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一種國槐離體葉片體細胞胚誘導的快速繁殖方法.pdf

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一種 國槐 葉片 體細胞 誘導 快速 繁殖 方法
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摘要
申請專利號:

CN201610017997.0

申請日:

20160112

公開號:

CN105660396A

公開日:

20160615

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A01H4/00 主分類號: A01H4/00
申請人: 山東省林業科學研究院
發明人: 李雙云,楊國良,李麗,龐彩紅,劉盛芳,王守國,張炳孝,夏陽
地址: 250014 山東省濟南市歷下區文化東路42號
優先權: CN201610017997A
專利代理機構: 濟南圣達知識產權代理有限公司 代理人: 曹麗
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201610017997.0

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種國槐離體葉片體細胞胚誘導的快速繁殖方法,步驟如下選取國槐嫩枝消毒后,取帶有腋芽或頂芽的莖段,接入芽啟動培養基上,誘導頂芽和腋芽萌發;將誘導出的新梢去掉基部葉片,切成含腋芽或頂芽的莖段接種在試管苗增殖培養基上,獲得無菌試管苗;取無菌試管苗的葉片接種在體胚誘導培養基上培養形成愈傷組織;將上述愈傷組織轉接到不定芽誘導培養基上,培養形成叢生芽小苗;將叢生芽小苗切成愈傷塊轉接到試管苗增殖培養基或不定芽誘導培養基上進行培養;將培養的叢生芽轉入壯苗培養基中,進行壯苗培養后即可煉苗移栽。本發明方法,再生率高、出芽多,植株移栽成活率可達到95%以上,種苗生長健壯,不但可有效解決優良種苗種質退化問題。

權利要求書

1.一種國槐離體葉片體細胞胚誘導的快速繁殖方法,其特征是:包括以下步驟:(1)將國槐莖消毒后,取帶有芽的莖段,接入芽啟動培養基上,誘導頂芽和腋芽萌發,所述芽啟動培養基為:MS+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8~6.0;(2)將誘導出的新梢去掉基部葉片,切成含芽的莖段接種在試管苗增殖培養基上培養,獲得無菌試管苗,所述試管苗增殖培養基為:MS+1.0~2.0mg/LBA+1.0~2.0mg/LIBA+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8~6.0;(3)取無菌試管苗的葉片接種在體胚誘導培養基上培養形成愈傷組織,所述體胚誘導培養基為:MS+3.0~5.0mg/L2,4-D+0.5~1.0mg/LBA+0.5~1.0mg/LNAA+0.1~0.5mg/LTDZ+0.5~1.0mg/L谷氨酰胺+0.5~1.0mg/LCH+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8~6.0;(4)將上述愈傷組織轉接到不定芽誘導培養基上,培養形成叢生芽小苗,所述不定芽誘導培養基為:MS+0.1~0.5mg/LBA+0.1~0.5mg/LNAA+0.5~1.0mg/L谷氨酰胺+0.5~1.0mg/LCH+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8~6.0;(5)將叢生芽小苗切成愈傷塊轉接到試管苗增殖培養基或不定芽誘導培養基上進行增殖快繁培養;(6)將增殖培養的叢生芽從基部切開,轉入壯苗培養基中,進行壯苗培養,所述壯苗培養基為:MS+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8~6.0;(7)將壯苗培養后的小苗切成單株轉接到生根培養基上培養后,即可煉苗移栽,所述生根培養基為:1/2MS+0.1~0.5mg/LIBA+0~0.05mg/LNAA+5.0g/L瓊脂+20g/L蔗糖,pH值5.8~6.0,所述1/2MS是MS全量減半。2.如權利要求1所述的快速繁殖方法,其特征是:所述步驟(1)之前還包括選取國槐嫩枝,所述國槐嫩枝為取無病蟲害的當年生嫩枝,除去多余的莖葉,用洗潔精仔細清洗后,流水沖洗1小時得到。3.如權利要求1所述的快速繁殖方法,其特征是:所述步驟(1)中消毒為:于超凈工作臺上,用體積分數為70%酒精浸泡30~60s,無菌水沖洗2~3次,再用質量分數為0.1%升汞溶液消毒10~15min,然后用無菌水沖洗4~6次。4.如權利要求1所述的快速繁殖方法,其特征是:所述步驟(3)中無菌試管苗的葉片接種時葉片的處理方法:取無菌試管苗,從莖尖向下第3到第6片展開葉為材料,葉片帶短葉柄,用手術刀片垂直于葉片背面主脈劃3~4個傷口。5.如權利要求1所述的快速繁殖方法,其特征是:所述各步驟中培養條件除特殊說明外,均為培養室溫度白天25±2℃,夜晚18±2℃,光照強度1000~1500lx,光照時間16h/d。6.如權利要求1所述的快速繁殖方法,其特征是:所述MS包括常量營養元素、微量營養元素和有機試劑。7.如權利要求6所述的快速繁殖方法,其特征是:所述的常量營養元素的組分和其對應的濃度如下:硝酸鉀1900mg/L,硝酸銨1650mg/L,七水硫酸鎂370mg/L,無水磷酸二氫鉀170mg/L,二水氯化鈣440mg/L,乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L,七水硫酸亞鐵27.8mg/L。8.如權利要求6所述的快速繁殖方法,其特征是:所述的微量營養元素的組分和其對應的濃度如下:四水硫酸錳22.3mg/L,硫酸鋅8.6mg/L,硼酸6.2mg/L,碘化鉀0.83mg/L,鉬酸鈉0.25mg/L,硫酸銅0.025mg/L,氯化鈷0.025mg/L。9.如權利要求6所述的快速繁殖方法,其特征是:所述的有機試劑的組分和其對應的濃度如下:鹽酸硫胺素10mg/L,煙酸1.0mg/L,鹽酸吡哆醇1.0mg/L,肌醇100mg/L。10.如權利要求1所述的快速繁殖方法,其特征是:所述步驟(7)中煉苗移栽的具體步驟為:將試管苗封口膜綁繩松開,在培養室適應1~2d,轉入遮光度50%的溫室中,去掉封口膜,煉苗2~3d,待小苗葉片上的氣孔自主開合后,用鑷子輕輕將小苗夾出,清水洗去基部殘留的培養基,移栽到裝有混合育苗基質的花盆中,保持相對濕度在80%以上。

