維持基礎胰島素水平所需的注射次數,使用各種延長原理來設計胰島素,例如結晶或化學衍生。

與循環蛋白(例如血清白蛋白)的可逆結合也可為延長藥物的體內活性的一個因素。對于胰島素和其它肽,已經通過藥物與脂肪酸、脂肪二酸或相關化合物的結合(任選經由各種連接基結合)來利用白蛋白結合作為延伸要素。

在豬的正葡萄糖鉗夾(euglycemic?glucose-clamp)研究中,已顯示低親和力胰島素類似物對于葡萄糖利用率造成與高親和力類似物一樣的等價總體效果,表明對于低親和力和高親和力類似物兩者,胰島素生物活性可能類似。然而,當與高親和力類似物相比時,低親和力類似物在更長的時間段期間發揮它們的效果(參見例如Ribel,U.等人,Equivalent?in?vivo?biological?activity?of?insulin?analogues?and?human?insulin?despite?different?in?vitro?potencies(胰島素類似物和人胰島素的等價體內生物活性,盡管體外潛能不同)。Diabetes?39,1033-1039?(1990),附摘要)。

WO1999/032116和WO1999/021578關于脂肪酸-酰化的胰島素,WO1999/022754、WO1999/032116、WO1999/021578、JP1254699通過吸入而服用脂肪酸二酰化和三酰化的胰島素或胰島素類似物,US3868356涉及胰島素與二羧酸官能衍生物(例如,酸酐)的酰化。

仍需要具有延長的體內活性的基礎胰島素藥物。

概述

本發明關于一種包含兩個或更多個取代的胰島素衍生物,每個所述取代包含脂肪二酸取代,所述胰島素衍生物任選包含胰島素與脂肪酸取代之間的連接基。

本發明還關于通過胰島素的酰化和/或還原性烷基化來制備所述胰島素衍生物或其藥物鹽的方法。

本發明涉及一種用于治療糖尿病或相關方面的胰島素衍生物并且可因此用作藥物。

描述

本發明涉及一種胰島素,其被至少兩個白蛋白結合部分取代,每個所述白蛋白結合部分包含延伸部分,該延伸部分更具體地為脂肪二酸取代。任選地,白蛋白結合部分還包含各種連接基。通過酰化和/或還原性烷基化,實現根據本發明的胰島素衍生,相對于天然的人胰島素,所得到的胰島素衍生物實現提高的白蛋白親和力和體內循環次數。

本發明還提供了一種用于B1殘基(例如,胰島素的B鏈的N-末端)還原性烷基化的方法。

本發明還提供了一種用于A1殘基(例如,胰島素的A鏈的N-末端)還原性烷基化的方法。

本發明的目的是克服或改善現有技術的至少一個缺點,或者提供可用的備選。

本發明還可解決其它問題,由示例性實施方案的公開將顯而易見。

發現用至少兩個脂肪二酸取代胰島素或胰島素類似物能使胰島素與人血清白蛋白結合并且延長體內胰島素供應,保持IR-結合性質。這一點是有利的,因為根據本發明的取代對于僅具有非常少的(例如,2-6個)突變的胰島素類似物也是可能的,從而本發明提供了以下選項:延長胰島素的胰島素體內供應并維持與天然的人胰島素非常類似的胰島素主鏈。

在本發明的一方面,當與單取代的胰島素衍生物相比時,被至少兩個脂肪二酸取代的胰島素衍生物對白蛋白的親和力提高。

在本發明的一方面,當與單取代的胰島素衍生物相比時,延長效果提高。

本發明的胰島素衍生物為長效的,并且在一方面,它們顯示在皮下貯存中低聚合的提高的趨勢,能夠減慢向循環的擴散。

在一方面,根據本發明的胰島素衍生物對白蛋白的親和力隨著提高的脂肪二酸鏈長度而升高。

在一方面,根據本發明的胰島素衍生物與白蛋白的親和力隨著脂肪二酸鏈增加到22個碳原子而升高。

在一方面,隨著脂肪二酸鏈增加到22個碳原子,胰島素衍生物保持總體親水。

在一方面,根據本發明的至少兩個白蛋白結合部分的延長效果隨著提高的脂肪二酸鏈長度而升高。

在一方面,根據本發明的至少兩個白蛋白結合部分的延長效果隨著脂肪二酸鏈增加到22個碳原子而升高。

在一個實施方案中,根據本發明的胰島素衍生物包含由最多22個碳原子組成的脂肪二酸取代。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素衍生物包含由10-22個碳原子組成的脂肪二酸取代。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素衍生物包含由10-20個碳原子組成的脂肪二酸取代。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素衍生物包含由10-18個碳原子組成的脂肪二酸取代。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素衍生物包含由10-16個碳原子組成的脂肪二酸取代。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素衍生物包含由10-14個碳原子組成的脂肪二酸取代。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素衍生物包含由12-20個碳原子組成的脂肪二酸取代。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素衍生物包含由12-18個碳原子組成的脂肪二酸取代。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素衍生物包含由12-16個碳原子組成的脂肪二酸取代。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素衍生物包含由12-14個碳原子組成的脂肪二酸取代。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素衍生物包含由14-20個碳原子組成的脂肪二酸取代。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素衍生物包含由14-18個碳原子組成的脂肪二酸取代。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素衍生物包含由14-16個碳原子組成的脂肪二酸取代。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素衍生物包含由10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個碳原子組成的脂肪二酸取代。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素衍生物包含由14、15、16、17、18、19或20個碳原子組成的脂肪二酸取代。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素衍生物包含由16、17、18、19或20個碳原子組成的脂肪二酸取代。

在本發明的一個實施方案中,胰島素衍生物包含至少2個白蛋白結合部分,其中所述白蛋白結合部分包含脂肪二酸取代,并且其中來自每個所述脂肪二酸取代的一個羧基任選經由連接基與胰島素連接。

在本發明的一個實施方案中,胰島素衍生物包含至少3個白蛋白結合部分,其中所述白蛋白結合部分包含脂肪二酸取代,并且其中來自每個所述脂肪二酸取代的一個羧基任選經由連接基與胰島素連接。

在本發明的一個實施方案中,胰島素衍生物包含2個或3個白蛋白結合部分,其中所述白蛋白結合部分包含脂肪二酸取代,并且其中來自每個所述脂肪二酸取代的一個羧基任選經由連接基與胰島素連接。

在本發明的一個實施方案中,胰島素衍生物包含2個白蛋白結合部分,其中所述白蛋白結合部分包含脂肪二酸取代,并且其中來自每個所述脂肪二酸取代的一個羧基任選經由連接基與胰島素連接。

在本發明的一個實施方案中,胰島素衍生物包含2個白蛋白結合部分,其中所述白蛋白結合部分包含脂肪二酸取代,并且其中來自每個所述脂肪二酸取代的一個羧基任選經由連接基與胰島素中的氨基酸殘基連接。

在本發明的一個實施方案中,胰島素衍生物包含2個白蛋白結合部分,其中所述白蛋白結合部分包含脂肪二酸取代,并且其中來自每個所述脂肪二酸取代的一個羧基任選經由連接基與胰島素中位于以下任何位置的氨基酸殘基連接:A22、B29或胰島素的A鏈的N-末端氨基酸殘基和/或胰島素的B鏈的N-末端氨基酸殘基。

在本發明的一個實施方案中,胰島素衍生物包含3個白蛋白結合部分,其中所述白蛋白結合部分包含脂肪二酸取代,并且其中來自每個所述脂肪二酸取代的一個羧基任選經由連接基與胰島素連接。

在本發明的一個實施方案中,胰島素衍生物包含3個白蛋白結合部分,其中所述白蛋白結合部分包含脂肪二酸取代,并且其中來自每個所述脂肪二酸取代的一個羧基任選經由連接基與胰島素中的氨基酸殘基連接。

在本發明的一個實施方案中,胰島素衍生物包含3個白蛋白結合部分,其中所述白蛋白結合部分包含脂肪二酸取代,并且其中來自每個所述脂肪二酸取代的一個羧基任選經由連接基與胰島素中位于以下任何位置的氨基酸殘基連接:A22、B29、胰島素的A鏈的N-末端氨基酸殘基和/或胰島素的B鏈的N-末端氨基酸殘基。

在本發明的一個實施方案中,胰島素衍生物由通式Chem?1表示:

Chem.?1:????????????????????????????????????????????????,

其中Ins代表包含B29賴氨酸或B29精氨酸殘基和/或A22賴氨酸殘基的胰島素,X、X1和X2為脂肪二酸取代,并且X2為任選的,Z、Z1和Z2分別為Ins與X、X1和X2之間的連接基,并且n、m和p為0或1。

在本發明的一個實施方案中,胰島素衍生物由通式Chem?1表示,其中Ins代表包含B29賴氨酸或B29精氨酸殘基和/或A22賴氨酸殘基的胰島素,X、X1和X2為脂肪二酸取代并且分別位于選自以下的位置:B29賴氨酸、A22賴氨酸、A鏈的N-末端、B鏈的N-末端,Z、Z1和Z2分別為Ins與X、X1和X2之間的連接基,并且n、m和p為0或1。

在本發明的一個實施方案中胰島素衍生物由通式Chem?2表示:

Chem?2:XZn-Ins-Z1mX1,

其中Ins代表包含B29賴氨酸或B29精氨酸殘基和/或A22賴氨酸殘基的胰島素,X和X1為脂肪二酸取代,Z和Z1分別為Ins與X和X1之間的連接基,并且n和m為0或1。

在本發明的一個實施方案中,胰島素衍生物由通式Chem.?2表示,其中Ins代表包含B29賴氨酸或B29精氨酸殘基和/或A22賴氨酸殘基的胰島素,X和X1為脂肪二酸取代并且分別位于選自以下的位置:B29賴氨酸、A22賴氨酸、A鏈的N-末端、B鏈的N-末端,Z和Z1分別為Ins與X和X1之間的連接基,并且n和m為0或1。

本文使用的“Z、Z1和Z2分別為Ins與X、X1和X2之間的連接基”或“Z和Z1分別為Ins與X和X1之間的連接基”是指Z、Z1或Z2為胰島素(Ins)中的氨基酸與相應的延伸部分X、X1或X2之間的連接基。更具體地,這意味著Z為胰島素(Ins)與延伸部分X之間的連接基,Z1為胰島素(Ins)與延伸部分X1之間的連接基,并且Z2為胰島素(Ins)與延伸部分X2之間的連接基。

Chem.?1和Chem.?2的字母n、m和p獨立地表示在胰島素衍生物中表示的連接基(分別為Z、Z1和Z2)的數量,并且n、m和p為0或1。更具體地,這意味著當n為0時,在Chem.1或Chem.?2中在胰島素(Ins)和延伸部分(X)之間不存在連接基,當m為0時,在Chem.1或Chem.?2中在胰島素(Ins)和延伸部分(X1)之間不存在連接基,當p為0時,在Chem.1中在胰島素(Ins)和延伸部分(X2)之間不存在連接基,當n為1時,在Chem.1或Chem.?2中在胰島素(Ins)和延伸部分(X)之間存在一個連接基,當m為1時,在Chem.1或Chem.?2中在胰島素(Ins)和延伸部分(X1)之間存在一個連接基,當p為1時,在Chem.1中在胰島素(Ins)和延伸部分(X2)之間存在一個連接基。

白蛋白結合部分(例如,在式Chem.1和Chem.?2中的ZnX)、延伸部分(例如,在式Chem.1和Chem.?2中的X)或連接基(例如,在式Chem.1和Chem.?2中的Z)可通過酰化和/或還原性烷基化與胰島素的A鏈和/或B鏈的賴氨酸殘基或N-末端共價連接。

在一個實施方案中,胰島素類似物相對于人胰島素包含少于10個氨基酸修飾(取代、刪除、添加(包括插入)和它們的任何組合),或者相對于人胰島素少于9、8、7、6、5、4、3、2或1個修飾。

指明鏈(A或B)、位置和取代天然氨基酸殘基的氨基酸殘基所用的一個或三個字母編碼,以表示胰島素分子中的修飾。

在一個實施方案中,根據本發明的胰島素衍生物包含至少2個白蛋白結合部分。

在一個實施方案中,根據本發明的胰島素衍生物的白蛋白結合部分(例如,Chem.?1的ZnX)包含延伸部分,所述延伸部分也可指示為脂肪二酸取代(例如,在Chem.1中的X)。

在一個實施方案中,根據本發明的胰島素衍生物的每一個白蛋白結合部分包含延伸部分和任選的連接基(例如,在Chem.1中的Zn,其中n為1)。

在一個實施方案中,優選包含延伸部分和連接基的白蛋白結合部分的活性酯與賴氨酸殘基的氨基(優選其ε氨基)藉由形成酰胺鍵而共價連接(該過程稱為酰化)。

在一個實施方案中,優選包含延伸部分(例如,X,Chem.1)和連接基(例如,Zn,其中n為1,Chem.?1)的白蛋白結合部分的活性酯(例如,ZnX,Chem.1)與賴氨酸殘基的氨基(優選其ε氨基)和/或A鏈或B鏈N-末端中的氨基酸殘基的氨基藉由形成酰胺鍵而共價連接(該過程稱為酰化)。

在一個實施方案中,優選包含延伸部分和連接基的白蛋白結合部分的醛衍生物通過還原性烷基化與A鏈N-末端中的α-氨基或B鏈N-末端中的α-氨基共價連接,或者醛衍生物在A鏈和/或B鏈的N-末端氨基酸殘基處還原性烷基化。

在一個實施方案中,優選包含延伸部分和連接基的白蛋白結合部分的醛衍生物通過還原性烷基化與賴氨酸殘基(優選其ε-氨基)共價連接。

在一個實施方案中,根據本發明的胰島素在B29位包含精氨酸殘基,并且在A22賴氨酸處而不是在B29位被白蛋白結合部分取代。

在一個實施方案中,期望根據本發明的胰島素衍生物在A22位包含一個白蛋白結合部分,在胰島素中的另一個氨基酸位置包含一個白蛋白結合部分,并且在B29位不含白蛋白結合部分,經受取代的胰島素在B29位包含精氨酸殘基。

在一個實施方案中,期望根據本發明的胰島素衍生物在A22位包含一個白蛋白結合部分,在胰島素的另一個氨基酸位置(例如胰島素的B29位)包含一個白蛋白結合部分,經受取代的胰島素可在B29位包含賴氨酸殘基。

在一個實施方案中,根據本發明的胰島素在A22賴氨酸和B29賴氨酸處被白蛋白結合部分取代。

在一個實施方案中,每一個白蛋白結合部分(例如,ZnX,Chem.1)包含獨立地選自Chem.?3和Chem.?4的延伸部分(例如,X):

Chem.?3:HOOC-(CH2)x-CO-*

Chem.?4:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*

其中x為10-20的整數,y為6-14的整數。

在一個實施方案中,Chem.?1或Chem.?2的X選自Chem.?3和Chem.?4:

Chem.?3:HOOC-(CH2)x-CO-*

Chem.?4:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*

其中x為10-20的整數,y為6-14的整數。

在一個實施方案中,Chem.?1或Chem.?2的X1選自Chem.?3和Chem.?4:

Chem.?3:HOOC-(CH2)x-CO-*

Chem.?4:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*

其中x為10-20的整數,y為6-14的整數。

在一個實施方案中,Chem.?2的X2選自Chem.?3和Chem.?4:

Chem.?3:HOOC-(CH2)x-CO-*

Chem.?4:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*

其中s為10-20的整數,t為6-14的整數。

在一個實施方案中,Chem.?1或Chem.?2的X、X1和X2獨立地選自Chem.?3和Chem.?4:

