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用于治療風濕骨病的中藥組合物及中成藥的制備方法和應用.pdf

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用于 治療 風濕 中藥 組合 中成藥 制備 方法 應用
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摘要
申請專利號:

CN201310540299.5

申請日:

20131105

公開號:

CN103585275B

公開日:

20160511

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K36/56,A61P29/00,A61P19/02,A61P37/04,A61K31/352 主分類號: A61K36/56,A61P29/00,A61P19/02,A61P37/04,A61K31/352
申請人: 華東理工大學
發明人: 倪力軍,張立國,吳婷婷,趙雯雯,歐陽霄雯,徐曉玲,郭燕子,薛志斌,何婉瑛,潘潔文,鄭帥,趙麗麗,馬東升
地址: 200237 上海市徐匯區梅隴路130號
優先權: CN201310540299A
專利代理機構: 上海翼勝專利商標事務所(普通合伙) 代理人: 翟羽;曾人泉
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310540299.5

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明用于治療風濕骨病的中藥組合物,各活性部位的質量百分比為:甘草皂苷40%~60%;甘草黃酮10%~20%;麻黃生物堿5%~20%;川牛膝皂苷5%~20%;馬錢子生物堿5%~10%。根據該中藥組合物制備中成藥的方法包含以下步驟:⑴制備甘草皂苷;⑵制備甘草黃酮;⑶制備麻黃生物堿;⑷制備川牛膝皂苷;⑸制備馬錢子生物堿;⑹配制活性部位組合物;⑺制作用于治療風濕骨病的中成藥;所述中成藥包括膠囊、軟膠囊、片劑。根據本發明的中藥組合物制備的用于治療風濕骨病的中成藥能在鎮痛抗炎、活血祛瘀和補中益氣增強免疫力以及治療寒濕淤阻經絡所致的風濕性關節炎、關節痛中進行應用。

權利要求書

1.用于治療風濕骨病的中藥組方,其特征在于,各活性部位的質量百分比為:甘草皂苷40%~60%;甘草黃酮10%~20%;麻黃生物堿10%~20%;川牛膝皂苷5%~20%;馬錢子生物堿5%~10%。2.一種根據權利要求1所述的中藥組方制備用于治療風濕骨病的中成藥的方法,其特征在于,包含以下步驟:(1)制備甘草皂苷取甘草粉以氨性乙醇超聲提取兩次;過濾,旋蒸,離心;過HZ-816大孔樹脂柱,收集乙醇洗脫液;旋蒸至干,干燥,稱重;所述甘草提取物中甘草皂苷的質量百分比為50%~95%;(2)制備甘草黃酮取甘草藥材進行粉碎,用乙醇回流提取;離心、濃縮并脫色;先過D101大孔樹脂柱,濃縮后過HZ915聚酰胺樹脂柱;醇液減壓濃縮干燥,稱重;所述甘草提取物中甘草黃酮的質量百分比為20%~80%;(3)制備麻黃生物堿稱取麻黃藥材進行粉碎,用乙醇回流提取;過濾,離心,減壓濃縮;旋蒸至干,稱重,制得麻黃生物堿;所述麻黃提取物中麻黃堿的質量百分比為20%~70%;(4)制備川牛膝皂苷取川牛膝藥材進行粉碎,用乙醇回流提取兩次;過濾離心提取,旋蒸至浸膏;用去離子水溶解,過HZ-816大孔樹脂柱,重復上樣一次,收集乙醇的洗脫液;醇液旋蒸,干燥,稱重;所述川牛膝提取物中川牛膝皂苷的質量百分比為5%~30%;(5)制備馬錢子生物堿稱取馬錢子藥材進行粉碎,用乙醇回流提取;過濾,離心,減壓濃縮;旋蒸至干,稱重,制得馬錢子生物堿;所述馬錢子提取物中馬錢子堿的質量百分比為40%~95%;(6)配制活性部位質量百分比將步驟(1)-(5)制備的甘草皂苷、甘草黃酮、麻黃生物堿、川牛膝皂苷和馬錢子生物堿按下述活性部位質量百分比進行配制:甘草皂苷40%~60%;甘草黃酮10%~20%;麻黃生物堿10%~20%;川牛膝皂苷5%~20%;馬錢子生物堿5%~10%;(7)制作用于治療風濕骨病的中成藥將步驟(6)配制的活性部位混合物制備成膠囊和片劑。3.權利要求1所述的中藥組方在制備治療風濕骨病中成藥中的應用,其特征在于,所述中成藥具有鎮痛抗炎、活血祛瘀和補中益氣、增強免疫力的作用。4.權利要求1所述的中藥組方在制備治療風濕骨病中成藥中的應用,其特征在于,所述中成藥具有治療風濕性關節炎、類風濕性關節炎以及關節痛的作用。

說明書

技術領域

本發明屬于中醫藥領域,涉及中藥的成藥,具體地涉及一種用于治療風濕骨病的中藥組合物及中藥成藥(以下簡稱“中成藥”)的制備方法和應用。

背景技術

風濕性疾病,俗稱“風濕病”,系風、寒、濕、創傷侵入人體,形成痹毒并附于人體骨骼,從而損傷骨骼和與骨骼相關的硬組織,致使肌、韌帶、滑囊、筋膜的營養供給不良而導致的一類疾病。在該類疾病中,99%為風濕骨病,它是現今最為常見的慢性骨病之一。早在古時中醫對該疾病就有相關描述。風濕屬于中醫“痹癥”的范疇,在《素問·痹論》中就有“風寒濕三氣雜至,合而為痹”之說,它從中醫角度闡明了該疾病的發病機理是為陽氣不足、腠理不密、風寒濕邪入侵等所致。近代醫學研究也發現,風濕骨病的發病與寒冷、潮濕、疲勞、營養不良、創傷、精神等因素密切相關。