說明書

技術領域

本發明涉及一種國槐離體葉片體細胞胚誘導的快速繁殖方法,屬于植物生物技術領域。

背景技術

國槐(SophorajaponicaLinn),別名家槐、中國槐,屬蝶形花亞科、槐屬。國槐為落葉喬木,樹勢優美,花期較長,極耐修剪,耐寒、耐旱、耐空氣污染,又是吉祥、幸福、美好的象征,是理想的行道樹種和庭院綠化樹種,而且國槐材質優良,花、果實、根皮、樹皮可入藥,種子可榨油制皂,具有較高的經濟價值,應用前景十分廣闊。目前,國槐是嫁接龍爪槐、金枝槐、聊紅槐、蝴蝶槐等觀賞品種的唯一砧木樹種,苗木需求大。國槐主要以種子繁殖為主,但其開花結果具有大小年現象,且種子易受病蟲害危害,干癟、空洞現象嚴重。常規的育種方法,依靠種子或扦插繁殖,難以滿足生產的需求,基于此有必要對國槐進行組培快繁研究,提供優質、大量國槐種苗,切實解決國槐苗木需求的瓶頸。

國槐古樹資源歷經千百年的風霜歲月,具有最原始的長壽和抗逆基因,但由于各種原因,衰老死亡的現象時常發生。就古槐衰敗的現狀來看,常表現為樹干腐朽空洞、冠形殘缺、頂梢枯萎、枝葉凋零、病蟲害嚴重、根系生長不良等等。這些古槐是大自然和前人留給我們的寶貴的基因資源。

