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自身凝膠化核酸.pdf

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自身 凝膠 核酸
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摘要
申請專利號:

CN201280027322.4

申請日:

20120419

公開號:

CN103596594A

公開日:

20140219

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K47/30,C12N15/09,A61K31/7088,A61P37/04 主分類號: A61K47/30,C12N15/09,A61K31/7088,A61P37/04
申請人: 國立大學法人京都大學
發明人: 西川元也,高橋有己,高倉喜信
地址: 日本京都
優先權: 2011-093082
專利代理機構: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 代理人: 羅菊華
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201280027322.4

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本申請發明旨在提供制備基本上僅由核酸構成的水凝膠的方法。本申請發明提供由選自一部分互相互補的,與核酸、核酸衍生物、修飾型核酸、核酸互補地結合的化合物、及它們的混合物的2個以上的核酸單體構成,一個核酸單體含構成粘性突出末端的部分、可與1個以上的別的核酸單體形成雙鏈的互補性堿基序列部,并且不含有核酸連結酶的,用于不使用核酸連結酶制成核酸凝膠的核酸溶膠狀組合物及使用其制成的核酸凝膠。

權利要求書

1.用于不使用核酸連結酶制成核酸凝膠的核酸溶膠狀組合物,其由選自一部分互相互補的,與核酸、核酸衍生物、修飾型核酸、核酸互補地結合的化合物、及它們的混合物的2個以上的核酸單體構成,一個核酸單體含構成粘性突出末端的部分、可與1個以上的別的核酸單體形成雙鏈的互補性堿基序列部,并且不含有核酸連結酶。2.權利要求1所述的溶膠狀組合物,其用于在活體內制成凝膠。3.權利要求1或2所述的溶膠狀組合物,其中核酸單體包括在互補性堿基序列部中互補地結合,并且以粘性突出末端在生理的條件下形成表現出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補的序列結構。4.不使用核酸連結酶制成核酸凝膠的方法,其包括提高權利要求1~3之任一項的核酸溶膠狀組合物的核酸濃度及/或鹽濃度。5.用于不使用核酸連結酶制成核酸凝膠的試劑盒,其為用于制成不含有核酸連結酶的核酸凝膠的試劑盒,其分別含:含權利要求1所述的第1核酸單體,不含有核酸連結酶的第1溶膠狀組合物;及含權利要求1所述的第2核酸單體,不含有核酸連結酶的第2溶膠狀組合物;其中該第1核酸單體中的粘性突出末端含第1序列,該第2核酸單體中的粘性突出末端含第2序列,并且該第1序列和該第2序列以互相在生理條件下形成表現出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補。6.制成不含有核酸連結酶的核酸凝膠的方法,其包括通過混合權利要求5所述的試劑盒中的第1溶膠狀組合物和第2溶膠狀組合物來形成凝膠。7.用于不使用核酸連結酶制成核酸凝膠的試劑盒,其為用于制成不含有核酸連結酶的核酸凝膠的試劑盒,其分別包括:含權利要求1所述的核酸單體,不含有核酸連結酶的第1溶膠狀組合物;及含有在兩末端具有包括粘性單鏈的突出末端的雙鏈核酸,不含有核酸連結酶的第2溶膠狀組合物;其中該第1核酸單體中的粘性突出末端含第1序列,該雙鏈核酸的兩末端的突出末端含第2序列,并且該第1序列和該第2序列以互相在生理條件下形成表現出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補。8.制成不含有核酸連結酶的核酸凝膠的方法,其包括通過混合權利要求7所述的試劑盒中的第1溶膠狀組合物和第2溶膠狀組合物來形成凝膠。9.不含有核酸連結酶的核酸凝膠,其通過權利要求4、6及8之任一項所述的方法制成。10.封入內封物質,并且制成不含有核酸連結酶的核酸凝膠的方法,其包括在權利要求4、6及8之任一項所述的方法中,將要在凝膠形成前封入凝膠的內封物質添加到溶膠狀組合物中。11.權利要求10所述的方法,其中內封物質選自:低分子量化合物、蛋白質及細胞。12.含有內封物質,并且不含有核酸連結酶的核酸凝膠,其通過權利要求10或11所述的方法制成。13.權利要求1~12之任一項所述的核酸溶膠狀組合物、方法、試劑盒、或者核酸凝膠,其中核酸單體含CpG基序。14.權利要求1~13之任一項所述的核酸溶膠狀組合物、方法、試劑盒、或者核酸凝膠,其中核酸單體的種類數是3~8。15.權利要求1~3之任一項所述的溶膠狀組合物,其中核酸單體含CpG基序,所述核酸溶膠狀組合物用于制成免疫佐劑。16.免疫佐劑,其特征在于,是含權利要求9或12所述的核酸凝膠的免疫佐劑,核酸單體含CpG基序。

說明書

【技術領域】

本發明涉及自身凝膠化核酸。具體而言,本發明涉及不使用連接酶等的核酸連結酶,制備基本上僅由核酸組成的水凝膠的方法。

【背景技術】

核酸、特別是,使用DNA制備凝膠的嘗試已經有報告(非專利文獻1)。在非專利文獻1中公開的方法中,將DNA單體的末端使用DNA連接酶共有結合。更具體而言,在非專利文獻1中,合成具有與末端互補的序列的各DNA鏈,使用T4連接酶制備X型DNA、Y型DNA、T型DNA,及使用這些DNA制備水凝膠已有報告。但是,在使用非專利文獻1中公開的DNA制備的凝膠中,由于凝膠化中使用的酶(DNA連接酶)殘留,安全性及抗原性成為問題。

另外,在非專利文獻1中公開的方法中,由于凝膠化中酶反應是必要的,從而在向活體施用凝膠之時,不得不預先在活體外制備凝膠,以得到的凝膠的形狀施用,施用上、這成為大的限制。再者,對比文件1中公開的凝膠化反應由于是使用酶的反應,為了將比較大的物質封入凝膠之中,有在凝膠化、即連接反應時加封入物質的必要,而這損害封入物質的功能的危險性高。另外,在使用連接酶制備的凝膠中,得不到充分高度的粘彈性。

此外,制成以DNA作為構成要素的水凝膠的嘗試也多,有化學交聯或熱·pH依賴性等多的報告(非專利文獻2、3及專利文獻1)。

例如,在非專利文獻2中報告,將從鮭魚精巢提取的DNA化學(通過使用乙二醇二縮水甘油基醚)交聯之后,添加1M?NaOH和TEMED,加熱(50℃)2小時左右而制成凝膠。但是,在涉及的方法中,除核酸外,由于使用對活體的安全性受到質疑的有機化合物,從而向活體的施用其安全性受到在疑。再者,由于在凝膠化中加熱是必要的,無法含有易變性的物質。

另外,非專利文獻3涉及pH依賴性的Y型DNA制備。涉及的方法利用依賴于pH變化的,DNA分子的狀態的變化。在此方法中,可向DNA溶液添加HCl而使成為酸性來凝膠化,一旦凝膠化的則也可通過添加NaOH使其回到溶液的狀態。但是,為了維持凝膠狀態,不得不使環境維持在酸性,從而有凝膠對周圍的環境不穩定的問題。

專利文獻1公開了提供不伴隨化學反應或聚合反應,在人的體溫(37℃)附近,在生理的條件下簡便、迅速地得到充分的強度的水凝膠的合成水凝膠的方法。但是,由該方法得到的凝膠由于是將多糖類等的水溶性高分子與核酸混合而制成的水凝膠,溫度依賴性地凝膠-溶膠轉移是可能的,但由于大量地含多糖類等,很難說是由核酸組成的水凝膠。

另一方面,利用明膠或合成聚合物等開發了各種各樣的水凝膠制劑。由這些制備的凝膠的情況也是施用前凝膠化,施用后,凝膠化的系統少。注射可能的凝膠也有報告,但這是通過注射針的亞微米~微米尺寸的凝膠。從而,在通過注射等的施用的情況中,使用微細化的凝膠,在此時緩慢釋放化等的凝膠特性被大幅地損害。

另外,多處報告了利用由溫度的溶膠-凝膠轉移的水凝膠(專利文獻2等)。但是,使用的化合物利用一部分化學修飾,不是由核酸等的純粹的天然原料構成的凝膠。

再有,進行多個以CpG?DNA作為佐劑的嘗試。也報告了由膽甾醇修飾或硫代化的活化能的增強。但是,在這時,佐劑(CpG?DNA)和抗原即使同時施用,在活體內的行為也被懷疑是獨立的。另外,在硫代型DNA的情況中,由高的蛋白結合性的組織障礙是問題。

【現有技術文獻】

【專利文獻】

專利文獻1:特開2002-18270號公報

專利文獻2:特開2005-239860號公報

【非專利文獻】

非專利文獻1:Nat.Mater.5:797-801,2006

非專利文獻2:J?Phys?Chem?B.2007Sep20;111(37):10886-96

非專利文獻3:Angew?Chem?Int?Ed?Engl.2009;48(41):7660-3

【發明內容】

【發明要解決的技術課題】

使水凝膠等的生理活性物質緩慢釋放化的受控的釋放系統對于得到持續的的治療效果或副作用的減輕有效。本發明的目的是提供通過以DNA或RNA的核酸單體作為基本單位,制備各種結構的核酸單位,將其不使用DNA連接酶等的酶連接來制備基本上僅由核酸構成,并且,比使用連接酶的凝膠粘彈性高的水凝膠的方法。

【解決課題的技術方案】

本發明人發現,通過調節鹽濃度和核酸濃度-核酸單位中的突出末端的堿基數,可提供基本上僅由核酸構成的粘彈性高的水凝膠。即,由本發明提供不使用連接酶等的酶而制備基本上僅由核酸構成的粘彈性高的水凝膠的方法。

以往的方法取將在末端結合磷酸基的寡核苷酸用DNA連接酶結合的方法。對此,在本發明的方法中,通過調節突出末端的堿基數或鹽濃度、核酸濃度等,可無需酶反應而制備水凝膠。由本發明的方法,不僅不使用酶,不利用熱或pH變化等,所以可在溶膠狀態下施用,施用后可在活體內凝膠化。另外,通過設計多種核酸單體,可通過混合構建凝膠化的系統。此時,在凝膠化中由于不需要酶或熱等,化學-物理不穩定的物質的內包也可能。

即,本發明,在第一實施方式中,提供以下技術方案:

(1-1):用于不使用核酸連結酶制成核酸凝膠的核酸溶膠狀組合物,其由選自一部分互相互補的,與核酸、核酸衍生物、修飾型核酸、核酸互補地結合的化合物、及它們的混合物的2個以上的核酸單體構成,一個核酸單體含構成粘性突出末端的部分、可與1個以上的別的核酸單體形成雙鏈的互補性堿基序列部,并且不含有核酸連結酶。

(1-2):(1-1)所述的溶膠狀組合物,其用于在活體內制成凝膠。

(1-3):(1-1)或(1-2)記載的溶膠狀組合物,其中核酸單體包括在互補性堿基序列部中互補地結合,并且以粘性突出末端在生理的條件下形成表現出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補的序列結構。

(1-4):不使用核酸連結酶制成核酸凝膠的方法,其包括提高上述(1-1)~(1-3)任何的核酸溶膠狀組合物的核酸濃度及/或鹽濃度。

(1-5):用于不使用核酸連結酶制成核酸凝膠的試劑盒,其為用于制成不含有核酸連結酶的核酸凝膠的試劑盒,其分別包括:

含上述(1-1)所述的第1核酸單體,不含有核酸連結酶的第1溶膠狀組合物;及

含(1-1)中記載的第2核酸單體,不含有核酸連結酶的第2溶膠狀組合物;

其中

該第1核酸單體中的粘性突出末端含第1序列,

該第2核酸單體中的粘性突出末端含第2序列,并且

該第1序列和該第2序列以互相在生理條件下形成表現出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補。

(1-6):制成不含有核酸連結酶的核酸凝膠的方法,其包括通過混合上述(1-5)所述的試劑盒中的第1溶膠狀組合物和第2溶膠狀組合物來形成凝膠。

(1-7):用于不使用核酸連結酶制成核酸凝膠的試劑盒,其為用于制成不含有核酸連結酶的核酸凝膠的試劑盒,其分別包括:

含上述(1-1)所述的核酸單體,不含有核酸連結酶的第1溶膠狀組合物;及

含有在兩末端具有包括粘性單鏈的突出末端的雙鏈核酸,不含有核酸連結酶的第2溶膠狀組合物;

其中

該第1核酸單體中的粘性突出末端含第1序列,

該雙鏈核酸的兩末端的突出末端含第2序列,并且

該第1序列和該第2序列以互相在生理條件下形成表現出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補。

(1-8):制成不含有核酸連結酶的核酸凝膠的方法,其包括通過混合上述(1-7)所述的試劑盒中的第1溶膠狀組合物和第2溶膠狀組合物,形成凝膠。

(1-9):不含有核酸連結酶的核酸凝膠,其通過上述(1-4)、(1-6)及(1-8)所述的任何方法制成。

(1-10):封入內封物質,并且制成不含有核酸連結酶的核酸凝膠的方法,其包括在上述(1-4)、(1-6)及(1-8)所述的任何方法中,將要在凝膠形成前封入凝膠的內封物質添加到溶膠狀組合物中。

(1-11):(1-10)所述的方法,其中內封物質選自:低分子量化合物、蛋白質及細胞。

(1-12):含有內封物質,并且不含有核酸連結酶的核酸凝膠,其由上述(1-10)或(1-11)記載的方法制成。

另外,本發明也可提供以下技術方案:

(1-13):(1-1)或(1-2)記載的溶膠狀組合物,其中核酸單體在互補性堿基序列部中互補地結合,并且,粘性突出末端含回文序列結構。

本發明,在再第二的實施方式中,也可提供以下技術方案:

(2-1):用于制成不含有核酸連結酶的核酸凝膠的溶膠狀組合物,其在組合物中以核酸濃度0.3mM+1.6/x(突出末端部堿基數)mM以下含有由粘性突出末端部和互補性堿基序列部組成的2個以上的寡核苷酸的混合物,不含有核酸連結酶,鹽濃度以NaCl濃度換算在80mM/x(突出末端部堿基數)以下,

[其中,

粘性突出末端部是4~12個核苷酸長,以與至少1個別的寡核苷酸中的粘性突出末端部在生理條件下形成表現出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補的單鏈核酸部分,

與別的寡核苷酸互補地結合的互補性堿基序列部是8~45個核苷酸長,以與別的寡核苷酸中的互補性堿基序列部在生理條件下形成表現出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補]。

(2-2):(2-1)所述的溶膠狀組合物,其用于在活體內制成凝膠。

(2-3):(2-1)記載的溶膠狀組合物,其中粘性突出末端含回文序列結構。

(2-4):制成不含有核酸連結酶的核酸凝膠的方法,其包括通過分別將上述(2-3)所述的溶膠狀組合物中的核酸濃度提高到3.2/x(突出末端部堿基數)mM以上、鹽濃度以NaCl濃度換算提高到640mM/x(突出末端部堿基數)-60mM以上來形成凝膠。

(2-5):用于制成不含有核酸連結酶的核酸凝膠的試劑盒,其分別包括:

含有上述(2-1)所述的寡核苷酸的混合物,不含有核酸連結酶的第1溶膠狀組合物;及

含有(2-1)所述的寡核苷酸的混合物,不含有核酸連結酶的第2溶膠狀組合物;

其中

該第1寡核苷酸的粘性突出末端部含第1序列,

該第2寡核苷酸的粘性突出末端部含第2序列,并且

該第1序列和該第2序列以互相在生理條件下形成表現出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補。

(2-6):制成不含有核酸連結酶的核酸凝膠的方法,其包括通過將上述(2-5)所述的試劑盒中的第1溶膠狀組合物和第2溶膠狀組合物在核酸濃度成3.2/x(突出末端部堿基數)mM以上、鹽濃度成以NaCl濃度換算640mM/x(突出末端部堿基數)-60mM以上的條件下混合來形成凝膠。

(2-7):用于制成不含有核酸連結酶的核酸凝膠的試劑盒,其分別包括:

含有上述(2-1)所述的寡核苷酸的混合物,不含有核酸連結酶的第1溶膠狀組合物;及

含有在兩端具有包括粘性的單鏈的突出末端部,其間具有由雙鏈構成的互補性堿基序列部的核酸,不含有核酸連結酶的第2溶膠狀組合物;

[在第2溶膠狀組合物中,

突出末端部是4~12個核苷酸長,以與該第1溶膠狀組合物中的寡核苷酸中的粘性突出末端部在生理條件下形成表現出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補的單鏈核酸部分,