Chem.?3:HOOC-(CH2)x-CO-*

Chem.?4:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*

其中x為10-20的整數,y為6-14的整數。

在一個實施方案中,Chem.?3的*-(CH2)x-*是指直鏈或支化(優選直鏈)亞烷基,其中x為10-20的整數。

在另一實施方案中,Chem.?4的*-(CH2)y-*是指直鏈或支化(優選直鏈)亞烷基,其中y為6-14的整數。

在一個實施方案中,Chem.?3的*-(CH2)x-*是指直鏈或支化(優選直鏈)亞烷基,其中x為12-20的整數。

在另一實施方案中,Chem.?4的*-(CH2)y-*是指直鏈或支化(優選直鏈)亞烷基,其中y為6-12的整數。

在一個實施方案中,Chem.?3的*-(CH2)x-*是指直鏈或支化(優選直鏈)亞烷基,其中x為14-20的整數。

在另一實施方案中,Chem.?4的*-(CH2)y-*是指直鏈或支化(優選直鏈)亞烷基,其中y為6-10的整數。

在一個實施方案中,Chem.?3的*-(CH2)x-*是指直鏈或支化(優選直鏈)亞烷基,其中x為14-16的整數。

在另一實施方案中,Chem.?4的*-(CH2)y-*是指直鏈或支化(優選直鏈)亞烷基,其中y為6-8的整數。

在一個實施方案中,Chem.?3的*-(CH2)x-*是指直鏈或支化(優選直鏈)亞烷基,其中x為12-18的整數。

在另一實施方案中,Chem.?4的*-(CH2)y-*是指直鏈或支化(優選直鏈)亞烷基,其中y為8-10的整數。

在一個實施方案中,Chem.?3的*-(CH2)x-*是指直鏈或支化(優選直鏈)亞烷基,其中x為14-18的整數。

在另一實施方案中,Chem.?4的*-(CH2)y-*是指直鏈或支化(優選直鏈)亞烷基,其中y為8-12的整數。

在一個實施方案中,Chem.?3的*-(CH2)x-*是指直鏈或支化(優選直鏈)亞烷基,其中x為10-16的整數。

在另一實施方案中,Chem.?4的*-(CH2)y-*是指直鏈或支化(優選直鏈)亞烷基,其中y為8-14的整數。

在一個實施方案中,Chem.?3的*-(CH2)x-*是指直鏈或支化(優選直鏈)亞烷基,其中x為整數并且選自12、14、16、18和20。

在另一實施方案中,Chem.?4的*-(CH2)y-*是指直鏈或支化(優選直鏈)亞烷基,其中y為整數并且選自6、8、10、12和14。

在一個實施方案中,Chem.?3的*-(CH2)x-*是指直鏈或支化(優選直鏈)亞烷基,其中x為整數并且選自14、16、18和20。

在另一實施方案中,Chem.?4的*-(CH2)y-*是指直鏈或支化(優選直鏈)亞烷基,其中y為整數并且選自8、10和12。

在一個實施方案中,脂肪二酸的一個酸基與所述胰島素中的賴氨酸殘基的ε氨基形成酰胺鍵,優選經由連接基。

本文使用的術語“經受取代的胰島素”是指通過本文提供的方法處理的胰島素,像被白蛋白結合部分取代的胰島素,得到根據本發明的胰島素衍生物。

術語"脂肪二酸"是指在ω位具有另外的羧酸基的脂肪酸。因此,脂肪二酸為二羧酸。

命名法按本領域慣常的,例如在上式中,*-COOH以及HOOC-*是指羧基;*-C6H4-*是指亞苯基;*-CO-*以及*-OC-*是指羰基(O=C<**)。

在特定的實施方案中,芳族(例如苯氧基和亞苯基)可獨立地為鄰、間或對位。

在一個實施方案中,根據本發明的胰島素衍生物包含至少2個白蛋白結合部分,每一個白蛋白結合部分包含選自Chem.?3或Chem.?4的延伸部分。

在一個實施方案中,根據本發明的胰島素衍生物包含至少2個白蛋白結合部分,每一個白蛋白結合部分包含選自Chem.?3或Chem.?4的延伸部分,并且白蛋白結合部分任選還包含連接基,其中每一個連接基包含式Chem.?5、Chem.?6、Chem.?7、Chem.?8、Chem.?9、Chem.?10和/或Chem.?11的一個或多個連接基組分。

在一個實施方案中,根據本發明的胰島素衍生物包含至少2個白蛋白結合部分,每一個白蛋白結合部分包含選自Chem.?3或Chem.?4的延伸部分,并且白蛋白結合部分還包含連接基(其可指示為Z)。

在一個實施方案中,連接基包含式Chem.?5、Chem.?6、Chem.?7、Chem.?8、Chem.?9、Chem.?10和/或Chem.?11的一個或多個連接基組分。

在一個實施方案中,根據本發明的連接基組分可指示為e。

在一個實施方案中,連接基(Z)包含兩個連接基組分,其可指示為e1-e2,說明相對于彼此的排列,例如,連接基組分e1與連接基組分e2連接。

在一個實施方案中,連接基(Z)包含三個連接基組分,其可指示為e1-e2-e3,說明相對于彼此的排列,例如,連接基組分e1與連接基組分e2連接,并且連接基組分e2與連接基組分e1和連接基組分e3連接。

在一個實施方案中,連接基(Z)包含四個連接基組分,其可指示為e1-e2-e3-e4,說明相對于彼此的排列,例如,連接基組分e1與連接基組分e2連接,并且連接基組分e2與連接基組分e1和連接基組分e3連接,并且連接基組分e3與連接基組分e4連接。

在一個實施方案中,連接基(Z)包含四個連接基組分,其可指示為e1-e2-e3-e4-e5,說明相對于彼此的排列,例如,連接基組分e1與連接基組分e2連接,并且連接基組分e2與連接基組分e1和連接基組分e3連接,連接基組分e3與連接基組分e4連接,并且e4與連接基組分e5連接。

在一個實施方案中,連接基(Z)包含四個連接基組分,其可指示為e1-e2-e3-e4-e5-e6,說明相對于彼此的排列,例如,連接基組分e1與連接基組分e2連接,并且連接基組分e2與連接基組分e1和連接基組分e3連接,連接基組分e3與連接基組分e4連接,e4與連接基組分e5連接,并且e5與連接基組分e6連接。

在一個實施方案中,本發明的連接基中,用最高的數字(例如,連接基e1-e2-e3-e4中的e4或連接基e1-e2-e3中的e3)指示的連接基組分與延伸部分(即,脂肪二酸)連接。

本發明的衍生物的連接基可包含以下第一連接基組分:

Chem?5:

其中k為1-5的整數,并且n為1-5的整數。

在一個特定的實施方案中,當k=1并且n=1時,該連接基組分可指示為OEG,或8-氨基-3,6-二氧雜辛酸的雙基,和/或其可用下式表示:

Chem.?5a:

*-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*。

在一個實施方案中,獨立地或與一個或多個其它連接基組分組合,本發明的衍生物的每一個連接基還包含第二連接基組分,優選Glu雙基,例如Chem.?6和/或Chem.?7:

Chem.?6:

Chem.?7:,

其中可包括p倍Glu雙基,其中p為1-3的整數。

Chem.?6也可稱為γ-Glu,或簡稱為g-Glu,因為事實上,在這里用于與另一個連接基組分或與賴氨酸的ε-氨基連接的是氨基酸谷氨酸的γ羧基。其它連接基組分可例如為另一個Glu殘基或OEG分子。Glu的氨基進而與延伸部分的羧基或與例如OEG分子(如果存在)的羧基或與例如另一個Glu(如果存在)的γ-羧基形成酰胺鍵。

Chem.?7也可稱為α-Glu,或簡稱為aGlu,或簡單地Glu,因為事實上,在這里用于與另一個連接基組分或與賴氨酸的ε-氨基或與A鏈或B鏈的N-末端連接的是氨基酸谷氨酸的α羧基。

Chem.?6和Chem.?7的以上結構涵蓋Glu的L-形式以及D-形式。L-形式可指示為γ-L-Glu或gLGlu,而D-形式可指示為γ-D-Glu或gDGlu。在特定的實施方案中,Chem.?6和/或Chem.?7獨立地為a)?L-形式或b)?D-形式。

在一個實施方案中,獨立地或與一個或多個其它連接基組分組合,本發明的衍生物的每一個連接基還包含第二連接基組分,優選Asp雙基,例如Chem.?8和/或Chem.?9:

Chem.?8:

Chem.?9:,

其中可包括p倍Asp雙基,其中p為1-3的整數。

Chem.?8也可稱為β-Asp,或簡稱為bAsp,因為事實上,在這里用于與另一個連接基組分或與賴氨酸的ε-氨基或與A鏈或B鏈的N-末端連接的是氨基酸天冬氨酸的γ羧基。其它連接基組分可例如為另一個Asp殘基或OEG分子。Asp的氨基進而與延伸部分的羧基或與例如OEG分子(如果存在)的羧基或與例如另一個Asp(如果存在)的β-羧基形成酰胺鍵。

Chem.?9也可稱為α-Asp,或簡稱為aAsp,或簡單地Asp,因為事實上,在這里用于與另一個連接基組分或與賴氨酸的ε-氨基連接的是氨基酸天冬氨酸的α羧基。

Chem.?8和Chem.?9的以上結構涵蓋Asp的L-形式以及D-形式。L-形式可指示為β-L-Asp或bLAsp,而D-形式可指示為β-D-Asp或bDAsp。在特定的實施方案中,Chem.?8和/或Chem.?9獨立地為a)?L-形式或b)?D-形式。

在一個實施方案中,獨立地或與其它連接基組分組合,本發明的衍生物的每一個連接基還包含以下第三連接基組分:

Chem.?10:

*-N((CH2)nCOOH)(CH2)mCO-*,n=1-2

其中n和m為1-2的整數。該連接基組分可指示為IDA。

在一個實施方案中,當白蛋白結合部分通過還原性烷基化連接時,獨立地或與其它連接基組分組合,本發明的衍生物的每一個連接基還包含以下連接基組分:

Chem.?11:

*-CH2PhCH2NH-*

該連接基組分可指示為CPH。

在其它特定的實施方案中,連接基具有a)?5-41個C原子;和/或b)?4-28個雜原子。雜原子的具體和非限制性實例為N原子和O原子。H原子不是雜原子。

或者,連接基部分(如果存在)具有5-30個C原子,優選5-25個C原子,更優選5-20個C原子,或最優選5-17個C原子。在另外的優選實施方案中,連接基部分(如果存在)具有4-20個雜原子,優選4-18個雜原子,更優選4-14個雜原子,或最優選4-12個雜原子。

或者,連接基包含至少一個OEG分子和/或至少一個谷氨酸殘基,或者更確切地說相應的自由基。

在一個實施方案中,每一個連接基由一倍Chem.?6和兩倍Chem.?5組成,經由酰胺鍵并且按照說明的順序互連,連接基在其游離的氨基端與延伸部分的游離的羰基連接,并且在其游離的羰基端與胰島素的B29賴氨酸殘基、A22K賴氨酸殘基或A鏈和/或B鏈的N-末端連接。

在一個實施方案中,一個或多個白蛋白結合部分通過酰化與胰島素連接。

在一個實施方案中,一個或多個白蛋白結合部分通過還原性烷基化與胰島素連接。

一個實施方案為通過還原性烷基化,用白蛋白結合部分取代根據本發明的胰島素或胰島素衍生物的方法。

在一個實施方案中,根據本發明分兩步取代胰島素,在第一步中,一個或多個白蛋白結合部分通過酰化與胰島素連接,而在第二步中,一個或多個白蛋白結合部分通過還原性烷基化與在第一步中獲得的胰島素衍生物連接。

在一個實施方案中,根據本發明分兩步取代胰島素,在第一步中,一個或多個白蛋白結合部分通過還原性烷基化與胰島素連接,而在第二步中,一個或多個白蛋白結合部分通過酰化與在第一步中獲得的胰島素衍生物連接。

在一個實施方案中,胰島素的A鏈和/或B鏈的N-末端中的胺與白蛋白結合部分中的醛官能反應。

在一個實施方案中,通過還原性烷基化,根據本發明的胰島素或胰島素衍生物被白蛋白結合部分取代。

在一個實施方案中,通過使用還原劑還原性烷基化,根據本發明的胰島素或胰島素衍生物被一個或多個白蛋白結合部分取代。

在一個實施方案中,通過使用NaCNBH3作為還原劑還原性烷基化,根據本發明的胰島素或胰島素衍生物被一個或多個白蛋白結合部分取代。

一個實施方案為通過還原性烷基化,用白蛋白結合部分取代根據本發明的胰島素或胰島素衍生物的方法,其中NaCNBH3用作還原劑。

一個實施方案為在所述胰島素的A鏈和/或B鏈中,在所述胰島素的N-末端氨基酸殘基處,用白蛋白結合部分取代根據本發明的胰島素或胰島素衍生物的方法。

本發明的一個實施方案為在所述胰島素的A鏈和/或B鏈中,在所述胰島素的N-末端氨基酸殘基處,用白蛋白結合部分取代根據本發明的胰島素或胰島素衍生物的方法,其中NaCNBH3用作還原劑。

在一個實施方案中,本發明的至少兩個側鏈類似。

在一個實施方案中,本發明的至少兩個白蛋白結合部分(即,整個側鏈)類似。

在一個實施方案中,每一個白蛋白結合部分的延伸部分類似。

本文使用的術語“類似”,其涉及本發明的至少兩個側鏈或白蛋白結合部分,是指延伸部分和連接基的組合相同(例如,Z=Z1,n=m和X=X1,Chem.?1)。

本文使用的術語“類似”,其涉及本發明的至少兩個側鏈的延伸部分,是指在胰島素衍生物的側鏈中延伸部分的組合相同(例如,X=X1)。

本文使用的術語“類似”,其涉及本發明的至少兩個白蛋白結合部分的延伸部分,是指在胰島素衍生物的白蛋白結合部分中延伸部分的組合相同(例如,X=X1)。

在一個實施方案中,每一個側鏈或白蛋白結合部分的連接基組分的組合類似(例如,對于根據本發明的一種胰島素衍生物,如果對于Z,e1-e2=gDGlu-aLAsp組合,則對于Z1,e1-e2也是gDGlu-aLAsp組合)。

在一個實施方案中,在每一個側鏈或白蛋白結合部分中連接基組分的組合不類似(例如,對于根據本發明的一種胰島素衍生物,如果對于Z,e1-e2為gDGlu-aLAsp組合,則對于Z1,e1-e2為不同于gDGlu-aLAsp組合的另一種連接基組分組合,例如,gDGlu-OEG)。

在一個實施方案中,在本發明的至少兩個側鏈的連接基(如果存在)中的連接基組分組合不類似(例如,對于根據本發明的一種胰島素衍生物,如果對于Z,e1-e2為gDGlu-aLAsp組合,則對于Z1,e1-e2為不同于gDGlu-aLAsp組合的另一種連接基組分組合,例如,gDGlu-OEG)并且延伸部分不類似(例如,X不是與X1相同的脂肪二酸)。

在一個實施方案中,根據本發明的胰島素衍生物形式為在藥學上可接受的鹽。

在一個實施方案中,鹽可為堿式鹽、酸式鹽或者二者均不是(即,中性鹽)。在水中,堿式鹽產生氫氧根離子,而酸式鹽產生水合氫離子。

本發明的胰島素衍生物的鹽可與加入的陽離子或陰離子形成,所述加入的陽離子或陰離子分別與陰離子或陽離子基團反應。這些基團可位于肽部分中,和/或在本發明的衍生物的側鏈中。

本發明的衍生物的陰離子基團的非限制性實例包括在側鏈(如果有的話)以及在肽部分中的游離羧基。肽部分通常在C-末端包括游離的羧酸基團,并且其還可在內部酸氨基酸殘基(例如Asp和Glu)處包括游離的羧基。

在肽部分中的陽離子基團的非限制性實例包括在N-末端(如果存在)的游離氨基以及內部堿性氨基酸殘基(例如His、Arg和Lys)的任何游離氨基。

在一個實施方案中,根據本發明的胰島素衍生物用作藥物。

在一個實施方案中,根據本發明的胰島素衍生物用作藥劑。

在一個實施方案中,根據本發明的胰島素衍生物用作用于延緩或防止2型糖尿病的疾病進展的藥劑。

在本發明的一個實施方案中,提供了胰島素衍生物用作藥物,其用于治療或預防包括應激性高血糖癥的高血糖癥、2型糖尿病、葡萄糖耐量減低、1型糖尿病、以及燒傷、手術創傷和在治療中需要合成代謝作用的其它疾病或損害、心肌梗塞、中風、冠心病和其它心血管病癥。