目前,治療風濕骨病多以非手術治療為主,常用非甾體類抗炎鎮痛藥物治療以控制急性發作。自1899年阿司匹林問世以來,已有100余種非甾體抗炎鎮痛藥(NSAIDs)用于臨床,他們巳成為治療風濕性關節炎(RA)、骨關節炎(OA)以及各種輕到中度疼痛的一線用藥,其中不少巳成為非處方藥。根據藥物對環氧化酶(COX)選擇性的不同,將COX抑制劑分為四類:①COX-1特異性抑制劑,如小劑量阿司匹林。②COX非特異性抑制劑,如布洛芬、萘普生、吲哚美辛、大劑量阿司匹林等。③COX-2傾向性抑制劑,如吡羅昔康、伊索昔康、美洛昔康等。④COX-2特異性抑制劑,如塞來昔布、羅非昔布、伐地昔布。長期以來,上述藥物的療效已得到充分肯定,但是長期用藥的安全性令人擔憂。所述藥物的毒副作用相對明顯,患者難以長期耐受。因此,尋求有效理想的風濕治療藥物已成為近些年藥物研究的熱點。在中醫藥領域,用中藥治療風濕痹癥已有悠久的歷史。傳統的治療風濕骨病的中成藥有風濕馬錢片、通絡止痛膠囊、益腎蠲痹丸、虎骨丸、血痹大易方、腰痛寧膠囊等。其中,風濕馬錢片的藥物組成為馬錢子粉、僵蠶(炒)、乳香(炒)、沒藥(炒)、全蝎、牛膝、蒼術、麻黃、甘草等9味藥材。通絡止痛膠囊的藥物組成為防己、苦杏仁、黃柏、蠶砂、百部、薏苡仁、法半夏、連翹、滑石粉、通草、苦參、甘草等12味藥材。益腎蠲痹丸的藥物組成為地黃、當歸、淫羊藿、骨碎補、蜂房、全蝎、蜈蚣等7味藥材。虎骨丸的藥物組成為乳香、沒藥(各另研)、赤芍藥、熟地黃、當歸、虎脛骨(酥炙黃、狗骨代)、血竭等7味藥材。血痹大易方的藥物組成為山藥、牛膝、澤瀉、地膚子、白術、干漆、蠐螬、狗脊、車前子、茵陳、山茱萸、干地黃、天雄等13味藥材。腰痛寧膠囊的藥物組成有馬錢子粉、土鱉蟲、川牛膝、甘草、麻黃、乳香(醋制)、沒藥(醋制)、全蝎、僵蠶(麩炒)、麩炒蒼術等10味藥材。

近些年來,用于治療風濕骨病的新型中藥的專利層出不窮:中國專利CN201110382506.X公開了由龍爪葉、穿山甲、吳茱萸、雄黃、白花蛇、當歸、骨碎補、石菖蒲、絡石藤、威靈仙、淫羊藿、路路通、大黃、蜈蚣、全蝎、丁香和過江龍共計17種藥物組成的“一種治療風濕和類風濕性關節炎的藥物組合物”。中國專利文獻CN01114363.0公開了一種由制馬錢子、制川烏、制草烏、制鰲甲、宣木瓜、川牛膝和紅花共計7種藥物組成的“馬錢子風濕散”。中國專利CN200610031135.X公開了一種由水蛭、秦艽、金銀花和魚腥草共計4種藥物組成的“治療類風濕病的中藥注射液”。中國專利CN98112207.8公開了由乳香、沒藥、威靈仙、木鱉子、柳枝、蓖麻油、蜂蠟共計7種藥物等配制而成的“風濕貼”。中國專利CN200410010720.2公開了一種主要由木香、桃仁、丹皮、赤芍、延胡索、半夏、茯苓、大黃、柴胡、荊芥、白術、知母、黨參、熟地、防風、伸筋草、透骨草、乳香、沒藥、甘草共計20種藥物組成的“治療類風濕性關節炎的中藥通絡制劑”。

上述已有中成藥及發明專利中所含藥物種類繁多、成分復雜,其質量可控性差、安全隱患大、服用劑量大。并且采用的藥材是全粉入藥,含有很多非有效物質,其中某些藥物存在毒副作用,不宜長期服用。因此,人們一直在努力改善抗風濕骨病中成藥的藥物組成,探索這些藥物的作用機理。希望能提出組方簡單、質量可控性強、毒副作用和服用劑量小的治療風濕骨病的新型中藥。

中藥中的同類活性成分組群稱為活性部位,可按照其分子結構的基本構架分為生物堿類、黃酮類、皂苷類、揮發油類等等。中藥復方中的不同活性部位相互間的協同及拮抗作用是中藥發揮藥效的物質基礎。因此,通過總結中醫驗方及中醫配伍準則,設計合理的中藥活性部位組成的中藥組合物有望研制出功效顯著、毒副作用和服用劑量小的治療風濕骨病藥物。

發明內容

本發明的目的在于發展中藥的成藥,提供一種用于治療風濕骨病的中藥組合物。所述組合物以甘草皂苷為君藥,含有馬錢子生物堿、麻黃生物堿、甘草黃酮和川牛膝皂苷,具有補腎健脾、散風祛濕、消炎止痛的功效。本發明的第二目的在于,根據所述用于治療風濕骨病的中藥組合物提供一種用于治療風濕骨病的中成藥的制備方法。本發明的第三目的在于提供所述用于治療風濕骨病的中成藥的應用。

為實現上述目的,本發明采取了以下技術方案。

一種用于治療風濕骨病的中藥組合物,其特征是,各活性部位的質量百分比為:

進一步,用于治療風濕骨病的中藥組合物,各活性部位的質量百分比為:

本發明用于治療風濕骨病的中藥組合物以甘草皂苷為君藥,其占各原料成分的近一半或一半以上。甘草是豆科甘草屬植物,其根和根莖是最常用的中藥。甘草味甘、性平、無毒,主治五臟六腑寒熱邪氣,堅筋骨,長肌肉,倍氣力,解毒,久服能輕身延年。甘草含有多種化學成分,主要成分為甘草酸、甘草黃酮。所述甘草酸又稱甘草皂苷,具有抗炎、抗病毒和保肝解毒及增強免疫功能等作用。多數報道認為,甘草皂苷的抗炎機理與抑制前列腺素等介質的作用有關。甘草酸可能通過對花生四烯酸水解所需的磷脂酶A2的抑制來實現抑制前列腺素的合成與釋放。另據日本學者TaKagi的報導,將我國東北甘草除去甘草甜素后得到一種黃酮類成分,命名為FM100(商品名為Aspallon),具有抗實驗消化性潰瘍的作用及抗炎作用,已開發有成藥上市。

所述甘草黃酮是甘草中的重要活性部位之一,主要存在于甘草根表皮以內的部分。前蘇聯學者在研究中發現了甘草黃酮具有較強的消炎和抗變態作用,比磺胺和抗生素的藥效要好。日本學者小菅卓夫等人也相繼從甘草中分離得到了有抗炎活性的黃酮類成分Liquiritin,其作用機理可能與對透明質酸酶的活性和對組胺釋放的抑制作用有關。

本發明的中藥組合物中含有川牛膝皂苷。所述川牛膝皂苷活性部位的苷元為齊墩果酸,屬于五環三萜類化合物,是中藥川牛膝的主要活性成分。現代藥理研究發現:從川牛膝中提取的皂苷對大鼠蛋清性關節炎有促進炎性腫脹消退的明顯作用;可有效降低大鼠全血粘度、紅細胞壓積、紅細胞聚集指數,具有明顯的活血化瘀的作用;此外還具有消炎止痛的功效。

本發明的中藥組合物中還含有兩種生物堿:馬錢子生物堿和麻黃生物堿。其中,馬錢子生物堿為馬錢子的主要活性部位,是一種吲哚類生物堿,含量約為3%~5%。近代藥理實驗表明:馬錢子生物堿具有顯著的鎮痛、鎮靜的作用。小鼠扭體、小鼠熱板及小鼠肌肉注射模型均證實:馬錢子生物堿有顯著的鎮痛作用且其鎮痛作用與M膽堿受體有一定的聯系。所述麻黃生物堿與馬錢子生物堿的作用相似,其中的麻黃堿可通過作用于α1-受體來提高中樞性痛覺閾值從而達到鎮痛的作用。因此,以甘草皂苷為主,輔以馬錢子生物堿及麻黃生物堿,可以增強本發明的中藥組合物的鎮痛作用,使其在治療風濕骨病時表現出理想的治療療效。

為實現上述第二目的,本發明采取了以下技術方案。

一種根據所述中藥組合物制備用于治療風濕骨病的中成藥的方法,其特征是,包含以下步驟:

(1)制備甘草皂苷

取甘草粉以氨性乙醇超聲提取兩次;過濾,旋蒸,離心;過HZ-816大孔樹脂柱,收集乙醇洗脫液;旋蒸至干,干燥,稱重;

所述甘草提取物中甘草皂苷的質量百分比為50%~95%;

(2)制備甘草黃酮

取甘草藥材進行粉碎,用乙醇回流提取;離心、濃縮并脫色;先過D101大孔樹脂柱,濃縮后過HZ915聚酰胺樹脂柱;醇液減壓濃縮干燥,稱重;

所述甘草提取物中甘草黃酮的質量百分比為20%~80%;

(3)制備麻黃生物堿

稱取麻黃藥材進行粉碎,用乙醇回流提取;過濾,離心,減壓濃縮;旋蒸至干,稱重,制得麻黃生物堿;

所述麻黃提取物中麻黃堿的質量百分比為20%~70%;

(4)制備川牛膝皂苷

取川牛膝藥材進行粉碎,用乙醇回流提取兩次;過濾離心提取,旋蒸至浸膏;用去離子水溶解,過HZ-816大孔樹脂柱,重復上樣一次,收集乙醇的洗脫液;醇液旋蒸,干燥,稱重;

所述川牛膝提取物中川牛膝皂苷的質量百分比為5%~30%;

(5)制備馬錢子生物堿

稱取馬錢子藥材進行粉碎,用乙醇回流提取;過濾,離心,減壓濃縮;旋蒸至干,稱重,制得馬錢子生物堿;

所述馬錢子提取物中馬錢子堿的質量百分比為40%~95%;

(6)配制活性部位質量百分比

將步驟(1)-(5)制備的甘草皂苷、甘草黃酮、麻黃生物堿、川牛膝皂苷和馬錢子生物堿按下述活性部位質量百分比進行配制:

(7)制作用于治療風濕骨病的中藥成藥

將步驟(6)配制的活性部位混合物制備成膠囊、軟膠囊和片劑。

進一步,將步驟(1)~步驟(5)制備的甘草皂苷、甘草黃酮、麻黃生物堿、川牛膝皂苷和馬錢子生物堿按下述活性部位質量百分比進行配制:

為實現上述第三目的,本發明采取了以下技術方案。

根據本發明的中藥組合物制備的用于治療風濕骨病的中成藥在鎮痛抗炎、活血祛瘀和補中益氣、增強免疫力中的應用,所述中成藥具有去濕除寒、補腎健脾、活血通絡的功效。

進一步,所述用于治療風濕骨病的中成藥在治療風濕性關節炎、類風濕性關節炎以及關節痛中的應用。

本發明的積極效果是:

(1)按照“標本兼治”的原則,采用補腎健脾、通絡止痛的治療方案,在甘草皂苷抗炎、抗病毒和保肝解毒及增強免疫功能基礎上,輔以一種黃酮(甘草黃酮)及一種皂苷(川牛膝皂苷),兩種生物堿(馬錢子生物堿和麻黃生物堿),在多個體外細胞模型中表現出有顯著的療效。

(2)根據本發明的中藥組合物制備的用于治療風濕骨病的中成藥的藥效經體外細胞實驗結果證實:各濃度的藥物均表現出顯著的免疫、抗炎及活血作用;該組方對小鼠巨噬細胞生成PGE2有明顯的抑制作用,對小鼠脾淋巴細胞分泌IL-2水平具有明顯的促進作用;對小鼠巨噬細胞產生IL-6和TNF-α亦有促進作用;對IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞有顯著的增殖作用,對該細胞的損傷有明顯的修復作用。此外,所述中成藥具有顯著的活血祛瘀作用,能有效的增強人臍靜脈內皮細胞釋放NO的能力。

(3)根據本發明的中藥組合物制備的用于治療風濕骨病的中成藥的藥效經體外動物實驗結果證實:該藥物可顯著抑制佐劑性關節炎大鼠的急性足爪腫脹和繼發性足腫脹,提示該中藥活性部位具有防治佐劑性關節炎的作用。

(4)綜上所述,根據本發明的中藥組合物制備的用于治療風濕骨病的中成藥在鎮痛抗炎、活血祛瘀和補中益氣增強免疫力等方面均有明顯作用,對風濕骨病有良好療效。

具體實施方式

以下繼續介紹本發明用于治療風濕骨病的中藥組合物的具體實施方式,通過12個實施例來分析、檢查和驗證根據本發明的中藥組合物制備的用于治療風濕骨病的中成藥的作用和功能。但是,本發明的實施不限于以下的實施方式。

實施例1

一種用于治療風濕骨病的中藥組合物,各活性部位的配方質量百分比如下:

根據本發明的中藥組合物制備用于治療風濕骨病的中成藥的方法,包含以下步驟:

(1)制備甘草皂苷

①取甘草粉以0.5%氨性70%乙醇(以下所涉及到的試劑百分含量均為質量百分含量)超聲提取兩次,每次1小時;

②過濾離心提取,旋蒸至約300mL,加去離子水,靜置過夜,離心;

③過HZ-816大孔樹脂柱(依次使用1200mL去離子水,600mL30%乙醇,600mL50%乙醇,600mL70%乙醇洗脫),收集70%乙醇洗脫液;

④醇液旋蒸至干,干燥,稱重,通過高效液相色譜以單一標準品為衡量標準,測定甘草皂苷的含量為82.0%。

(2)制備甘草黃酮

①取甘草,粉碎后用乙醇回流提取2.5小時;

②將提取液離心、濃縮并脫色;

③先過D101大孔樹脂柱(用乙醇洗脫),將洗脫液減壓濃縮;后過HZ915聚酰胺樹脂柱(乙醇洗脫);

④醇液減壓濃縮干燥,分別獲得甘草藥材的總黃酮提取物,通過高效液相色譜以單一標準品為衡量標準,測得甘草黃酮的含量為69.94%。

(3)制備麻黃生物堿

稱取麻黃藥材進行粉碎,用乙醇回流提取;將提取液過濾,濾液在4000r/min轉速下離心5min后取上清液減壓旋蒸濃縮;定容后減壓旋蒸至干,制得麻黃生物堿,測得其生物堿含量為42.0%。

(4)制備川牛膝皂苷

①取川牛膝藥材進行粉碎,以8倍量濃度為80%的乙醇回流提取兩次,提取時間分別為第一次3小時,第二次2小時;

②過濾離心提取,旋蒸至浸膏;

③用去離子水溶解,以2mL/min上HZ-816大孔樹脂柱,重復上樣一次:分別以4倍量濃度為10%的乙醇及濃度為95%的乙醇分別洗脫,收集95%乙醇的洗脫液;

④醇液旋蒸,獲得川牛膝皂苷,用香草醛-冰醋酸比色法測得其皂苷含量為13.88%。

(5)制備馬錢子生物堿

稱取馬錢子藥材進行粉碎,用乙醇回流提取;將提取液過濾,濾液在4000r/min轉速下離心5min后取上清液減壓旋蒸濃縮;定容后減壓旋蒸至干,制得馬錢子生物堿,測得其生物堿含量為88.7%。

(6)配制活性部位質量百分比

將步驟(1)-(5)制備的甘草皂苷、甘草黃酮、麻黃生物堿、川牛膝皂苷和馬錢子生物堿按用于治療風濕骨病的中藥組合物進行配制,各活性部位的質量百分比為:

(7)制作用于治療風濕骨病的中藥成藥

將步驟(6)配制的活性部位制備成膠囊、軟膠囊和片劑。

實施例2

根據本發明的中藥組合物制備用于治療風濕骨病的中藥成藥的方法,包含以下步驟:

制備方法和步驟基本同實施例1,與實施例1所不同的是:

將步驟(1)-(5)制備的甘草皂苷、甘草黃酮、麻黃生物堿、川牛膝皂苷和馬錢子生物堿按用于治療風濕骨病的中藥組合物進行配制,各活性部位的質量百分比為:

實施例3

根據本發明的中藥組合物制備用于治療風濕骨病的中藥成藥的方法,包含以下步驟:

制備方法和步驟基本同實施例1,與實施例1所不同的是:

將步驟(1)-(5)制備的甘草皂苷、甘草黃酮、麻黃生物堿、川牛膝皂苷和馬錢子生物堿按用于治療風濕骨病的中藥組合物進行配制,各活性部位的質量百分比為:

實施例4

根據本發明的中藥組合物制備的用于治療風濕骨病的中藥成藥對風濕骨病治療作用的動物實驗:了解本發明的用于治療風濕骨病的中藥組合物對IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞增殖的影響。

(1)受試藥物:根據本發明的中藥組合物制備的用于治療風濕骨病的中藥成藥。

(2)受試動物:SD大鼠,6只,7日齡,雌雄各半。

(3)實驗方法

取7日齡SD大鼠脫頸處死,浸泡于酒精質量百分含量為95%的酒精數分鐘后取出,取出股骨頭、肩關節及膝關節軟骨組織,用PBS(磷酸鹽緩沖液)沖洗數次,加入少量PBS剪碎,用0.2%的Ⅱ型膠原酶37℃消化,移取上清液作為單個細胞懸液接種于培養皿中培養,隔天換液。

待細胞基本長滿后傳代培養,傳至第2代時,調整細胞濃度為1×107/L,接種于96孔培養板內用于實驗。每孔接種200μL細胞懸液,接種24h后將培養孔分為空白對照組、IL-1β對照組、受試樣品組、陽性對照組,每樣3復孔,分別更換相應的培養液:

①空白對照組:換DMEM(含5%FBS,0.02%吐溫-80);

②模型組:換DMEM(含10μg/L的IL-1β,0.02%吐溫-80及5%FBS);

③受試藥物及陽性對照組:換DMEM(含10μg/L的IL-1β,0.02%吐溫-80,5%FBS及各濃度藥物或陽性藥);

將各組放入培養箱中繼續培養48h用于細胞增殖檢測。去除原有細胞培養基,每孔加入100μL全培養基及10μLCCK8溶液重懸,繼續孵育,于給藥后3h置于酶標儀450nm波長下測定每孔的光密度值(OD值),對受試樣品促增殖作用進行分析。

(4)實驗結果

受試藥物對IL-1β誘導的大鼠骨關節炎軟骨細胞的增殖影響見表1。

表1.受試藥物對IL-1β誘導的大鼠骨關節炎軟骨細胞的增殖影響(O.D.)

表1中,**與模型組P<0.01,*與模型組P<0.05。

(5)實施例4的結果表明

由表1可見,模型組在加入IL-1β后,OD值較正常組明顯降低,細胞數量顯著減少,該現象說明IL-1β已有效誘導細胞發生過早衰老,大鼠骨關節退行性病變模型構建成功。同時,受試藥物組在(0.08~9.77μg/mL)濃度范圍內均顯示出顯著的細胞增殖作用,且呈劑量依賴性,并在濃度為9.77μg/mL時作用最為明顯:增殖率為69.98%,達到其最大藥效。由此可知,本發明用于治療風濕骨病的中藥組合物可有效治療骨關節炎,可有效促進軟骨細胞的增殖以緩解關節炎對關節造成的傷害。

實施例5

本實施例是在實施例4的基礎上,對免疫調節作用所做的動物實驗:以了解本發明的用于治療風濕骨病的中藥組合物對小鼠脾淋巴細胞免疫功能的影響。

(1)受試藥物:根據本發明的中藥組合物制備的用于治療風濕骨病的中藥成藥。

(2)受試動物:C57小鼠,SPF級別,6~8周齡,10只雌性。

(3)實驗方法

小鼠斷頸,無菌取脾,用濾網磨碎后制備脾細胞懸液,保證原代細胞活性95%以上,調整細胞濃度至3×106個/mL。加入ConA誘導脾淋巴細胞增殖,細胞經過受試藥物處理,培養72h后用ELISA法測定細胞培養上清中IL-2含量。

(4)實驗結果

①受試藥物對小鼠脾細胞IL-2分泌的影響見表2。

表2.受試藥物對小鼠脾細胞IL-2分泌的影響(O.D.)

受試藥物濃度(μg/mL) ConA組 受試藥物組 400 0.7430±0.1124 2.3593±0.0162** 200 0.7323±0.1276 2.2707±0.0174** 100 0.6923±0.1585 1.2420±0.1450** 50 0.6847±0.2434 0.5660±0.0072Δ 25 0.6467±0.2175 0.5283±0.0286Δ 12.5 0.7397±0.2045 0.5657±0.0068Δ 6.25 0.8100±0.0726 0.6577±0.0102Δ 3.125 1.0157±0.1262 0.8970±0.0320Δ

表2中,**與ConA組P<0.01,Δ與ConA組P>0.05。

如表2所示,本發明的用于治療風濕骨病的中藥組合物在100-400μg/mL濃度范圍內均可對小鼠脾淋巴細胞的IL-2分泌水平有顯著的正向調節作用,其中當濃度在400μg/mL時,其促進作用達到最強。該結果顯示本發明的用于治療風濕骨病的中藥組合物在高濃度情況下可調動機體免疫應答,調節T淋巴細胞的生長與分化,通過增強機體免疫作用而達到治本的目的。

實施例6

本實施例是在實施例5的基礎上,對Ana-1巨噬細胞免疫功能進行的細胞實驗:以了解本發明的用于治療風濕骨病的中藥組合物對小鼠Ana-1巨噬細胞免疫功能、抗腫瘤的影響。

(1)受試藥物:根據本發明的中藥組合物制備的用于治療風濕骨病的中藥成藥。

(2)受試細胞:Ana-1小鼠巨噬細胞

(3)實驗方法

①將Ana-1小鼠巨噬細胞在37℃、5%CO2條件下,用含10%小牛血清、青霉素(1×105u·L-1)及鏈霉素(100mg·L-1)的DMEM培養液進行傳代培養。實驗用細胞均處于對數生長期。