互補性堿基序列部是8~45個核苷酸長,以與第1溶膠狀組合物中的寡核苷酸中的互補性堿基序列部在生理條件下形成表現出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補的雙鏈核酸部分]

其中

該第1溶膠狀組合物中的寡核苷酸的粘性突出末端部含第1序列,

該由雙鏈構成的互補性堿基序列部的兩端的突出末端部含第2序列,并且

該第1序列和該第2序列以互相在生理條件下形成表現出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補。

(2-8):制成不含有核酸連結酶的核酸凝膠的方法,其包括通過將上述(2-7)所述的試劑盒中的第1溶膠狀組合物和第2溶膠狀組合物在核酸濃度成3.2/x(突出末端部堿基數)mM以上、鹽濃度成以NaCl濃度換算640mM/x(突出末端部堿基數)-60mM以上的條件下混合來形成凝膠。

(2-9):不含有核酸連結酶的核酸凝膠,其由上述(2-4)、(2-6)及(2-8)所述的任何方法制成。

(2-10):封入內封物質,并且制成不含有核酸連結酶的核酸凝膠的方法,其包括在上述(2-4)、(2-6)及(2-8)所述的任何方法中,將要在凝膠形成前封入凝膠的內封物質添加到溶膠狀組合物中。

(2-11):(2-10)所述的方法,其中內封物質選自:低分子量化合物、蛋白質及細胞。

(2-12):含有內封物質,并且不含有核酸連結酶的核酸凝膠,其由上述(2-10)或(2-11)記載的方法制成。

(3-1):(1-12)及(2-12)之任一項所述的核酸溶膠狀組合物、方法、試劑盒、或者核酸凝膠,其中核酸單體含CpG基序。

(3-2):(1-12)、(2-12)及(3-1)之任一項所述的核酸溶膠狀組合物、方法、試劑盒、或者核酸凝膠,其中核酸單體的種類數是3~8。

(3-3):(1-1)~(1-3)、及(2-1)~(2-3)之任一項所述的溶膠狀組合物,其中核酸單體含CpG基序,所述核酸溶膠狀組合物用于制成免疫佐劑。

(3-4):免疫佐劑,其是含(1-9)、(1-12)、(2-9)、及(2-12)之任一項所述的核酸凝膠的免疫佐劑,核酸單體含CpG基序。

【發明效果】

由本發明,因為可不添加連接酶等的核酸連結酶,通過調節鹽濃度-核酸濃度或突出末端的堿基數來凝膠化各種序列的核酸,從而可制成添加物含有量少的水凝膠。另外,在本發明中,沒必要使用給凝膠制成帶來安全性隱患的有機化合物。再者,也克服了由連接酶等的酶的使用所至的安全性-抗原性的問題。另外發現,通過使用連接酶的以往的方法,難以制備粘彈性優良的核酸凝膠,但通過本發明的方法,可制備示優良的粘彈性的核酸凝膠。

再者,DNA或RNA可為以人為首的哺乳類細胞中表達的Toll-樣受體(TLR)的配體,如水凝膠一樣的微粒子易攝取入表達TLR的免疫活性細胞,所以基于核酸形成的本發明的系統除了生理活性物質的緩慢釋放化之外,作為有效活化免疫活性細胞的免疫佐劑發揮功能。再者由本發明也可克服佐劑和抗原的在活體內的行為獨立的問題。另外,通過本發明的方法的凝膠化,例如,由CpG基序的使用,導入活體內時可得到示高的細胞的免疫刺激性的核酸制備物。而且,由本發明可制備副作用少的免疫佐劑。

一般而言,施用凝膠制劑時有必要切開等成為問題,但在本發明的系統中,在溶膠狀態下施用后,在體內的凝膠化也可能。由此,由注射或噴霧、滴下、涂布的施用也可能。另外,與微細化凝膠不同,由于在溶膠狀態下施用后,在體內凝膠化,無損害緩慢釋放化等的凝膠特性的擔憂。另外,本發明的凝膠有觸變性,通過注射器施用也能在體內再度凝膠化,所以不損害緩慢釋放化等的凝膠特性。

另外,隨著核酸濃度或鹽濃度的變化進行凝膠化,在凝膠化中無需加熱等,所以對于熱或化學反應弱的物質、例如抗原蛋白質或細胞之內封也可能,內封不穩定的物質時變性的可能性也少。從而,將比較大的物質封入凝膠之中,損害封入物質的功能的危險也少。再者,本發明的凝膠對周圍環境也穩定。

再者,將反義DNA或siRNA、CpG?DNA等的核酸醫藥摻入構造中也可能。關于免疫活化,也可通過選擇適當的堿基序列而構建不活化免疫的系統。凝膠的強度可通過核酸單位的結構、突出末端數控制,可通過調節核酸濃度、鹽濃度、突出末端堿基數來控制凝膠化。由這些的調節,也可控制凝膠內部的結構、凝膠強度、內封物質的釋放速度。另外,也可向核酸單位的末端之一部分插入各種功能性分子,由此可更大幅度改變性質。也可利用各種修飾核酸。

【附圖說明】

【圖1】是根據本發明從寡核苷酸形成水凝膠的推定模式圖。

【圖2】是示由本發明形成的水凝膠的概觀的照片。

【圖3】是由本發明形成的水凝膠的掃描型電子顯微鏡像。

【圖4】是通過混合可形成兩種核酸單位的核酸單體的組形成凝膠的推定模式圖。

【圖5】是內包內封物質的水凝膠的形成的流程及涉及的凝膠的掃描型電子顯微鏡像。

【圖6】是示由寡核苷酸制成的Y型單位及連結Y型單位制備的樹狀聚體樣DNA的模式圖及它們的TNF-α釋放活性及由細胞的攝取的坐標圖。

【圖7】是示施用本發明的溶膠狀組合物之后,在活體內形成凝膠的照片。

【圖8-1】是示施用溶膠狀組合物之后,在活體內形成凝膠的照片及在活體內形成的凝膠的掃描型電子顯微鏡像。

【圖8-2】是示在注射器內、及從注射器的壓出后的DNA溶液或DNA水凝膠的照片(A)、將這些皮內施用的部位的照片(C)、以及注射器通過前(B左)及注射器通過后(B右)的水凝膠的粘彈性的坐標圖(B)。

【圖9】是示含或不含CpG基序的,免疫學有活性或免疫學無活性的寡核苷酸的序列及使用它們得到的凝膠的樹突細胞的刺激活性的照片。

【圖10】示各種序列的寡核苷酸的例。

【圖11】是示通過混合兩種四足DNA形成凝膠的推定模式圖和通過混合形成的水凝膠的概觀的照片。

【圖12】是示通過混合四足DNA和雙鏈DNA(dsDNA)形成凝膠的推定模式圖和通過混合形成的水凝膠的概觀的照片。

【圖13】是含誘餌DNA及siRNA的四足DNA的設計圖。

【圖14】是示由免疫學有活性的四足DNA用OVA刺激的免疫應答的增強的流程及坐標圖。

【圖15】是本發明的凝膠的推定立體結構。

【圖16】是示使用各種核酸單位得到的凝膠之內部結構的差異的掃描型電子顯微鏡像。

【圖17】是示由DNA濃度、粘性突出末端的長度及鹽濃度控制凝膠的特性的坐標圖。

【圖18】是示由四足DNA的突出末端的性質及鹽濃度控制從凝膠釋放內封物質的特性的坐標圖。

【圖19】是示使用膽甾醇修飾寡核苷酸的凝膠的細胞攝取及組織遷移性的增大的模式圖、坐標圖及照片。

【圖20】是示在活體外將溶膠狀的溶液施用到小鼠的鼻腔內的結果,變成凝膠的照片。

【圖21】是示DNA水凝膠中摻入GFP標記骨髓來源細胞(BMDC)的熒光顯微鏡圖像。

【圖22】是對比使用連接酶制備的DNA水凝膠和不使用連接酶制備的DNA水凝膠的凝膠粘彈性的坐標圖。

【圖23】是示對有3~12個足的多足DNA制備物的PAGE分析的結果的照片。

【圖24】是示DNA制備物的CD光譜的坐標圖。

【圖25】是示小鼠血清中的多足DNA制備物的分解的照片(A及B)及坐標圖(C及D)。

【圖26】是示向小鼠注入的32P-DNA水凝膠的注入部位或排出淋巴節中的檢測量的經時變化的坐標圖。

【圖27】是示小鼠血清中的DNA水凝膠的經時分解(左上圖)、從內包DXR的DNA水凝膠的DXR釋放的經時變化(左下圖)、及內包DXR的CpGDNA水凝膠的腫瘤增殖抑制效果的坐標圖(右圖)。

【圖28】是示由CpGDNA水凝膠的IL-6釋放誘導效果的坐標圖。

【圖29】是示由含有CpG的多足DNA制備物的TNF-α(A)及IL-6(B)釋放誘導的坐標圖。

【圖30】是示由含有CpG的多足DNA制備物的TNF-α釋放誘導的坐標圖。

【圖31】是示含有CpG的多足DNA制備物的向細胞內的攝取的坐標圖。

【圖32】是示由多足DNA制備物的IL-6釋放的活化以TLR9依賴性地進行的坐標圖。

【圖33】是示單核細胞進行多足DNA制備物的向細胞內的攝取的坐標圖。

【圖34】是示含有CpG的DNA水凝膠持續強力地誘導IL-6mRNA表達的坐標圖。

【圖35】是示內包OVA的CpGDNA水凝膠強誘導適應免疫反應的坐標圖。

【圖36】是將注入部位中的免疫細胞的浸潤(左圖)、及脾腫重量(右圖)以各種佐劑對比的照片及坐標圖。

【實施方式】

1.定義

在專利權利要求中,“體溫”是指37℃,“生理條件下”是指鹽濃度以NaCl濃度換算150mM的條件下。

在本說明書及專利權利要求中,“核酸單體”是指選自與核酸、核酸衍生物、修飾型核酸、核酸互補地結合的化合物、及它們的混合物,可形成接下來定義的“核酸單位”的化合物。具體而言,一個“核酸單體”含構成粘性突出末端的部分(下述模式圖中的x部分)及可與別的核酸單體形成雙鏈的互補性堿基序列部(下述模式圖中的y部分)。

在本說明書及專利權利要求中,“核酸單位”是指構成將含上述核酸單體的水溶液中的核酸單體濃度及鹽濃度升高到一定濃度以上時形成的水凝膠(以下簡稱為凝膠)的推定結構單位,有以下的模式圖所示的結構(n=2~12)。但是,由本發明得到的凝膠之內部結構不是實際確認的,是在估計形成的凝膠內推測各核酸單體經取以下的結構的核酸單位的形成而成為凝膠的。再有,“核酸單位”為方便起見、如下述模式圖以平面顯示,但實際推測為取如圖10之下部所示的復雜的立體結構。這些“核酸單位”由構成其的核酸單體中的粘性突出末端的相互之間的互補性連結,推定形成有如圖15所示的復雜的高級結構的凝膠。

【核酸單位的模式圖】

【化1】

【化2】

上述模式圖中,x是構成將1個核酸單位與其他核酸單位通過其互補性連結的“粘性突出末端”的部分,y是使構成1個核酸單位的核酸單體和其他核酸單體的雙鏈的形成可能的“互補性堿基序列部”。以下,將“粘性突出末端”簡稱為x、“互補性堿基序列部”簡稱為y。

在本說明書及專利權利要求中,有時將推定形成到凝膠中的“核酸單位”或溶膠中的“可形成核酸單位的核酸單體的集合體”簡稱為“xxx足DNA”。在xxx部分中,表示上述核酸單位中的n的數的用語包括、例如,三、四、七、六等。即,在上述模式圖中,可形成n=3的情況的核酸單位或核酸單位的核酸單體的集合體稱為“三足DNA”,同樣地,n=4時,將其稱為“四足DNA”。另外,在“xxx足DNA(a-b-b)”的用語中,a表示形成上述模式圖中的x部分的寡核苷酸的堿基數,b表示形成上述y部分的寡核苷酸的堿基數。但是,n=2時,例外地表示為“雙鏈核酸”或“ds”或“dsDNA”。

本說明書及專利權利要求中,將“互補性”或“互補的”的用語用帶%的數值表示時,構成相同的長度的2個核酸單體的部分、例如,比較2個x或2個y時,是指以互相形成堿基對的堿基數/全堿基數x100給出的數值。

2.發明的概要

接下來將本發明利用上述模式圖簡單地說明。

(A)從1種核酸單位的凝膠的形成

首先對由上述定義的1種核酸單位構成的凝膠進行說明。

當凝膠由1種核酸單位形成時,核酸單位是選自用以下的模式圖表示的中的1種。

【化3】

在上述模式圖中,n的范圍是3~12,優選為3~8,再優選為3~6。n的值過小或過大均有形成凝膠難的傾向。

由本發明,含可構成上述核酸單位的核酸單體的水溶液在低鹽濃度并且低核酸濃度中,作為溶膠存在,但在一定的高鹽濃度和高核酸濃度的組合的條件下,通過構成核酸單體的y部分互相通過其互補性形成雙鏈,形成取上述推定結構的核酸單位,并且,通過構成1個核酸單位中的核酸單體的x部分與構成別的核酸單位中的核酸單體的x部分通過它們的互補性形成雙鏈,多數的核酸單位連結而形成凝膠。此機制示于圖1,凝膠的推定內部結構示于圖15。

(B)從2種以上的核酸單位的凝膠的形成

接下來對由上述定義的2種以上的核酸單位構成的凝膠進行說明。

當凝膠由2種以上的核酸單位形成時,核酸單位是選自以下的模式圖所表示的中的2種以上,但是,至少1種不是n=2(n是3~12的)的核酸單位。

【化4】

【化5】

即,在上述模式圖中,n的范圍是2~12,優選為2~8,再優選為2~6。1種核酸單位的n是2時,至少別的種核酸單位的n是3~12,優選為3~8,再優選為3~6。

含可構成這2種以上的核酸單位的核酸單體的水溶液,在低鹽濃度并且低核酸濃度中作為溶膠存在。另外,在2種以上的核酸單位中,1種核酸單位的x和別的種核酸單位的x有互補的必要,但沒必要與其自身互補(自身互補的、例如,回文序列)。2種以上的核酸單位的x部分不自身互補時,含1種這些核酸單位的水溶液在高鹽濃度、高核酸濃度下也無形成凝膠,常常作為溶膠存在。另一方面,含2種這些核酸單位的水溶液在低鹽濃度并且低核酸濃度中作為溶膠存在,在一定的高鹽濃度和高核酸濃度的組合的條件下,通過構成核酸單體的y部分互相通過其互補性形成雙鏈,形成取上述推定結構的核酸單位,并且,通過構成1個核酸單位中的核酸單體的x部分與構成別的核酸單位中的核酸單體的x部分通過它們的互補性形成雙鏈,多數的核酸單位連結而形成凝膠。

從而,將可構成2種以上的核酸單位的核酸單體作為含可構成各自1種核酸單位的核酸單體的分離的水溶液提供時,它們單獨,無論鹽濃度、核酸濃度,是溶膠狀。但是,將它們在成一定的高鹽濃度和高核酸濃度的組合的條件下混合,則形成凝膠。即,以高濃度含可構成各自的核酸單位的核酸單體,并且作為高鹽濃度的水溶液單獨是溶膠,但僅通過互相混合,可形成凝膠。此由混合形成凝膠的機制示于圖4、圖11及圖12。

3.發明的詳細的說明

以下,詳細地說明本發明,本發明由專利權利要求限定,不限于上述的發明的概要及以下的發明的詳細的說明的具體性的記載。

●對于粘性突出末端(模式圖中的x)

在本發明中,為了形成凝膠而必要的x的長度是作為堿基數4堿基以上、優選為6堿基以上、再優選為8堿基以上。上限不特別限定,但例如,12堿基以下是優選的。適宜的x的長度也依賴于n的數,優選為4~12堿基、再優選為8~12堿基。x的長度長的方有易形成凝膠的傾向,但x的長度短的有凝膠之內部結構更微細(密)的傾向。