在一個實施方案中,本發明涉及一種方法,其用于治療或預防包括應激性高血糖癥的高血糖癥、2型糖尿病、葡萄糖耐量減低、1型糖尿病、以及燒傷、手術創傷和在治療中需要合成代謝作用的其它疾病或損害、心肌梗塞、冠心病和其它心血管病癥、中風,所述方法包括對需要這種治療的患者給予對于這種治療有效量的根據本發明的胰島素衍生物。

術語“糖尿病(diabetes)”或“糖尿病(diabetes?mellitus)”包括1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠期糖尿病(在懷孕期間)和造成高血糖癥的其它狀況。該術語用于代謝病癥,其中胰腺產生不足夠量的胰島素,或者其中身體的細胞不能適當與胰島素響應,因此妨礙細胞吸收葡萄糖。結果是,葡萄糖在血液中累積。

1型糖尿病,也稱為胰島素依賴性糖尿病(IDDM)和幼年發病型糖尿病,由B-細胞破壞造成,通常導致絕對的胰島素缺乏。

2型糖尿病,也稱為非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)和成年發病型糖尿病,與以下有關:占主導的胰島素抵抗,由此造成相對的胰島素缺乏;和/或占主導的胰島素分泌缺陷,伴隨著胰島素抵抗。

在一個實施方案中,根據本發明的胰島素衍生物用于制備藥物,所述藥物其用于治療或預防包括壓力誘導高血糖癥的高血糖癥、2型糖尿病、葡萄糖耐量減低、1型糖尿病、燒傷、手術創傷、在治療中需要合成代謝作用的其它疾病或損害、心肌梗塞、中風、冠心病、其它心血管病癥,治療重癥糖尿病患者和非糖尿病患者和多發性神經病。

本文使用的術語“人胰島素”是指其結構和性質為眾所周知的人胰島素激素。人胰島素具有兩個多肽鏈,稱為A鏈和B鏈。A鏈為21個氨基酸的肽,而B鏈為30個氨基酸肽,兩個鏈通過二硫橋連接:第一橋在A鏈7位的半胱氨酸與B鏈7位的半胱氨酸之間,而第二橋在A鏈20位的半胱氨酸與B鏈19位的半胱氨酸之間。第三橋存在于A鏈的6位與10位的半胱氨酸之間。

在人體中,合成激素作為單鏈前體胰島素原(前胰島素原),其由24個氨基酸的前肽后接含有86個氨基酸的胰島素原組成,結構為:前肽-B-Arg?Arg-C-Lys?Arg-A,其中C為31個氨基酸的連接肽。Arg-Arg和Lys-Arg為用于連接肽從A鏈和B鏈裂解的裂解位點。

根據本發明的“胰島素”在本文中應理解為人胰島素或來自另一個物種的胰島素(例如豬或牛胰島素)。

根據本發明的“可溶性胰島素”在本文中應理解為可溶于水溶液(包括但不局限于水)的胰島素。

在一個實施方案中,根據本發明的胰島素可溶于水。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素為可溶性水溶液。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素可溶于pH為pH?6-9的水溶液。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素可溶于pH為pH?7-8的水溶液。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素可溶于pH為pH?7.2-7.8的水溶液。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素為可溶于pH為pH?7.2-7.6的水溶液。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素可溶于pH為pH?7.4-7.6的水溶液。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素可溶于pH為pH?7.4-7.8的水溶液。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素可溶于pH堿性水溶液。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素可溶于pH中性水溶液。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素可溶于中性或低于中性1-2個pH單位的水溶液。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素可溶于中性或低于中性1個pH單位的水溶液。

在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為0.5?mM-8?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為0.6?mM-7.2?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少0.6?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少0.8?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少1.0?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少1.2?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少1.4?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少1.8?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少2.0?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少2.2?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少2.4?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少2.6?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少2.8?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少3.0?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少3.2?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少3.4?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少3.6?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少3.8?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少4.0?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少4.2?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少4.4?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少4.6?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少4.8?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少5.0?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少5.2?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少5.4?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少5.6?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少5.8?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少6.0?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少6.2?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少6.4?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少6.6?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少6.8?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少7.0?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少7.2?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少7.4?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少7.6?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少7.8?mM。在一個實施方案中,根據本發明的胰島素的溶解度為至少8.0?mM。

本文使用的術語“胰島素肽”是指一種肽,其具有胰島素活性的人胰島素或其類似物或衍生物。

本文使用的術語“胰島素衍生物”是指化學修飾的胰島素,其中修飾的形式為酰胺、碳水化合物、烷基、酰基、酯、聚乙二醇化等的連接。根據本發明的人胰島素的衍生物的實例為A22Nα-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基B29Nε-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基A22K?desB30人胰島素、A22Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A22K?desB30人胰島素、A22Nε-十四烷二酰基-γ-L-谷氨酰基B29Nε-十四烷二酰基-γ-L-谷氨酰基A22K?desB30人胰島素、A22Nε-十八烷二酰基-γ-D-谷氨酰基B29Nε-十八烷二酰基-γ-D-谷氨酰基A22K?desB30人胰島素、A22Nε-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基B29Nε-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基A14E?A22K?B25H?desB30人胰島素、A22Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?A22K?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基B29Nε-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基A14E?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基B29Nε-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基desB30人胰島素、A1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB27?desB30人胰島素、A1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B1Nα-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB27?desB30人胰島素、A1Nα-十四烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B1Nα-十四烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB27?desB30人胰島素、A1Nα-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B1Nα-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB30人胰島素、B1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-氨基甲基-芐基B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B29Nε十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十八烷二酰基-N-羧甲基-β-丙氨酰基B29Nε-十八烷二酰基-N-羧甲基-β-丙氨酰基A14E?B25H?desB30人胰島素、A1Nα十八烷二酰基-N-2-羧乙基-甘氨酰基B29Nε-十八烷二酰基-N-2-羧乙基-甘氨酰基A14E?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十八烷二酰基-N-羧甲基-β-丙氨酰基A22Nε-N-十八烷二酰基-N-羧甲基-β-丙氨酰基A22K?B29R?desB30人胰島素、A22Nε-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29Nε-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29Nε-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29Nε-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B16H?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?B29R?desB30人、A22Nε-二十烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29Nε-二十烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?A22K?B25H?desB30人胰島素、B1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B16H?B25H?desB30人胰島素、B1Nα-(十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB30人胰島素、B1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB27?desB30人胰島素、A22Nε-4-羧基苯氧基-癸酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29Nε-4-羧基苯氧基-癸酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?A22K?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B16H?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B16H?desB27?desB30人胰島素、B1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB30人胰島素、B1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?desB27?desB30人胰島素、B1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-OEG-OEG?A14E?desB27?desB30人胰島素。

本文使用的術語“胰島素類似物”是指修飾的人胰島素,其中胰島素的一個或多個氨基酸殘基被其它氨基酸殘基取代和/或其中一個或多個氨基酸殘基已從胰島素刪除和/或其中一個或多個氨基酸殘基已加入和/或插入胰島素。

在一個實施方案中,胰島素類似物相對于人胰島素包含少于10個氨基酸修飾(取代、刪除、添加(包括插入)和它們的任何組合),或者相對于人胰島素少于9、8、7、6、5、4、3、2或1個修飾。

指明鏈(A或B)、位置和取代天然氨基酸殘基的氨基酸殘基所用的一個或三個字母編碼,以表示胰島素分子中的修飾。

“連接肽”或“C-肽”是指單鏈胰島素原-分子的B-C-A多肽序列的連接部分“C”。在人胰島素鏈中,C-肽連接B鏈的30位和A鏈的1位,并且為35氨基酸殘基長。連接肽包括兩個末端二價氨基酸序列,例如,用作連接肽從A鏈和B鏈裂解以形成雙鏈胰島素分子的裂解位點的Arg-Arg和Lys-Arg。

“desB30”或“B(1-29)”是指缺乏B30氨基酸的天然胰島素B鏈或其類似物,而“A(1-21)”是指天然胰島素A鏈。因此,例如,A14E?A22K?desB30人胰島素為人胰島素的類似物,其中在A鏈中14位的氨基酸被谷氨酸取代,在A鏈中22位的氨基酸被賴氨酸取代,并且在B鏈中30位的氨基酸被刪除。

本文中術語像“A1”、“A2”和“A3”等分別說明在胰島素的A鏈的1位、2位和3位等的氨基酸(從N-末端計數)。類似地,術語像“B1”、“B2”和“B3”等分別說明在胰島素的B鏈的1位、2位和3位等的氨基酸(從N-末端計數)。對氨基酸使用一個字母編碼,術語像A21A、A21G和A21Q分別指示在A21位的氨基酸為A、G和Q。對氨基酸使用三個字母編碼,相應的表述分別為A21Ala、A21Gly和A21Gln。

本文術語“氨基酸殘基”為在形式上羥基已從羧基除去和/或在形式上氫原子已從氨基除去的氨基酸。

氨基酸以D(右)或L(左)的立體異構形式存在。D和L是指光學活性化合物的絕對構型(absolute?confirmation)。除甘氨酸外,所有的其它氨基酸為不能疊合的鏡像。自然界中發現的大多數氨基酸為L-類型。因此,真核蛋白質總是由L-氨基酸組成,但是在細菌細胞壁中和在一些肽抗生素中發現D-氨基酸。在自然界中已描述至少300種氨基酸,但是這些中僅二十種通常作為人肽和蛋白質中的組分而存在。在肽生物合成中,二十種標準氨基酸被細胞利用,并且這些由通用的遺傳編碼指定。二十種標準氨基酸為丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、蛋氨酸(Met)、脯氨酸(Pro)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)和組氨酸(His)。

胰島素類似物的實例為其中A鏈14位的Tyr(Y)被Glu(E)取代和/或B29位的Lys(K)被Pro(P)、Arg(R)取代的那些。此外,在B3位的Asn(N)可被Lys(K)取代。另外,可將一個或多個氨基酸加入到A鏈和/或B鏈的C-末端,例如像Lys(K)。在B1位的氨基酸可被Glu(E)取代。在B16位的氨基酸可被His(H)取代。胰島素類似物的其它實例為刪除類似物,例如,其中人胰島素中的B30氨基酸已刪除的類似物(desB30人胰島素)、desB28-B30人胰島素和desB27人胰島素。其中A鏈和/或B鏈具有N-末端延伸的胰島素類似物和其中A鏈和/或B鏈具有C-末端延伸的胰島素類似物(例如具有加入到B鏈的C-末端的兩個精氨酸殘基)也是胰島素類似物的實例。其它實例為包含所提及的突變的組合的胰島素類似物。其中在B25位的氨基酸為His(H)并且其任選還包含一個或多個另外的突變的胰島素類似物是胰島素類似物的其它實例。其中在A22位的氨基酸殘基為Lys(?K)和/或其中胰島素類似物在C-末端被兩個Arg(R)殘基進一步延伸的人胰島素的胰島素類似物也是胰島素類似物的實例。

胰島素類似物的其它實例包括:desB30人胰島素、A22K?desB30人胰島素、A14E?A22K?desB30人胰島素、A14E?A22K?B25H?B29R?desB30人胰島素、A14E?A22K?B25H?desB30人胰島素A14E?B25H?desB27?desB30人胰島素、A14E?B25H?desB30人胰島素、A14E?B16H?desB30人胰島素、A14E?B16H?B25H?desB30人胰島素B28D人胰島素、A22K?B29R?desB30人胰島素、B3K?B28E人胰島素、B28D?desB30人胰島素、A22K?B29P?desB30人胰島素、B28K?B29P人胰島素、B28K?B29P?desB30人胰島素、B3K?B28E?desB30人胰島素、A14E?desB27?desB30人胰島素和A14E?B16H?desB27?desB30人胰島素。

胰島素受體結合試驗(HIRspa):

本發明的胰島素衍生物對人胰島素受體的親和力通過SPA試驗(鄰近閃爍試驗)微量滴定板抗體捕獲試驗來測定。將SPA-PVT抗體結合珠、抗鼠試劑(Amersham?Biosciences,分類號PRNQ0017)與25?mL結合緩沖劑(100?mM?HEPES?pH?7.8;100?mM氯化鈉,10?mM?MgSO4,0.025%吐溫-20)混合。用于單一Packard?Optiplate(Packard?No.?6005190)的試劑混合物包含:2.4?μl的1:5000稀釋的純化的重組人胰島素受體(含有或不含外顯子11)、相應于每100?μl試劑混合物5000?cpm的量的A14Tyr[125I]-人胰島素的儲液、12?μl的F12抗體的1:1000稀釋液、3?mL的SPA珠和結合緩沖劑,總計12?mL。隨后將共100?μl試劑混合物加入到Packard?Optiplate中的每一個孔中,并且在Optiplate中由適當的樣品制備胰島素衍生物的稀釋系列。隨后將樣品溫育16小時,同時輕微振動。隨后通過離心1分鐘,將各相分離,并且在Topcounter中對板計數。使用非線性回歸算法在GraphPad?Prism?2.01(GraphPad?Software,San?Diego,CA)中擬合結合數據,親和力用相對于(按百分比(%))人胰島素的親和力表示。

還使用其中結合緩沖劑還含有1.5%HSA的相關測定,以模仿生理條件。

藥代動力學試驗,靜脈大鼠PK:

麻醉的大鼠通過靜脈給藥(i.v.)各種劑量的胰島素衍生物,并且以給藥后4小時或更長的指定間隔,使用免疫測定或質譜法測量所采用的化合物的血漿濃度。隨后使用WinNonLin?Professional(Pharsight?Inc.,Mountain?View,CA,USA)計算藥代動力學參數。

使用重約200?g的非禁食的雄性Wistar大鼠(Taconic)。

測量體重,隨后用Hypnorm/多美康(每一種化合物單獨在無菌水中1:1稀釋,隨后混合;在實驗當天新制備)麻醉大鼠。通過2?mL/kg?Hypnorm/多美康混合物皮下注射引發麻醉,接著是1?mL/kg?sc的兩個維持劑量,間隔為30分鐘,以及1?mL/kg皮下注射的兩個維持劑量,間隔為45分鐘。如果需要,為了從始至終保持大鼠輕度麻醉,供應1-2?mL/kg?sc的另外的劑量。在大鼠容納室中進行稱重和初始麻醉,以避免由于將它們從一個房間移到另一個房間而使動物緊張。

白蛋白結合試驗,保留時間(RT)

通過使用固定人血清白蛋白色譜-質譜法測量藥物-蛋白質結合。

白蛋白結合,按照固定的HSA-柱上的保留時間(Rt)來測量。

按以下順序使用溶劑:

A:新制備的50mM乙酸銨pH?7.4(3,854?g/?1L)

B:100%?2-丙醇

時間(分鐘) A溶劑(%) B溶劑(%) 流速(mL/分鐘) 0 100 0 0.7 5 65 35 0.7 15 60 40 0.7 16 100 0 0.7 20 100 0 0.7

HPLC?1100系統(CTC?PAL自動取樣器)如下排列:

·HPLC-柱:手性HSA?50×3.0mm?5μm(Chromtech分類號:HSA?50.3?06-F)

·UV檢測器:280?nm

·柱溫度:45℃

·化合物注射:10?μL,10μM

·分流1:4(MS;LC)

LC/MSD?Trap?XCT如下排列:

·離子源類型:ESI

·極性:正

·干溫度:325℃

·噴霧器:40.00?psi

·干氣體:8.00?L/分鐘

生產胰島素

多肽(例如,胰島素)的生產為本領域眾所周知的。用作胰島素衍生物的一部分的胰島素或胰島素類似物可例如通過經典的肽合成來生產,例如,使用t-Boc或Fmoc化學或其它充分建立的技術的固相肽合成,參見,例如,Greene和Wuts,“Protective?Groups?in?Organic?Synthesis(有機合成中的保護基團)”,John?Wiley?&?Sons,1999。胰島素或胰島素類似物還可通過以下方法生產:所述方法包括培養含有DNA序列的宿主細胞,該序列對類似物編碼,并且能在合適的營養培養基中在允許表達胰島素或胰島素類似物的條件下表達胰島素或胰島素類似物。若干重組體方法可用于生產人胰島素和人胰島素類似物。可用于在微生物(例如像大腸桿菌(Escherichia?coli)和釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae))中生產胰島素的方法的實例例如公開于WO2008/034881。