②取需要的細胞量,加入需要體積的新鮮完全培養基重懸細胞,接種96孔板中,空白對照組及待測藥物處理組(3.125;6.25;12.525;50;100;200μg·mL-1),于37℃,5%CO2條件下培養。

③在加藥前棄去舊培養液,用新鮮培養液洗滌3次,加入新鮮的待測藥物孵育30min,用酶聯法測定樣品IL-6及TNF-α含量,每組重復3次,同時加入CCK8試劑,檢測細胞活力狀態。

(4)實驗結果

①受試藥物對Ana-1細胞的增殖影響見表3。

表3.受試藥物對Ana-1細胞的增殖影響(OD值/A)

受試藥物濃度(μg/mL) 空白組 受試藥物組 200 2.4860±0.0132 2.6337±0.0031** 100 2.3893±0.0441 2.6013±0.0393** 50 2.1413±0.0499 2.4997±0.0508** 25 2.2173±0.1158 2.4557±0.0514** 12.5 2.2487±0.0483 2.3743±0.0266** 6.25 2.5703±0.0080 2.4543±0.0083** 3.125 2.4640±0.0151 2.2357±0.0862**

表3中,**與空白組P<0.01。

如表3所示,本發明的用于治療風濕骨病的中藥組合物在12.5~200μg/mL濃度范圍內皆對促進巨噬細胞增殖有顯著影響,剩余濃度組細胞無明顯死亡,該現象說明細胞活力狀態良好。

②受試藥物對Ana-1細胞產生TNF-α的影響見表4。

表4.受試藥物對Ana-1細胞產生TNF-α的影響(OD值/A)

表4中,**與空白組P<0.01,*與空白組P<0.05,Δ與空白組P>0.05。

表4的結果顯示:本發明的用于治療風濕骨病的中藥組合物在3.125~200μg/mL濃度范圍內均可對小鼠脾淋巴細胞的TNF-α分泌水平有正向調節作用。TNF-α是一種能夠直接殺傷腫瘤細胞而對正常細胞無明顯毒性的細胞因子,是迄今為止所發現的直接殺傷腫瘤作用最強的生物活性因子之一,參與機體免疫應答和炎癥反應。因此,本發明的用于治療風濕骨病的中藥組合物在高濃度的情況下可調動機體免疫應答,增強機體免疫力,能更有效地治療風濕骨病。

③受試藥物干預Ana-1細胞產生IL-6的影響見表5。

表5.受試藥物干預Ana-1細胞產生IL-6的影響(OD值/A)

受試藥物濃度(μg/mL) 空白組 受試藥物組 200 0.1180±0.0090 0.1903±0.1320Δ 100 0.1233±0.0229 0.2673±0.1583Δ 50 0.1057±0.0078 0.1545±0.3869** 25 0.1017±0.0194 0.1690±0.0771Δ 12.5 0.0957±0.0119 0.1047±0.0035Δ 6.25 0.0997±0.0107 0.1040±0.0066Δ 3.125 0.1183±0.0135 0.1630±0.0953Δ

表5中,**與空白組P<0.01,Δ與空白組P>0.05。

如表5所示,本發明的用于治療風濕骨病的中藥組合物在3.125~200μg/mL濃度范圍內均可增強小鼠脾淋巴細胞的IL-6分泌水平,且在50μg/mL濃度下,促進作用顯著。IL-6能夠活化T細胞和成纖維細胞產生的淋巴因子,能使B細胞前體成為產生抗體的細胞;IL-6與集落刺激因子協同,能促進原始骨髓源細胞的生長和分化,增強自然殺傷細胞的裂解功能。因此,本發明的用于治療風濕骨病的中藥組合物亦可調動機體免疫應答,帶動原始骨髓源細胞及NK細胞的增殖與作用,具有標本皆治的功效。

實施例7

本實施例是在實施例6的基礎上,對Ana-1巨噬細胞抗炎活性進行的評價實驗:以了解本發明的用于治療風濕骨病的中藥組合物抑制小鼠Ana-1巨噬細胞產生PGE2的能力。

(1)受試藥物:根據本發明的中藥組合物制備的用于治療風濕骨病的中藥成藥。

(2)受試細胞:Ana-1小鼠巨噬細胞

(3)實驗方法

①將Ana-1小鼠巨噬細胞在37℃、5%CO2條件下,用含10%小牛血清、青霉素(1×105u·L-1)及鏈霉素(100mg·L-1)的DMEM培養液進行傳代培養。實驗用細胞均處于對數生長期。

②取需要的細胞量,加入需要體積的新鮮完全培養基重懸細胞,接種96孔板中,設溶劑DMSO對照組、LPS處理組、陽性藥物(環氧酶抑制劑NS-398)對照組及受試藥物處理組(3.125;6.25;12.5;25;50;100;200;400μg·mL-1)于37℃、5%CO2培養。

③建立模型,加入誘導劑LPS(終質量濃度為1mg·L-1)進行培養(溶劑DMSO對照組不加LPS)。

④藥物處理,棄去舊培養液,用新鮮培養液洗滌3次,分別加入新鮮的受試藥物孵育30min。

⑤檢測,加入底物AA(終濃度為10μmol·L-1),37℃,溫育20min,收集上清液,-20℃保存,用酶聯法測定樣品PGE2含量,以反映各受試藥物對COX-2酶活性的直接抑制作用,每組重復3次。

⑥活力檢測,加入CCK8試劑,檢測細胞活力狀態。

(4)實驗結果

①受試藥物干預Ana-1細胞產生PGE2的影響見表6。

表6.受試藥物干預Ana-1細胞產生PGE2的影響(OD/A)