近年來,利用生物轉基因技術培育具有抗性如抗逆、抗蟲、抗病等新型品種是國槐育種的新趨勢。到目前為止,對槐樹的形成層培養、莖培養、葉片培養、胚培養、未授粉子房的培養均已獲得了完整的植株,對原生質的培養也取得了一定的進展。袁秀云等利用國槐的子葉和下胚軸產生了不定芽,王喆之等利用花藥培養形成了單倍體植株,HanK.H等(1993,1997)將直徑為0.5~1.0cm的枝條消毒后,取出形成層接入愈傷誘導培養基中誘導愈傷,再將愈傷組織轉入分化培養基中,獲得了叢生芽,將成苗轉入生根培養基中,可誘導生根。上述的方法存在的缺點:由于國槐為多年生木本植物,其再生率普遍較低,出芽少,直接影響了國槐的遺傳轉化。利用植物體胚誘導技術不但能達到保存母株優良基因、快速繁育的目的,還是提高基因遺傳轉化或誘變育種的重要途徑。目前,有關國槐的體細胞胚誘導技術研究的較少,可以參考的現有技術比較少。國槐為多年生喬木,基因組龐大,鑒于基因型的限制,其他物種的體細胞胚誘導的繁殖技術對國槐沒有參考價值。在這一方面,即使是同一物種,不同的品種之間,體胚誘導培養基也不相同。例如,同樣是國槐,同一種培養基,對黃金槐適合,對金葉槐就不適合。

專利CN102499086A公開了一種刺槐的繁殖方法,以不同胚齡的合子胚為外植體,以MS+2,4-D+BA+蔗糖+瓊脂為胚性愈傷組織的誘導培養基;以MS基本培養基+MES+谷氨酰胺+水解酪蛋白+萘乙酸+6-芐氨基腺嘌呤+蔗糖+瓊脂為體細胞胚誘導培養基,通過對愈傷組織的誘導,形成球形胚后將其轉接到MS+水解酪蛋白培養基上,進行體細胞胚的成熟培養,然后轉接到MS基本培養基上萌發形成完整小植株。該專利使用刺槐的不同胚齡的合子胚(莢果)作為原料進行體細胞培養,不論是刺槐還是國槐,其每年的花期以及果實期都是固定的兩個月左右,所以在進行體細胞培養時具有時間的局限性;國槐的離體葉片、不成熟的合子胚均可誘導產生胚狀體。但是,在山東地區,最近幾年的國槐小峰危害非常嚴重,很難采到無蟲害的完整種子。其次,相對于國槐葉片誘導來說,不成熟合子胚的誘導時間更長,且誘導出的叢生芽也不如葉片誘導的多。因此,本專利采用取材方便、誘導率高的葉片進行國槐體胚誘導。國槐與刺槐分屬不同的屬,物種差別較大,不能參考莢果的體細胞培養得到葉片的體細胞培養。

發明內容

本發明的目的就是為了解決上述問題,提供一種國槐離體葉片體細胞胚誘導的快速繁殖方法,以解決國槐再生率低下、出芽少的問題。

為了實現上述目的,本發明采用如下技術方案:

一種國槐離體葉片體細胞胚誘導的快速繁殖方法,包括以下步驟:

(1)將國槐莖消毒后,取帶有芽(優選:腋芽或頂芽)的莖段,接入芽啟動培養基上,誘導頂芽和腋芽萌發,所述芽啟動培養基為:MS+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8~6.0;

(2)將誘導出的新梢去掉基部葉片,切成含芽(優選:腋芽或頂芽)的莖段接種在試管苗增殖培養基上培養,獲得無菌試管苗,所述試管苗增殖培養基為:MS+1.0~2.0mg/LBA(6-芐基腺嘌呤)+1.0~2.0mg/LIBA(吲哚丁酸)+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8~6.0;

(3)取無菌試管苗的葉片接種在體胚誘導培養基上培養形成愈傷組織,所述體胚誘導培養基為:MS+3.0~5.0mg/L2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)+0.5~1.0mg/LBA+0.5~1.0mg/LNAA(萘乙酸)+0.1~0.5mg/LTDZ+0.5~1.0mg/L谷氨酰胺+0.5~1.0mg/LCH(水解酪蛋白)+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8~6.0;

(4)將上述愈傷組織轉接到不定芽誘導培養基上,培養形成叢生芽小苗,所述不定芽誘導培養基為:MS+0.1~0.5mg/LBA+0.1~0.5mg/LNAA+0.5~1.0mg/L谷氨酰胺+0.5~1.0mg/LCH(水解酪蛋白)+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8~6.0;

(5)將叢生芽小苗切成愈傷塊轉接到試管苗增殖培養基或不定芽誘導培養基上進行增殖快繁培養;

(6)將增殖培養的叢生芽從基部切開,轉入壯苗培養基中,進行壯苗培養,所述壯苗培養基為:MS+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8~6.0;