通常通過在合適的宿主細胞中以眾所周知的技術對編碼所討論的胰島素或胰島素類似物或其前體的DNA序列作表達,來生產胰島素或胰島素類似物,例如,在EP1246845或WO2008/034881中描述的。

胰島素或胰島素類似物可連帶N-末端延伸來表達,如在EP?1,246,845中公開的。在分泌至培養基和恢復后,胰島素前體將經受各種體外程序來除去可能的N-末端延伸序列和連接肽,以得到胰島素或胰島素類似物。這樣的方法包括:在L-蘇氨酸酯存在下,借助胰蛋白酶或水解無色桿菌(Achromobacer?lyticus)蛋白酶的酶轉化,接著通過堿性或酸性水解將胰島素或胰島素類似物的蘇氨酸酯轉化為胰島素或胰島素類似物,如在美國專利說明書4,343,898或4,916,212號中描述的。

適用于本發明的N-末端延伸類型的實例公開于US5395922和EP0765395。

對于包含非天然氨基酸殘基的胰島素類似物,應修飾重組體細胞,使得非天然氨基酸結合到類似物中,例如通過使用tRNA突變體。因此,簡要地,與已知的胰島素類似物的制備類似地制備根據本發明的胰島素或胰島素類似物。

蛋白質純化

從細胞培養基回收用作本發明的胰島素衍生物的一部分的胰島素或胰島素類似物。本發明的胰島素或胰島素類似物可通過本領域已知的多種程序純化,包括但不限于層析法(例如,離子交換、親和力、疏水、聚焦層析和尺寸排阻)、電泳程序(例如,制備型等電聚焦(IEF)、差別溶解(例如,硫酸銨沉淀)或萃取(參加,例如,Protein?Purification(蛋白質純化),J.-C.?Janson和Lars?Ryden編輯,VCH?Publishers,New?York,1989)。優選,它們可通過親和力層析法在抗胰島素或抗胰島素類似物抗體柱上純化。通過常規的化學純化手段可實現額外的純化,例如高效液相層析法。其它純化方法(包括檸檬酸鋇沉淀)為本領域已知的,并且可應用于本文描述的新的胰島素或胰島素類似物的純化(參加,例如,Scopes,R.,Protein?Purification(蛋白質純化),Springer-Verlag,N.Y.,1982)。

藥物制劑

含有根據本發明的胰島素衍生物的藥物組合物可在數個部位給予需要這種治療的患者,例如,在局部部位,例如,皮膚和粘膜部位,在旁路吸收的部位,例如,在動脈、靜脈、心臟中給予,以及在涉及吸收的部位,例如,在皮膚中、在皮膚下、在肌肉中或在腹中給予。

根據本發明的藥物組合物可通過數個給予路線給予需要這種治療的患者,例如,舌、舌下、頰、口中、口腔、胃和腸中、鼻、肺(例如,通過細支氣管和肺泡或它們的組合)、表皮、皮膚、透皮、陰道、直腸、眼(例如通過結膜)、輸尿管和腸胃外。

本發明的組合物可采用數種劑型給予,例如,溶液劑、混懸劑、乳液劑、微乳液劑、多重乳液、泡沫、膏、糊、硬膏、軟膏、片劑、包衣片劑、沖洗劑、膠囊劑(例如,硬明膠膠囊和軟明膠膠囊)、栓劑、直腸膠囊、滴劑、凝膠劑、噴霧劑、散劑、氣溶膠、吸入劑、滴眼劑、眼用軟膏、眼用沖洗劑、陰道栓劑、陰道環、陰道軟膏、注射溶液、原位轉變溶液劑(例如原位凝膠化、原位固化、原位沉淀、原位結晶)、灌注溶液和植入物。

對于腸胃外給予,與已知胰島素的配制類似地配制本發明的胰島素衍生物。此外,對于腸胃外給予,與已知胰島素的給予類似地給予本發明的胰島素衍生物,并且醫生熟悉該程序。

腸胃外給予可借助注射器進行,任選筆狀注射器。或者,腸胃外給予可借助灌注泵進行。

含有本發明的胰島素衍生物的可注射組合物可使用藥物行業常規的技術制備,其包括適當地溶解和混合成分,以得到期望的終產物。因此,根據一種程序,將本發明的胰島素衍生物溶解于一定量的水中,水的量稍微低于待制備的組合物的最終體積。按需加入等滲劑、防腐劑和緩沖劑,并且如果需要,則按需使用酸(例如,鹽酸)或堿(例如,氫氧化鈉水溶液)調節溶液的pH值。最后,用水調節溶液的體積,以得到期望的成分濃度。

旨在用于口腔使用的制劑可根據任何已知的方法制備,并且所述制劑可含有一種或多種選自增甜劑、調味劑、著色劑和防腐劑的試劑,以提供在藥學上精致和可口的制備物。片劑可含有活性成分混合,帶有適用于制備片劑的非毒性、藥學上可接受的賦形劑。片劑可未包衣或者可通過已知的技術對它們包衣,以延遲分解或釋放治療活性多肽。

本發明的可口腔給予的制劑可根據藥物化學中熟知的方法制備和給予,參見Remington的Pharmaceutical?Sciences(藥物科學),第17版(A.?Osol編輯,1985)。

本發明的胰島素衍生物制備物與已知的胰島素制備物的使用類似地使用。

以下為進一步包含在本發明范圍內的方面的非限制性列舉:

1)?胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其包含至少2個白蛋白結合部分,其中每一個白蛋白結合部分包含脂肪二酸取代,并且其中來自每個所述脂肪二酸取代的一個羧基任選經由連接基與胰島素連接。

2)?胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其包含至少3個白蛋白結合部分,其中每一個白蛋白結合部分包含脂肪二酸取代,并且其中來自每個所述脂肪二酸取代的一個羧基任選經由連接基與胰島素連接。

3)?胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其包含2個或3個白蛋白結合部分,其中每一個白蛋白結合部分包含脂肪二酸取代,并且其中來自每個所述取代的一個羧基任選經由連接基與胰島素連接。

4)?胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其包含2個白蛋白結合部分,其中每一個白蛋白結合部分包含脂肪二酸取代,并且其中來自每個所述脂肪二酸取代的一個羧基任選經由連接基與胰島素連接。

5)?胰島素衍生物或在藥學上可接受的鹽,其包含3個白蛋白結合部分,其中每一個白蛋白結合部分包含脂肪二酸取代,并且其中來自每個所述脂肪二酸取代的一個羧基任選經由連接基與胰島素連接。

6)?根據任何前述方面的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其包含至少3個白蛋白結合部分,其中每一個白蛋白結合部分包含脂肪二酸取代,并且其中來自每個所述脂肪二酸取代的一個羧基任選經由連接基與胰島素連接。

7)?根據任何前述方面的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其包含2個或3個白蛋白結合部分,其中每一個白蛋白結合部分包含脂肪二酸取代,并且其中來自每個所述取代的一個羧基任選經由連接基與胰島素連接。

8)?根據任何前述方面的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其包含2個白蛋白結合部分,其中每一個白蛋白結合部分包含脂肪二酸取代,并且其中來自每個所述脂肪二酸取代的一個羧基任選經由連接基與胰島素連接。

9)?根據任何前述方面的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其包含3個白蛋白結合部分,其中每一個白蛋白結合部分包含脂肪二酸取代,并且其中來自每個所述脂肪二酸取代的一個羧基任選經由連接基與胰島素連接。

10)?以下通式的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽

,其中

a.?Ins代表包含B29賴氨酸或B29精氨酸殘基和/或A22賴氨酸殘基的胰島素,

b.?X、X1和X2為脂肪二酸取代,并且X2為任選的,

c.?Z、Z1和Z2分別為Ins與X、X1和X2之間的連接基,和

d.?n、m和p為0或1。

11)?根據任何前述方面的以下通式的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽

,其中

a.?Ins代表包含B29賴氨酸或B29精氨酸殘基和/或A22賴氨酸殘基的胰島素,

b.?X、X1和X2為脂肪二酸取代,并且X2為任選的,

c.?Z、Z1和Z2分別為Ins與X、X1和X2之間的連接基,和

d.?n、m和p為0或1。

12)?根據任何前述方面的以下通式的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽

,其中

a.?Ins代表包含B29賴氨酸或B29精氨酸殘基和/或A22賴氨酸殘基的胰島素,

b.?X、X1和X2為脂肪二酸取代并且分別位于選自以下的位置:B29賴氨酸、A22賴氨酸、A鏈的N-末端、B鏈的N-末端,

c.?Z、Z1和Z2分別為Ins與X、X1和X2之間的連接基,和

d.?n、m和p為0或1。

13)?根據任何前述方面的以下通式的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽

,其中

a.?Ins代表包含B29精氨酸殘基和A22賴氨酸殘基的胰島素,

b.?X、X1和X2為脂肪二酸取代,并且X位于所述A22賴氨酸殘基,并且X1位于A鏈的N-末端,并且X2不存在,

c.?Z、Z1和Z2分別為Ins與X、X1和X2之間的連接基,和

d.?n和m為1或0,并且p為0。

14)?根據任何前述方面的以下通式的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽

,其中

a.?Ins代表包含B29精氨酸殘基和A22賴氨酸殘基的胰島素,

b.?X、X1和X2為脂肪二酸取代,并且X位于所述A22賴氨酸殘基,并且X1位于B鏈的N-末端,并且X2不存在,

c.?Z、Z1和Z2分別為Ins與X、X1和X2之間的連接基,和

d.?n和m為1或0,并且p為0。

15)?根據任何前述方面的以下通式的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽

,其中

a.?Ins代表包含B29賴氨酸的胰島素,

b.?X、X1和X2為脂肪二酸取代,并且X位于所述B29賴氨酸殘基,并且X1位于所述A鏈的N-末端,并且X2不存在,

c.?Z、Z1和Z2分別為Ins與X、X1和X2之間的連接基,和

d.?n和m為1或0,并且p為0。

16)?根據任何前述方面的以下通式的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽

,其中

a.?Ins代表包含B29賴氨酸殘基和/或A22賴氨酸殘基的胰島素,

b.?X、X1和X2為脂肪二酸取代,并且X位于所述B29賴氨酸殘基,并且X1位于B鏈的N-末端,并且X2不存在,

c.?Z、Z1和Z2分別為Ins與X、X1和X2之間的連接基,和

d.?n和m為1或0,并且p為0。

17)?根據任何前述方面的以下通式的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽

,其中

a.?Ins代表包含B29賴氨酸殘基和A22賴氨酸殘基的胰島素,

b.?X、X1和X2為脂肪二酸取代,并且X位于所述B29賴氨酸殘基,并且X1位于所述A22賴氨酸殘基,并且X2不存在,

c.?Z、Z1和Z2分別為Ins與X、X1和X2之間的連接基,和

d.?n和m為1或0,并且p為0。

18)?根據任何前述方面的以下通式的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽

,其中

a.?Ins代表包含B29精氨酸殘基和/或A22賴氨酸殘基的胰島素,

b.?X、X1和X2為脂肪二酸取代,并且X位于所述A鏈的N-末端,并且X1位于所述B鏈的N-末端,并且X2不存在,

c.?Z、Z1和Z2分別為Ins與X、X1和X2之間的連接基,和

d.?n和m為1或0,并且p為0。

19)?根據任何前述方面的以下通式的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽

,其中

a.?Ins代表包含B29賴氨酸的胰島素,

b.?X、X1和X2為脂肪二酸取代,并且X位于所述B29賴氨酸殘基,并且X1在所述A鏈的N-末端,并且X2位于所述B鏈的N-末端,

c.?Z、Z1和Z2分別為Ins與X、X1和X2之間的連接基,和

d.?n、m和p為0或1。

20)?根據任何前述方面的以下通式的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽

,其中

a.?Ins代表包含B29精氨酸殘基和A22賴氨酸殘基的胰島素,

b.?X、X1和X2為脂肪二酸取代,并且X位于所述A22賴氨酸殘基,并且X1在所述A鏈的N-末端,并且X2位于所述B鏈的N-末端,

c.?Z、Z1和Z2分別為Ins與X、X1和X2之間的連接基,和

d.?n、m和p為0或1。

21)?通式XZn-Ins-Z1mX1的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中

a.?Ins代表包含B29賴氨酸或B29精氨酸殘基和/或A22賴氨酸殘基的胰島素,

b.?X和X1為脂肪二酸取代,

c.?Z和Z1分別為Ins與X和X1之間的連接基,和

d.?n和m為0或1。

22)?根據任何前述方面的通式XZn-Ins-Z1mX1的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中

a.?Ins代表包含B29賴氨酸或B29精氨酸殘基和/或A22賴氨酸殘基的胰島素,

b.?X和X1為脂肪二酸取代,

c.?Z和Z1分別為Ins與X和X1之間的連接基,和

d.?n和m為0或1。

23)?根據任何前述方面的通式XZn-Ins-Z1mX1的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中

a.?Ins代表包含B29賴氨酸或B29精氨酸殘基和/或A22賴氨酸殘基的胰島素,

b.?X和X1為脂肪二酸取代并且分別位于選自以下的位置:B29賴氨酸、A22賴氨酸、A鏈的N-末端、B鏈的N-末端,

c.?Z和Z1分別為Ins與X和X1之間的連接基,和

d.?n和m為0或1。

24)?根據任何前述方面的通式XZn-Ins-Z1mX1的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中

a.?Ins代表包含B29精氨酸殘基和A22賴氨酸殘基的胰島素,

b.?X和X1為脂肪二酸取代脂肪二酸取代,并且X位于所述A22賴氨酸殘基,并且X1位于A鏈的N-末端,

c.?Z和Z1分別為Ins與X和X1之間的連接基,和

d.?n和m為0或1。

25)?根據任何前述方面的通式XZn-Ins-Z1mX1的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中

a.?Ins代表包含B29精氨酸殘基和A22賴氨酸殘基的胰島素,

b.?X和X1為脂肪二酸取代,并且X位于所述A22賴氨酸殘基,并且X1位于B鏈的N-末端,

c.?Z和Z1分別為Ins與X和X1之間的連接基,和

d.?n和m為0或1。

26)?根據任何前述方面的通式XZn-Ins-Z1mX1的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中

a.?Ins代表包含B29賴氨酸殘基的胰島素,

b.?X和X1為脂肪二酸取代,并且X位于所述B29賴氨酸殘基,并且X1位于所述A鏈的N-末端,

c.?Z和Z1分別為Ins與X和X1之間的連接基,和

d.?n和m為0或1。

27)?根據任何前述方面的通式XZn-Ins-Z1mX1的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中

a.?Ins代表包含B29賴氨酸殘基的胰島素,

b.?X和X1為脂肪二酸取代,并且X位于所述B29賴氨酸殘基,并且X1位于B鏈的N-末端,

c.?Z和Z1分別為Ins與X和X1之間的連接基,和

d.?n和m為0或1。

28)?根據任何前述方面的通式XZn-Ins-Z1mX1的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中

a.?Ins代表包含B29賴氨酸和A22賴氨酸殘基的胰島素,

b.?X和X1為脂肪二酸取代,并且X位于所述B29賴氨酸殘基,并且X1位于所述A22賴氨酸殘基,

c.?Z和Z1分別為Ins與X和X1之間的連接基,和

d.?n和m為0或1。

29)?根據任何前述方面的通式XZn-Ins-Z1mX1的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中

a.?Ins代表包含B29精氨酸殘基的胰島素,

b.?X和X1為脂肪二酸取代,并且X位于所述A鏈的N-末端,并且X1位于所述B鏈的N-末端,

c.?Z和Z1分別為Ins與X和X1之間的連接基,和

d.?n和m為0或1。

30)?根據任何前述方面的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中所述脂肪二酸取代包含10-20個碳原子。

