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一種抗PEG苜蓿愈傷組織再分化的方法.pdf

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一種 PEG 苜蓿 組織 再分 方法
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摘要
申請專利號:

CN201610082224.0

申請日:

20160205

公開號:

CN105660404A

公開日:

20160615

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A01H4/00,A01H1/06 主分類號: A01H4/00,A01H1/06
申請人: 齊齊哈爾大學
發明人: 李波,賈秀峰,趙宇佳,徐婉玉,馬赫,陳雪梅
地址: 161006 黑龍江省齊齊哈爾市建華區文化大街42號
優先權: CN201610082224A
專利代理機構: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 代理人: 侯靜
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201610082224.0

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

一種抗PEG苜蓿愈傷組織再分化的方法,本發明屬于生物技術育種領域,它為了解決現有常規育種方法得到的苜蓿抗旱性較差,移栽成活率不高的問題。苜蓿愈傷組織再分化的方法:一、經NaN3誘變和PEG脅迫處理后的苜蓿愈傷組織置于MS固體培養基中繼代培養;二、塊狀愈傷組織接種到含有NAA和6-BA的芽分化MS培養基上進行培養,得到分化出芽的苜蓿組織;三、再將出芽的苜蓿組織放入生根培養基中培養,得到分化出根的苜蓿組織;四、苜蓿幼苗的馴化與移栽。本發明抗PEG苜蓿愈傷組織再分化的方法簡便易行,移栽成活率達到90%以上,并通過此愈傷組織再分化的方法獲得抗旱育種材料。

權利要求書

1.一種抗PEG苜蓿愈傷組織再分化的方法,其特征在于是通過下列步驟實現:一、將經NaN誘變和PEG脅迫處理后的苜蓿愈傷組織接種于MS固體培養基中,在23~25℃下培養,每日光照射12h,1000Lx光照強度,培養18~22d完成1次繼代,重復繼代培養多次,得到繼代培養后的愈傷組織;二、將步驟一得到的繼代培養后的愈傷組織分割成塊狀,然后接種到含有NAA和6-BA的芽分化MS培養基上,在溫度為23~25℃,每日光照射16h,2000~4000Lx光照度的條件下進行培養,得到分化出芽的苜蓿組織;三、將分化出芽的苜蓿組織在分芽處切斷成兩段,分段后移接到以1/2MS或MS為基本培養基的生根培養基上,在溫度為23~25℃,1000~2000Lx的光照度,每天光照16h的條件下在培養瓶中進行培養,得到分化出根的無菌苗;四、當分化出根的無菌苗長到2~3cm并有4~5條粗壯根系時,在培養室內將培養瓶口打開,進行2~5d的煉苗,然后挑選株高為4~5cm,并有4~5條粗壯根系的幼苗移栽到營養土中進行培養,完成抗PEG苜蓿愈傷組織的再分化;其中步驟二所述的芽分化MS培養基為MS+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+10g/L瓊脂;當步驟三所述的生根培養基以1/2MS為基本培養基時,生根培養基為1/2MS+0.15mg/LNAA+30g/L蔗糖+30g/L瓊脂+0.5g/L活性炭或1/2MS+0.05mg/LNAA+1.5mg/LIBA+30g/L蔗糖+10g/L瓊脂+0.5g/L活性炭;當步驟三所述的生根培養基以MS為基本培養基時,生根培養基中含有0.05~0.10mg/LNAA、1.0~1.5mg/LIBA、0~2mg/L6-BA、30g/L蔗糖、30g/L瓊脂、0.5g/L的活性炭和15ml鐵鹽母液,其中所述的鐵鹽母液是將2~3gFeSO·7HO和3~4gNa-EDTA溶于1L去離子水中得到的。2.根據權利要求1所述的一種抗PEG苜蓿愈傷組織再分化的方法,其特征在于步驟一所述的經NaN誘變和PEG脅迫處理后的苜蓿愈傷組織按下列步驟實現:將苜蓿愈傷組織分割成塊狀,然后轉入含有濃度為200mg/LNaN的液體誘變培養基中進行振蕩培養,靜止1h后得到誘變后的愈傷組織,再將誘變后的愈傷組織轉入含有8mmol/L的L-Hyp和質量百分含量為30%PEG的含PEG的MS培養基中進行培養,存活的愈傷組織再轉入MS固體培養基中培養,依次在含PEG的MS培養基和MS固體培養基上培養進行交替篩選。3.根據權利要求1所述的一種抗PEG苜蓿愈傷組織再分化的方法,其特征在于步驟一所述的MS固體培養基為MS+0.5mg/L6-BA+2.0mg/L2,4-D+30g蔗糖+0.8%瓊脂,pH=5.8。4.根據權利要求1所述的一種抗PEG苜蓿愈傷組織再分化的方法,其特征在于步驟二繼代培養后的愈傷組織分割成0.5cm的塊狀。5.根據權利要求1所述的一種抗PEG苜蓿愈傷組織再分化的方法,其特征在于將步驟二得到的分化出芽的苜蓿組織再轉入壯芽培養基中進行培養,壯芽培養基為:MS+2.0mg/L6-BA+30g/L蔗糖+10g/L瓊脂。6.根據權利要求1所述的一種抗PEG苜蓿愈傷組織再分化的方法,其特征在于步驟三所述的鐵鹽母液是將2.78gFeSO·7HO和3.73gNa-EDTA溶于1L去離子水中得到的。7.根據權利要求6所述的一種抗PEG苜蓿愈傷組織再分化的方法,其特征在于步驟三的生根培養基為MS+1.5mg/LIBA+0.05mg/LNAA+2.00mg/L6-BA+15ml鐵鹽母液+30g/L蔗糖+10g/L瓊脂+0.5g/L活性炭。8.根據權利要求1所述的一種抗PEG苜蓿愈傷組織再分化的方法,其特征在于步驟三在溫度為23~25℃,2000~4000Lx的強光照度,每天光照16h的條件下在培養瓶中進行培養22~28d。9.根據權利要求1所述的一種抗PEG苜蓿愈傷組織再分化的方法,其特征在于步驟四幼苗移栽到營養土中在環境濕度為70%~80%的條件下進行培養。