作為x的序列,不特別限定,但如上述(A)中記載的一樣,從1種核酸單位制備凝膠時,例如,x可與其自身互補(自身互補),涉及的x的序列可舉出回文序列。如上述(B)中記載一樣,從2種以上的核酸單位制備凝膠時,x有與可形成至少1種其他核酸單位的核酸單體中的x互補的必要。在兩種的情況中,互補性的程度以在生理條件下形成表現出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補即可。x的互補性以數值表示則是,例如,90%以上互補是優選的,95%以上互補更優選,100%互補(回文序列)是最優選的。核酸單體中的粘性突出末端在可構成1種核酸單位的全部的種核酸單體之間相同也可。另外,核酸單體中的粘性突出末端也有由全部相同的回文序列結構組成的情況。用于構成某核酸單位的核酸單體中的粘性突出末端有時與用于構成別的核酸單位的全部或一部分的核酸單體中的粘性突出末端互補。另外,核酸單體中的粘性突出末端有時與其核酸單體一同與用于構成相同的核酸單位的別的全部或一部分的核酸單體中的粘性突出末端不互補。

●對于互補性堿基序列部(模式圖中的y)

在本發明中,為了形成凝膠必要的y的長度也依賴于n的數,但作為堿基數是8堿基以上、優選為14堿基以上、再優選為18堿基以上。y的長度之上限不特別限定,但例如,n是3的情況中,y的長度是8堿基以上、45堿基以下是優選的。作為y的長度之上限,例如,45堿基以下,優選為30堿基以下,更優選為20堿基以下。n的數增加,則對于凝膠的形成必要的y的長度有變長的傾向,但y的長度短的有凝膠之內部結構更微細(密)的傾向。

作為y的序列,不特別限定,但如可形成上述模式圖中的核酸單位,1個核酸單體中的y的序列有與作為其所構成的核酸單位的構成要素的別的核酸單體中的y的序列互補的必要。互補性的程度以在生理條件下形成表現出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補即可。在相同的核酸單位中形成雙鏈的2個y之間的互補性也依賴于n的數,但以數值表示則是,例如,85%以上互補是優選的,90%以上互補更優選,95%以上互補更優選,100%互補最優選。例如,n的數是6的情況中,確認y之間的互補性是89%則可形成凝膠。

形成核酸單位的n個臂(由2個y的雙鏈構成)的序列是互相不同的序列的是優選的。例如,n是4的情況中,核酸單體的序列可表示為x-a-b(此時,a、b分別是y)、x-c-d、x-e-f、x-g-h,但為了形成完全的核酸單位,有b和c、d和e、f和g、及h和a分別互補的必要。例如,在活體內形成凝膠時,它們的互補性有以在生理條件下形成表現出體溫以上的融解溫度的雙鏈的程度分別互補的必要。其以外的序列間(例如,b和e)的互補性高時,有不形成均一的核酸單位的擔憂。但是,凝膠的形成階段可嚴密設定條件,(例如,考慮非常緩慢地降低溫度)、n個臂的序列近似也可。

1個核酸單體中的2個y的序列是,預測預先與其他核酸單體的互補性或可由1個核酸單體形成的發夾結構的穩定性而適宜設計即可。即,使和發夾結構或與目的以外的核酸單體中的序列的結合相關的自由能相比與目的臂(雙鏈)的形成相關的自由能更大即可。即,適宜設計y的序列,使得在凝膠形成條件下,相比核酸單體零亂地或以推定核酸單位以外的結構形態存在,形成核酸單位的能量更穩定即可。

●對于考慮核酸單體的功能的序列-修飾

本發明的核酸單體,根據形成的凝膠要求的功能,具有各種核酸序列也可,含修飾核酸,附加核酸以外的修飾基也可。例如,通過由DNA構成的核酸單體中含CpG基序,可提高得到的凝膠的免疫活性。再有,“CpG基序”,在人的情況的最適序列是GTCGTT、在嚙齒類(小鼠、大鼠)中是GACGTT。在小鼠的議論中,也有使用一般化的嘌呤-嘌呤-C-G-嘧啶-嘧啶時,但這不符合在人的優化。再者這以外也報告多數的CpG基序示免疫活化。另外報告,在序列中的CpG基序的數和免疫活性之間有正的相關。再有,在本說明書中,CpG基序簡稱為CpG。

或者,除了DNA序列以外,利用RNA序列也可。例如,也可制成含作為功能核酸被知的siRNA的凝膠。另外,在核酸單體中含修飾核酸也可。作為涉及的修飾核酸,2’-O-甲基修飾、硫代磷酸修飾、嗎啉代核酸、LNA、PNA等,至今開發的衍生物-類似物均可在凝膠的制備中利用。使用天然型的僅核酸也可,從穩定性的觀點來看,使用修飾核酸也可。

再者,除了修飾核酸以外,將膽甾醇或其他脂質等的修飾基直接附加到核酸單體也可。例如,通過將膽甾醇附加到核酸單體,可升高得到的凝膠的目的組織(例如,皮膚施用的情況中,向皮膚組織)的遷移性或由細胞的攝取率。

●對于含內封物質的凝膠的形成

在由本發明的核酸構成的凝膠中,可內包各種物質。作為內包的物質的例,可舉出多柔比星、道諾霉素等的DNA嵌入劑、胰島素等的肽及肽藥品、卵清蛋白、柳杉抗原等的蛋白質抗原、生長因子、細胞因子等的蛋白質及蛋白質藥品、細胞、及基因改變細胞等,不特別限定。內包的機制不十分明了,認為是核酸單位間的結合發生之時,其間存在的內封物質被閉合在凝膠內。從而,首先制備溶膠,添加內封物質,例如,通過升高鹽濃度或核酸濃度,可制成內包內封物質的凝膠。另外,內封物質的添加量不特別限定,與凝膠同程度的重量也可內包。

再有,本發明的凝膠的尺寸不特別限定,基本上無上限。例如,如果用0.5mM的DNA制備500μl的凝膠,則成0.5×10-3(mol/l)×500×10-6(l)×6×1023(分子/mol)=1.5×1017的數值,但更嚴謹的尺寸不明。

●對于與凝膠化相關的因子

如上述一樣,可形成凝膠的本發明的溶膠狀態的組合物有可通過升高鹽濃度,或升高核酸濃度不凝膠化的傾向。對于溫度而言,在高溫有相比凝膠更溶膠化的傾向,在低溫有凝膠化的傾向。另外,通過形成凝膠的核酸單體的序列或粘性突出末端的長度也可控制凝膠化。例如,想在活體內形成凝膠時,設計序列而使得形成凝膠的核酸單體的各自的雙鏈及粘性突出末端的Tm相比活體溫度(37℃左右)更高即可。

作為鹽,實施例中使用作為一價的陽離子的鈉離子,但不限于此,也可利用鎂離子或鈣離子等的二價的陽離子,二價的陽離子的方可以比一價的陽離子低濃度使核酸凝膠化。

本發明的組合物必須不含核酸連結酶,作為組合物中含的成分,除水之外,可舉出核酸單體、鹽類(上述一價或二價的陽離子或其對陰離子)、緩沖劑、上述內封物質等,只要不抑制本發明的目的,含其他成分也可。

●對于在活體內的凝膠形成

本發明的組合物可在溶膠狀態下施用而在活體內形成凝膠。作為施用實施方式,可舉出皮膚施用、注射、鼻腔內施用等,但不限于這些。施用于皮膚表面時,在皮膚上發生凝膠化,注射時,根據注射部位,在皮下、皮內、肌肉內、腹腔內等發生凝膠化,在鼻腔內施用時,在鼻腔發生凝膠化。

如上述(A)一樣,從1種核酸單位在活體內形成凝膠時,活體內施用用的本發明的溶膠狀組合物,為使施用前不凝膠化,維持在低鹽濃度、低核酸濃度是優選的。在施用低鹽濃度、低核酸濃度的本發明的溶膠狀組合物時,由于相比活體鹽濃度(以NaCl濃度換算大概150mM)而鹽濃度低,由施用后在活體內水分的吸收及鹽分的分泌引起的核酸濃度增大、鹽濃度增大驅動凝膠化。

如上述(B)一樣,從2種以上的核酸單位在活體內形成凝膠時,如上述一樣,施用維持在低鹽濃度、低核酸濃度的2種以上的溶膠狀組合物也可,但由于含可形成各1種別的核酸單位的單體的各自的溶膠狀組合物單獨在高鹽濃度、高核酸濃度也不凝膠化,作為高鹽濃度、高核酸濃度的溶膠狀組合物施用也可。使用低鹽濃度、低核酸濃度的2種以上的溶膠狀組合物時,無論同時施用還是分別施用,由于在活體內成高鹽濃度、高核酸濃度而形成凝膠。但是,使用高鹽濃度、高核酸濃度的2種以上的溶膠狀組合物時,由于僅通過混合而凝膠化,分別施用而在活體內開始混合而使凝膠化是優選的。

●對于在凝膠狀態的施用

另外,本發明的凝膠由于有觸變性,在凝膠狀態下施用也可。本發明的凝膠在通過注射器之后也與通過前的凝膠具有同等的粘彈性,在注射時的施用是可能的。

●對于構成核酸單位的核酸單體的數

用于形成核酸單位的核酸單體的數依賴于核酸單體中的堿基數、凝膠的形成中使用的鹽的種類、鹽濃度、pH及其他緩沖劑。含CpG基序等的免疫刺激性的核酸時,核酸單體的堿基數越多,免疫刺激性越。另外,對于含具有免疫刺激性的基序的核酸單體,包括相同的核酸量及相同的基序量的核酸單位之間比較,則構成核酸單位的核酸單體的數越多,免疫刺激性越高。但是,在使核酸單體的數變多時,在生理性的條件中,有核酸單位的形成不充分地發生的可能性。非生理性的條件不適宜于使用核酸單位的凝膠的藥理的用途。另外,堿基數多的核酸單體成本高,純化也困難。再者,在構成核酸單位的核酸單體的數增加時,由于核酸凝膠中的核酸末端的數增加,變得易受外切核酸酶的分解,在血清中的穩定性變低。從而,使用CpG基序等的具有免疫刺激性的基序時,為了使免疫刺激性增大,構成核酸單位的核酸單體的數是3~12、再者4~8、特別是6~8是適當的。

●由本發明的凝膠化的免疫刺激性的升高

如后述的實施例所示,含有CpG基序等的具有免疫刺激性的要素的核酸單體,相比在單鏈的狀態下使用時,在核酸單位(多足DNA)的狀態或核酸凝膠的狀態下使用時,免疫應答的活化的程度更高(圖28、圖34、圖35)。如此,通過本發明的方法的凝膠化,導入活體內時可得到示高的細胞的免疫刺激性的核酸制備物。

4.對各發明的詳細

以上、舉出適宜的實施方式而對包括本發明的作用結構進行說明,但不限于上述的發明的概要及詳細的說明的具體性的記載。

本發明可提供(1-1)及(2-1)、即,以下技術方案:

用于制成不含有核酸連結酶的核酸凝膠的溶膠狀組合物,其

●由選自一部分互相互補的,與核酸、核酸衍生物、修飾型核酸、核酸互補地結合的化合物、及它們的混合物的2個以上的核酸單體構成,一個核酸單體含構成粘性突出末端的部分、可與1個以上的別的核酸單體形成雙鏈的互補性堿基序列部,并且不含有核酸連結酶的,用于不使用核酸連結酶制成核酸凝膠的核酸溶膠狀組合物、及,

●在組合物中以核酸濃度0.3mM+1.6/x(突出末端部堿基數)mM以下含有由粘性突出末端部和互補性堿基序列部組成的2個以上的寡核苷酸的混合物,不含有核酸連結酶,鹽濃度以NaCl濃度換算在80mM/x(突出末端部堿基數)以下

[其中,

粘性突出末端部是4~12個核苷酸長,以與至少1個別的寡核苷酸中的粘性突出末端部在生理條件下形成表現出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補的單鏈核酸部分,

與別的寡核苷酸互補地結合的互補性堿基序列部是8~45個核苷酸長,以與別的寡核苷酸中的互補性堿基序列部在生理條件下形成表現出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補]。

(1-1)及(2-1)中涉及的發明涉及用于不使用核酸連結酶而制成核酸凝膠的核酸溶膠狀組合物,其以本發明的不含有核酸連結酶為特征。

在(1-1)中,“核酸單體”、“互補的”等的用語如先前定義。核酸單體由“粘性突出末端”和“互補性堿基序列部”構成。另外,優選為如在(2-1)中,“核酸單體”是所謂的“寡核苷酸”。

在(1-1)及(2-1)的兩方中,“粘性突出末端”是在上述詳細的說明中使用模式圖說明的與x相當的部分,某“核酸單體”2個以上集合而形成推定的某“核酸單位”時,是核酸單位中作為單鏈部分殘留的部分,當與在形成別的“核酸單位”的核酸單體的核酸單位中作為單鏈部分殘留的同樣的部分具有互相互補性時,是在特定條件下可形成雙鏈的部分。

在(1-1)及(2-1)的兩方中,“互補性堿基序列部”是上述詳細的說明中使用模式圖說明的與y(y是2個)相當的部分,某“核酸單體”集合2個以上而形成推定的某“核酸單位”時在核酸單位中與構成相同的核酸單位的別的核酸單體中的同樣的部分具有互相互補性,在特定條件下形成雙鏈的部分。

在(1-1)中,“核酸單體”選自與核酸、核酸衍生物、修飾型核酸、核酸互補地結合的化合物、及它們的混合物。核酸是指天然存在的DNA或RNA或它們的混合物。如優選在(2-1)中,核酸單體是寡核苷酸。核酸衍生物是指通過對天然存在的DNA或RNA或它們的混合物附加修飾基而得到的衍生物。修飾基不特別限定,可舉出脂質、例如,膽甾醇等。修飾型核酸是指對天然存在的DNA或RNA或它們的混合物,向糖部分、堿基部分或磷酸結合部分之任一種以上實施本領域技術人員知道的改變。修飾型核酸不特別限定,可舉出2’-O-甲基修飾、硫代磷酸修飾、嗎啉代核酸、LNA等。另外,與核酸互補地結合的化合物是指可與DNA或RNA等的核酸分子由非共價鍵,由其結構特性而結合的化合物,例如,可舉出PNA。

(1-1)及(2-1)的溶膠狀組合物含分別“核酸單體”及“寡核苷酸”的2種以上的混合物。如上述(A)中記載一樣,在用于從1種核酸單位形成凝膠的溶膠狀組合物中,“核酸單體”及“寡核苷酸”的種類如對上述(A)的n進行說明,是3~12、優選為3~8、更優選為3~6。如上述(B)中記載一樣,在用于從2種以上的核酸單位形成凝膠的溶膠狀組合物中,“核酸單體”及“寡核苷酸”的種類如對上述(B)的n進行說明,是2~12、優選為2~8、更優選為2~6。

(1-1)及(2-1)的溶膠狀組合物中含的“核酸單體”及“寡核苷酸”的“粘性突出末端”及“互補性堿基序列部”的結構、即,長度及序列、互相的互補性等不特別限定,但優選如對上述詳細的說明的x及y的說明的記載。

(2-1)的溶膠狀組合物是對(1-1)的溶膠狀組合物進行的進一步限定,特征在于在組合物中以核酸濃度0.3mM+1.6/x(突出末端部堿基數)mM以下含有2個以上的寡核苷酸的混合物,鹽濃度以NaCl濃度換算在80mM/x(突出末端部堿基數)以下。其中使用的“x”是指形成寡核苷酸的突出末端部的堿基數。對于鹽濃度而言,“以NaCl濃度換算80mM/x以下”是指,當組合物中的鹽是1價的陽離子是80mM/x以下,當是2價的陽離子時,是其2分之1的濃度。

(2-1)的溶膠狀組合物再特征在于,寡核苷酸的粘性突出末端部的長度是4~12個核苷酸長,粘性突出末端部的序列與至少1個別的寡核苷酸中的粘性突出末端部以在生理條件下形成表現出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補。另外,(2-1)的溶膠狀組合物再特征在于,寡核苷酸的互補性堿基序列部的長度是8~45個核苷酸長,互補性堿基序列部的序列與別的寡核苷酸中的互補性堿基序列部以在生理條件下形成表現出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補。其中,生理條件下是指37℃、鹽濃度是指以NaCl濃度換算150mM的條件。

在(1-1)中,不是像在(2-1)中限定鹽濃度及核酸濃度,但根據構成其的核酸單體的性質,通過是不于室溫形成凝膠的程度的低鹽濃度及低核酸濃度,作為溶膠存在。

本發明可提供(1-2)及(2-2)、即,以下技術方案:

●用于在活體內制成凝膠的,(1-1)所述的溶膠狀組合物、及,

●用于在活體內制成凝膠的,(2-1)所述的溶膠狀組合物。

(1-2)及(2-2)的發明是將(1-1)及(2-1)的溶膠狀組合物的用途限定于“在活體內的凝膠的制成”,具體而言具備,構成組合物的“核酸單體”及“寡核苷酸”分別在生理條件下、即,37℃及鹽濃度150mM的條件下凝膠化的特征。