31)?根據任何前述方面的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中所述脂肪酸取代從選自Chem.?1和Chem.?2的延伸部分選取:

Chem?1:HOOC-(CH2)X-CO-*

Chem?2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*

其中x為10-20的整數,并且y為6-14的整數。

32)?根據任何前述方面的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中所述脂肪酸取代從選自Chem.?1和Chem.?2的延伸部分選取:

Chem?1:HOOC-(CH2)X-CO-*

Chem?2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*

其中x為14-20的整數,并且y為6-10的整數。

33)?根據任何前述方面的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中所述脂肪酸取代從選自Chem.?1和Chem.?2的延伸部分選取:

Chem?1:HOOC-(CH2)X-CO-*

Chem?2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*

其中x為14-18的整數,并且y為8-10的整數。

34)?根據任何前述方面的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中所述脂肪酸取代從選自Chem.?1和Chem.?2的延伸部分選取:

Chem?1:HOOC-(CH2)X-CO-*

Chem?2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*

其中x為14-16的整數,并且y為10-12的整數。

35)?根據任何前述方面的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中所述脂肪酸取代從選自Chem.?1和Chem.?2的延伸部分選取:

Chem?1:HOOC-(CH2)X-CO-*

Chem?2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*

其中x為14-20的整數,并且y為6-12的整數。

36)?根據任何前述方面的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中所述脂肪酸取代從選自Chem.?1和Chem.?2的延伸部分選取:

Chem?1:HOOC-(CH2)X-CO-*

Chem?2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*

其中x為12、14、16、18或20,并且y為6、8、10、12或14。

37)?根據任何前述方面的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中所述脂肪酸取代從選自Chem.?1和Chem.?2的延伸部分選取:

Chem?1:HOOC-(CH2)X-CO-*

Chem?2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*

其中x為14、16、18或20,并且y為8、10或12。

38)?根據任何前述方面的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中所述脂肪酸取代從選自Chem.?1和Chem.?2的延伸部分選取:

Chem?1:HOOC-(CH2)X-CO-*

Chem?2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*

其中x為14、16、18或20,并且y為6、8或10。

39)?根據任何前述方面的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中所述脂肪酸取代從選自Chem.?1和Chem.?2的延伸部分選取:

Chem?1:HOOC-(CH2)X-CO-*

Chem?2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*

其中x為14、16或18,并且y為8、10或12。

40)?根據任何前述方面的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中所述脂肪二酸取代在所述胰島素中的氨基酸殘基處連接,所在位置選自A1、A22、B1和B29。

41)?根據任何前述方面的胰島素衍生物,其中所述脂肪二酸取代分別與賴氨酸側鏈ε-氨基或胰島素的A鏈和/或B鏈的N-末端連接。

42)?根據任何前述方面的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中所述脂肪二酸取代經由連接基與胰島素的氨基酸殘基連接。

43)?根據任何前述方面的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中所述連接基(Z)包含一個或多個連接基組分(e)。

44)?根據任何前述方面的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中所述連接基包含一個或多個選自以下的連接基組分:α-L-Glu、α-D-Glu、γ-L-Glu、γ-D-Glu、α-L-Asp、α-D-Asp、β-L-Asp、β-D-Asp、CPH、IDA和OEG。

45)?根據任何前述方面的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中所述連接基包含下式表示的兩個連接基組分:e1-e2,其中

a.?e1為選自以下的連接基組分:α-L-Glu、α-D-Glu、γ-L-Glu、γ-D-Glu、α-L-Asp、α-D-Asp、β-L-Asp、β-D-Asp、CPH、IDA和OEG,

b.?e2為選自以下的連接基組分:α-L-Glu、α-D-Glu、γ-L-Glu、γ-D-Glu、α-L-Asp、α-D-Asp、β-L-Asp、β-D-Asp、CPH、IDA和OEG。

46)?根據任何前述方面的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中所述連接基包含下式表示的三個連接基組分:e1-e2-e3,其中

a.?e1為選自以下的連接基組分:α-L-Glu、α-D-Glu、γ-L-Glu、γ-D-Glu、α-L-Asp、α-D-Asp、β-L-Asp、β-D-Asp、CPH、IDA和OEG,

b.?e2為選自以下的連接基組分:α-L-Glu、α-D-Glu、γ-L-Glu、γ-D-Glu、α-L-Asp、α-D-Asp、β-L-Asp、β-D-Asp、CPH、IDA和OEG,

c.?e3為選自以下的連接基組分:α-L-Glu、α-D-Glu、γ-L-Glu、γ-D-Glu、α-L-Asp、α-D-Asp、β-L-Asp、β-D-Asp、CPH、IDA和OEG。

47)?根據任何前述方面的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中所述連接基包含下式表示的四個連接基組分:e1-e2-e3-e4,其中

a.?e1為選自以下的連接基組分:α-L-Glu、α-D-Glu、γ-L-Glu、γ-D-Glu、α-L-Asp、α-D-Asp、β-L-Asp、β-D-Asp、CPH、IDA和OEG,

b.?e2為選自以下的連接基組分:α-L-Glu、α-D-Glu、γ-L-Glu、γ-D-Glu、α-L-Asp、α-D-Asp、β-L-Asp、β-D-Asp、CPH、IDA和OEG,

c.?e3為選自以下的連接基組分:α-L-Glu、α-D-Glu、γ-L-Glu、γ-D-Glu、α-L-Asp、α-D-Asp、β-L-Asp、β-D-Asp、CPH、IDA和OEG,

d.?e4為選自以下的連接基組分:α-L-Glu、α-D-Glu、γ-L-Glu、γ-D-Glu、α-L-Asp、α-D-Asp、β-L-Asp、β-D-Asp、CPH、IDA和OEG。

48)?根據任何前述方面的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中所述白蛋白結合部分位于所述胰島素A鏈和/或B鏈的N-末端,并且其中所述連接基包含一個或多個CPH連接基組分。

49)?根據任何前述方面的胰島素衍生物,其中所述胰島素衍生物的白蛋白結合部分類似。

50)?根據任何前述方面的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中所述胰島素衍生物選自人胰島素的衍生物、desB30人胰島素的衍生物和胰島素類似物的衍生物。

51)?根據任何前述方面的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中所述胰島素選自desB30人胰島素、A22K?desB30人胰島素、A14E?A22K?desB30人胰島素、A14E?A22K?B25H?B29R?desB30人胰島素、A14E?A22K?B25H?desB30人胰島素、A14E?B25H?desB27?desB30人胰島素、A14E?B25H?desB30人胰島素、A14E?B16H?desB30人胰島素、A14E?B16H?B25H?desB30人胰島素、B28D人胰島素、A22K?B29R?desB30人胰島素、B3K?B28E人胰島素、B28D?desB30人胰島素、A22K?B29P?desB30人胰島素、B28K?B29P人胰島素、B28K?B29P?desB30人胰島素和B3K?B28E?desB30人胰島素、A1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B16H?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B16H?desB27?desB30人胰島素、B1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB30人胰島素、B1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?desB27?desB30人胰島素、B1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-OEG-OEG?A14E?desB27?desB30人胰島素。

52)?根據任何前述方面的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽用作藥物的用途,所述藥物用于治療或預防包括應激性高血糖癥的高血糖癥、2型糖尿病、葡萄糖耐量減低、1型糖尿病、燒傷、手術創傷、在治療中需要合成代謝作用的其它疾病或損傷、心肌梗塞、中風、冠心病、其它心血管病癥,治療重癥糖尿病患者和非糖尿病患者和多發性神經病。

53)?根據任何前述方面的通式XZn-Ins-Z1mX1的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中

a.?Ins代表包含B29賴氨酸殘基的胰島素,

b.?X和X1為脂肪二酸取代,并且X位于所述B29賴氨酸殘基,并且X1位于所述A鏈的N-末端,并且其中X和X1由20個碳原子組成,

c.?Z和Z1分別為Ins與X和X1之間的連接基,并且其中Z和Z1為gGlu-OEG-OEG,

d.?n和m為1。

54)?根據前述權利要求中任一項的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其盡可能選自A22Nα-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基B29Nε-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基A22K?desB30人胰島素、A22Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A22K?desB30人胰島素、A22Nε-十四烷二酰基-γ-L-谷氨酰基B29Nε-十四烷二酰基-γ-L-谷氨酰基A22K?desB30人胰島素、A22Nε-十八烷二酰基-γ-D-谷氨酰基B29Nε-十八烷二酰基-γ-D-谷氨酰基A22K?desB30人胰島素、A22Nε-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基B29Nε-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基A14E?A22K?B25H?desB30人胰島素、A22Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?A22K?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基B29Nε-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基A14E?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基B29Nε-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基desB30人胰島素、A1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-氨基甲基-芐基B1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB27?desB30人胰島素、A1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-氨基甲基-芐基B1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-氨基甲基-芐基B1Nα-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB27?desB30人胰島素、A1Nα-十四烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-氨基甲基-芐基B1Nα-十四烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB27?desB30人胰島素、A1Nα-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG4-氨基甲基-芐基B1Nα-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB30人胰島素、B1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-氨基甲基-芐基B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B29Nε十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十八烷二酰基-N-羧甲基-β-丙氨酰基B29Nε-十八烷二酰基-N-羧甲基-β-丙氨酰基A14E?B25H?desB30人胰島素、A1Nα十八烷二酰基-N-2-羧乙基-甘氨酰基B29Nε-十八烷二酰基-N-2-羧乙基-甘氨酰基A14E?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十八烷二酰基-N-羧甲基-β-丙氨酰基A22Nε-N-十八烷二酰基-N-羧甲基-β-丙氨酰基A22K?B29R?desB30人胰島素、A22Nε-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29Nε-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29Nε-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29Nε-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B16H?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?B29R?desB30人、A22Nε-二十烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29Nε-二十烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?A22K?B25H?desB30人胰島素、B1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B16H?B25H?desB30人胰島素、B1Nα-(十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?desB30人胰島素、B1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-氨基甲基-芐基B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB27?desB30人胰島素、A22Nε-4-羧基苯氧基-癸酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29Nε-4-羧基苯氧基-癸酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?A22K?B25H?desB30人胰島素。

55)?根據任何前述方面的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其用作藥物的用途。

56)?根據前述權利要求中任一項的胰島素衍生物,其中所述胰島素衍生物可溶于水溶液。

57)?以下通式的可溶性胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽

,其中

a.?Ins代表包含B29賴氨酸或B29精氨酸殘基和/或A22賴氨酸殘基的胰島素,

b.?X、X1和X2為脂肪二酸取代,并且X2為任選的,其中所述脂肪二酸取代包含14-20個碳原子,

c.?Z、Z1和Z2分別為Ins與X、X1和X2之間的連接基,和

d.?n、m和p為0或1。

58)?以下通式的可溶性胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽

,其中

a.?Ins代表包含B29賴氨酸或B29精氨酸殘基和/或A22賴氨酸殘基的胰島素,

b.?X、X1和X2為脂肪二酸取代,并且X2為任選的,其中所述脂肪二酸取代包含14-20個碳原子,

c.?Z、Z1和Z2分別為Ins與X、X1和X2之間的連接基,和

d.?n、m和p為0或1。

59)?以下通式的可溶性胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽

,其中

a.?Ins代表包含B29賴氨酸或B29精氨酸殘基和/或A22賴氨酸殘基的胰島素,

b.?X、X1和X2為脂肪二酸取代,并且X2為任選的,其中所述脂肪二酸取代包含14-20個碳原子,

c.?Z、Z1和Z2分別為Ins與X、X1和X2之間的連接基,和

d.?n、m和p為0或1。

60)?根據權利要求1的可溶性胰島素衍生物或在藥學上可接受的鹽,其用作藥物的用途。

61)?根據前述權利要求中任一項的以下通式的可溶性胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽

,其中

a.?Ins代表包含B29賴氨酸或B29精氨酸殘基和/或A22賴氨酸殘基的胰島素,

b.?X、X1和X2為脂肪二酸取代并且分別位于選自以下的位置:B29賴氨酸、A22賴氨酸、A鏈的N-末端、B鏈的N-末端,其中所述脂肪二酸取代包含14-20個碳原子,

c.?Z、Z1和Z2分別為Ins與X、X1和X2之間的連接基,和

d.?n、m和p為0或1。

62)?以下通式的根據前述權利要求中任一項的可溶性胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽

,其中

a.?Ins代表包含B29賴氨酸或B29精氨酸殘基和/或A22賴氨酸殘基的胰島素,

b.?X、X1和X2為脂肪二酸取代并且分別位于選自以下的位置:A22賴氨酸、A鏈的N-末端、B鏈的N-末端,其中所述脂肪二酸取代包含14-20個碳原子,

c.?Z、Z1和Z2分別為Ins與X、X1和X2之間的連接基,和

d.?n、m和p為0或1。

63)?根據前述權利要求中任一項的以下通式的可溶性胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽

,其中

a.?Ins代表包含B29賴氨酸或B29精氨酸殘基和/或A22賴氨酸殘基的胰島素,

b.?X、X1和X2為脂肪二酸取代并且分別位于選自以下的位置:B29賴氨酸、A22賴氨酸、B鏈的N-末端,其中所述脂肪二酸取代包含14-20個碳原子,

c.?Z、Z1和Z2分別為Ins與X、X1和X2之間的連接基,和

d.?n、m和p為0或1。

64)?根據前述權利要求中任一項的通式XZn-Ins-Z1mX1的可溶性胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中

a.?Ins代表包含B29賴氨酸或B29精氨酸殘基和/或A22賴氨酸殘基的胰島素,

b.?X和X1為脂肪二酸取代,其中所述脂肪二酸取代包含14-20個碳原子,

c.?Z和Z1分別為Ins與X和X1之間的連接基,和

d.?n和m為0或1。

65)?根據前述權利要求中任一項的通式XZn-Ins-Z1mX1的可溶性胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中

a.?Ins代表包含B29賴氨酸或B29精氨酸殘基和/或A22賴氨酸殘基的胰島素,

b.?X和X1為脂肪二酸取代并且分別位于選自以下的位置:B29賴氨酸、A22賴氨酸、A鏈的N-末端、B鏈的N-末端,其中所述脂肪二酸取代包含14-20個碳原子。

66)?根據前述權利要求中任一項的以下通式的可溶性胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽

,其中

a.?Ins代表包含B29賴氨酸或B29精氨酸殘基和/或A22賴氨酸殘基的胰島素,

b.?X、X1和X2為脂肪二酸取代并且分別位于選自以下的位置:B29賴氨酸、A22賴氨酸、A鏈的N-末端、B鏈的N-末端,其中所述脂肪二酸取代包含14、16、18或20個碳原子。

c.?Z、Z1和Z2分別為Ins與X、X1和X2之間的連接基,和

d.?n、m和p為0或1。

67)?根據前述權利要求中任一項的以下通式的可溶性胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽

,其中

a.?Ins代表包含B29賴氨酸或B29精氨酸殘基和/或A22賴氨酸殘基的胰島素,

b.?X、X1和X2為脂肪二酸取代并且分別位于選自以下的位置:A22賴氨酸、A鏈的N-末端、B鏈的N-末端,其中所述脂肪二酸取代包含14、16、18或20個碳原子,

c.?Z、Z1和Z2分別為Ins與X、X1和X2之間的連接基,和

d.?n、m和p為0或1。

68)?根據前述權利要求中任一項的以下通式的可溶性胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽

,其中

a.?Ins代表包含B29賴氨酸或B29精氨酸殘基和/或A22賴氨酸殘基的胰島素,

b.?X、X1和X2為脂肪二酸取代并且分別位于選自以下的位置:B29賴氨酸、A22賴氨酸、B鏈的N-末端,其中所述脂肪二酸取代包含14、16、18或20個碳原子,

c.?Z、Z1和Z2分別為Ins與X、X1和X2之間的連接基,和

d.?n、m和p為0或1。

69)?根據前述權利要求中任一項的通式XZn-Ins-Z1mX1的可溶性胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中

a.?Ins代表包含B29賴氨酸或B29精氨酸殘基和/或A22賴氨酸殘基的胰島素,

b.?X和X1為脂肪二酸取代,其中所述脂肪二酸取代包含14、16、18或20個碳原子,

c.?Z和Z1分別為Ins與X和X1之間的連接基,和

d.?n和m為0或1。

70)?根據前述權利要求中任一項的通式XZn-Ins-Z1mX1的可溶性胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中

a.?Ins代表包含B29賴氨酸或B29精氨酸殘基和/或A22賴氨酸殘基的胰島素,

b.?X和X1為脂肪二酸取代并且分別位于選自以下的位置:B29賴氨酸、A22賴氨酸、A鏈的N-末端、B鏈的N-末端,其中所述脂肪二酸取代包含14、16、18或20個碳原子,

c.?Z和Z1分別為Ins與X和X1之間的連接基,和

d.?n和m為0或1。

71)?根據前述權利要求中任一項的可溶性胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中所述脂肪酸取代從選自Chem.?1和Chem.?2的延伸部分選取:

Chem?1:HOOC-(CH2)X-CO-*

Chem?2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*

其中x為10-20的整數,并且y為6-14的整數。

72)?根據前述權利要求中任一項的可溶性胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中所述脂肪酸取代從選自Chem.?1和Chem.?2的延伸部分選取:

Chem?1:HOOC-(CH2)X-CO-*

Chem?2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*

其中x為14、16或18,并且y為8、10或12。

73)?根據前述權利要求中任一項的可溶性胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中所述脂肪二酸取代在所述胰島素中的氨基酸殘基處連接,所在位置選自A1、A22、B1和B29。

74)?根據前述權利要求中任一項的可溶性胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中所述脂肪二酸取代經由連接基與胰島素的氨基酸殘基連接。

75)?根據前述權利要求中任一項的可溶性胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中所述連接基包含一個或多個選自以下的連接基組分:α-L-Glu、α-D-Glu、γ-L-Glu、γ-D-Glu、α-L-Asp、α-D-Asp、β-L-Asp、β-D-Asp、CPH、IDA和OEG。

76)?根據前述權利要求中任一項的可溶性胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其用作藥物的用途,所述藥物用于治療或預防包括應激性高血糖癥的高血糖癥、2型糖尿病、葡萄糖耐量減低、1型糖尿病、燒傷、手術創傷、在治療中需要合成代謝作用的其它疾病或損傷、心肌梗塞、中風、冠心病、其它心血管病癥,治療重癥糖尿病患者和非糖尿病患者和多發性神經病。

77)?根據前述權利要求中任一項的可溶性胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其選自A22Nα-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基B29Nε-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基A22K?desB30人胰島素、A22Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A22K?desB30人胰島素、A22Nε-十四烷二酰基-γ-L-谷氨酰基B29Nε-十四烷二酰基-γ-L-谷氨酰基A22K?desB30人胰島素、A22Nε-十八烷二酰基-γ-D-谷氨酰基B29Nε-十八烷二酰基-γ-D-谷氨酰基A22K?desB30人胰島素、A22Nε-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基B29Nε-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基A14E?A22K?B25H?desB30人胰島素、A22Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?A22K?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基B29Nε-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基A14E?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基B29Nε-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基desB30人胰島素、A1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-氨基甲基-芐基B1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB27?desB30人胰島素、A1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-氨基甲基-芐基B1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-氨基甲基-芐基B1Nα-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB27?desB30人胰島素、A1Nα-十四烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-氨基甲基-芐基B1Nα-十四烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB27?desB30人胰島素、A1Nα-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG4-氨基甲基-芐基B1Nα-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB30人胰島素、B1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-氨基甲基-芐基B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B29Nε十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十八烷二酰基-N-羧甲基-β-丙氨酰基B29Nε-十八烷二酰基-N-羧甲基-β-丙氨酰基A14E?B25H?desB30人胰島素、A1Nα十八烷二酰基-N-2-羧乙基-甘氨酰基B29Nε-十八烷二酰基-N-2-羧乙基-甘氨酰基A14E?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十八烷二酰基-N-羧甲基-β-丙氨酰基A22Nε-N-十八烷二酰基-N-羧甲基-β-丙氨酰基A22K?B29R?desB30人胰島素、A22Nε-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29Nε-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29Nε-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29Nε-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B16H?B25H?desB30人胰島素、A1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?B29R?desB30人、A22Nε-二十烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29Nε-二十烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?A22K?B25H?desB30人胰島素、B1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B16H?B25H?desB30人胰島素、B1Nα-(十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?desB30人胰島素、B1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-氨基甲基-芐基B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB27?desB30人胰島素、A22Nε-4-羧基苯氧基-癸酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29Nε-4-羧基苯氧基-癸酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?A22K?B25H?desB30人胰島素。

78)?用于制備根據上述權利要求中任一項的胰島素衍生物的方法,所述方法包括酰化或烷基化的步驟。

79)?用于制備根據任何上述方面的胰島素衍生物的方法。

80)?通過使胰島素還原性烷基化和/或酰化,制備根據任何上述方面的胰島素衍生物的方法。

81)?通過使胰島素還原性烷基化,制備根據任何上述方面的胰島素衍生物的方法。

82)?通過使胰島素酰化,制備根據任何上述方面的胰島素衍生物的方法。

83)?根據方面1-77的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽作為藥物的用途。

84)?根據方面1-77的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽的用途,用于治療或預防包括應激性高血糖癥的高血糖癥、2型糖尿病、葡萄糖耐量減低、1型糖尿病、燒傷、手術創傷、在治療中需要合成代謝作用的其它疾病或損傷、心肌梗塞、中風、冠心病、其它心血管病癥,治療重癥糖尿病患者和非糖尿病患者和多發性神經病。

85)?根據方面1-77中任一項的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中所述脂肪二酸取代X位于B29位賴氨酸,并且脂肪二酸取代X1位于所述胰島素的A鏈的N-末端,其中X和X1由20個碳原子組成,并且所述連接基Z和Z1為gGlu-OEG-OEG。

86)?根據方面1-77中任一項的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽作為藥物的用途,其中所述脂肪二酸取代X位于B29位賴氨酸,并且脂肪二酸取代X1位于所述胰島素的A鏈的N-末端,其中X和X1由20個碳原子組成,并且所述連接基Z和Z1為gGlu-OEG-OEG。

87)?根據方面1-77中任一項的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽的用途,其中所述脂肪二酸取代X位于B29位賴氨酸,并且脂肪二酸取代X1位于所述胰島素的A鏈的N-末端,其中X和X1由20個碳原子組成,并且所述連接基Z和Z1為gGlu-OEG-OEG,所述用途為用于治療或預防包括壓力誘導高血糖癥的高血糖癥、2型糖尿病、葡萄糖耐量減低、1型糖尿病、燒傷、手術創傷、在治療中需要合成代謝作用的其它疾病或損傷、心肌梗塞、中風、冠心病、其它心血管病癥,治療重癥糖尿病患者和非糖尿病患者和多發性神經病。

88)?根據方面1-77中任一項的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中所述脂肪二酸取代X位于B29位賴氨酸,并且脂肪二酸取代X1位于所述胰島素的A鏈的N-末端,其中其中X和X1由20個碳原子組成,并且所述連接基Z和Z1不是gGlu-OEG-OEG。

89)?根據方面1-77中任一項的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中所述脂肪二酸取代X位于B29位賴氨酸,并且脂肪二酸取代X1位于所述胰島素的A鏈的N-末端,并且其中所述連接基Z和Z1為gGlu-OEG-OEG,并且其中所述X和X1不是由20個碳原子組成。

90)?根據方面1-77中任一項的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中如果所述脂肪二酸取代X位于B29位賴氨酸,并且脂肪二酸取代X1位于所述胰島素的A鏈的N-末端,并且其中所述連接基Z和Z1為gGlu-OEG-OEG,則其中所述X和X1不是由20個碳原子組成。

91)?根據方面1-72中任一項的胰島素衍生物或其在藥學上可接受的鹽,其中如果所述脂肪二酸取代X位于B29位賴氨酸,并且脂肪二酸取代X1位于所述胰島素的A鏈的N-末端,其中其中X和X1由20個碳原子組成,則所述連接基Z和Z1不是gGlu-OEG-OEG。

縮寫列表

AcOH,乙酸

Cpm,計數/分鐘

Da,道爾頓

DCM,二氯甲烷

DIPEA,N,N-二異丙基乙基胺

DMSO,二甲基亞砜

EDTA,乙二胺四乙酸

ESI,電噴霧電離

Fmoc,芴基甲氧基羰基

HCCA,4-羥基-α-氰基-肉桂酸

HEPES,4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙磺酸

HPCD,2-羥基丙基-β-環糊精

HPLC,高效液相層析法,有時稱為高壓液相層析法

HSA,人血清白蛋白

LC-MS/LCMS,液相色譜法-質譜法

IDDM,胰島素依賴性糖尿病

IEF,等電聚焦

NaAc,乙酸鈉

NIDDM,非胰島素依賴性糖尿病

NMP,N-甲基吡咯烷酮

MALDI,基質輔助激光解吸電離

MRT,平均停留時間

OEG,8-氨基-3,6-二氧雜辛酸,8-氨基-3,6-二氧雜辛酰基

RP-HPLC,反相HPLC

Rt,保留時間

RT,室溫

SPA,鄰近閃爍試驗

SPA-PVT,鄰近閃爍試驗聚乙烯基甲苯珠粒

T-boc,二碳酸二叔丁酯

THF,四氫呋喃

TFA,三氟乙酸

Tris,三(羥甲基)氨基甲烷

tRNA,轉移RNA

UV,紫外。

實施例

實施例1?A22N α -十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基B29N ε -十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基A22K?desB30人胰島素

將A22K?desB30胰島素(200?mg,34?μM)溶解于pH?10.5的0.2?M碳酸鈉(2.4?mL)中,并用乙腈(2.4?mL)中的十六烷二酰基-γ-琥珀酰亞胺基-L-谷氨酸鹽(44?mg,86?uM,如WO05012347所述制備)處理。測量pH,如果需要,調節至10.5。30分鐘后,通過加入pH?8的0.2?M甲基胺(0.24?mL)淬滅反應。用1?M?HCl將pH調節至5.5,通過離心收集沉淀物。通過RP-HPLC在C18柱上純化產物,使用緩沖劑A:10?mM?Tris、15?mM硫酸銨,pH?7.3,在水/乙腈80/20中,緩沖劑B:水/乙腈20/80,梯度11?%?B-50?%?B,經60分鐘。通過調節pH至5.5,接著離心,使產物沉淀。或者,通過RP-HPLC在C18柱上進一步純化產物,使用緩沖劑A:0.1?%三氟乙酸/水,緩沖劑B:0.1?%三氟乙酸/乙腈,產物池部分真空蒸發,冷凍干燥,得到A22Nε-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基B29Nε-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基A22K?desB30人胰島素。

產物LCMS:1658.4?Da?[M?+?4H]4+。

C301H458N68O88S6?[M?+?4H]4+計算值:1658.5?Da。

LCMS?緩沖劑A:0.1?%三氟乙酸/水;緩沖劑B:0.1?%三氟乙酸/乙腈,梯度10-90?%?B,經10分鐘。

實施例2?A22N ε -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29N ε -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A22K?desB30人胰島素

該化合物與實施例1的化合物類似地制備,通過使用十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-琥珀酰亞胺基作為試劑,如WO2010/029159所述制備。

產物LCMS:1817.5?Da?[M?+?4H]4+。

C329H510N72O100S6?[M?+?4H]4+計算值:1817.6?Da。

實施例3?A22N ε -十四烷二酰基-γ-L-谷氨酰基B29N ε -十四烷二酰基-γ-L-谷氨酰基A22K?desB30人胰島素

該化合物與實施例1的化合物類似地制備,通過使用十四烷二酰基-γ-琥珀酰亞胺基-L-谷氨酸鹽作為試劑。

產物LCMS:1643.9?Da?[M?+?4H]4+。

C297H450N68O88S6?[M?+?4H]4+計算值:1644.4?Da。

實施例4?A22N ε -十八烷二酰基-γ-D-谷氨酰基B29N ε -十八烷二酰基-γ-D-谷氨酰基A22K?desB30人胰島素

該化合物與實施例1的化合物類似地制備,通過使用叔丁基-十八烷二酰基-γ-琥珀酰亞胺基-D-谷氨酸鹽-叔丁基作為試劑,如WO05012347所述制備。通過用冰冷卻的95?%三氟乙酸/水處理粗產物45分鐘,除去叔丁基保護基團。

產物LCMS:1672.2?Da?[M?+?4H]4+。

C305H466N68O88S6?[M?+?4H]4+計算值:1672.5?Da。

實施例5?A22N ε -十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基B29N ε -十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基A14E?A22K?B25H?desB30人胰島素

該化合物與實施例1的化合物類似地制備,通過使用十六烷二酰基-γ-琥珀酰亞胺基-L-谷氨酸鹽和A14E?A22K?B25H?desB30人胰島素。

產物LCMS:1647.3?Da?[M?+?4H]4+。

C294H454N70O89S6?[M?+?4H]4+計算值:1647.4?Da。

實施例6?A22N ε -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29N ε -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?A22K?B25H?desB30人胰島素

該化合物與實施例1的化合物類似地制備,通過使用十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-琥珀酰亞胺基和A14E?A22K?B25H?desB30人胰島素。

產物LCMS:1806.6?Da?[M?+?4H]4+。

C322H506N74O101S6?[M?+?4H]4+計算值:1806.6?Da。

實施例7?A1N α -十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基B29N ε -十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基A14E?B25H?desB30人胰島素

在pH?9.0的1:1乙腈/0.2?M碳酸鈉中,該化合物與實施例1的化合物類似地制備,通過使用十六烷二酰基-γ-琥珀酰亞胺基-L-谷氨酸鹽和A14E?B25H?desB30人胰島素。

產物LCMS:1615.3?Da?[M?+?4H]4+。

C288H442N68O88S6?[M?+?4H]4+計算值:1615.4?Da。

HSA柱的親和力,Rt(分鐘):8.0分鐘,單取代的胰島素C的值(參見實施例29和表1)?6.4分鐘。

實施例8?A1N α -十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基B29N ε -十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基desB30人胰島素

在pH?9.0的1:1乙腈/0.2?M碳酸鈉中,該化合物與實施例1的化合物類似地制備,通過使用十六烷二酰基-γ-琥珀酰亞胺基-L-谷氨酸鹽和desB30人胰島素。

產物LCMS:1626.4?Da?[M?+?4H]4+。

C295H446N68O87S6?[M?+?4H]4+計算值:1626.4?Da。

實施例9?A1N α -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29N ε -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB30人胰島素

在pH?9.0的1:1乙腈/0.2?M碳酸鈉中,該化合物與實施例1的化合物類似地制備,通過使用十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-琥珀酰亞胺基和A14E?B25H?desB30人胰島素。

產物LCMS:1774.7?Da?[M?+?4H]4+。

C316H494N72O100S6?[M?+?4H]4+計算值:1774.6?Da。

實施例10?A1N α -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B1N α -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB27?desB30人胰島素

十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-苯甲醛叔丁基-N-(4-甲酰基芐基)氨基甲酸酯制備物(100?mg)用TFA/DCM(1:1)處理1小時。將混合物真空濃縮,并且與甲苯共同濃縮兩次。將殘余物溶解于THF(2.5?mL)中,加入十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-琥珀酰亞胺基酯(320?mg,如先前在WO2009/083549中所述制備)的THF(5?mL)溶液。緩慢加入DIPEA(0.5?mL)。130分鐘后,將混合物真空濃縮。將殘余物溶解于EtOAc和1N?HCl中。有機層用1N?HCl和鹽水萃取。將有機層干燥(Na2SO4),真空濃縮,以得到標題化合物,為白色固體,其不經進一步純化而使用。收率234?mg(72%)。