(7)將壯苗培養后的小苗切成單株轉接到生根培養基上培養后,即可煉苗移栽,所述生根培養基為:1/2MS+0.1~0.5mg/LIBA+0~0.05mg/LNAA+5.0g/L瓊脂+20g/L蔗糖,pH值5.8~6.0,所述1/2MS是MS全量減半。

優選:所述步驟(1)之前還包括選取國槐嫩枝,所述國槐嫩枝為取無病蟲害的當年生嫩枝,除去多余的莖葉,用洗潔精仔細清洗后,流水沖洗1小時。優點:減少外植體消毒過程中的污染。

優選:步驟(1)中消毒為:于超凈工作臺上,用體積分數為70%酒精浸泡30~60s,無菌水沖洗2~3次,再用質量分數為0.1%升汞(氯化汞)溶液消毒10~15min,然后用無菌水沖洗4~6次。

優選:步驟(3)中無菌試管苗的葉片接種時葉片的處理方法:取無菌試管苗,從莖尖向下第3到第6片展開葉為材料,葉片帶短葉柄,用手術刀片垂直于葉片背面主脈劃3~4個傷口。

優選:上述各步驟中培養條件除特殊說明外,均為培養室溫度白天25±2℃,夜晚18±2℃,光照強度1000~1500lx,光照時間16h/d。

優選:MS包括常量營養元素、微量營養元素和有機試劑。

優選:所述的常量營養元素的組分和其對應的濃度如下:硝酸鉀1900mg/L,硝酸銨1650mg/L,七水硫酸鎂370mg/L,無水磷酸二氫鉀170mg/L,二水氯化鈣440mg/L,乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L,七水硫酸亞鐵27.8mg/L。

優選:所述的微量營養元素的組分和其對應的濃度如下:四水硫酸錳22.3mg/L,硫酸鋅8.6mg/L,硼酸6.2mg/L,碘化鉀0.83mg/L,鉬酸鈉0.25mg/L,硫酸銅0.025mg/L,氯化鈷0.025mg/L。

優選:所述的有機試劑的組分和其對應的濃度如下:鹽酸硫胺素10mg/L,煙酸1.0mg/L,鹽酸吡哆醇1.0mg/L,肌醇100mg/L。

優選:步驟(7)中煉苗移栽的具體步驟為:將試管苗封口膜綁繩松開,在培養室適應1~2d,轉入遮光度50%的溫室中,去掉封口膜,煉苗2~3d,待小苗葉片上的氣孔可自主開合后,用鑷子輕輕將小苗夾出,清水洗去基部殘留的培養基,移栽到裝有混合育苗基質的花盆中,保持相對濕度在80%以上。

優選:所述花盆混合育苗基質的成分以體積比計為:珍珠巖:鋸末:腐殖土=30:30:40。

優選:利用間歇噴霧裝置或人工噴水保持相對濕度。具體要求為:噴水一定為非常細小的霧狀水,使葉面保持濕潤,而花盆中基質狀態為用手攥不滴水,松手不散開。如此馴化煉苗5~10d后,長出新根,新芽萌出,逐漸減少澆水次數并進行常規管理。

有益效果:

體細胞胚發生的因素包括內因和外因,內因包括物種和基因型,外因主要涉及培養基中附加成分的種類和濃度。即使是同一屬的植物,由于基因型不同,體細胞胚發生頻率相差極大,原因如下:一是不同基因型體細胞胚發生頻率不同,二是不同基因型的最適誘導條件不同。外植體的生理狀態和發育程度都直接影響體細胞胚的發生,一般生理代謝旺盛而分化程度較低的組織有利于體細胞胚的誘導。

對于培養條件中必需的生長素、細胞分裂素、赤霉素、脫落酸,還原性氮鹽和外源氨基酸,pH值等其他因素,他們的作用方向、作用程度都不相同。誘導植物體細胞胚發生的因素眾多,但它們的作用程度不盡相同,各種因子通過轉錄與翻譯水平復雜而精確地調控,使體細胞胚發生的相關基因在時間上和空間上得以選擇性激活和表達,只有各種因素配合使用時才能快速、高效地誘導出體細胞胚。

外植體的生理狀態和發育程度都直接影響體細胞胚的發生,一般生理代謝旺盛而分化程度較低的組織有利于體細胞胚的誘導,葉片相較于花芽、花藥、子葉、子房中的合子胚,各種單細胞,游離的小孢子、原生質體以及體細胞胚本身的分化程度都高,做體細胞誘導的難度也更大。