本發明可提供(1-3)及(2-3)、即,以下技術方案:

●(1-1)或(1-2)記載的溶膠狀組合物,其中核酸單體包括在互補性堿基序列部中互補地結合,并且以粘性突出末端在生理的條件下形成表現出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補的序列結構、及,

●(2-1)記載的溶膠狀組合物,其中粘性突出末端部含回文序列結構。

在(2-3)的發明中,構成核酸單體及寡核苷酸的粘性突出末端部是全部相同的回文序列結構也可。(1-3)的發明特征在于,在(1-1)或(1-2)的發明中,核酸單體在互補性堿基序列部中互補地結合。其中,互補地結合是指可形成核酸單位的,核酸單體中的互補性堿基序列部與可形成相同的核酸單位的別的核酸單體中的互補性堿基序列部至少85%互補、優選為90%以上互補、更優選為95%以上互補、特別優選為100%互補。

本發明可提供(1-4)及(2-4)、即,以下技術方案:

●通過提高上述(1-1)~(1-3)任何的核酸溶膠狀組合物的核酸濃度及/或鹽濃度,不使用核酸連結酶制成核酸凝膠的方法、及,

●包括通過分別將上述(2-3)所述的溶膠狀組合物中的,核酸濃度提高到3.2/x(突出末端部堿基數)mM以上、鹽濃度以NaCl濃度換算提高到640mM/x(突出末端部堿基數)-60mM以上來形成凝膠的,制成不含有核酸連結酶的核酸凝膠的方法。

(1-4)及(2-4)均涉及通過提高本發明的核酸溶膠狀組合物的核酸濃度及/或鹽濃度,不使用核酸連結酶制成核酸凝膠的方法。本發明特征在于,在核酸凝膠的制成中不使用核酸連結酶。即,(1-4)及(2-4)的發明是通過僅提高本發明之上述溶膠狀組合物的核酸濃度及/或鹽濃度來形成凝膠的方法。

在(1-4)中,用于形成凝膠的核酸濃度及/或鹽濃度不特別限定,本領域技術人員可根據構成溶膠狀組合物的核酸單體的性質適宜選擇。(2-4)的凝膠的制成方法包括分別將上述(2-3)所述的溶膠狀組合物中的核酸濃度提高到3.2/x(突出末端部堿基數)mM以上、將鹽濃度提高到以NaCl濃度換算640mM/x(突出末端部堿基數)-60mM以上。其中“x”及“以NaCl濃度換算”如在(2-1)的發明中說明。

本發明可提供(1-5)及(2-5)、即,以下技術方案:

●用于不使用核酸連結酶制成核酸凝膠的試劑盒,其為用于制成不含有核酸連結酶的核酸凝膠的試劑盒,其分別包括:

含上述(1-1)所述的第1核酸單體,不含有核酸連結酶的第1溶膠狀組合物;及

含(1-1)所述的第2核酸單體,不含有核酸連結酶的第2溶膠狀組合物;

其中

該第1核酸單體中的粘性突出末端含第1序列,

該第2核酸單體中的粘性突出末端含第2序列,并且

該第1序列和該第2序列以互相在生理條件下形成表現出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補,及,

●用于制成不含有核酸連結酶的核酸凝膠的試劑盒,其分別包括:

含有上述(2-1)所述的寡核苷酸的混合物,不含有核酸連結酶的第1溶膠狀組合物;及

含有(2-1)中所述的寡核苷酸的混合物,不含有核酸連結酶的第2溶膠狀組合物;

其中

該第1寡核苷酸的粘性突出末端部含第1序列,

該第2寡核苷酸的粘性突出末端部含第2序列,并且

該第1序列和該第2序列以互相在生理條件下形成表現出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補。

(1-5)及(2-5)涉及用于從上述(B)的2種以上的核酸單位形成凝膠的溶膠狀組合物。

具體而言,(1-5)的發明是分別含互相不同的(1-1)中規定的第1溶膠狀組合物及第2溶膠狀組合物(這些分別含互相不同的第1及第2核酸單體,不含有核酸連結酶)的,用于制成不含有核酸連結酶的核酸凝膠的試劑盒。在再(1-5)的發明中,該第1核酸單體中的粘性突出末端含第1序列,該第2核酸單體中的粘性突出末端含第2序列。其中,該第1序列和該第2序列的特征在于,以互相在生理條件下形成表現出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補。再有,該第1序列和該第2序列的互補性的程度的定義中的“生理條件下”是指37℃、NaCl濃度150mM的條件。互補性的百分率是指,該第1序列和該第2序列、即,根據粘性突出末端的長度而不同,但優選為90%以上互補,再優選為95%以上互補,特別優選為100%互補。

另外,(2-5)的發明是對(1-5)的發明的進一步限定,其限定的特征與(2-1)中的相同。

本發明可提供(1-6)及(2-6)、即,以下技術方案:

●包括通過混合上述(1-5)所述的試劑盒中的第1溶膠狀組合物和第2溶膠狀組合物而形成凝膠的,制成不含有核酸連結酶的核酸凝膠的方法、及,

●包括通過將上述(2-5)所述的試劑盒中的第1溶膠狀組合物和第2溶膠狀組合物在核酸濃度成3.2/x(突出末端部堿基數)mM以上、鹽濃度成以NaCl濃度換算640mM/x(突出末端部堿基數)-60mM以上的條件下混合來形成凝膠的,制成不含有核酸連結酶的核酸凝膠的方法。

(1-6)及(2-6)的發明是包括混合分別(1-5)及(2-5)的第1溶膠狀組合物和第2溶膠狀組合物的,核酸凝膠的制成方法。在(1-6)的發明中,用于形成凝膠的核酸濃度及/或鹽濃度不特別限定,本領域技術人員可根據構成2種溶膠狀組合物的核酸單體的性質適宜選擇。(2-6)的凝膠的制成方法包括通過將上述(2-5)所述的試劑盒中的第1溶膠狀組合物和第2溶膠狀組合物在核酸濃度成3.2/x(突出末端部堿基數)mM以上、鹽濃度成以NaCl濃度換算640mM/x(突出末端部堿基數)-60mM以上的條件下混合來形成凝膠。其中“x”及“以NaCl濃度換算”如在(2-1)的發明中說明。

再有,模式化顯示(1-6)及(2-6)的方法的機制的是圖11,但不限于此模式圖所示的實施方式。

本發明可提供(1-7)及(2-7)、即,以下技術方案:

●用于不使用核酸連結酶制成核酸凝膠的試劑盒,其為用于制成不含有核酸連結酶的核酸凝膠的試劑盒,其分別包括:

含上述(1-1)所述的核酸單體,不含有核酸連結酶的第1溶膠狀組合物;及

含有在兩末端具有包括粘性單鏈的突出末端的雙鏈核酸,不含有核酸連結酶的第2溶膠狀組合物;

其中

該第1核酸單體中的粘性突出末端含第1序列,

該雙鏈核酸的兩末端的突出末端含第2序列,并且

該第1序列和該第2序列以互相在生理條件下形成表現出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補,及,

●用于制成不含有核酸連結酶的核酸凝膠的試劑盒,其分別包括:

含有上述(2-1)所述的寡核苷酸的混合物,不含有核酸連結酶的第1溶膠狀組合物;及

含有在兩端具有包括粘性的單鏈的突出末端部,其間具有由雙鏈構成的互補性堿基序列部的核酸,不含有核酸連結酶的第2溶膠狀組合物;

[在第2溶膠狀組合物中,

突出末端部是4~12個核苷酸長,以與該第1溶膠狀組合物中的寡核苷酸中的粘性突出末端部在生理條件下形成表現出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補的單鏈核酸部分,

互補性堿基序列部是8~45個核苷酸長,以與第1溶膠狀組合物中的寡核苷酸中的互補性堿基序列部在生理條件下形成表現出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補的雙鏈核酸部分]

其中

該第1溶膠狀組合物中的寡核苷酸的粘性突出末端部含第1序列,

該由雙鏈構成的互補性堿基序列部的兩端的突出末端部含第2序列,并且

該第1序列和該第2序列以互相在生理條件下形成表現出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補。

(1-7)的發明除了將(1-5)的發明中的“第2溶膠狀組合物”中含的“第2核酸單體”變更為“在兩末端具有包括粘性單鏈的突出末端的雙鏈核酸”之外,與(1-5)的發明同樣。即,將(1-5)的發明的“核酸單體”可形成的“核酸單位”變更為當上述模式圖中n是2時的,“在兩末端具有包括粘性單鏈的突出末端的雙鏈核酸”。

(2-7)的發明除了將(2-5)的發明中的“第2溶膠狀組合物”中含的“第2寡核苷酸”變更為“在兩端具有包括粘性的單鏈的突出末端部,其間具有由雙鏈構成的互補性堿基序列部的核酸”之外,與(2-5)的發明同樣。即,將(2-5)的發明的“寡核苷酸”可形成的“核酸單位”變更為上述模式圖中n是2時的,“在兩端具有包括粘性的單鏈的突出末端部,其間具有由雙鏈構成的互補性堿基序列部的核酸”。再者(2-7)的發明是在第2溶膠狀組合物的特征中,將“突出末端部”限定為“4~12核苷酸長,與第1溶膠狀組合物中的寡核苷酸中的粘性突出末端部以在生理條件下形成表現出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補的單鏈核酸部分”,并且,將“互補性堿基序列部”限定為“8~45核苷酸長,以與第1溶膠狀組合物中的寡核苷酸中的互補性堿基序列部在生理條件下形成表現出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補的雙鏈核酸部分”。

本發明可提供(1-8)及(2-8)、即,以下技術方案:

●包括通過混合上述(1-7)所述的試劑盒中的第1溶膠狀組合物和第2溶膠狀組合物來形成凝膠的,制成不含有核酸連結酶的核酸凝膠的方法、及,

●包括通過將上述(2-7)所述的試劑盒中的第1溶膠狀組合物和第2溶膠狀組合物在核酸濃度成3.2/x(突出末端部堿基數)mM以上、鹽濃度成以NaCl濃度換算640mM/x(突出末端部堿基數)-60mM以上的條件下混合來形成凝膠的,制成不含有核酸連結酶的核酸凝膠的方法。

(1-8)及(2-8)的發明是包括混合分別(1-7)及(2-7)的第1溶膠狀組合物和第2溶膠狀組合物的,核酸凝膠的制成方法。在(1-8)的發明中,用于形成凝膠的核酸濃度及/或鹽濃度不特別限定,適宜本領域技術人員可根據構成2種溶膠狀組合物的核酸單體及雙鏈核酸的性質選擇。(2-8)的凝膠的制成方法包括通過將上述(2-7)所述的試劑盒中的第1溶膠狀組合物和第2溶膠狀組合物在核酸濃度成3.2/x(突出末端部堿基數)mM以上、鹽濃度成以NaCl濃度換算640mM/x(突出末端部堿基數)-60mM以上的條件下混合來形成凝膠。其中“x”及“以NaCl濃度換算”如在(2-1)的發明中說明。

再有,模式化顯示(1-8)及(2-8)的方法的機制的是圖12,但不限于此模式圖所示的實施方式。

本發明可再提供(1-9)及(2-9)、即,以下技術方案:

●由上述(1-4)、(1-6)及(1-8)所述的任何方法制成的不含有核酸連結酶的核酸凝膠、及,

●由上述(2-4)、(2-6)及(2-8)所述的任何方法制成的不含有核酸連結酶的核酸凝膠。

由(1-9)及(2-9)的發明的核酸凝膠以不含有核酸連結酶作為特征。

本發明可提供(1-10)及(2-10)、即,以下技術方案:

●在上述(1-4)、(1-6)及(1-8)所述的任何方法中,包括將要在凝膠形成前封入凝膠的內封物質添加到溶膠狀組合物中,封入內封物質,并且制成不含有核酸連結酶的核酸凝膠的方法、及,

●在上述(2-4)、(2-6)及(2-8)所述的任何方法中,包括將要在凝膠形成前封入凝膠的內封物質添加到溶膠狀組合物中,封入內封物質,并且制成不含有核酸連結酶的核酸凝膠的方法。

(1-10)及(2-10)的發明涉及不含有核酸連結酶的核酸凝膠,還內包內封物質的核酸凝膠的制成方法。涉及的方法是,在(1-4)、(1-6)及(1-8)~(2-4)、(2-6)及(2-8)的核酸凝膠的制成方法中,還包括將要在凝膠形成前封入凝膠的內封物質添加到溶膠狀組合物中。作為內封物質,只要是想要內包于凝膠中的核酸連結酶以外的物質就不特別限定,可舉出例如,多柔比星、道諾霉素等的DNA嵌入劑、胰島素等的肽及肽藥品、卵清蛋白、柳杉抗原等的蛋白質抗原、生長因子、細胞因子等的蛋白質及蛋白質藥品、細胞、及基因改變細胞等,不特別限定。

由(1-10)及(2-10)的發明,通過首先制備溶膠,添加內封物質,例如,升高鹽濃度或核酸濃度,可制成內包內封物質的凝膠。另外,內封物質的添加量不特別限定,就算是與凝膠同程度的重量,也可內包。

本發明可提供(1-11)及(2-11)、即,以下技術方案:

●(1-10)所述的方法,其中內封物質選自:低分子量化合物、蛋白質及細胞,及,

●(2-10)所述的方法,其中內封物質選自:低分子量化合物、蛋白質及細胞。

(1-11)及(2-11)的發明分別將(1-10)及(2-10)的發明中的,內封物質限定為低分子量化合物、蛋白質、及細胞,但是,蛋白質不是核酸連結酶。低分子量化合物、蛋白質、及細胞的例如上述。

本發明可提供(1-12)及(2-12)、即,以下技術方案:

●由上述(1-10)或(1-11)記載的方法制成的,含有內封物質,并且不含有核酸連結酶的核酸凝膠、及,

●由上述(2-10)或(2-11)記載的方法制成的,含有內封物質,并且不含有核酸連結酶的核酸凝膠。

(1-12)及(2-12)的發明涉及由(1-10)、(1-11)、(2-10)或(2-11)的方法制成的含有內封物質,并且不含有核酸連結酶的核酸凝膠。涉及的核酸凝膠在凝膠的復雜的微細結構之中內包希望得到之內封物質,例如,可在活體內緩慢地釋放內封物質。

本發明可提供(1-13)、即以下技術方案:

●(1-1)或(1-2)記載的溶膠狀組合物,其中核酸單體在互補性堿基序列部中互補地結合,并且,粘性突出末端含回文序列結構。

本發明可提供(3-1)~(3-4)、即,以下技術方案:

(3-1):核酸單體含CpG基序的,(1-1)~(1-12)及(2-1)~(2-12)之任一項所述的核酸溶膠狀組合物、方法、試劑盒、或者核酸凝膠。

(3-2):核酸單體的種類數是3~8的,(1-1)~(1-12)、(2-1)~(2-12)、及(3-1)之任一項所述的核酸溶膠狀組合物、方法、試劑盒、或者核酸凝膠。

(3-3):核酸單體含CpG基序,所述核酸溶膠狀組合物用于制成免疫佐劑的,(1-1)~(1-3)、及(2-1)~(2-3)之任一項所述的溶膠狀組合物。

(3-4):免疫佐劑,其是含(1-9)、(1-12)、(2-9)、及(2-12)之任一項所述的核酸凝膠的免疫佐劑,核酸單體含CpG基序。

【實施例】

以下,使用實施例及附圖詳細地說明本發明,這些實施例及附圖不旨在限定本發明的范圍。

【材料及方法】

【化學物質】

RPMI1640培養基獲自日水制藥(Nissui?Pharmaceutical?Co.,Ltd.,Tokyo,Japan)。胎兒牛血清(FBS)獲自Equitech-Bio,Inc(Kerrville,TX,USA)。Opti-MEM(Opti-modified?Eagle’s培養基)購自Invitrogen(Carlsbad,CA,USA)。20-bp?DNA階梯購自寶生物株式會社(Takara?Bio?Inc.Otsu,Japan)。其其他全部的試劑-物質是利用可能的最高等級的試劑-物質,不進一步純化而使用。

【寡脫氧核苷酸(也稱為ODN)】

磷酸二酯寡脫氧核苷酸(ODN)購自Integrated?DNA?Technologies,Inc.(Coralville,IA,USA)。ODN的序列列于表1。在表1中,各ODN被命名為“X足DNA-Y-Z”。其中,X表示三(三(3))、四(四(4))、五(五(5))、六(六(6))或八(八(8)),Y表示各X足DNA的編號(1、2等)、Z表示構成各X足DNA的ODN的編號。對于細胞攝取研究而言,將5’-末端用AlexaFluor488標記的ODN購自JBioS(Saitama,Japan),用于熒光標記多足DNA的制備。