LCMS:理論質量:851.0?實測值:851.5(M+1)。

將相應于約400?mg胰島素的A14E?B25H?desB27?desB30人胰島素的鋅沉淀物溶解于水(32?mL)中,并加入EDTA(40?mg)。讓混合物在室溫下留置1小時。用10%?AcOH將pH降低至4.8。加入溶解于1M?NaAc的十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-苯甲醛(92?mg)(3.0?mL,在自來水下加熱)。攪拌10分鐘后,加入1M?NaCNBH3/水(0.715?mL),以得到20?mM?溶液。1分鐘內,混合物變得不透明,并且出現粘性沉淀物。1小時后,加入更多的醛(36?mg)和THF(3?mL)。40分鐘后,用AcOH將pH降低至3.1,并且加入一些乙腈。將混合物凍干。通過RP-HPLC在C18柱上純化產物,使用A:0.1?%三氟乙酸/水,緩沖劑B:0.1?%三氟乙酸/乙腈。梯度20?%?B-60?%?B,經45分鐘。將產物池部分真空蒸發,冷凍干燥,得到A1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB27?desB30人胰島素。

MALDI:(基質,HCCA);m/z:7233.5?Da,C328H505N73O98S6計算值:7231.5?Da

實施例11?A1N α -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B1N α -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB30人胰島素

將A14E?B25H?desB30人胰島素(300?mg)溶解于pH?5.0的1.0?M?NaAc(3.2?mL)中。將醛十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-苯甲醛(79?mg)在1.0?M?NaAc中的pH?5.0的溶液(3.0?mL,在自來水下加熱)加入。混合物變得不透明。攪拌5分鐘后,加入1M?NaCNBH3(135?μL),以得到20?mM?溶液。pH為4.9,反應混合物顯得不透明。40分鐘后,用AcOH將pH降低至3.1,并且加入一些乙腈。將混合物凍干。通過RP-HPLC在C18柱上純化產物,使用A:0.1?%三氟乙酸/水,緩沖劑B:0.1?%三氟乙酸/乙腈。梯度20?%?B-60?%?B,經45分鐘。將產物池部分真空蒸發,冷凍干燥,得到A1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB30人胰島素。

MALDI:(基質,HCCA);m/z:7334.5?Da,C332H512N74O100S6計算值:7332.6?Da

實施例12?A1N α -十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-氨基甲基-芐基B1N α -十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB27?desB30人胰島素

將相應于約400?mg胰島素的A14E?B25H?desB27?desB30人胰島素的鋅沉淀物溶解于水(48?mL)中,并且加入EDTA(40?mg)。讓混合物在室溫下留置45分鐘。用10%?AcOH將pH降低至5.0。加入溶解于1M?NaAc的十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-苯甲醛(90?mg,與十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-苯甲醛類似地制備)(3.0?mL,在自來水下加熱)。攪拌7分鐘后,加入1M?NaCNBH3/水(1.08?mL),以得到20?mM?溶液。1分鐘內,混合物變得不透明,片刻以后出現粘性沉淀物。45分鐘后,用AcOH將pH降低至3.1,并且加入一些乙腈。將混合物凍干。通過RP-HPLC在C18柱上純化產物,使用A:0.1?%三氟乙酸/水,緩沖劑B:0.1?%三氟乙酸/乙腈。梯度20?%?B-60?%?B,經45分鐘pH。將產物池部分真空蒸發,冷凍干燥,得到A1Nα-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B1Nα-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB27?desB30人胰島素。

MALDI:(基質,HCCA);m/z:7178.9?Da,C324H497N73O98S6計算值:7175.4?Da

實施例13?A1N α -十四烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B1N α -十四烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB27?desB30人胰島素

將相應于約100?mg胰島素的A14E?B25H?desB27?desB30人胰島素的鋅沉淀物溶解于水中(16?mL),并加入EDTA(10?mg)。讓混合物在室溫下留置1小時。用10%?AcOH將pH降低至4.8。加入溶解于1M?NaAc的十四烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-苯甲醛(36?mg,與十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-苯甲醛類似地制備)(0.75?mL,在自來水下加熱)。攪拌10分鐘后,加入1M?NaCNBH3/水(0.35?mL),以得到20?mM?溶液。1分鐘內,混合物變得不透明,片刻以后出現粘性沉淀物。1小時后,加入更多的醛(36?mg)和THF(3?mL)。4小時后,將混合物在5℃下儲存過夜。通過RP-HPLC在C18柱上純化產物,使用A:0.1?%三氟乙酸/水,緩沖劑B:0.1?%三氟乙酸/乙腈。梯度20?%?B-60?%?B,經45分鐘。將產物池部分真空蒸發,冷凍干燥,得到A1Nα-十四烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B1Nα-十四烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB27?desB30人胰島素。

LCMS:1780.6?Da?[M?+?4H]4+。C320H489N73O98S6?[M?+?4H]4+計算值:1780.8?Da。

LCMS?緩沖劑A:0.1?%三氟乙酸/水;緩沖劑B:0.1?%三氟乙酸/乙腈,梯度10-90?%?B,經10分鐘。

MALDI:(基質,HCCA);m/z:7118.7?Da,計算值:7119.3?Da

實施例14?A1N α -十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG4-氨基甲基-芐基B1N α -十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB30人胰島素

將A14E?B25H?desB30人胰島素(300?mg)溶解于pH?5.0的1.0?M?NaAc(3.2?mL)中。將十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-氨基甲基-苯甲醛(79?mg)在1.0?M?NaAc中的pH?5.0的溶液(3.0?mL,在自來水下加熱)加入。混合物變得不透明。攪拌5分鐘后,加入1M?NaCNBH3(135?μL),以得到20?mM?溶液。pH為4.9,反應混合物不透明,但在變化。40分鐘后,用AcOH將pH降低至3.1,并且加入一些乙腈。將混合物凍干。通過RP-HPLC在C18柱上純化產物,使用A:0.1?%三氟乙酸/水,緩沖劑B:0.1?%三氟乙酸/乙腈。梯度20?%?B-60?%?B,經45分鐘。將產物池部分真空蒸發,冷凍干燥,得到A1Nα-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B1Nα-十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB30人胰島素。

MALDI:(基質,HCCA);m/z:7279.4?Da,C328H504N74O100S6計算值:7276.5?Da

實施例15?B1N α -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B29N ε -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB30人胰島素

將300?mg如WO?2010/029159所述制備的B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB30人胰島素溶解于2M?AcOH/NMP?9:1(9?mL)中。用1N?NaOH將pH從2.9調節至3.5。加入十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-苯甲醛(44?mg)/NMP(0.5?mL)。混合物變為不透明,pH?3.77。攪拌15分鐘后,在NMP/1M?NaAc(0.45?mL)中加入1M?2-甲基吡啶硼烷復合物。pH為3.77。將混合物在室溫下攪拌。粘性材料聚集在混合物的頂部。7分鐘后,混合物用1M?AcOH(4.7?mL,以稀釋硼化物)稀釋。1小時后,用AcOH將pH降低至3.0,以得到溶液,其通過RP-HPLC在C18柱上純化,使用A:0.1?%三氟乙酸/水,緩沖劑B:0.1?%三氟乙酸/乙腈。梯度20?%?B-60?%?B,經45分鐘。將產物池部分真空蒸發,冷凍干燥,得到B1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB30人胰島素。

LCMS:1804.8?Da?[M?+?4H]4+。C324H503N73O100S6?[M?+?4H]4+計算值:1804.4Da。

LCMS緩沖劑A:0.1?%三氟乙酸/水;緩沖劑B:0.1?%三氟乙酸/乙腈,梯度10-90?%?B,經10分鐘。

MALDI:(基質,HCCA);m/z:7215.9?Da,C324H503N73O100S6計算值:7213.4?Da

實施例16?A1N α -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B1N α -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B29N ε 十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB30人胰島素

將B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB30人胰島素(300?mg)溶解于2?M?AcOH/NMP?9:1(9?mL)中。用1N?NaOH將pH從2.9調節至3.5,得到粘性懸浮液。加入十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-苯甲醛(44?mg)/NMP(0.5?mL)。混合物變為不透明,pH為3.77。攪拌15分鐘后,在NMP/1M?NaAc(0.45?mL)中加入1M?2-甲基吡啶硼烷復合物。pH為3.77。將混合物在室溫下攪拌。粘性材料聚集在混合物的頂部。7分鐘后,用1M?AcOH(4.7?mL,以稀釋硼化物)稀釋混合物。1小時后,用AcOH將pH降低至3.0,以得到溶液,其通過RP-HPLC在C18柱上純化,使用A:0.1?%三氟乙酸/水,緩沖劑B:0.1?%三氟乙酸/乙腈。梯度20?%?B-60?%?B,經45分鐘。將產物池部分真空蒸發,冷凍干燥,得到A1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-氨基甲基-芐基B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB30人胰島素。

該實施例說明這種類型的反應得到B1N-烷基化作為主要產物。

LCMS:1610.9?Da?[M?+?5H]5+。C367H573N77O112S6?[M?+?5H]5+計算值:1610.7?Da。

LCMS緩沖劑A:0.1?%三氟乙酸/水;緩沖劑B:0.1?%三氟乙酸/乙腈,梯度10-90?%?B,經10分鐘。

MALDI:(基質,HCCA);m/z:8050.7?Da,C367H573N77O112S6計算值:8048.5?Da

實施例17?A1N α -十八烷二酰基-N-羧甲基-β-丙氨酰基B29N ε -十八烷二酰基-N-羧甲基-β-丙氨酰基A14E?B25H?desB30人胰島素

將A14E?B25H?desB30人胰島素(200?mg)溶解于100?mM水性Na2CO3(4.5?mL)中,并用1?N?NaOH將pH?調節至10.1。將叔丁基十八烷二酰基-N-(叔丁氧基羰基甲基)-β-丙氨酰基-OSu(28?mg)(如WO?2005/012347所述制備)溶解于THF(2.25?mL),并且加入到胰島素溶液中。觀察到一些沉淀,加入更多的THF(0.75?mL)。Ph為10.7。34分鐘后,加入更多的叔丁基十八烷二酰基-N-(叔丁氧基羰基甲基)-β-丙氨酰基-OSu(14?mg)。57分鐘后,加入水,用1N?HCl將pH調節至5.1。使沉淀物旋轉下沉并凍干。將固體溶解于冰冷卻的95%三氟乙酸(含有5%水)中,并在冰上保持40分鐘。將混合物真空濃縮,由二氯甲烷再蒸發。通過RP-HPLC在C18柱上將殘余物純化,使用A:0.1?%三氟乙酸/水,緩沖劑B:0.1?%三氟乙酸/乙腈。梯度20?%1B-55?%?B,經75分鐘。將產物池部分真空蒸發,冷凍干燥,得到A1Nα-十八烷二酰基-N-羧甲基-β-丙氨酰基B29Nε-十八烷二酰基-N-羧甲基-β-丙氨酰基A14E?B25H?desB30人胰島素。

LCMS:1629.0?Da?[M?+?4H]4+。C292H450N68O88S6?[M?+?4H]4+計算值:1629.4?Da。

LCMS緩沖劑A:0.1?%三氟乙酸/水;緩沖劑B:0.1?%三氟乙酸/乙腈,梯度10-90?%?B,經10分鐘。

MALDI:(基質,HCCA);m/z:6511.0?Da,C292H450N68O88S6計算值:6513.6?Da

實施例18?A1N α 十八烷二酰基-N-2-羧乙基-甘氨酰基B29N ε -十八烷二酰基-N-2-羧乙基-甘氨酰基A14E?B25H?desB30人胰島素

將A14E?B25H?desB30人胰島素(100?mg)溶解于DMSO(1.0?mL)中,并加入三乙胺(0.05?mL)。加入溶解于乙腈/THF?1:1(2.25?mL)中的叔丁基十八烷二酰基-N-(2-(叔丁氧基羰基)乙基)-Gly-OSu(46?mg)(如WO?2005/012347所述制備)。在室溫下攪拌30分鐘后,加入溶解于乙腈/THF?1:1(2.25?mL)中的更多的叔丁基十八烷二酰基-N-(2-(叔丁氧基羰基)乙基)-Gly-OSu(46?mg)。75分鐘后,加入水(5?mL),用1N?HCl將pH調節至5.3。使沉淀物旋轉下沉并凍干。在pH?12下,干混合物用0.1N?NaOH在冰浴上處理45分鐘。將pH再次調節至5.3,將沉淀物旋轉下沉并凍干。將固體溶解于冰冷卻的95%三氟乙酸(含有5%水)中,并在冰上保持45分鐘。將混合物真空濃縮,由二氯甲烷再次蒸發。通過RP-HPLC在C18柱上將殘余物純化,使用A:0.1?%三氟乙酸/水,緩沖劑B:0.1?%三氟乙酸/乙腈。梯度25?%1B-70?%?B,經60分鐘。將產物池部分真空蒸發,冷凍干燥,得到A1Nα-十八烷二酰基-N-2-羧乙基-甘氨酰基B29Nε-十八烷二酰基-N-2-羧乙基-甘氨酰基A14E?B25H?desB30人胰島素。

LCMS:1628.7?Da?[M?+?4H]4+。C292H450N68O88S6?[M?+?4H]4+計算值:1629.4?Da。

LCMS緩沖劑A:0.1?%三氟乙酸/水;緩沖劑B:0.1?%三氟乙酸/乙腈,梯度10-90?%?B,經10分鐘。

MALDI:(基質,HCCA);m/z:6511.1?Da,C292H450N68O88S6計算值:6513.6?Da

實施例19?A1N α -十八烷二酰基-N-羧甲基-β-丙氨酰基A22N ε -N-十八烷二酰基-N-羧甲基-β-丙氨酰基A22K?B29R?desB30人胰島素

將A22K?B29R?desB30人胰島素(200?mg)溶解于100?mM水性Na2CO3(4.5?mL)中,并用1?N?NaOH將pH調節至10.1。將叔丁基十八烷二酰基-N-(叔丁氧基羰基甲基)-βAla-OSu(27?mg)(如WO?2005/012347所述制備)溶解于乙腈/THF?1.2(2.25?mL)中,并且加入到胰島素溶液中。觀察到一些沉淀,加入更多的THF(1.0?mL),以得到透明的溶液。Ph為10.7。57分鐘后,加入溶解于THF(1.1?mL)中的更多的叔丁基十八烷二酰基-N-(叔丁氧基羰基甲基)-?βAla-OSu(14?mg)。90分鐘后,加入水(4.5?mL),用1N?HCl將pH調節至5.5。使沉淀物旋轉下沉并凍干。將固體溶解于冰冷卻的95%三氟乙酸(含有5%水)中,并在冰上保持25分鐘。將混合物真空濃縮。通過RP-HPLC在C18柱上將殘余物純化,使用A:0.1?%三氟乙酸/水,緩沖劑B:0.1?%三氟乙酸/乙腈。梯度10?%?B-55?%?B,經75分鐘。將產物池部分真空蒸發,冷凍干燥,得到A1Nα-十八烷二酰基-N-羧甲基)-β-丙氨酰基)A22Nε-十八烷二酰基-N-羧甲基-β-丙氨酰基A22K?B29R?desB30人胰島素。

LCMS:1679.0?Da?[M?+?4H]4+。C305H466N70O88S6?[M?+?4H]4+計算值:1679.5?Da。

LCMS緩沖劑A:0.1?%三氟乙酸/水;緩沖劑B:0.1?%三氟乙酸/乙腈,梯度10-90?%?B,經10分鐘。

MALDI:(基質,HCCA);m/z:6709.4?Da,C305H466N70O88S6計算值:6713.9?Da

實施例20?A22N ε -十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29N ε -十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB30人胰島素

將A14E?A22K?B25H?desB30人胰島素(0.5?g,86?μmol)溶解于200?mM?Na2CO3(5?mL)中,用1N?NaOH將pH調節至11。隨后,將十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-琥珀酰亞胺基(150?mg,186?μmol)?溶解于NMP(0.5mL)中,將乙腈(0.1?mL)加入到胰島素溶液中,并加入1N?NaOH,以保持pH在11。將反應攪拌5分鐘,通過LCMS監測反應進程。將溶解于NMP(0.5?mL)和乙腈(0.1?mL)中的十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-琥珀酰亞胺基(150?mg,186?μmol)再加入2次(使用以上方案),隨后通過LCMS監測形成的目標產物。通過RP-HPLC在C18柱上純化產物,使用緩沖劑A:0.1%?TFA/水,緩沖劑B:0.1%?TFA/乙腈,梯度25-50%乙腈,經60分鐘,流速為25?mL/分鐘。將產物純化2次。柱:Phenomenex,Gemini,5?μ,C18,110??,250×30?cm。隨后將純餾分匯合并冷凍干燥。