表6中,**與LPS處理組P<0.01,*與LPS組P<0.05,△與LPS處理組P>0.05。

②受試藥物對Ana-1細胞的增殖影響見表7。

表7.受試藥物對Ana-1細胞的增殖影響(OD值/A)

受試藥物濃度(μg/mL) 空白組 受試藥物組 400 3.6313±0.1415 3.5973±0.1544Δ 200 3.3247±0.0567 3.4423±0.0457Δ 100 3.3033±0.0631 3.0760±0.1621* 50 2.7633±0.1876 2.6300±0.2292Δ 25 2.8530±0.2390 2.6950±0.2202Δ 12.5 3.1083±0.0116 2.8637±0.0662* 6.25 3.1890±0.0286 3.0687±0.0262Δ 3.125 3.3310±0.0287 3.1667±0.0150Δ

表7中,*與空白組組P<0.05,△與空白組P>0.05。

表6及表7分別為受試藥物干預細胞后對細胞PGE2及細胞增殖的影響。

由表6可知,本發明的用于治療風濕骨病的中藥組合物在12.5~400μg/mL濃度范圍內均對小鼠巨噬細胞生成PGE2產生了抑制作用,隨著藥物濃度的增大,抑制作用增強。濃度在400μg/mL時抑制作用達到最強(74.40%)。為了探究PGE2生成量減少是否與細胞的大量死亡有關,此實驗模型還對細胞增殖進行了檢測。

表7的結果顯示,本發明的用于治療風濕骨病的中藥組合物在濃度范圍內細胞增殖趨勢與空白組基本一致,并未出現細胞大量死亡的情況,因此,PGE2的檢測結果是可信的。由此可知,本發明的用于治療風濕骨病的中藥組合物對風濕骨病有顯著的抗炎療效。

實施例8

本實施例是在實施例7的基礎上,將本發明的用于治療風濕骨病的中藥組合物用于人臍靜脈內皮細胞分泌NO的影響(心血管活性)的細胞實驗,以了解其活血化瘀的功能。

(1)受試藥物:根據本發明的中藥組合物制備的用于治療風濕骨病的中藥成藥。

(2)受試細胞:人臍靜脈內皮細胞。

(3)實驗方法

培養人臍靜脈內皮細胞,用DMEM培養基對受試藥物進行溶解和配置,所述人臍靜脈內皮細胞經過不同濃度的受試藥物的48~72小時處理(采用八個濃度,一個陰性對照藥及一個陽性對照藥,三復孔)。然后取細胞上清液,用CCK8試劑盒檢測細胞的增殖;用NO試劑盒檢測NO的釋放。

(4)實驗結果

①受試藥物對人臍靜脈內皮細胞的增殖影響見表8。

表8.用于治療風濕骨病的中藥組合物對人臍靜脈內皮細胞的增殖影響(O.D.)

受試藥物濃度(μg/mL) 空白組 受試藥物組 800 1.0760±0.0127 0.6460±0.0346** 400 0.8350±0.0099 0.9897±0.0316** 200 0.7630±0.0976 1.2627±0.0378** 100 0.6845±0.0587 1.2130±0.0650** 50 0.6960±0.0438 1.2447±0.0391** 25 0.6585±0.0361 1.1933±0.0437** 12.5 0.7050±0.0566 1.2240±0.0053** 6.25 0.8145±0.0035 1.2073±0.0534**

表8中,**與空白組P<0.01。

由表8可知,受試藥物濃度在6.25~400μg/mL范圍內對人臍靜脈內皮細胞皆有顯著的增殖作用,且在濃度為25μg/mL時,增值率達到最大(81.25%)。該結果說明,在受試藥物對人臍靜脈內皮細胞的干預下,本發明的用于治療風濕骨病的中藥組合物能有效地促進人臍靜脈內皮細胞發生增殖,在活血化瘀、疏通經絡方面具有一定的功效。

②組方干預人臍靜脈內皮細胞分泌NO量見表9。

表9.用于治療風濕骨病的中藥組合物干預人臍靜脈內皮細胞分泌NO量(uM)

受試藥物濃度(μg/mL) 空白組 受試藥物組 800 32.1681±3.6071 31.5203±7.6497 400 27.1104±5.6017 38.9908±12.7529 200 26.7200±1.6567 34.5020±12.6296 100 27.2778±1.2989 56.9790±29.2177* 50 24.8234±0.3944 38.7942±17.2594 25 25.2696±1.6567 35.3866±15.0834 12.5 22.9267±0.2367 22.5754±13.0243 6.25 29.5649±5.3644 49.1481±23.0915

表9中,*與空白組P<0.05。

表9中,受試藥物在低濃度時對人臍靜脈內皮細胞釋放NO產生了促進作用。據文獻記載,NO能夠抑制血小板聚集與粘附,減少白細胞的聚集,防止血栓的形成;能抑制淋巴細胞增殖,抑制巨噬細胞的氧化產物,抑制肥大細胞的活性;在慢性感染和炎癥時,激活巨噬細胞、白細胞產生的NO參與殺滅細菌、病毒、寄生蟲、真菌、腫瘤細胞的作用,參與其他一系列的免疫過程。因此,實施例8的實驗結果說明,本發明的用于治療風濕骨病的中藥組合物不僅具有活血祛瘀、通經活絡的功效,還能提高機體的免疫力,達到標本兼治的效果。

實施例9

在實施例4~8細胞實驗的基礎上,將本發明的用于治療風濕骨病的中藥組合物用于治療佐劑性關節炎大鼠的動物實驗,以觀察治療風濕骨病的中藥組合物對佐劑性關節炎大鼠的原發性病變和繼發性足跖腫脹的影響。