【ODN的溶液(也稱為多足DNA)的制備】

將各ODN溶解于含有5mM氯化鈉(NaCl)的TE緩沖液(10mMTris-HCl,1mM乙二胺四醋酸(EDTA),pH8)。將混合物相繼,使用熱循環儀于95℃溫育5分鐘、于65℃溫育2分鐘、于62℃溫育1分鐘,然后緩慢地冷卻至4℃。將生成物由12%聚丙烯酸類樹脂酰胺凝膠電泳(PAGE)于室溫(約22-25℃)、以200V電泳45分鐘而進行分析。

【凝膠的形成和凝膠強度的評價】

向ODN的溶液(多足DNA)添加NaCl溶液至最終Na+濃度達到5-150mM。在凝膠強度分析器(凝膠強度計、中山電機、大阪)中測定凝膠的形成和凝膠強度。

【由DNA水凝膠的掃描型電子顯微鏡的觀察】

為了觀察DNA水凝膠之內部結構,將它們使用2%戊二醛于室溫固定一晚,使用緩慢地升高的濃度的乙醇脫水,然后將乙醇置換為丁醇,冷凍干燥。將干燥的材料用刀斷開,使用場致發射型掃描電子顯微鏡(FE-SEM:S4700,HITACHI,Japan)觀察DNA水凝膠之內部結構。

表1:實施例中使用的寡核苷酸的名稱-序列

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

四足DNA(I)

四-I-01 AGTC?TCGCTGACGTTGCAGACA?TCACGTTGACGCTGTCGA(SEQ?ID?NO:58) 四-I-02 AGTC?TCGACAGCGTCAACGTGA?AACGTGAAGCGTCTGCGA(SEQ?ID?NO:59) 四-I-03 AGTC?TCGCAGACGCTTCACGTT?GCAGACAGACGTTGACGA(SEQ?ID?NO:60) 四-I-04 AGTC?TCGTCAACGTCTGTCTGC?TGTCTGCAACGTCAGCGA(SEQ?ID?NO:61)

【表1-4】

名稱 序列(5’→3’)(序列編號) 六足DNA(8-16-16)-4-01 gcagacga?cgttgaatccatgacg?ttgtatgactgcaacg(62) 六足DNA(8-16-16)-4-02 gcagacga?cgttgcagtcatacaa?tcctgacgctctgacg(63) 六足DNA(8-16-16)-4-03 gcagacga?cgtcagagcgtcagga?cgttcatcagtatacg(64) 六足DNA(8-16-16)-4-04 gcagacga?cgtatactgatgaacg?aagtgacgtctcaacg(65) 六足DNA(8-16-16)-4-05 gcagacga?cgttgagacgtcactt?atcgacgtctgagacg(66) 六足DNA(8-16-16)-4-06 gcagacga?cgtctcagacgtcgat?cgtcatggattcaacg(67) 六足DNA(8-16-16)-5-01 tcctgagc?ttgctagagcctgtca?ggagcagctagtgcaa(68) 六足DNA(8-16-16)-5-02 tcctgagc?ttgcactagctgctcc?agcagagctcgatcaa(69) 六足DNA(8-16-16)-5-03 tcctgagc?ttgatcgagctctgct?tgagcctcagctgcaa(70) 六足DNA(8-16-16)-5-04 tcctgagc?ttgcagctgaggctca?gagcctgatctagcaa(71) 六足DNA(8-16-16)-5-05 tcctgagc?ttgctagatcaggctc?ctcagcttgactacaa(72) 六足DNA(8-16-16)-5-06 tcctgagc?ttgtagtcaagctgag?tgacaggctctagcaa(73) 六足DNA(8-16-16)-6-01 gctcagga?gcttgaatccatgagc?ttgtatgactgcaagc(74) 六足DNA(8-16-16)-6-02 gctcagga?gcttgcagtcatacaa?tcctgagcctctgagc(75) 六足DNA(8-16-16)-6-03 gctcagga?gctcagaggctcagga?gcttcatcagtatagc(76) 六足DNA(8-16-16)-6-04 gctcagga?gctatactgatgaagc?aagtgagctctcaagc(77) 六足DNA(8-16-16)-6-05 gctcagga?gcttgagagctcactt?atgcagctctgagagc(78) 六足DNA(8-16-16)-6-06 gctcagga?gctctcagagctgcat?gctcatggattcaagc(79) 六足DNA(8-16-16)-7-01 gctgtcca?gcttgaatccatgagc?ttgtatgactgcaagc(80) 六足DNA(8-16-16)-7-02 gctgtcca?gcttgcagtcatacaa?tcctgagcctctgagc(81) 六足DNA(8-16-16)-7-03 gctgtcca?gctcagaggctcagga?gcttcatcagtatagc(82) 六足DNA(8-16-16)-7-04 gctgtcca?gctatactgatgaagc?aagtgagctctcaagc(83) 六足DNA(8-16-16)-7-05 gctgtcca?gcttgagagctcactt?atgcagctctgagagc(84) 六足DNA(8-16-16)-7-06 gctgtcca?gctctcagagctgcat?gctcatggattcaagc(85)

【表1-5】

【表1-6】

【表1-7】

【表1-8】

【表1-9】

表中,作為各ODN的名稱的XXX足DNAy-Z(其中,XXX是三、四、五等,y及Z是數字)是指,其序列是用于制作XXX足DNAy的ODN。例如,三足DNA30使用三足DNA30-1、三足DNA30-2、及三足DNA30-3制作。

【實施例1】

【(1-1)DNA構成的水凝膠的制成】

在室溫、5mM~150mM氯化鈉濃度(150mM是大致生理的濃度)、DNA連接酶不含的條件下闡明成為水凝膠的結構(核酸單體及推定核酸單位)。這時發現,通過增加被認為可構成核酸單位的核酸單體的數,能在更溫和的條件(低鹽濃度)下凝膠化。為簡便起見,根據可構成核酸單位的核酸單體數,將推定形成的核酸單位表示為xxx足DNA(xxx足-樣結構形成核酸、在xxx中,根據可構成核酸單位的核酸單體的數包括三(3)、四(4)等)。在下述表2中,xxx足DNA是推定核酸單位、xxx-Y-N分別是可成為其上標記的核酸單位(xxx足DNA)的構成要素的核酸單體,Y的標記相不異,則表示可形成相異的核酸單位,N表示構成各推定核酸單位的核酸單體的編號。

表2:實施例1-1中使用的寡核苷酸的名稱-序列

【表2-1】

三足DNA

三-A-01 ACGT?TCGTCAACGTCTGTGCTC?TCACGTTGACGCTGTCGA(SEQ?ID?NO:1) 三-A-02 ACGT?TCGACAGCGTCAACGTGA?AACGTGAAGCGTCTGCGA(SEQ?ID?NO:2) 三-A-03 ACGT?TCGCAGACGCTTCACGTT?GAGCACAGACGTTGACGA(SEQ?ID?NO:3)

【表2-2】

四足DNA

四-A-01 ACGT?TCGCTGACGTTGCAGACA?TCACGTTGACGCTGTCGA(SEQ?ID?NO:4) 四-A-02 ACGT?TCGACAGCGTCAACGTGA?AACGTGAAGCGTCTGCGA(SEQ?ID?NO:2) 四-A-03 ACGT?TCGCAGACGCTTCACGTT?GCAGACAGACGTTGACGA(SEQ?ID?NO:5) 四-A-04 ACGT?TCGTCAACGTCTGTCTGC?TGTCTGCAACGTCAGCGA(SEQ?ID?NO:6) 四-B-01 AACGTT?TACGCACGACATCAGCG?TCTGGACGCTTCGTCGA(SEQ?ID?NO:18) 四-B-02 AACGTT?TCGACGAAGCGTCCAGA?TCTCGTCAACGCTGCGA(SEQ?ID?NO:19) 四-B-03 AACGTT?TCGCAGCGTTGACGAGA?CAGACGCTGTGACGCTA(SEQ?ID?NO:20) 四-B-04 AACGTT?TAGCGTCACAGCGTCTG?CGCTGATGTCGTGCGTA(SEQ?ID?NO:21) 四-C-01 ACGTACGT?TAGCACGACATCAGCG?TCTGACGCTTCGTCGA(SEQ?ID?NO:22) 四-C-02 ACGTACGT?TCGACGAAGCGTCAGA?TCTCGTCAACGCTGCA(SEQ?ID?NO:23) 四-C-03 ACGTACGT?TGCAGCGTTGACGAGA?CAGACGCTTGACGCTA(SEQ?ID?NO:24) 四-C-04 ACGTACGT?TAGCGTCAAGCGTCTG?CGCTGATGTCGTGCTA(SEQ?ID?NO:25) 四-D-01 ACGTTAACGT?TGCACGACATCAGCG?TCTGACGCTCGTCGA(SEQ?ID?NO:26) 四-D-01 ACGTTAACGT?TCGACGAGCGTCAGA?TCTCGCAACGCTGCA(SEQ?ID?NO:27) 四-D-01 ACGTTAACGT?TGCAGCGTTGCGAGA?CAGACGCTTGACGCA(SEQ?ID?NO:28) 四-D-01 ACGTTAACGT?TGCGTCAAGCGTCTG?CGCTGATGTCGTGCA(SEQ?ID?NO:29) 四-E-01 ACGTCATGACGT?TGCACGACATCACGT?TGACGCTCGTCGA(SEQ?ID?NO:30) 四-E-01 ACGTCATGACGT?TCGACGAGCGTCAAT?CTCGCAACGTGCA(SEQ?ID?NO:31) 四-E-01 ACGTCATGACGT?TGCACGTTGCGAGAC?AGACGCTTGACGA(SEQ?ID?NO:32) 四-E-01 ACGTCATGACGT?TCGTCAAGCGTCTGC?GTGATGTCGTGCA(SEQ?ID?NO:33) 四-F-01 AGCT?AGGCACCGTAGTCAATCG?CCGATGTGTCCAAAGCCT(SEQ?ID?NO:14) 四-F-02 AGCT?AGGCTTTGGACACATCGG?TGCTCCTACCGTACTCCT(SEQ?ID?NO:15) 四-F-03 AGCT?AGGAGTACGGTAGGAGCA?GTTTCGGCATGTCCACCT(SEQ?ID?NO:16) 四-F-04 AGCT?AGGTGGACATGCCGAAAC?CGATTGACTACGGTGCCT(SEQ?ID?NO:17)

【表2-3】

五足DNA

五-A-01 ACGT?TCGCTGACGTTGCAGACA?TCACGTTGACGCTGTCGA(SEQ?ID?NO:4) 五-A-02 ACGT?TCGACAGCGTCAACGTGA?AACGTGAAGCGTCTGCGA(SEQ?ID?NO:2) 五-A-03 ACGT?TCGCAGACGCTTCACGTT?GAGCACAGACGTTGACGA(SEQ?ID?NO:3) 五-A-04 ACGT?TCGTCAACGTCTGTGCTC?GCAGCGTCTTAACGTCGA(SEQ?ID?NO:7) 五-A-05 ACGT?TCGACGTTAAGACGCTGC?TGTCTGCAACGTCAGCGA(SEQ?ID?NO:8)

【表2-4】

六足DNA

六-A-01 ACGT?TCGCTGACGTTGCAGACA?TCACGTTGACGCTGTCGA(SEQ?ID?NO:4) 六-A-02 ACGT?TCGACAGCGTCAACGTGA?AACGTGAAGCGTCTGCGA(SEQ?ID?NO:2) 六-A-03 ACGT?TCGCAGACGCTTCACGTT?GAGCACAGACGTTGACGA(SEQ?ID?NO:3) 六-A-04 ACGT?TCGTCAACGTCTGTGCTC?GCAGCGTCTTAACGTCGA(SEQ?ID?NO:7) 六-A-05 ACGT?TCGACGTTAAGACGCTGC?TGTCTGCAACGTCAGCGA(SEQ?ID?NO:9) 六-A-06 ACGT?TCGTAGTCCTGAACGTCT?TGTCTGCAACGTCAGCGA(SEQ?ID?NO:10)

從使用這些核酸單體的以上的檢查發現,粘性突出末端是4個堿基以上、構成核酸單位的寡核苷酸數是3個以上時,可無關于堿基序列而制備水凝膠。圖1示4個核酸單體(寡核苷酸)經推定的核酸單位四足DNA而形成DNA水凝膠的推定模式圖,在圖2示使用四足DNA時形成的水凝膠的概觀。另外在圖3示,用掃描型電子顯微鏡觀察的凝膠之內部結構。圖3中右側是左側的擴大圖,知形成網目結構的凝膠。再有,在本實施例中,構成xxx足DNA的核酸單體的粘性突出末端均為回文序列,推定為1種核酸單位互相經回文序列連接。

【(1-2)利用多個核酸單位的核酸水凝膠】

與上述(1-1)不同,通過使用具有不與其自身連接(即不是回文序列)的粘性突出末端的核酸單體,可控制凝膠化。例如,通過將下述的四足DNA(G)和四足DNA(H)混合,可制備水凝膠。另外,代替四足DNA(H)而使用雙鏈DNA(dsDNA)也可制備同樣的凝膠。在圖4所示的模式圖中,上側示使用2種具有不是回文序列的互相互補的粘性突出末端的四足DNA的水凝膠的形成(對應于以下的四足DNA(G)和四足DNA(H)的混合)、與此相比,下側示使用具有不是回文序列的粘性突出末端的四足DNA(A)和具有與所述粘性突出末端互補的粘性突出末端的dsDNA的水凝膠的形成(對應于以下的四足DNA(G)和dsDNA的混合)。使用的核酸單體示于表3。

表3:實施例1-2中使用的寡核苷酸的名稱-序列

【表3】

四足DNA(G)

四-G-01 TCAGAGTCAGTC?TGCACGACATCACG?TTGACGCTCGTCGA(SEQ?ID?NO:34) 四-G-01 TCAGAGTCAGTC?TCGACGAGCGTCAA?TCTCGCAACGTGCA(SEQ?ID?NO:35) 四-G-01 TCAGAGTCAGTC?TGCACGTTGCGAGA?CAGACGCTTGACGA(SEQ?ID?NO:36) 四-G-01 TCAGAGTCAGTC?TCGTCAAGCGTCTG?CGTGATGTCGTGCA(SEQ?ID?NO:37)

四足DNA(H)

四-H-01 GACTGACTCTGA?TGCACGACATCACG?TTGACGCTCGTCGA(SEQ?ID?NO:38) 四-H-01 GACTGACTCTGA?TCGACGAGCGTCAA?TCTCGCAACGTGCA(SEQ?ID?NO:39) 四-H-01 GACTGACTCTGA?TGCACGTTGCGAGA?CAGACGCTTGACGA(SEQ?ID?NO:40) 四-H-01 GACTGACTCTGA?TCGTCAAGCGTCTG?CGTGATGTCGTGCA(SEQ?ID?NO:41)

ds

ds-01 GACTGACTCTGA?ACGTCAGCGTTA(SEQ?ID?NO:42) ds-02 GACTGACTCTGA?TAACGCTGACGT(SEQ?ID?NO:43)

【實施例2】

【實施例2-1】

【內包抗原蛋白質或細胞的水凝膠的制備】

由實施例1可利用核酸單體的核酸水凝膠的制備,所以利用其嘗試了內包抗原蛋白質或細胞的水凝膠的制備。具體而言,用表1中記載的四足DNA(4-18-18)(SEQ?ID?NO:2、4、5、6)制備DNA濃度成0.5mM、NaCl濃度成5mM的水溶液,向該處加目的內封物質(多柔比星、卵清蛋白、或者RAW264.7細胞),將NaCl濃度升高至150mM。結果,內包抗原蛋白質或細胞的水凝膠的制備變得可能。圖5示內包得到的內封物質的水凝膠的掃描型電子顯微鏡照片。

【實施例2-2】

【生存細胞的向DNA水凝膠的摻入】

在巨細胞病毒/雞β-肌動蛋白啟動子控制下表達強化綠色熒光蛋白質(eGFP)的eGFP轉基因小鼠(5周齡)從日本SLC株式會社(靜岡、日本)購入。通過使用戊巴比妥的麻醉處死小鼠,自大腿骨及脛骨除去全部的結締組織。使用26號針,用含有10%加熱失活牛胎兒血清的RPMI沖洗大腿骨及脛骨,單離骨髓細胞。通過40μm細胞過濾器(BDFalcon、FranklinLakes、NJ、USA)過濾細胞混合物,其后,在0.1%氯化銨的低滲透壓溶液中,于室溫溫育5分鐘,溶解混入的紅細胞。將殘留細胞用離心機以450×g離心10分鐘,將回收沉淀的細胞作為骨髓來源細胞(BMDC)使用。向96孔板中的各自的孔以1×106細胞/孔的密度添加GFP-BMDC。