發明人綜合考慮影響國槐葉片體細胞胚發生的各種因素,圍繞提高再生率、增加出芽,提高植株移栽成活率等目的,設計了本發明的繁殖方法,該方法相較于其他的方法再生率高、出芽多,植株移栽成活率可達到95%以上,種苗生長健壯,不但可有效解決優良種苗種質退化問題,還可為國槐遺傳轉化或誘變育種提供一個理想的受體系統

使用本發明的培養基繁殖國槐幼苗,可省去先建立國槐快繁再生體系這一步驟,大大節省時間。

附圖說明

圖1離體葉片劃傷口;

圖2經過暗培養形成胚性愈傷組織;

圖3光照培養形成黏性愈傷組織;

圖4愈傷組織誘導出叢生芽;

圖5切割叢生芽進行快繁培養;

圖6長成小苗;

圖7小苗生根;

圖8移栽到花盆中煉苗;

圖9成活后花盆中單株種植。

具體實施方式

下面結合附圖與實施例對本發明作進一步說明。

MS包括常量營養元素、微量營養元素和有機試劑。

所述的常量營養元素的組分和其對應的濃度如下:硝酸鉀1900mg/L,硝酸銨1650mg/L,七水硫酸鎂370mg/L,無水磷酸二氫鉀170mg/L,二水氯化鈣440mg/L,乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L,七水硫酸亞鐵27.8mg/L。

所述的微量營養元素的組分和其對應的濃度如下:四水硫酸錳22.3mg/L,硫酸鋅8.6mg/L,硼酸6.2mg/L,碘化鉀0.83mg/L,鉬酸鈉0.25mg/L,硫酸銅0.025mg/L,氯化鈷0.025mg/L。

所述的有機試劑的組分和其對應的濃度如下:鹽酸硫胺素10mg/L,煙酸1.0mg/L,鹽酸吡哆醇1.0mg/L,肌醇100mg/L。

實施例一:

選取生長健壯、性狀表現優良的單株,取其無病蟲害的當年生嫩枝,除去多余的莖葉,用洗潔精仔細清洗后,流水沖洗1小時,清洗干凈后,切割成適當大小準備消毒。

將試材置于超凈工作臺上,用70%的酒精消毒30s,無菌水沖洗3次,再用0.1%升汞滅菌10min,無菌水沖洗5次,用滅菌濾紙吸干水分,然后剪取1cm左右帶一個腋芽或頂芽的莖段,垂直插入芽啟動培養基(MS+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8)中。每瓶接種3個莖段,誘導頂芽和腋芽萌發。經過15d的培養,莖段腋芽或頂芽開始萌動,莖尖明顯伸長,40d左右芽點可長成2cm左右的新梢。

將誘導出的新梢,切下接種在試管苗增殖培養基(MS+2.0mg/LBA+2.0mg/LIBA+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8)中。一般莖基部有少量愈傷產生并從愈傷處長出2~3個小芽,25d繼代1次,通過連續幾次繼代培養,可獲得試驗所需無菌試管苗。

以試管苗第3到第6片展開葉片為材料,葉片帶短葉柄,葉片背面朝上放置在培養皿中,用手術刀片垂直于葉片主脈輕輕劃3刀,不要劃至葉邊緣。葉背朝下緊貼培養基放置,接種在體胚誘導培養基(MS+3.0mg/L2,4-D+0.5mg/LBA+0.5mg/LNAA+0.1mg/LTDZ+0.5mg/L谷氨酰胺+0.5mg/LCH(水解酪蛋白)+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8)中。暗培養30d,誘導體胚的形成。開始,葉片慢慢變硬變厚,逐漸形成愈傷組織,經過30d的暗培養,外植體變為淺黃色黏狀愈傷組織。

將上述愈傷組織轉接到不定芽誘導培養基(MS+0.3mg/LBA+0.1mg/LNAA+0.5mg/L谷氨酰胺+0.5mg/LCH(水解酪蛋白)+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8)中。放入溫度白天25±2℃,夜晚20±2℃,光照強度1000~1500lx,光照時間16h/d的培養室中培養,愈傷組織逐漸增殖。在此環境中培養90d,中間用同種培養基繼代兩次。繼代一次后,愈傷組織出現綠色的芽點。再繼續繼代一次,綠色的芽點逐漸長成1~2cm的小苗。