說明書

技術領域

本發明屬于生物技術育種領域,具體涉及一種抗PEG苜蓿愈傷組織再分化的方法。

背景技術

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是世界上廣泛分布且享有盛譽的優良牧草,被稱為“牧草之王”,不僅能改良土壤,還可以增加優質蛋白質,是發展優質高效畜牧業的物質基礎,也是人類有益健康與保健的食用植物之一。

我國苜蓿產業的發展嚴重受到種質資源的限制,缺乏適應不同地區苜蓿品種的種子,為了滿足現代化畜牧業發展的需要,擴大苜蓿的種植面積,培育、繁殖適應不同生境條件不同使用目的的苜蓿品種,已成為發展我國苜蓿產業的主要問題之一。

中國苜蓿育種通常采用選擇育種、雜交育種、雄性不育系育種、生物技術輔助育種、航天育種等方法。各種方法均有應用,應用較多的是選擇育種和雜交育種。我國目前已選育出的苜蓿新品種均采用了常規育種技術和方法(引種選擇、鑒定篩選、雜交育種)。國內育成的品種都是采用傳統的常規育種技術和方法育成的,普遍采用的是引種馴化、人工選擇、雜交育種、誘變育種、鑒定篩選等育種方法,而細胞誘變、細胞融合、雜種胚培養等細胞工程現代生物技術在牧草育種中的應用幾乎還是空白。利用現代植物組織培養等生物技術選育出的品種尚未見報道。目前,我國登記的品種當中沒有單純應用生物技術育成的品種。較多的研究集中于抗性基因的轉化與基因表達,以提高苜蓿的抗性。選育適應干旱、嚴寒、沙化、鹽堿化等不同生態條件的苜蓿品種對保護生態環境、充分利用國土資源、滿足市場對草飼性畜產品的需求有重要的現實意義。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有常規育種方法得到的苜蓿抗旱性較差,移栽成活率不高的問題,而提供對干旱具有抗性的苜蓿愈傷組織再分化成芽和根的方法。

本發明抗PEG苜蓿愈傷組織再分化的方法按下列步驟實現:

一、將經NaN3誘變和PEG脅迫處理后的苜蓿愈傷組織(莖段為外植體)接種于MS固體培養基中,在23~25℃下培養,每日光照射12h,1000Lx光照強度,培養18~22d(天)完成1次繼代,重復繼代培養多次,得到繼代培養后的愈傷組織;

二、將步驟一得到的繼代培養后的愈傷組織分割成塊狀,然后接種到含有NAA和6-BA的芽分化MS培養基上,在溫度為23~25℃,每日光照射16h,2000~4000Lx光照度的條件下進行培養,得到分化出芽的苜蓿組織;