接下來,使用表1中的ODN(六足DNA(8-16-16)-2-01~06、及六足DNA(8-16-16)-3-01~06),用Hanks平衡鹽類溶液(HBSS)中制備DNA水凝膠。

然后,以350μg/孔的最終濃度向含有GFP-BMDC-的孔添加DNA樣品。將用于水凝膠的2組的六足DNA在孔中混合。使用熒光顯微鏡Biozero(KEYENCE、大阪、日本)得到熒光圖像。

x-z切片的圖像示于圖21。圖21中,棒及箭頭表示六足DNA溶液(上的圖)或DNA水凝膠(下的圖)的高度。如圖21所示,細胞摻入水凝膠中。

【實施例3】

【由凝膠化的核酸的免疫細胞活化能的增強可能性】

使用含CpG基序的三足DNA(SEQ?ID?NO:1、2、3),如圖6所示,首先通過退火制成推定作為三足DNA結構的Y型DNA(Ys)、接下來,將其再4單位退火而得到具有G1的推定結構的樹狀聚體樣DNA、再10單位退火而得到具有G2的推定結構的樹狀聚體樣DNA。使用這些研究TNF-α釋放刺激能及向細胞的攝取率。結果示于圖6。通過高分子量化,可理解TNF-α釋放活性及細胞攝取率的兩者顯著地升高。

【實施例4-1】

實施例1中制成的水凝膠,通過適當調節條件,可在溶膠狀態下制備。從而,向活體的注射施用是可能的。如圖7所示,制成末端具有非粘性突出末端的對照的四足DNA及,由本發明的末端具有粘性突出末端的四足DNA(4-18-18)(SEQ?ID?NO:2、4、5、6)的總DNA濃度2mM、NaCl濃度5mM的溶膠狀溶液,分別注射到小鼠的背中左側及右側的皮下而施用。結果如圖7及圖8-1所示,在對照的四足DNA中在活體內不形成凝膠,與此相比,使用由本發明的四足DNA時,由從溶膠狀的低鹽濃度水溶液的水分的吸收的DNA濃度的升高及由向活體內的鹽濃度的鹽濃度的升高,確認施用后,在活體內凝膠化。由此確認,由本發明的水凝膠通過僅在溶膠狀態下制備而在活體內施用,在活體內形成凝膠。在圖8-1也示在活體內形成的凝膠的掃描型電子顯微鏡照片。

【實施例4-2】

【(4-2-1)注射器通過后的DNA水凝膠的樣式】

在DNA(六足DNA)及DNA水凝膠的制備中,分別使用表1的序列之中的下述的ODN。

將DNA(六足DNA):六足DNA(8-16-16)-2-01~06,六足DNA(8-16-16)-4-01~06;

DNA水凝膠:六足DNA(8-16-16)-2-01~06,六足DNA(8-16-16)-3-01~06;

六足DNA(8-16-16)-2-01~06、六足DNA(8-16-16)-3-01~06、六足DNA(8-16-16)-4-01~06加熱至95℃后,緩慢地冷卻而分別制備六足DNA-2、六足DNA-3、六足DNA-4,用碘化丙啶(PI)將DNA染色。此時,ODN用含1.5M?NaCl的TE緩沖液(10mM?Tris-HCl、1mMEDTA、pH8)溶解,制備成各ODN的終濃度為0.5mM。用帶29G針的注射器吸取六足DNA-2溶液,接下來吸六足DNA-4(DNA)或六足DNA-3(DNA水凝膠),用注射器內攪拌。通過目測確認凝膠化的有無后,將DNA溶液或DNA水凝膠從注射器壓出。

圖8-2A示注射器內、及壓出后的DNA溶液及DNA水凝膠的樣式的照片。如圖8-2A所示,DNA水凝膠從注射器的壓出后在凝膠狀態下。

【(4-2-2)凝膠粘彈性的測定】

向凝膠粘彈性測定器(株式會社中山電機制)設置導入了凝膠的管。將測定棒降低到凝膠的至上端,其后,經時測定將測定棒降低500μm之時的荷重值。在測定中,使用在(4-2-1)中管內制備的DNA水凝膠和在注射器內形成后從注射器壓出的DNA水凝膠。

粘彈性的結果示于圖8-2B。如圖8-2B所示,通過注射器的凝膠與通過前的凝膠有同程度的粘彈性。

【(4-2-3)通過注射器的向小鼠皮內的施用】

通過與(4-2-1)同樣的方法在帶29G針的注射器內制備PI標記DNA(六足DNA)或DNA水凝膠。將ICR小鼠用異氟烷麻醉,背部除毛后,向皮內注射施用各樣品。施用3小時后,處死小鼠,剝離背部皮膚,觀察施用部位的樣式。

施用3小時后的施用部位的照片示于圖8-2C。如圖8-2C所示,本發明的水凝膠通過注射器的施用后在體內處在凝膠狀態下。

從(4-2-1)~(4-2-3)的結果知,由于本發明的水凝膠具有觸變性,在凝膠狀態下通過注射器注射施用也在體內再度凝膠化,可在凝膠狀態下通過注射器注射施用。

【實施例5】

【使用各種序列的核酸(不僅由DNA構成,也含RNA)的水凝膠的制成】

【(5-1)免疫學有活性的凝膠及免疫學無活性的凝膠的制成】

如圖9所示,使用不含CpG基序的四足DNA(4-18-18)(SEQ?ID?NO:14、15、16、17)及含CpG基序的四足DNA(4-18-18)(SEQ?ID?NO:2、4、5、6)(圖9中,以下劃線示CpG基序的存在)如上述一樣制成凝膠。使制成的凝膠與小鼠樹突細胞DC2.4接觸時,由不含CpG基序的四足DNA制成的凝膠,如圖9之右側的照片所示,不免疫學刺激小鼠樹突細胞,由含CpG基序的四足DNA制成的凝膠,如圖9之中央的照片所示,免疫學顯著地刺激小鼠樹突細胞。因此確證,通過控制本發明的核酸單體的序列,具體而言通過使含CpG基序,可制成免疫學有活性的凝膠。另外也確證,通過同樣地不含CpG基序,可制成免疫學無活性的凝膠。

【(5-2)使用具有各種序列的xxx足DNA的凝膠的制備例】

如圖10所示確認,使用末端含是回文序列的4堿基~12堿基的長度的粘性突出末端的,三足DNA(4-18-18)(SEQ?ID?NO:1、2、3)、四足DNA(4-18-18)(SEQ?ID?NO:2、4、5、6)、四足DNA(6-17-17)(SEQ?ID?NO:18、19、20、21)、四足DNA(8-16-16)(SEQ?ID?NO:22、23、24、25)、四足DNA(10-15-15)(SEQ?ID?NO:26、27、28、29)、四足DNA(12-14-14)(SEQ?ID?NO:30、31、32、33)、五足DNA(4-18-18)(SEQ?ID?NO:2、3、4、7、8)、六足DNA(4-18-18)(SEQ?ID?NO:2、3、4、7、9、10)可制備凝膠。圖10的下方的圖分別是三足DNA、四足DNA、五足DNA、六足DNA的在凝膠中的推定結構。

【5-3】

如圖11所示,制備以總DNA濃度2mM含末端含不是回文序列的12堿基的長度的粘性突出末端的四足DNA(A)(12-14-14)(SEQ?ID?NO:34、35、36、37),以濃度150mM含NaCl的水溶液,和以總DNA濃度2mM含有含與四足DNA(A)的粘性突出末端互補的12堿基的長度的粘性突出末端的四足DNA(B)(12-14-14)(SEQ?ID?NO:38、39、40、41),以濃度150mM含NaCl的水溶液。這些四足DNA(A)及四足DNA(B)即便升高DNA濃度及鹽濃度,單獨也無法形成凝膠,但當各自的水溶液混合而使最終DNA濃度為2mM及NaCl濃度為150mM時形成凝膠。如圖11之右下所示,四足DNA(A)及四足DNA(B)各自單獨不形成凝膠,但通過簡單混合這些可形成凝膠。

【5-4】

如圖12所示,制備以總DNA濃度2mM含末端含不是回文序列的12堿基的長度的粘性突出末端的四足DNA(A)(12-14-14)(SEQ?ID?NO:34、35、36、37),以濃度150mM含NaCl的水溶液,和以總DNA濃度1mM含有含與四足DNA(A)的粘性突出末端互補的12堿基的長度的粘性突出末端的dsDNA(12-14)(SEQ?ID?NO:42及43),以濃度150mM含NaCl的水溶液。這些四足DNA(A)及dsDNA即便升高DNA濃度及鹽濃度,單獨也無法形成凝膠,但當簡單混合各自的水溶液而使最終DNA濃度為1.5mM及NaCl濃度為150mM時,形成凝膠。如圖12之右下所示,四足DNA(A)及dsDNA各自單獨不形成凝膠,但通過簡單混合這些可形成凝膠。

【5-5】

如圖13所示,通過使本發明的xxx足DNA、例如四足DNA含誘餌DNA或siRNA,也可制成由在凝膠內部或末端部位具有作為核酸醫藥的功能的核酸組成的水凝膠。如此,通過利用以DNA、RNA為首的各種核酸序列,可改變本發明的凝膠的功能。

【實施例6】

【使用免疫學有活性的凝膠中內包卵清蛋白(OVA)的凝膠的免疫應答的增強】

如圖14所示,作為對照將含OVA100μg的溶膠狀水溶液(OVA濃度2.5μg/μl、NaCl濃度5mM)、或者,除了OVA100μg之外,含100μg本發明的四足DNA(4-18-18)(SEQ?ID?NO:2、4、5、6)的溶膠狀水溶液DNA(OVA濃度2.5μg/μl、NaCl濃度5mM、總DNA濃度2mM)分別注射到小鼠(0d免疫)、免疫第14天摘出脾臟,將得到的脾細胞用OVA刺激而測定IFN-γ的產生。如圖14之右側所示,與自對照的僅施用OVA的小鼠的脾細胞比較,在自將本發明的四足DNA與OVA一同施用的小鼠的脾細胞中,IFN-γ的產生量顯著地升高。由此示,由本發明的四足DNA形成的凝膠的免疫應答的增強效果。

【實施例7】

【凝膠之內部結構的調節】

圖15示,自可形成本發明的核酸單位、三足DNA、四足DNA、五足DNA及六足DNA的核酸單體得到的凝膠內部的推定立體結構。如從圖15可以看出,可構成核酸單位的核酸單體的數越多,即,相比三足DNA,六足DNA,被推定為取越復雜的凝膠之內部結構。另外,通過粘性突出末端的長度也可調節凝膠的結構。

圖16示,以DNA濃度1.5mM含三足DNA(4-18-18)(SEQ?IDNO:1、2、3)(粘性突出末端的長度是4堿基)的凝膠之內部結構、以DNA濃度0.5mM含四足DNA(4-18-18)(SEQ?ID?NO:2、4、5、6)(粘性突出末端的長度是4堿基)的凝膠之內部結構、以DNA濃度0.5mM含六足DNA(4-18-18)(SEQ?ID?NO:2、3、4、7、9、10)(粘性突出末端的長度是4堿基)的凝膠之內部結構、及以DNA濃度0.5mM含四足DNA(12-14-14)(SEQ?ID?NO:30、31、32、33)(粘性突出末端的長度是12堿基)的凝膠之內部結構的掃描型電子顯微鏡照片。從照片可以看出,相比三足DNA,使用四足DNA得到的凝膠的凝膠之內部結構更微細、相比其,使用六足DNA得到的凝膠的凝膠之內部結構更微細。另外,使用相同的四足DNA時,使用粘性突出末端的長度長的,得到的凝膠的凝膠之內部結構更微細。

【實施例8】

【由凝膠之內部結構的調節的凝膠強度的調節】

【(8-1)DNA濃度的調節】

通過使以DNA濃度0.1mM、0.25mM、或者0.5mM含四足DNA(12-14-14)(SEQ?ID?NO:30、31、32、33)的水溶液的NaCl濃度成為150mM而形成凝膠,經時測定殘留的凝膠的百分率。結果示于圖17之左上的坐標圖。橫軸示經過的時間。低濃度的DNA(0.1mM)僅25%左右成凝膠,通過使DNA濃度升高到0.25mM而最初的凝膠的百分率升高,殘留的凝膠的百分率經時降低。另一方面,高濃度的DNA(0.5mM)時,最初的凝膠的百分率是大致100%,凝膠的百分率僅經時略微降低。由此確證,在鹽濃度一定的情況中,DNA濃度越高,越有易以凝膠(而非溶膠)的形態存在的傾向。

【(8-2)粘性突出末端的長度的調節】

使用有各種各樣的粘性突出末端的長度(4、6、8、10或12堿基)的四足DNA(分別SEQ?ID?NO:2、4、5、6、SEQ?ID?NO:18、19、20、21、SEQ?ID?NO:22、23、24、25、SEQ?ID?NO:26、27、28、29、SEQ?ID?NO:30、31、32、33)在一定DNA濃度(0.5mM)及一定NaCl濃度(150mM)的條件下形成凝膠,經時測定殘留的凝膠的百分率。結果示于圖17之左下的坐標圖。橫軸示經過的時間。粘性突出末端的長度短(4堿基)時,經時凝膠溶膠化,經過12小時后殘留凝膠的百分率成大致50%。另一方面,粘性突出末端的長度長(6、8、10或12堿基)時,最初的凝膠的百分率大致是100%,殘留凝膠的百分率僅經時略微降低。由此確證,在DNA濃度、鹽濃度一定的情況中,粘性突出末端的長度越長,越有易以凝膠(而非溶膠)的形態存在的傾向。

【(8-3)鹽濃度的調節-1】

通過改變以0.5mM的DNA濃度含四足DNA(12-14-14)(SEQID?NO:30、31、32、33)的水溶液的NaCl濃度(5mM、50mM、100mM或150mM)、形成凝膠,經時測定殘留的凝膠的百分率。結果示于圖17之右上的坐標圖。橫軸示經過的時間。在低鹽濃度(5mM),經過約6小時則形成的凝膠的絕大部分溶膠化,將鹽濃度升高到50mM,則溶膠化的傾向弱,更穩定地從凝膠向溶膠變化(經過12小時約40%)。另一方面,在高鹽濃度(100mM或150mM),最初的凝膠的百分率是大致100%,殘留凝膠的百分率僅經時略微降低。由此確證,在DNA濃度一定的情況中,鹽濃度越高的,越有易以凝膠(而非溶膠)的形態存在的傾向。

【(8-4)鹽濃度的調節-2】

除了代替四足DNA(12-14-14)(SEQ?ID?NO:30、31、32、33)使用四足DNA(4-18-18)(SEQ?ID?NO:2、4、5、6)之外,與(8-3)同樣經時測定殘留的凝膠的百分率。結果示于圖17之右下的坐標圖。橫軸示經過的時間。與(8-3)同樣地確證,在DNA濃度一定的情況中,鹽濃度越高,越有易以凝膠(而非溶膠)的形態存在的傾向。另外確證,相對于(8-3)中四足DNA(12-14-14)(粘性突出末端的長度是12堿基),在(8-4)中使用四足DNA(4-18-18)(粘性突出末端的長度4堿基),將這些進行比較,則當DNA濃度及鹽濃度相同時,粘性突出末端的長度越長,越有易以凝膠(而非溶膠)的形態存在的傾向。

由這些確證,當使其他條件一定時,DNA濃度越高,鹽濃度越高,粘性突出末端的長度越長,越有易以凝膠(而非溶膠)的形態存在的傾向。即確證,通過適宜調節DNA濃度、鹽濃度、及粘性突出末端的長度,可控制凝膠之內部結構、凝膠化的程度、及凝膠強度。