將小苗從基部切下,轉入壯苗培養基(MS+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8)中,進行壯苗培養。培養環境同上。大約培養25d,小苗長至3~4cm高。

將小苗從基部剪下,去除小苗下半部分的葉片,插入生根培養基(1/2MS+0.1mg/LIBA+0.05mg/LNAA+5.0g/L瓊脂+20g/L蔗糖,pH值5.8)中。12d左右,小苗基部有根原基長出,15d,有新根長出,待新根長至0.5cm以上時,即可煉苗移栽。

首先將試管苗封口膜綁繩松開,在培養室適應1~2d,轉入遮光度50%的溫室中(不要通風),去掉封口膜,煉苗2~3d,待小苗氣孔可自主開合后,用鑷子輕輕將小苗夾出,清水洗去基部殘留的培養基,移栽到裝有混合育苗基質的花盆中,利用間歇噴霧裝置或人工噴水保持相對濕度在80%以上,如此馴化煉苗5~10d后,長出新根,新芽萌出,逐漸減少澆水次數并進行常規管理。

花盆混合育苗基質的成分以體積比計為:珍珠巖:鋸末:腐殖土=30:30:40。

所述繁殖過程中的發育情況如圖1-圖9所示。

按照該實施例的結果如下表:

實施例二:

選取生長健壯、性狀表現優良的單株,取其無病蟲害的當年生嫩枝,除去多余的莖葉,用洗潔精仔細清洗后,流水沖洗1小時,清洗干凈后,切割成適當大小準備消毒。

將試材置于超凈工作臺上,用70%的酒精消毒40s,無菌水沖洗4次,再用0.1%升汞滅菌12min,無菌水沖洗6次,用滅菌濾紙吸干水分,然后剪取1cm左右帶一個腋芽或頂芽的莖段,垂直插入芽啟動培養基(MS+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8)中。每瓶接種3個莖段,誘導芽萌發。經過18d的培養,莖段腋芽或頂芽開始萌動,莖尖明顯伸長,44d左右芽點可長成2cm左右的新梢。

將誘導出的新梢,切下接種在試管苗增殖培養基(MS+1.0mg/LBA+1.0mg/LIBA+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8)中。一般莖基部有少量愈傷產生并從愈傷處長出2~3個小芽,25d繼代1次,通過連續幾次繼代培養,可獲得試驗所需無菌試管苗。

以試管苗第3到第6片展開葉為外植體,葉片帶短葉柄,葉片背面朝上放置在培養皿中,用手術刀片垂直于葉片主脈輕輕劃3刀,不要劃至葉邊緣。葉背朝下緊貼培養基放置,接種在體胚誘導培養基(MS+4.0mg/L2,4-D+0.7mg/LBA+0.7mg/LNAA+0.4mg/LTDZ+0.8mg/L-谷氨酰胺+0.8mg/LCH(水解酪蛋白)++5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8)中。經過28d的暗培養,外植體由綠色的葉片變為淺黃色黏狀愈傷組織。

將上述愈傷組織轉接到不定芽誘導培養基(MS+0.4mg/LBA+0.2mg/LNAA+0.8mg/L谷氨酰胺+0.8mg/LCH(水解酪蛋白)+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8)中。放入溫度白天25±2℃,夜晚20±2℃,光照強度1000~1500lx,光照時間16h/d的培養室中培養,愈傷組織逐漸增殖。在此環境中培養80d,中間用同種培養基繼代兩次。繼代一次后,愈傷組織出現綠色的芽點。再繼續繼代一次,綠色的芽點逐漸長成1~2cm的小苗。

將小苗從基部切下,轉入壯苗培養基(MS+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8)中,進行壯苗培養。培養環境同上。大約培養25d,小苗長至3~4cm高。

將小苗從基部剪下,去除小苗下半部分的葉片,插入生根培養基(1/2MS+0.3mg/LIBA+0.03mg/LNAA+5.0g/L瓊脂+20g/L蔗糖,pH值5.8)中。10d左右,小苗基部有根原基長出,13d,有新根長出,待新根長至0.5cm以上時,即可煉苗移栽。