三、將分化出芽的苜蓿組織在分芽處切斷成兩段,分段后移接到以1/2MS或MS為基本培養基的生根培養基上,在溫度為23~25℃,1000~2000Lx的光照度,每天光照16h的條件下在培養瓶中進行培養,得到分化出根的無菌苗;

四、當分化出根的無菌苗長到2~3cm并有4~5條粗壯根系時,在培養室內將培養瓶口打開,進行2~5d的煉苗,然后挑選株高為4~5cm,并有4~5條粗壯根系的幼苗移栽到營養土中進行培養,完成抗PEG苜蓿愈傷組織的再分化;

其中步驟二所述的芽分化MS培養基為MS+2.0mg/L6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)+0.2mg/LNAA(萘乙酸)+30g/L蔗糖+10g/L瓊脂;

當步驟三所述的生根培養基以1/2MS為基本培養基時,生根培養基為1/2MS+0.15mg/LNAA+30g/L蔗糖+30g/L瓊脂+0.5g/L活性炭或1/2MS+0.05mg/LNAA+1.5mg/LIBA+30g/L蔗糖+10g/L瓊脂+0.5g/L活性炭;

當步驟三所述的生根培養基以MS為基本培養基時,生根培養基中含有0.05~0.10mg/LNAA、1.0~1.5mg/LIBA(吲哚丁酸)、0~2mg/L6-BA、30g/L蔗糖、30g/L瓊脂、0.5g/L的活性炭和15ml鐵鹽母液,其中所述的鐵鹽母液是將2~3gFeSO4·7H2O和3~4gNa2-EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)溶于1L去離子水中得到的。

本發明抗PEG苜蓿愈傷組織再分化的方法簡便易行,所使用的愈傷組織易獲得胚性愈傷組織,在篩選的芽和根的分化培養基上易成苗,移栽成活率高,不受季節的限制,且使用的化學誘變劑具有高效、無毒、便宜及使用安全等優點,可通過此方法獲得抗旱育種材料。研究和建立該種植物的愈傷組織誘導、分化培養和植株再生,對建立該種苜蓿植物完善的組培體系和苜蓿抗逆性育種基礎材料的獲得具有其現實意義。

附圖說明

圖1為實施例通過愈傷組織再分化得到的苜蓿苗的實物圖。

具體實施方式

具體實施方式一:本實施方式抗PEG苜蓿愈傷組織再分化的方法按下列步驟實現:

一、將經NaN3誘變和PEG脅迫處理后的苜蓿愈傷組織(莖段為外植體)接種于MS固體培養基中,在23~25℃下培養,每日光照射12h,1000Lx光照強度,培養18~22d(天)完成1次繼代,重復繼代培養多次,得到繼代培養后的愈傷組織;

二、將步驟一得到的繼代培養后的愈傷組織分割成塊狀,然后接種到含有NAA和6-BA的芽分化MS培養基上,在溫度為23~25℃,每日光照射16h,2000~4000Lx光照度的條件下進行培養,得到分化出芽的苜蓿組織;

三、將分化出芽的苜蓿組織在分芽處切斷成兩段,分段后移接到以1/2MS或MS為基本培養基的生根培養基上,在溫度為23~25℃,1000~2000Lx的光照度,每天光照16h的條件下在培養瓶中進行培養,得到分化出根的無菌苗;

四、當分化出根的無菌苗長到2~3cm并有4~5條粗壯根系時,在培養室內將培養瓶口打開,進行2~5d的煉苗,然后挑選株高為4~5cm,并有4~5條粗壯根系的幼苗移栽到營養土中進行培養,完成抗PEG苜蓿愈傷組織的再分化;

其中步驟二所述的芽分化MS培養基為MS+2.0mg/L6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)+0.2mg/LNAA(萘乙酸)+30g/L蔗糖+10g/L瓊脂;

當步驟三所述的生根培養基以1/2MS為基本培養基時,生根培養基為1/2MS+0.15mg/LNAA+30g/L蔗糖+30g/L瓊脂+0.5g/L活性炭或1/2MS+0.05mg/LNAA+1.5mg/LIBA+30g/L蔗糖+10g/L瓊脂+0.5g/L活性炭;

當步驟三所述的生根培養基以MS為基本培養基時,生根培養基中含有0.05~0.10mg/LNAA、1.0~1.5mg/LIBA(吲哚丁酸)、0~2mg/L6-BA、30g/L蔗糖、30g/L瓊脂、0.5g/L的活性炭和15ml鐵鹽母液,其中所述的鐵鹽母液是將2~3gFeSO4·7H2O和3~4gNa2-EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)溶于1L去離子水中得到的。