LCMS:1791.7?Da?[M?+?4H]4+。C318H498N74O101S6?[M?+?4H]4+計算值:1790.5?Da。

LCMS緩沖劑A:0.1?%三氟乙酸/水;緩沖劑B:0.1?%三氟乙酸/乙腈,梯度5-90?%?B,經4分鐘。

實施例21?A1N α -十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29N ε -十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB30人胰島素

將A14E?B25H?desB30人胰島素(500?mg,88?μmol)溶解于200mM??Na2CO3(5mL)中,并用1N?NaOH將pH調節至11。隨后,將溶解于NMP(0.5mL)和乙腈(0.1mL)中的十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-琥珀酰亞胺基(150?mg,186?μmol)加入到胰島素溶液中,并加入1N?NaOH,以保持pH在11。將反應攪拌5分鐘,通過LCMS監測反應進程。將溶解于NMP(0.5?mL)和乙腈(0.1?mL)中的連接基十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-琥珀酰亞胺基(150?mg,186?μmol)再加入3次(使用以上方案),隨后通過LCMS監測,目標產物為主要產物。通過RP-HPLC在C18柱上純化產物,使用緩沖劑A:0.1%?TFA/水,緩沖劑B:0.1%?TFA/乙腈,梯度30-45%乙腈,經60分鐘,流速為25?mL/分鐘。柱:Phenomenex,Gemini,5μ,C18,110??,250×30?cm。將產物純化2次。隨后將純餾分匯合并冷凍干燥。

LCMS:1760.3?Da?[M?+?4H]4+。C312H486N72O100S6?[M?+?4H]4+計算值:1758.5?Da。

LCMS緩沖劑A:0.1?%三氟乙酸/水;緩沖劑B:0.1?%三氟乙酸/乙腈,梯度5-90?%?B,經4分鐘。

實施例22?A1N α -十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29N ε -十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B16H?B25H?desB30人胰島素

將A14E?B16H?B25H,desB30人胰島素(1?g,177?μmol)溶解于200?mM?Na2CO3(12.5mL)中,通過加入1N?NaOH將pH調節至11。隨后,經10分鐘,將溶解于NMP(1.0?mL)和乙腈(0.2?mL)中的十六烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-琥珀酰亞胺基(400?mg,499?μmol)加入到胰島素溶液中。另外加入1N?NaOH,以保持在反應期間pH在11.0。將反應混合物在室溫下攪拌30分鐘,通過LCMS監測反應進程,通過RP-HPLC在C18柱上純化產物,使用緩沖劑A:0.1%?TFA/水,緩沖劑B:0.1%?TFA/乙腈,梯度25-40%乙腈,經60分鐘,流速為25?mL/分鐘。隨后將純餾分匯合并冷凍干燥。

LCMS:1402.9?Da?[M?+?5H]5+。C309H484N74O99S6?[M?+?5H]5+計算值:1403.0?Da。

LCMS緩沖劑A:0.1?%三氟乙酸/水;緩沖劑B:0.1?%三氟乙酸/乙腈,梯度5-90?%?B,經4分鐘。

實施例23?A1N α -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B1N α -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?B29R?desB30人胰島素

將A14E?B25H?B29R?desB30人胰島素(0.35g,61?μmol)溶解于H2O(3mL)中,將pH調節至11。隨后,將溶解于NMP(0.4?mL)和乙腈(0.1?mL)中的十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-琥珀酰亞胺基(100?mg,120?μmol)加入到胰島素溶液中,并加入1N?NaOH,以保持pH在11。將反應攪拌5分鐘,通過LCMS監測反應進程。再加入溶解于NMP(0.4?mL)和乙腈(0.1?mL)中的十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-琥珀酰亞胺基(150?mg,120?μmol),通過LCMS監測形成的主要產物的進展。通過RP-HPLC在C18柱上將產物純化2次,使用緩沖劑A:0.1%?TFA/水,緩沖劑B:0.1%?TFA/乙腈,梯度;30-45%乙腈,經60分鐘,和10-40%乙腈,經60分鐘,流速為25?mL/分鐘。隨后將純餾分匯合并冷凍干燥。

LCMS:1189.9.88?Da?[M?+?6H]6+。C316H494N74O100S6?[M?+?6H]6+計算值:1188?Da。

LCMS緩沖劑A:0.1?%三氟乙酸/水;緩沖劑B:0.1?%三氟乙酸/乙腈,梯度5-90?%?B,經4分鐘。

實施例24?A22N ε -二十烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29N ε -二十烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?A22K?B25H?desB30人胰島素

將A14E?A22K?B25H?desB30人胰島素(450?mg,77?μmol)溶解于200mM?Na2CO3(5mL)中,并用1N?NaOH將pH調節至11。隨后,將溶解于NMP(0.5?mL)和乙腈(0.1mL)中的二十烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-琥珀酰亞胺基(150?mg,174?μmol)加入到胰島素溶液中,并加入1N?NaOH,以保持pH在11。將反應攪拌5分鐘。隨后,通過LCMS監測反應進程,將溶解于NMP(0.5?mL)和乙腈(0.1?mL)中的二十烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-琥珀酰亞胺基(150?mg,174?μmol)再加入2次(使用以上方案),隨后通過LCMS監測到,形成標靶產物。通過RP-HPLC在C18柱上將產物純化2次,使用1)?緩沖劑A:0.1%?TFA/水,緩沖劑B:0.1%?TFA/乙腈,梯度:25-50%乙腈,經40分鐘,流速為25?mL/分鐘;2)?緩沖劑A:10?mM?Tris,15?mM硫酸銨,pH?7.3,在水/乙腈80/20中,緩沖劑B:水/乙腈20/80,梯度:10-60%?緩沖劑B,經60分鐘,流速為25?mL/分鐘。隨后將純餾分匯合并冷凍干燥。

LCMS:1820.1?Da?[M?+?4H]4+。C326H514N74O101S6?[M?+?4H]4+計算值:1820.5?Da。

LCMS緩沖劑A:0.1?%三氟乙酸/水;緩沖劑B:0.1?%三氟乙酸/乙腈,梯度5-90?%?B,經4分鐘。

實施例25?B1N α -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B29N ε -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B16H?B25H?desB30人胰島素

通過加熱(自來水),將十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-苯甲醛(100?mg,117?μmol)溶解于2mL?25mM?HEPES(2mL)中,隨后加入20%?HPCD(500?μL),以得到不透明但是均質的溶液。向B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B16H?B25H?desB30人胰島素(250?mg,39.8?μmol)中加入25?mM?HEPES(5?mL,pH?5.6),用1N?HCl將pH調節至5.0。將以上醛溶液(2.5?mL)加入到胰島素中,溶液變得不透明。5分鐘后,加入1M?NaCNBH3/MeOH(165?μL),通過LCMS和UPLC監測反應進程。

通過RP-HPLC在C18柱上純化產物,使用緩沖劑A:0.1%?TFA/水,緩沖劑B:0.1%?TFA/乙腈,梯度:30-55%乙腈,經40分鐘,流速為25?mL/分鐘。隨后將純餾分匯合并冷凍干燥。

LCMS:1438.3?Da?[M?+?5H]5+。C321H501N75O99S6?[M?+?5H]5+計算值:1438.4?Da。

LCMS緩沖劑A:0.1?%三氟乙酸/水;緩沖劑B:0.1?%三氟乙酸/乙腈,梯度5-90?%?B,經4分鐘。肽的氨基酸排序證實C18二酸-γ-LGlu-OEG-OEG-氨基甲基-芐基與B1連接(烷基化)。

實施例26?B1N α -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B29N ε -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB30人胰島素

通過加熱(自來水),將十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-苯甲醛(100?mg,117?mmol)溶解于25mM?HEPES(2mL)中。隨后加入20%?HPCD(500?μL),以得到不透明但是均質的溶液。

向B29Ne-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB30人胰島素(250?mg,39?μmol)中加入25?mM?HEPES(5?mL,pH?5.6),用1N?HCl將pH調節至5.0。將醛溶液(2.5?mL)加入到胰島素中,溶液變得不透明。5分鐘后,加入1M?NaCNBH3/MeOH(165μL)。通過LCMS和uplc兩者監測反應進程。通過RP-HPLC在C18柱上純化產物,使用緩沖劑A:0.1%?TFA/水,緩沖劑B:0.1%?TFA/乙腈,梯度:30-55%乙腈,經40分鐘,流速為25?mL/分鐘。柱(Kolonne):Phenomenex,Gemini,5μ,C18,110??,250×30?cm。隨后將純餾分匯合并冷凍干燥。

LCMS:1802.4?Da?[M?+?4H]4+。C324H503N73O100S6?[M?+?4H]4+計算值:1804?Da。

LCMS緩沖劑A:0.1?%三氟乙酸/水;緩沖劑B:0.1?%三氟乙酸/乙腈,梯度5-90?%?B,經4分鐘。肽的氨基酸排序證實C18二酸-γ-LGlu-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基與B1連接(烷基化)。

實施例27?B1N α -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B29N ε -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB27?desB30人胰島素

通過加熱(自來水),將十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-苯甲醛(140?mg,163?μmol)溶解于25mM?HEPES(2.8?mL)中。加入20%?HPCD(700?μL),以得到不透明但是均質的溶液。

向B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B25H?desB27?desB30人胰島素(350?mg,55?μmol)中加入25?mM?HEPES(7?mL,pH?5.6),用1N?HCl將pH調節至5.5。加入醛溶液(3.5?mL),溶液不透明。幾分鐘后,加入1M?NaCNBH3/MeOH(230?μL)。30分鐘后,通過LCMS監測反應進程,隨后形成期望的產物。加入1N?HCl,以酸化反應混合物,隨后進行制備型HPLC純化。通過RP-HPLC在C18柱上純化產物,使用緩沖劑A:0.1%?TFA/水,緩沖劑B:0.1%?TFA/乙腈,梯度:25-65%乙腈,經40分鐘,流速為25?mL/分鐘。隨后將純餾分匯合并冷凍干燥。

LCMS:1423.4?Da?[M?+?5H]5+。C320H496N72O98S6?[M?+?5H]5+計算值:1423.5?Da。

LCMS緩沖劑A:0.1?%三氟乙酸/水;緩沖劑B:0.1?%三氟乙酸/乙腈,梯度5-90?%?B,經4分鐘。肽的氨基酸排序證實C18二酸-γ-LGlu-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基與B1連接(烷基化)。

實施例28?A22N ε -4-羧基苯氧基-癸酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29N ε -4-羧基苯氧基-癸酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?A22K?B25H?desB30人胰島素

該化合物與實施例4的化合物類似地制備,通過使用4-叔丁基-羧基苯氧基-癸酰基-γ-L-谷氨酰基-α-叔丁基-OEG-OEG-琥珀酰亞胺基(與在WO06082204中描述的類似地制備)和A14E?B25H?A22K?desB30人胰島素。

產物LCMS:1806.5?Da?[M?+?4H]4+。

C320H486N74O103S6?[M?+?4H]4+計算值:1803.6?Da。

實施例29?根據本發明的胰島素衍生物的人胰島素受體親和力、白蛋白親和力、平均停留時間

對根據本發明的胰島素衍生物(二取代和三取代的胰島素)和一種單取代的胰島素呈現表1中的數據。通過SPA試驗(鄰近閃爍試驗)微量滴定板抗體捕獲試驗來測定本發明的酰化的胰島素類似物對人胰島素受體的親和力。對麻醉的大鼠靜脈給藥(i.v.)各種劑量的胰島素類似物,使用免疫測定或質譜,以給藥后4小時或更長的指定間隔測量采用的化合物的血漿濃度。隨后使用WinNonLin?Professional?(Pharsight?Inc.,Mountain?View,CA,USA)計算藥代動力學參數。

A.?與人胰島素受體同種型A(hIRA)結合的胰島素衍生物實施例的人胰島素受體親和力,解離常數(Kd),相對于人胰島素的值。

B.?當向大鼠靜脈給予胰島素衍生物實施例時,按平均停留時間(MRT)測量的體內延長。

C.?在該列表中,B29Nε十六烷二酰基γ-L-谷氨酰基desB30人胰島素指示為“C”,并且表示單取代的參比,僅用于值的比較。

表1:

雖然本文已說明和描述了本發明的某些特征,但是本領域普通技術人員可以想到許多修改、取代、變化和等價物。因此,應理解的是,所附方面旨在涵蓋落入本發明的真實精神內的所有這些修改和變化。

實施例30?A1N α -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29N ε -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B16H?B25H?desB30人胰島素

該化合物與實施例7的化合物類似地制備,通過使用十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-琥珀酰亞胺基和A14E?B16H?B25H?desB30人胰島素。

產物LCMS:1767.9?Da?[M?+?4H]4+。

C313H492N74O99S6?[M?+?4H]4+計算值:1768.1?Da。

實施例31?A1N α -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?B29N ε -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?B16H?desB27?desB30人胰島素

該化合物與實施例7的化合物類似地制備,通過使用十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-琥珀酰亞胺基和A14E?B16H?desB27?desB30人胰島素。

產物LCMS:1744.8?Da?[M?+?4H]4+。

C312H487N71O97S6?[M?+?4H]4+計算值:1745.3?Da。

實施例32?B1N α -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B29N ε -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB30人胰島素

向A14E?B25H?desB30人胰島素(50?mg)在DMSO(1.5?ml)中的懸浮液中加入十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-苯甲醛(11.3?mg)的DMSO(0.5?mL)溶液。20分鐘后,混合物透明,加入1?M?2-甲基吡啶硼烷復合物/DMSO(0.041?ml)。2.5小時后和21小時后,加入另外1M?2-甲基吡啶硼烷復合物/DMSO(0.041?ml)。24.5小時后,通過RP-HPLC在C18柱上純化混合物,使用A:0.1?%三氟乙酸/水,緩沖劑B:0.1?%三氟乙酸/乙腈。梯度20?%?B-60?%?B,經60分鐘。將產物池部分真空蒸發,冷凍干燥,得到B1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB30人胰島素。

LCMS:1833.81?Da?[M?+?4H]4+。C332H512N74O100S6?[M?+?4H]4+計算值:1834.15?Da。

MALDI:(基質,HCCA);m/z:7332.76?Da,計算值:7332.60?Da

實施例33?A1N α -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B29N ε -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB30人胰島素

將A1Nα-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B29Nε-十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基A14E?B25H?desB30人胰島素從實施例32中描述的反應混合物中分離。

LCMS:1834.14?Da?[M?+?4H]4+。C332H512N74O100S6?[M?+?4H]4+計算值:1834.15?Da。

MALDI:(基質,HCCA);m/z:7332.94?Da,計算值:7332.60?Da

實施例34?B1N α -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B29N ε -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG?A14E?desB27?desB30人胰島素

該化合物與實施例27的化合物類似地制備,通過使用十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-4-氨基甲基-苯甲醛和十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-琥珀酰亞胺基和A14E?desB27?desB30人胰島素。

產物LCMS:1781.8?Da?[M?+?4H]4+。

C323H498N70O98S6?[M?+?4H]4+計算值:1781.6?Da。

實施例35?B1N α -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-OEG-OEG-4-氨基甲基-芐基B29N ε -十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-OEG-OEG?A14E?desB27?desB30人胰島素

該化合物與實施例27的化合物類似地制備,通過使用十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-OEG-OEG-4-氨基甲基-苯甲醛和十八烷二酰基-γ-L-谷氨酰基-OEG-OEG-OEG-OEG-琥珀酰亞胺基和A14E?desB27?desB30人胰島素。

產物LCMS:1926.8?Da?[M?+?4H]4+。

C347H542N74O110S6?[M?+?4H]4+計算值:1926.8?Da。

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