首先將試管苗封口膜綁繩松開,在培養室適應1~2d,轉入遮光度50%的溫室中(不要通風),去掉瓶蓋,煉苗2~3d,待小苗氣孔可自主開合后,用鑷子輕輕將小苗夾出,清水洗去基部殘留的培養基,移栽到裝有混合育苗基質的花盆中,利用間歇噴霧裝置或人工噴水保持相對濕度在80%以上,如此馴化煉苗5~10d后,長出新根,新芽萌出,逐漸減少澆水次數并進行常規管理。

花盆中混合育苗基質的成分以體積比計為:珍珠巖:鋸末:腐殖土=30:30:40。

按照該實施例的結果如下表:

實施例三:

選取生長健壯、性狀表現優良的單株,取其無病蟲害的當年生嫩枝,除去多余的莖葉,用洗潔精仔細清洗后,流水沖洗1小時,清洗干凈后,切割成適當大小準備消毒。

將試材置于超凈工作臺上,用70%的酒精消毒60s,無菌水沖洗3次,再用0.1%升汞滅菌15min,無菌水沖洗6次,用滅菌濾紙吸干水分,然后剪取1cm左右帶一個腋芽或頂芽的莖段,垂直插入芽啟動培養基(MS+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8)中。每瓶接種3個莖段,誘導芽萌發。經過20d的培養,莖段腋芽或頂芽開始萌動,莖尖明顯伸長,50d左右芽點可長成2cm左右的新梢。

將誘導出的新梢,切下接種在試管苗增殖培養基(MS+1.5mg/LBA+1.5mg/LIBA+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8)中。一般莖基部有少量愈傷產生并從愈傷處長出2~3個小芽,30d繼代1次,通過連續幾次繼代培養,可獲得試驗所需無菌試管苗。

以試管苗第3到第6片展開葉為外植體,葉片帶短葉柄,葉片背面朝上放置在培養皿中,用手術刀片垂直于葉片主脈輕輕劃3刀,不要劃至葉邊緣。葉背朝下緊貼培養基放置,接種在體胚誘導培養基(MS+5.0mg/L2,4-D+1.0mg/LBA+1.0mg/LNAA+0.5mg/LTDZ+1.0mg/L谷氨酰胺+1.0mg/LCH(水解酪蛋白)+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8)中。經過25d的暗培養,外植體變為淺黃色黏狀愈傷組織。

將上述愈傷組織轉接到不定芽誘導培養基(MS+0.5mg/LBA+0.1mg/LNAA+1.0mg/L谷氨酰胺+1.0mg/LCH(水解酪蛋白)+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8)中。放入溫度白天25±2℃,夜晚20±2℃,光照強度1000~1500lx,光照時間16h/d的培養室中培養。在此環境中培養65d,中間用同種培養基繼代兩次。繼代一次后,愈傷組織出現綠色的芽點。再繼續繼代一次,綠色的芽點逐漸長成1~2cm的小苗。

將小苗從基部切下,轉入壯苗培養基(MS+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8)中,進行壯苗培養。培養環境同上。大約培養25d,小苗長至3~4cm高。

將小苗從基部剪下,去除小苗下半部分的葉片,插入生根培養基(1/2MS+0.5mg/LIBA+0.05mg/LNAA+5.0g/L瓊脂+20g/L蔗糖,pH值5.8)中。8d左右,小苗基部有根原基長出,11d,有新根長出,待新根長至0.5cm以上時,即可煉苗移栽。

首先將試管苗封口膜綁繩松開,在培養室適應1~2d,轉入遮光度50%的溫室中(不要通風),去掉封口膜,煉苗2-3d,待小苗氣孔可自主開合后,用鑷子輕輕將小苗夾出,清水洗去基部殘留的培養基,移栽到裝有混合育苗基質的花盆中,利用間歇噴霧裝置或人工噴水保持相對濕度在80%以上,如此馴化煉苗5~10d后,長出新根,新芽萌出,逐漸減少澆水次數并進行常規管理。

花盆中混合育苗基質的成分以體積比計為:珍珠巖:鋸末:腐殖土=30:30:40。

按照該實施例的結果如下表:

上述雖然結合附圖對本發明的具體實施方式進行了描述,但并非對本發明保護范圍的限制,所屬領域技術人員應該明白,在本發明的技術方案的基礎上,本領域技術人員不需要付出創造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發明的保護范圍以內。

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