(1)受試藥物:根據本發明的中藥組合物制備的用于治療風濕骨病的中藥成藥。

(2)受試動物:SD大鼠,SPF級別,6~8周齡,8只雄性。

(3)實驗方法

①造模前,稱量每只大鼠的體重,并記錄,體重在180~220g之間。

②將16只大鼠隨機分為4組,分別是空白組(4只),模型組(4只),受試藥物組(4只),陽性對照組(4只)。用排水法測定正常狀態下大鼠右踝關節以下的容積(mL),然后于每只大鼠左后足跖皮下注射sigma弗氏完全佐劑0.1mL致炎,分別于致炎后3、6、9、24h同法測量致炎足容積,以致炎前后差值作為腫脹度,觀察受試藥物對AA大鼠急性炎癥的影響。分別于致炎后第6、11、13天觀察非致炎足容積的變化。致炎前三天開始以灌胃方式給藥,受試藥物組給予組方藥80mg/kg,陽性對照組給予雷公藤多苷片40mg/kg,空白組與模型組給予生理鹽水10mL/kg,每日一次,連續給藥至取材的前一天。

(4)實驗結果

①受試藥物對AA大鼠原發性炎癥的影響見表10。

表10.受試藥物對AA大鼠原發性炎癥的影響

表10中,**與模型組P<0.01,*與模型組P<0.05。

由表10可知,大鼠致炎后3h,模型組、陽性對照組以及受試藥物組中各給藥動物致炎部位的腫脹度均高于空白組,但是并無統計學意義;致炎后6~24h,模型組大鼠致炎足相比于空白組顯著性腫脹,陽性對照組以及受試藥物組的致炎部位也發生明顯腫脹,但是在9~24h腫脹度顯著性低于模型組;受試藥物組與陽性對照組的腫脹度并無顯著性差異,因此提示:陽性對照藥以及受試藥物對AA大鼠的原發性足爪腫脹有明顯的抑制作用,而且陽性藥物并沒有比受試藥物的療效更好。

②受試藥物對AA大鼠繼發性炎癥的影響見表11。

表11.受試藥物對AA大鼠繼發性炎癥的影響

表11中,*與模型組P<0.05。

由表11可知,對AA大鼠繼發性足腫脹,受試藥物組在給藥第13天的腫脹度值顯著低于模型組,這提示:受試藥物組試驗所用的劑量水平能夠顯著抑制AA大鼠繼發性足爪腫脹。因此,實施例9的實驗結果說明,本發明的用于治療風濕骨病的中藥組合物在試驗所用的劑量水平上可以改善大鼠佐劑性關節炎的癥狀,控制AA大鼠足爪腫脹,降低炎癥反應。這同時表明:本發明的用于治療風濕骨病的中藥組合物對大鼠AA原發性病變和繼發性病變都有顯著的抑制作用,具有防治關節炎的效果。

實施例10

在實施例1-9實驗的基礎上,取甘草皂苷21g、甘草黃酮7.2g、麻黃生物堿5g、川牛膝皂苷3.7g、馬錢子生物堿2.8g,將本發明的用于治療風濕骨病的中藥組合物中的五個活性部位混合均勻,然后進行噴霧干燥,干燥后藥物的含水率為3%~5%,干燥后得到治療風濕骨病的中藥藥物,按照常規方法加入適量的乳糖、糖粉、甘露醇和糊精,粉碎過篩,以90%乙醇為粘合劑制成軟材,20目篩制粒,在40~60℃條件下用烘箱烘干至含水率為2%~4%,然后用10目篩整粒再加入1%的硬脂酸鎂混合,壓制成片劑(每片劑含活性部位組合藥物500mg)。

實施例11

在實施例10實驗的基礎上,取甘草皂苷21g、甘草黃酮7.2g、麻黃生物堿5g、川牛膝皂苷3.7g、馬錢子生物堿2.8g,將本發明的用于治療風濕骨病的中藥組合物中的五個活性部位混合均勻,然后進行噴霧干燥,干燥后藥物的含水率為3%~5%,干燥后得到治療風濕骨病的中藥藥物,粉碎過100目篩,然后加入甘油加熱至60~80℃攪拌制成混懸劑,以明膠壓制、冷卻、制成軟膠囊1000粒。

實施例12

在實施例11實驗的基礎上,取甘草皂苷21g、甘草黃酮7.2g、麻黃生物堿5g、川牛膝皂苷3.7g、馬錢子生物堿2.8g,將本發明的用于治療風濕骨病的中藥組合物中的五個活性部位混合均勻,然后進行噴霧干燥,干燥后藥物的含水率為3%~5%,干燥后得到治療風濕骨病的中藥藥物,最后按照常規方法加入適量的二氧化硅混合、填充,制作成膠囊劑(每粒膠囊含活性部位組合藥物400mg)。

本發明的用于治療風濕骨病的中藥組合物,按“標本兼治”的原則,采用補腎健脾、通絡止痛的治療方案,在甘草皂苷抗炎、抗病毒和保肝解毒及增強免疫功能基礎上,輔以甘草黃酮、川牛膝皂苷以及麻黃生物堿和馬錢子生物堿,提出了用于治療風濕骨病的中藥組合物。經體外細胞實驗證實:本發明的用于治療風濕骨病的中藥組合物具有顯著的免疫、抗炎及活血作用:對IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞有顯著修復作用;對小鼠淋巴細胞及Ana-1巨噬細胞表現出顯著的免疫調節作用;對小鼠Ana-1巨噬細胞的PGE2分泌水平具有明顯抑制作用;對人臍靜脈內皮細胞NO分泌具有正向調節作用。本發明的用于治療風濕骨病的中藥組合物的藥效經體內動物實驗結果證實:可顯著抑制佐劑性關節炎大鼠的急性足爪腫脹和繼發性足腫脹,具有防治佐劑性關節炎的作用,能用于風濕骨關節炎的臨床治療。

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