【實施例9】

【通過凝膠之內部結構、凝膠化的程度及凝膠強度的控制來控制凝膠之內封化合物的釋放速度】

由四足DNA的突出末端的性質和鹽濃度的控制,研究了凝膠之內封化合物的釋放速度如何變化。具體而言,使用有粘性突出末端的四足DNA(4-18-18)(SEQ?ID?NO:2、4、5、6)及作為對照有非粘性突出末端的四足DNA(4-18-18)(SEQ?ID?NO:58、59、60、61)。將這些四足DNA制備至達到0.5mM的DNA濃度的水溶液的NaCl濃度調節為5mM或150mM。在升高NaCl濃度之時,作為內封物質加卵清蛋白(OVA、濃度2.5μg/μl),凝膠化之后,經時測定從凝膠釋放的OVA的百分率。結果示于圖18的坐標圖。在對照的有非粘性突出末端的四足DNA中,幾乎見不到凝膠化,從最初OVA大致100%釋放。另一方面,從以NaCl濃度5mM使用有粘性突出末端的四足DNA制成的凝膠OVA急速釋放而在短時間內全部的OVA釋放。與此相比,從以NaCl濃度150mM使用有粘性突出末端的四足DNA制成的凝膠OVA緩慢釋放,經24小時釋放約60%的OVA。

因此確證,通過適宜控制突出末端的性質和鹽濃度,可調節凝膠之內部結構、凝膠化的程度及凝膠強度,結果可控制內封物質的釋放速度。另外示,在活體中的鹽濃度(150mM)內封物質緩慢地釋放,通過在活體內形成本發明的凝膠,藥劑的釋放控制(緩慢釋放性的達成)變得可能。

【實施例10】

【有修飾基的核酸的利用】

為了研究有修飾基的核酸的利用可能性,制備使用由膽甾醇修飾的DNA的四足DNA。如圖19所示,將含有含膽甾醇修飾的核酸單體,并且,核酸中含CpG基序的四足DNA(SEQ?ID?NO:2、4、5、6:圖19中示為Chol-CpG?DNA)或未膽甾醇修飾的同樣的四足DNA(SEQ?ID?NO:2、4、5、6:圖19中,示為CpG?DNA)的溶液涂布于特應性皮膚炎模型小鼠。另外,測定由RAW264.7細胞的各自的四足DNA的攝取。如圖19之右下所示,有膽甾醇修飾的四足DNA與無膽甾醇修飾的對照的四足DNA相比,組織遷移性增大,小鼠的皮膚的炎癥被更好地抑制。另外,如圖19之左下的坐標圖所示,有膽甾醇修飾的四足DNA與無膽甾醇修飾的對照的四足DNA相比,更良好地被攝入RAW264.7細胞。

由此確證,通過有膽甾醇等的修飾基的核酸單體的使用,可改變-升高凝膠的特性。

【實施例11】

【由溶膠的鼻腔內施用的凝膠的形成】

將以總DNA濃度2mM含四足DNA(A)(12-14-14)(SEQ?ID?NO:34、35、36、37)、含150mM的NaCl的溶膠狀水溶液和以總DNA濃度2mM含四足DNA(B)(12-14-14)(SEQ?ID?NO:38、39、40、41)、含150mM的NaCl的溶膠狀水溶液同時施用到小鼠的鼻腔內。結果示于圖20。通過施用到鼻腔內確證,鹽濃度升高,溶膠狀水溶液凝膠化,凝膠良好地附著在鼻腔內。

【實施例12】

【形成凝膠的鹽濃度及核酸濃度條件的檢查】

由以上知,對于是否形成凝膠而言,DNA濃度、鹽濃度及粘性突出末端的長度(堿基數接下來表示為X)是重要的因子。從而,試著更詳細地評價凝膠的形成條件。

具體而言,如表4的行所示改變含三足DNA(4-18-18)(X=4)(SEQ?ID?NO:1、2、3)、四足DNA(4-18-18)(X=4)(SEQ?ID?NO:2、4、5、6)、六足DNA(4-18-18)(X=4)(SEQ?ID?NO:2、3、4、7、9、10)及四足DNA(8-16-16)(X=8)(SEQ?ID?NO:22、23、24、25)的水溶液的DNA濃度,另外,如表4的列所示改變NaCl濃度,在各種DNA濃度和NaCl濃度中,評價是否形成凝膠。結果示于表4-1~4-4。以觀察到凝膠化時是○、觀察到溶液狀(溶膠狀)時是×顯示結果。

表4:各種DNA濃度和NaCl濃度中的凝膠化的評價

【表4-1】

三足DNA(4-18-18)X=4

【表4-2】

四足DNA(4-18-18)X=4

【表4-3】

六足DNA(4-18-18)X=4

【表4-4】

四足DNA(8-16-16)X=8

以表4-1~4-4可以看出,三足DNA的情況比四足DNA或六足DNA,有難凝膠化的傾向,粘性突出末端的堿基數X大時,有更易凝膠化的傾向。從表4-1~4-4的結果將此傾向綜合為數式,則如下:

(1)作為溶膠維持的條件:作為X的函數,

NaCl濃度=80mM/x以下,并且

DNA濃度=0.3mM+1.6/xmM以下

(2)作為凝膠維持的條件:作為X的函數,

NaCl濃度=640mM/x-60mM以上、并且

DNA濃度=3.2/xmM以上。

即,通過將滿足(1)的條件的溶膠狀溶液的DNA濃度及NaCl濃度分別升高至滿足(2)的條件,認為發生凝膠化。

【實施例13】

【形成凝膠的溫度條件的檢查】

再檢查凝膠化也與溫度條件相關的可能性。使用四足DNA(4-18-18)(SEQ?ID?NO:2、4、5、6)、六足DNA(4-18-18)(SEQ?ID?NO:2、3、4、7、9、10)、及四足DNA(8-16-16)(SEQ?ID?NO:22、23、24、25),將NaCl濃度固定于150mM,變更DNA濃度為各濃度,研究在何溫度條件下作為凝膠存在,或作為溶膠存在。

將結果示于以下的表5。

【表5】

四足DNA(4-18-18)

DNA濃度 0.4-0.5mM 在45℃以下凝膠 在55℃以上溶膠 DNA濃度 0.6-0.8mM 在55℃以下凝膠 在65℃以上溶膠

六足DNA(4-18-18)

DNA濃度 0.3-0.8mM 在55℃以下凝膠 在65℃以上溶膠 DNA濃度 1.0mM 在65℃以下凝膠 在75℃以上溶膠

四足DNA(8-16-16)

DNA濃度 0.5mM 在55℃以下凝膠 在75℃以上溶膠

從以上確證,在任何情況中,溫度變高,則溶膠化,越高DNA濃度越容易凝膠化,X的長度越長,越有易凝膠化的傾向。

【實施例14】

【與使用連接酶制備的凝膠的特性的比較】

【(14-1)不使用連接酶的DNA水凝膠的制備】

將表1所示的四足DNA(8-16-16)-1-01~04用含1.5MNaCl的TE緩沖液(10mMTris-HCl、1mMEDTA、pH8)溶解,制備為各ODN的終濃度達到0.5mM。將各ODN混合物加熱至95℃后,緩慢地冷卻而得到DNA水凝膠。

【(14-2)使用連接酶的DNA水凝膠的制備】

將以下的表6所示的P-四足DNA(4-18-18)-1-01~04(表1中的序列的5’末端帶磷酸基的)用含50mMNaCl的TE緩沖液(10mMTris-HCl、1mMEDTA、pH8)溶解,制備成各ODN的終濃度為0.75mM。將各ODN混合物加熱至95℃后,通過緩慢地冷卻得到P-四足DNA。向生成物加T4DNA連接酶(200單位;Promega、WI、USA)和連接緩沖液(300mMTris-HCl、100mMMgCl2、100mMDTT、10mMATP),于16℃反應16小時而得到DNA水凝膠(使用連接酶)。

【表6】

/5Phos/表示5’末端的磷酸基。

【(14-3)凝膠粘彈性的測定】

將得到的凝膠或溶劑放入管中,設置到凝膠粘彈性測定器(株式會社中山電機制)中。將測定棒降低至凝膠的上端,其后,經時測定將測定棒500μm降低之時的荷重值(重量)。

結果示于圖22。圖中的峰值是對應于凝膠的凝固的參數。在相同的DNA濃度條件下,使用自身凝膠化核酸制備的DNA水凝膠示更高的值(約1600mg和約400mg)。得知不使用連接酶的自身凝膠化核酸相比使用連接酶制備的DNA水凝膠更強固。另外,圖22中的緩和曲線的斜率是對應于凝膠的粘彈性的參數。得知使用自身凝膠化核酸制備的DNA水凝膠更緩,粘彈性優良。使用連接酶制備的DNA水凝膠脆。

【實施例15】

【有3~12個足的多足DNA制備物的PAGE分析】

使用表1中的序列,通過與實施例1同樣的方法,制備ssDNA、dsDNA及各多足DNA制備物,以200V在6%聚丙烯酸類樹脂酰胺凝膠上將各自電泳20分鐘。

結果示于圖23。將圖23A及B中的各泳道與電泳物的對應示于以下的表7。

【表7】

圖23A ? 泳道1 100bp?DNA階梯 泳道2 ssDNA36 泳道3 dsDNA36 泳道4 三足DNA36 泳道5 四足DNA36 泳道6 五足DNA36 泳道7 六足DNA36 泳道8 八足DNA36 泳道9 十二足DNA36

圖23B ? 泳道1 100bp?DNA階梯 泳道2 三足DNA30 泳道3 三足DNA60 泳道4 三足DNA90 泳道5 三足DNA80 泳道6 四足DNA60 泳道7 五足DNA48 泳道8 六足DNA40

如圖23A所示,在三足DNA36、四足DNA36、五足DNA36、六足DNA36、及八足DNA36中觀察到主要的單一的條帶。因此知,多足樣結構以高的效率形成。另一方面,對于十二足DNA36而言,不形成主要的條帶。十二足DNA熱穩定性低,在8個足和12個足之間認為有臨界點。另外,足數增加則電泳度降低。

圖23B的泳道2~5示對含30、60、或者90核苷酸的三足DNA的PAGE分析。當三足DNA中的ODN長增加時電泳度變高。電泳度隨多足DNA制備物中的堿基數而變。含240堿基的各種多足DNA的電泳度(圖23B、泳道6~8)是大致相同的。因此認為,電泳度依賴于核苷酸數,不依賴于立體結構。

【實施例16】

【CD光譜(圓二色性光譜)】

使用表1中的序列,通過與實施例1同樣的方法,制備dsDNA36、A36、(CG)6、及各多足DNA制備物。用含有5mM氯化鈉的TE緩沖液將退火后的各DNA樣品稀釋至最終DNA濃度25μg/ml。然后,于25℃使用0.1cm途徑長的石英池,于4℃使用JASCO-820型分光偏光計(JASCO、東京、日本)記錄DNA的CD光譜(圓二色性光譜)。DNA的CD光譜(圓二色性光譜)在200nm~320nm的范圍測量。為了促進比較,對CD光譜(圓二色性光譜)進行背景除去、平滑化、及濃度調節,以得到摩爾橢圓率。

結果示于圖24。在dsDNA36的情況中,在280nm及240nm近邊分別觀察到陽性及陰性峰。這是B型DNA的典型光譜。全部的多足DNA與dsDNA36示同樣的峰(圖24A)。在圖24B(CG)6的光譜是Z型DNA的典型。六足DNA36示與這不同的峰。從這些得知,各多足DNA取作為在雙鏈DNA的通常條件下的結構的B型DNA結構。

【實施例17】

【Tm值及表觀尺寸】

使用表1中的序列,通過與實施例1同樣的方法,制備各DNA制備物。使用具備TMSPC-8溫度調節器18的島津UV-1600PC分光計(京都、日本),在260nm處測量多足DNA或其他DNA制備物的吸光度。從在5mM的鈉濃度的融解曲線,求出對各自的融解溫度(Tm)。

另外,在20℃使用MalvernZetasizer3000HS(MalvernInstruments、Malvern、UK)由動態光散射法,測定各自的多足DNA的表現尺寸。將測量至少重復3次,將結果以可再現的結果的平均±標準誤差(S.E.)表示。尺寸的結果以3個(三足DNA36、四足DNA36、五足DNA36、六足DNA36、三足DNA80、四足DNA60、五足DNA48、六足DNA40)或6個(八足DNA36、三足DNA60、三足DNA90)的測量的平均±SE表示。

各自的結果示于表8。

【表8】

DNA制備物 Tm(℃) 尺寸(nm) dsDNA36 66.5 N.D. 三足DNA36 54.6 6.16±0.04 四足DNA36 50.8 7.39±0.15a 五足DNA36 47.9 7.68±0.06a 六足DNA36 44.8 8.16±0.08a 八足DNA36 43.9 8.33±0.42a 三足DNA30 46.5 N.D. 三足DNA60 61.2 8.87±0.13b 三足DNA80 64.9 10.7±0.2d,e,f 三足DNA90 68.3 12.1±0.4 四足DNA60 59.8 9.14±0.17c,f 五足DNA48 53.2 8.48±0.31c,f 六足DNA40 48.5 6.47±0.30c,d,e

a?P<0.05三足DNA36;

b?P<0.05三足DNA90;

c?P<0.05三足DNA80;

d?P<0.05四足DNA60;

e?P<0.05五足DNA48;

f?P<0.05六足DNA40;

N.D.:不可檢測

如表8所示,dsDNA36的Tm值相比使用36聚體的ODN的其他制備物更高。知Tm值是足數的函數,足數增加,則Tm值下降。另外知,三足DNA制備物的Tm值依賴于ODN長,三足DNA90示最大的Tm值。

另外知,如表8所示,ODN長增加到30~90,則三足DNA制備物的表觀尺寸增加。有240個堿基的多足DNA(三足DNA80、四足DNA60、五足DNA48、六足DNA40)的尺寸也依賴于ODN長。對于包括36聚體的ODN的多足DNA制備物而言,足數增加,則其尺寸略微增加。這推測是由于,在足數多的制備物中,堿基堆疊(stacking)減少,結構膨脹。

【實施例18】

【血清中的多足DNA的穩定性】

使用表1中的序列,通過與實施例1同樣的方法,制備各多足DNA制備物。于37℃以10μg/100μl的濃度,將各多足DNA制備物與用RPMI1640培養基稀釋的20%小鼠血清溫育。溫育的0、2、4、8、12或24小時后,將樣品溶液的10μl等份移到塑料管,與20μl的0.5MEDTA溶液混合而停止分解,于-20℃保存直到使用。將這些的樣品于4℃在12%PAGE中電泳,用SYBRGold(MolecularProbes、Eugene、OR、SA)染色。使用MultiGaugesoftware(富士膜、東京、日本)定量評價DNA條帶的密度。

結果示于圖25A~D。這些的實驗進行3次,得到同樣的結果。圖25A及C是1個代表性的凝膠。如圖25A及B所示,三足DNA的足長越長,分解率越高。另外,如圖25C及D所示,足數越多,在小鼠血清中的穩定性越低。這被推測為,由于DNA在體液中主要被外切核酸酶分解,足數多末端數多則DNA易分解。

【實施例19】

【向局部淋巴節的DNA水凝膠的遷移】

將表1中的六足DNA(8-16-16)-2-01用32P末端標記。即,使用T4多核苷酸激酶(T4PNK;寶生物、大津、日本),于37℃、使ODN與γ-32PATP反應30分鐘,于80℃加熱12分鐘而使T4PNK變性。使用NAP5柱(GE?HEALTHCARE、東京、日本)將標記產物純化。使用痕量的32P-六足DNA(8-16-16)-2-01及以下的表9所示的其他ODN制備32P-標記樣品。

【表9】

將各自的32P-DNA樣品以10mg/kg的施用量注入4周齡雄ICR小鼠的背面皮膚。自注入起指定間隔后,將小鼠用異氟烷麻醉,將背面皮膚以及鼠徑及腋窩淋巴節分別從注入部位及局部淋巴節采集。將各自的樣品放入含有700μl的Soluene-350(PerkinElmer日本株式會社、神奈川、日本)的20ml聚丙烯閃爍瓶,于60℃溫育一晚而消化。向該瓶連續地添加2-丙醇(200μl)及過氧化氫(200μl、30%w/v;三德化學工業株式會社、東京、日本)。將樣品于室溫放置至泡沫消失。

接下來,向樣品添加100μl的5M氯化氫溶液及5ml的Clear-solI(Nacalai?tesque株式會社、京都、日本)。將樣品的放射線用Tri-Carb3110TR液體閃爍分光計(PerkinElmer、Norwalk、CT、USA)計數。將結果作為每樣品的放射線的注入量的百分率計算,以3只小鼠的平均±S.D.表示。