本實施方式步驟一為愈傷組織的繼代培養過程,步驟二進行愈傷組織芽的分化,步驟三進行愈傷組織根的分化,最后進行幼苗的馴化與移栽。

本實施方式利用植物組織培養技術對苜蓿莖段進行愈傷組織的誘導、疊氮化鈉化學誘變和PEG-6000滲透模擬干旱脅迫,獲得抗PEG的苜蓿愈傷組織。愈傷組織的分化是指愈傷組織在外界條件滿足時,細胞再分化形成芽和根的分生組織,并由其發育成完整植株的過程。苜蓿愈傷組織的分化是建立苜蓿再生體系關鍵的一步。愈傷組織在多次繼代培養、誘變處理、逆境脅迫處理后嚴重影響其再分化的能力,在適宜的離體培養條件下,通過外源激素的誘導,紫花苜蓿愈傷組織可以分化形成再生苗,通過組合試驗設計,篩選出適宜的芽和根分化外源激素組合。

具體實施方式二:本實施方式與具體實施方式一不同的是步驟一所述的經NaN3誘變和PEG脅迫處理后的苜蓿愈傷組織按下列步驟實現:將苜蓿愈傷組織分割成塊狀,然后轉入含有濃度為200mg/LNaN3的液體誘變培養基中進行振蕩培養,靜止1h后得到誘變后的愈傷組織,再將誘變后的愈傷組織轉入含有8mmol/L的L-Hyp(L-羥脯氨酸)和質量百分含量為30%PEG的含PEG的MS培養基中進行培養,存活的愈傷組織再轉入MS固體培養基中培養,依次在含PEG的MS培養基和MS固體培養基上培養進行交替篩選。其它步驟及參數與具體實施方式一相同。

具體實施方式三:本實施方式與具體實施方式一或二不同的是步驟一所述的MS固體培養基為MS+0.5mg/L6-BA(6-芐基氨基嘌呤)+2.0mg/L2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)+30g蔗糖+0.8%瓊脂,pH=5.8。其它步驟及參數與具體實施方式一或二相同。

本實施方式瓊脂的百分含量指質量百分含量。

具體實施方式四:本實施方式與具體實施方式一至三之一不同的是步驟二繼代培養后的愈傷組織分割成0.5cm3的塊狀。其它步驟及參數與具體實施方式一至三之一相同。

具體實施方式五:本實施方式與具體實施方式一至四之一不同的是將步驟二得到的分化出芽的苜蓿組織再轉入壯芽培養基中進行培養,壯芽培養基為:MS+2.0mg/L6-BA+30g/L蔗糖+10g/L瓊脂。其它步驟及參數與具體實施方式一至四之一相同。

具體實施方式六:本實施方式與具體實施方式一至五之一不同的是步驟三所述的鐵鹽母液是將2.78gFeSO4·7H2O和3.73gNa2-EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)溶于1L去離子水中得到的。其它步驟及參數與具體實施方式一至五之一相同。

具體實施方式七:本實施方式與具體實施方式六不同的是步驟三的生根培養基為MS+1.5mg/LIBA+0.05mg/LNAA+2.00mg/L6-BA+15ml鐵鹽母液+30g/L蔗糖+10g/L瓊脂+0.5g/L活性炭。其它步驟及參數與具體實施方式六相同。

本實施方式通過增加生根培養基中鐵鹽的含量,能夠增加苜蓿組織的培養周期。

具體實施方式八:本實施方式與具體實施方式一至七之一不同的是步驟三在溫度為23~25℃,2000~4000Lx的強光照度,使苜蓿愈傷組織變綠,利于獲得胚性愈傷組織,每天光照16h的條件下在培養瓶中進行培養22~28d。其它步驟及參數與具體實施方式一至七之一相同。

具體實施方式九:本實施方式與具體實施方式一至八之一不同的是步驟四幼苗移栽到營養土中在環境濕度為70%~80%的條件下進行培養。其它步驟及參數與具體實施方式一至八之一相同。

實施例一:本實施例抗PEG苜蓿愈傷組織再分化的方法按下列步驟實現:

一、將經NaN3誘變和PEG脅迫處理后的苜蓿愈傷組織(莖段為外植體)接種于MS固體培養基中,在25℃下培養,每日漫射光照射12h,1000Lx光照強度培養20d(天)完成1次繼代,重復繼代培養2次,得到繼代培養后的愈傷組織;

二、將步驟一得到的繼代培養后的愈傷組織分割成0.5cm3塊狀,然后接種到含有不同比例NAA和6-BA的芽分化MS培養基(見表1)上,在溫度為25℃,每日光照射16h,3000Lx光照度的條件下進行培養,得到分化出芽的苜蓿組織,然后再移接到壯芽培養基中進行培養,壯芽培養基為:MS+2.0mg/L的6-BA+30g/L的蔗糖+10g/L的瓊脂;

三、將分化出芽的苜蓿組織在分芽處切斷成兩段,兩段分別移接到不同生根培養基(見表2)上,在溫度為25℃,1000Lx的光照度,每天光照16h的條件下在培養瓶中進行培養,得到分化出根的無菌苗,起初根生長較少,需要轉接2-3次之后方才能長出足夠多的根;

四、當分化出根的無菌苗長到2~3cm并有4~5條粗壯根系時,在培養室內將培養瓶口打開,進行2~5d的煉苗,然后挑選株高為4~5cm,并有4~5條粗壯根系的試管苗移栽到營養土中進行培養,完成抗PEG苜蓿愈傷組織的再分化。

本實施例首先選取子粒飽滿的敖漢苜蓿種子,經0.1%升汞溶液消毒5min,用無菌水沖洗3~4次后將苜蓿種子置于MS固定培養基,在23±2℃的培養箱中培養一周后即得到無菌幼苗,然后將無菌幼苗從培養基中取出,置于無菌濾紙上,切成1cm的莖段,接種于MS固體培養基(MS+0.5mg/L6-BA+2.0mg/L2,4-D+30g蔗糖+0.8%瓊脂,pH=5.8)中,在25℃下培養,漫射光每日照射12h,選取生長了20d白色、松脆的愈傷組織。步驟一中經NaN3誘變和PEG脅迫處理后的苜蓿愈傷組織是將苜蓿愈傷組織分割成0.5cm3的均勻塊體,轉入NaN3200mg/L的液體培養基中,每瓶10塊,70r/min振蕩培養1h,靜止1h后對存活的愈傷組織進行繼代培養,誘變后的愈傷組織轉入含L-Hyp8mmol/L和30%PEG(PEG-6000)的MS培養基(其它成分同誘導培養基)進行交替篩選,培養條件同前,存活的愈傷組織擴大培養。

表1不同6-BA和NAA配比芽分化

通過表1確定最佳生芽培養基為:MS+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+10g/L瓊脂。若所需芽的數量很大時,需要擴大培養,可在芽分叉處將芽切開,移接到最適壯芽培養基上繼續培養,期間注意更換培養基,否則芽可能因為營養成分耗盡褐變死亡。

本實施例步驟二愈傷組織在誘導生芽培養基上培養一段時間后,可以發現原來黃綠色的愈傷組織逐漸變綠,繼續培養一段時間可以發現有的培養基上長出小芽。在芽移接過程中帶有少量愈傷組織,有未生芽的愈傷組織可繼續移接到生芽培養基繼續誘導生芽。步驟三在生根過程中在培養基中加入活性炭,從而為生根制造黑暗環境。

本實施例步驟三芽移栽到生根培養基中培養一段時間后,觀察發現有白色的根生出,起初根生長較少,需要轉接2-3次之后方才能長出足夠多的根,培養基不同配比下生根的情況見表2。生根培養基:MS+1.5mg/LIBA+0.05mg/LNAA+2.00mg/L6-BA+15mL鐵鹽母液+30g/L蔗糖+10g/L瓊脂+0.5g/L活性炭為最適生根培養基,其中鐵鹽母液是將2.78gFeSO4·7H2O和3.73gNa2-EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)溶于1L去離子水中得到的。培養出的幼苗不僅根長、多、壯,且培養周期長。本實施例幼苗移栽成活率能夠達到90%以上。

表2不同配比激素的培養基中生根情況

下表顯示誘變和未誘變的苜蓿葉片的脯氨酸含量、可溶性糖含量、POD活性在誘變前后的差異顯著,誘變后脯氨酸含量、可溶性糖含量、POD活性明顯增高,表明分化的苜蓿幼苗抗旱能力的增強。

表3苜蓿葉片脯氨酸含量、可溶性糖含量和POD活性

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