結果示于圖26。如圖26所示,DNA水凝膠相比六足DNA或ssDNA更長地留在注入部位,經長期間遷移到局部淋巴節。這證實DNA水凝膠的緩慢釋放性高。

【實施例20】

【DNA水凝膠的崩解、從DNA水凝膠的DXR釋放、及小鼠中的腫瘤增殖】

使用表1所示的ODN(六足DNA(8-16-16)-2-01~06、及六足DNA(8-16-16)-3-01~06),與實施例1同樣地制備DNA水凝膠。

為了制備多柔比星(DXR)/DNA水凝膠,在Mili-Q水中將DXR添加到注射器,將2個六足DNA制備物連續地添加到DXR。在室溫溫育1小時之后,將混合物作為DXR/DNA水凝膠使用。將DXR及DNA的混合率固定于1:40重量率。

向DXR/DNA水凝膠(300μg/10μl)添加10μl生理鹽水或20%小鼠血清,于37℃溫育。經過指定的時間后,采集樣品。以2000×g離心分離5秒鐘之后,采集上清,用分光光度計(UV-1600、島津、日本)及多標記計數器(ARVOTMM×1420、Wallac、Finland),以分別485及560nm的激發及發光波長,測定DNA的吸光度及DXR的熒光,分別推定DNA及DXR的濃度。

將結果示于圖27之左上圖及左下圖。DNA水凝膠,相比在生理鹽水中,在小鼠血清中更快速地分解(圖27左上)。另外,DNA水凝膠中DXR在小鼠血清中相比生理鹽水釋放更多(圖27左下)。

使用表1所示的ODN(六足DNA(8-16-16)-2-01~06、及六足DNA(8-16-16)-3-01~06),與實施例1同樣地制備水凝膠,如同上述制備DXR/DNA水凝膠。另一方面,將結腸26/Luc細胞(5×105細胞/小鼠)接種到BALB/c小鼠的背面皮膚。然后,腫瘤接種9天后,將生理鹽水、DXR(7.5μg/小鼠)、DNA水凝膠(300μg/小鼠)、或者DXR/DNA水凝膠(7.5μgDXR及300μgDNA/小鼠)注入小鼠的腫瘤內。使用彎腳規定期測定腫瘤尺寸。

結果示于圖27之右圖。DXR通過含在DNA水凝膠中而示高的腫瘤增殖抑制能力(圖27之右圖)。

【實施例21】

【IL-6誘導】

表1所示的序列之中,使用以下的表10的ODN,制備DNA樣品。

【表10】

將小鼠樹狀DC2.4細胞以5×104細胞/孔的密度接種于96孔培養板,5%CO2中,于37℃溫育一晚。以表示的濃度將DNA樣品添加到細胞,將細胞溫育16小時。

接下來,采集上清,于-80℃保存直至測量。根據生產商的流程(BDBiosciences、SanDiego、CA、USA),用酶聯免疫測定法(ELISA)測定IL-6的濃度。

結果示于圖28。如圖28所示,水凝膠的狀態的CpGDNA相比單鏈或六足DNA的CpGDNA示更高的免疫刺激性。

【實施例22】

【由DNA制備物從RAW264.7細胞的細胞因子釋放】

使用表1中的序列,通過與實施例1同樣的方法制備各樣品。

在添加10%加熱失活的FBS、0.15%碳酸氫鈉、100單位/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素、及2mML-谷氨酰胺的RPMI1640培養基中,含有5%CO2的加濕空氣中,于37℃增殖鼠巨噬細胞樣細胞RAW264.7。接下來,向24孔或96孔培養板上以5×105細胞s/ml的密度接種細胞,在使用之前培養24小時。

以2.5×105細胞/孔的密度將RAW264.7細胞接種于24孔板,處置前溫育24小時。然后,將在0.5mlOpti-MEM中稀釋的ssDNA、dsDNA、或者數種多足DNA以0.5、1或2μg/ml的最終濃度添加到細胞。將細胞溫育8小時,回收上清,于-70℃保存至使用。通過使用OptEIATM組(Pharmingen、SanDiego、CA、USA)的酶聯免疫吸附測定法(ELISA)測定上清中的TNF-α及IL-6的濃度。

將結果以3個測定的平均±SD表示,示于圖29。數據是4個(TNF-α)或2個(IL-6)的獨立的實驗的代表。圖中的*表示值低于檢測限界。在ssDNA、dsDNA的情況中,幾乎無TNF-α釋放。對此,多足DNA制備物DNA的濃度依賴性地誘導從RAW264.7細胞的細胞因子釋放(圖29A)。另外知,pod數多則TNF-α釋放量增加。同樣的結果也示于對IL-6釋放的圖29B。因此知,多足DNA制備物是,pod數越多,CpGDNA的免疫刺激活性越高。

【實施例23】

【由多足DNA制備物的從RAW264.7細胞的TNF-α釋放】

除了使用表1中的序列,通過與實施例1同樣的方法,制備各多足DNA制備物之外,進行與實施例22同樣的實驗。但是,使添加的DNA在各自的情況中是等量。

將結果作為3個測定的平均±SD示于圖30。數據是4個(圖30A)或3個(圖30B)獨立的實驗的代表。圖中的*表示值低于檢測限界。如圖30A所示,在三足DNA中,核苷酸數增加,則TNF-α釋放也增加。另外,如圖30B所示,在包括240個核苷酸的多足DNA制備物之中,六足DNA40示最高的TNF-α釋放。從這些知,增大足數對于增大CpGDNA的免疫刺激活性有效。

【實施例24-1】

【RAW264.7細胞中的DNA的攝取】

使用表1中的序列,前述的材料及方法、以及通過與實施例1同樣的方法,制備AlexaFluor488-標記DNA樣品。在96孔板上,以5×104細胞/孔的密度,將RAW264.7細胞與AlexaFluor488-標記ssDNA、dsDNA、或者多足DNA一同于37或4℃溫育8小時。其后,用200μl磷酸緩沖生理鹽水(PBS)將細胞清洗二次而采集。然后,使用CellQuest軟件(version3.1、BDBiosciences),通過流式細胞術(FACSCalibur、BDBiosciences、NJ、USA)測定細胞的平均熒光強度(MFI)。

將結果示于圖31A。平均熒光強度從高到低為八足DNA、六足DNA、五足DNA、四足DNA、三足DNA的順序,細胞釋放與細胞因子釋放的情況是相同傾向。因此知,pod數增加,則細胞因子誘導增加。

【實施例24-2】

【DNA攝取的熒光顯微鏡觀察】

將RAW264.7細胞接種到13mm直徑玻璃蓋玻片上,溫育24小時。將培養基用含有AlexaFluor488-標記六足DNA36的Opti-MEM取代。在37℃的3小時的溫育之后,將細胞用PBS清洗3次,用4%多聚甲醛固定20分鐘,再用PBS清洗3次。然后,為了染色核,加60nM的4’,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI),10分鐘的溫育之后,用PBS清洗3次。然后,將蓋玻片用SlowFade(注冊商標)Gold(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)加載到玻璃載玻片上,使用熒光顯微鏡(BiozeroBZ-8000、KEYENCE、大阪、日本)觀察。

結果示于圖31B~E。圖中,B示DAPI染色、C示AlexaFluor488-標記六足DNA36、D示重合圖像、E示明視野。如圖31B~E所示,熒光信號在細胞內被檢測為點狀。因此提示,細胞攝取由胞吞進行。

【實施例25】

【TLR9依賴性的活化】

表1的序列之中,使用SEQ?ID?NO:86~95的序列,通過與實施例1同樣的方法,制備DNA樣品。

接下來,如同文獻(Blood、2000;96:3029-39)記載,從8~10周齡雄C57BL/6小鼠、及有C57BL/6的遺傳背景的TLR9敲除小鼠(TLR9-/-)造出骨髓來源樹突細胞(BMDC)。即,使用26號針用RPMI沖洗大腿骨及脛骨,單離骨髓細胞。通的40μm細胞過濾器(BDFalcon、FranklinLakes、NJ、USA)過濾之后,將骨髓細胞再懸浮于5分鐘0.86%氯化銨中,溶解紅細胞。

其后,向補充10%加熱失活的FBS、0.2%碳酸氫鈉、100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、2mML-谷氨酰胺、0.5mM單硫代甘油、及100ng/ml小鼠重組Flt-3配體(Peprotech、RockyHill、NJ、USA)的RPMI,以5×106細胞/ml的密度、將殘留細胞培養8天。在含有5%CO2的加濕空氣中,于37℃增殖細胞。在培養的第7天、采集非粘接性細胞,將其作為BMDC使用。為了細胞因子釋放實驗,將細胞以3×105細胞/孔的密度再平鋪于96孔培養板上。將細胞與2μg/ml的ssDNA(三足DNA(0-18-18)-1-02)或多足DNA一同溫育24小時。其后,采集培養上清,于-80℃保存至用于酶聯免疫測定法(ELISA)。使用OptEIATM組(Pharmingen、SanDiego、CA、USA)測定小鼠IL-6的濃度。

結果示于圖32。知通過用含CpG的多足DNA制備的水凝膠的IL-6釋放是TLR9依賴性的。

【實施例26】

【單核細胞依賴性的多足DNA攝取】

表1的序列之中,使用SEQ?ID?NO:96~104的序列,通過與實施例1同樣的方法,制備DNA樣品。

通過Ficoll-PaquePLUS(GEhealthcare、Piscataway、NJ、USA)密度梯度離心分離,根據生產商的流程,從健康自愿者的末梢血單離人末梢血單核細胞(PBMC)。將采集的PBMC以6×105細胞/孔的密度再平鋪于48孔培養板上,用于細胞因子釋放實驗。在96孔培養板上,將6×105細胞/孔的濃度的PBMC與2μg/ml的AlexaFluor488-標記多足DNA制備物一同溫育4小時。其后,將細胞使用200μl磷酸緩沖生理鹽水清洗二次而采集。然后,將細胞的熒光強度使用CellQuest軟件(version3.1、BDBiosciences),通過流式細胞術(FACSCalibur、BDBiosciences、FranklinLakes、NJ、USA)分析。為了PBMC的調查,基于前方散射(FSC)及側方散射(SSC)特性(ClinChem、1998;44:966-72.)對細胞選通。其后,測定富含單核細胞的區域1及富含淋巴細胞的區域2中的細胞的MFI。

結果示于圖33。知由單核細胞進行多足DNA的攝取。

【實施例27】

【IL-6mRNA表達的誘導】

表1中的序列之中,使用以下的表11所示的ODN,通過與實施例1同樣的方法,制備各DNA樣品。

【表11】

在異氟烷的麻醉下,向C57BL/6小鼠的背面皮膚以200μg/小鼠的施用量注入各自的DNA樣品。在注入后的指定間隔中,將小鼠用異氟烷麻醉,然后,將背面皮膚以及鼠徑及腋窩淋巴節分別作為注入部位及局部淋巴節而采集。使用RNeasyminikit(QIAGENGmbH、Hilden、Germany),根據生產商的流程提取皮膚樣品的總RNA。使用SepasolRNAIsuper(Nacalai?tesque)提取淋巴節的總RNA。使用ReverTraAce(注冊商標)qPCRRTKit(TOYOBO、大阪、日本)逆轉錄提取的RNA。為了進行mRNA表達的定量的分析,使用KAPASYBRFASTABIPrism2×qPCRMasterMix(KAPABIOSYSTEMS、Boston、MA、USA)對總RNA進行RT-PCR。擴增中使用的ODN引物如以下的表12所示。使用StepOnePlusRealTimePCRSystem(AppliedBiosystems、FosterCity、CA、USA),經作為熒光染料的SYBRGREEN的嵌入,在線檢測擴增產物。將IL-6mRNA表達用β-肌動蛋白的mRNA水平標準化。

【表12】

將結果示于圖34。知CpG水凝膠持續強誘導IL-6mRNA的表達。

【實施例28】

【由OVA/CpGDNA水凝膠的適應免疫反應的誘導】

【(28-1)血清樣品的采集】

使用表1的序列,通過與實施例1同樣的方法,制備DNA樣品。在異氟烷的麻醉下、將含有200μgDNA樣品及50μgOVA(10μl/施用)、或者50μgOVA(20μl/施用)的完全弗氏佐劑(CFA)注入C57BL/6小鼠的背面皮膚。在第0、7、及14天給小鼠免疫3次。最后的免疫施加的7天后,處死小鼠,采集血清及脾臟。于-80℃保存至測量血清樣品。

【(28-2)OVA-特異性IgG】

為了由ELISA測定OVA特異性總IgG水平,連續地稀釋血清樣品。即,于4℃將96孔平底板用OVA(1mg/ml)包被8~16小時。然后,用含有5%BSA的磷酸緩沖生理鹽水(T-PBS)中的0.5w/w%吐溫-20阻斷孔。在T-PBS清洗之后,將稀釋的100μl血清樣品連續地添加到各孔中。在37℃溫育2小時之后,用T-PBS將孔清洗5次,然后,將用含有5%BSA-的T-PBS以3000:1稀釋的100μl的抗-IgG-HRP綴合物(Sigma、St.Louis、MO、USA)添加到各自的孔中。在37℃的1小時的溫育之后,將各自的孔用T-PBS清洗,其后,將含有檸檬酸磷酸鹽緩沖液(pH5)中的20μl過氧化氫的200μl的新制備的o-苯二胺二鹽酸鹽(和光純藥工業株式會社、大阪、日本)溶液添加到各自的孔中。溫育的4分鐘后,添加50μl的1M硫酸,其后,測定在490nm處的吸光度。

結果示于圖35之左圖。知處于水凝膠狀態時IgG效價升高。

【(28-3)來自脾臟細胞的IFN-γ】

最后的免疫施加的7天后,通過機械解剖將脾臟細胞單離。將混入的紅細胞用1.5M氯化銨溶解。在OVA(1mg/ml)的存在下,以5×106細胞/ml的密度,在96孔培養板中將脾臟細胞培養4天。采集上清,于-80℃保存至測量。根據生產商的流程,由ELISA測定IFN-γ的濃度(Ready-SET-Go!小鼠IFN-γELISA、eBioscience、SanDiego、CA、USA)。

結果示于圖35之中央圖。知在處于水凝膠的狀態時,IFN-γ的濃度升高。

【(28-4)CTL測定】

最后的免疫施加的7天后,由機械解剖,單離脾臟細胞。用1.5M氯化銨溶解混入紅細胞。為了準備CTL,于37℃5%CO2中將脾細胞(5×107細胞)與用絲裂霉素C處理的5×106EG7-OVA細胞一同共培養5天。將目標細胞、即,EG7-OVA及EL4用51Cr-標記鉻酸鈉(Na251CrO4、富士膠卷RIPharma、東京、日本)標記。為追加的脾細胞連續地稀釋,于37℃與目標細胞一同共溫育4小時。從無效應子細胞(脾細胞),且有1%Triton-X的溫育,分別評價51Cr的自然釋放及最大釋放。將上清的放射線用γ計數器測定。根據以下的方程式計算特異性溶解的百分率:

特異性溶解的%=(觀察釋放-自然釋放)/(最大釋放-自然釋放)

結果示于圖35之右圖。知相比在單鏈的狀態或核酸單位(多足DNA)的狀態下使用,在水凝膠的情況中特異性溶解更高。

【實施例29】

【副作用】

使用表1的序列,通過與實施例1同樣的方法,制備DNA樣品。

在異氟烷的麻醉下、向C57BL/6小鼠的背面皮膚注入200μgDNA樣品及50μgOVA(10μl)、含有50μgOVA(10μl)的CFA、或者100μgAlum及50μgOVA(20μl)。注入的7天后,摘出含注入部位的皮膚,在4%多聚甲醛中固定,摻入石蠟中,5μm切片為薄切,用蘇木精及伊紅染色。為了對染色的樣品進行組織學評價,在顯微鏡(BiozeroBZ-8000、KEYENCE、大阪、日本)下觀察。在如上所述1周間隔的第三次的免疫施加的7天后,從不同的組的C57BL/6小鼠采集脾臟。測定脾臟的重量,評價脾腫。

結果示于圖36。如圖36之左圖所示,在水凝膠的情況中,向注入部位的免疫細胞的浸潤少,局部的副作用少。另外,如圖36之右圖所示,在水凝膠的情況中,脾臟的肥大化小,全身性的副作用也少。

【工業實用性】

在緩慢釋放劑、免疫增強劑、組織遷移性DNA等的各種用途中都可利用。由本發明的組合物制備的凝膠被認為,對于廣泛的物質(藥物、抗原、細胞)作為受控的釋放系統利用。另外,通過摻入以CpG基序為代表的免疫活化結構,也可賦予作為免疫佐劑的功能,可期待與抗癌劑或抗原蛋白質、免疫細胞的協同效果。另外認為,由于在溶膠(溶液)狀態的施用是可能的,也可作為噴霧劑開發,對于向鼻腔等的抗原施用也有用,可在必要免疫應答的控制的治療中廣泛利用。

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