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一種利用根內球囊霉降低金銀花鎘積累并提高其產量的方法.pdf

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一種 利用 根內球囊霉 降低 金銀花 積累 提高 產量 方法
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摘要
申請專利號:

CN201610016838.9

申請日:

20160108

公開號:

CN105660098A

公開日:

20160615

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01G1/00,A01B79/02 主分類號: A01G1/00,A01B79/02
申請人: 華南師范大學
發明人: 靖元孝,江秋云,卓逢,鐘億珠
地址: 510631 廣東省廣州市天河區中山大道西55號
優先權: CN201610016838A
專利代理機構: 廣州粵高專利商標代理有限公司 代理人: 陳衛
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法律狀態
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CN201610016838.9

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摘要

本發明公開了一種利用根內球囊霉降低金銀花鎘積累并提高其產量的方法。該方法是利用根內球囊霉和金銀花共生栽培。具體地,是先利用宿主植物將根內球囊霉進行擴繁培養后,收獲含有宿主植物根段、真菌菌絲、菌根真菌孢子和栽培土壤的混合物,即為根內球囊霉菌劑;再將根內球囊霉菌劑接種于栽培基質中,進行金銀花的栽培。利用該方法不僅可以促進金銀花生長,提高產量;更重要的是,可以阻止鎘自根向地上部分轉移,降低地上部分(莖、葉和花)的鎘濃度。本發明為在鎘污染土壤中安全生產金銀花提供了一個途徑,對金銀花的生產及應用具有重要意義,而且該方法效果好、無二次污染、成本低。同時,還為根內球囊霉的開發利用提供了一個新的思路和方向。

權利要求書

1.根內球囊霉在降低金銀花的鎘積累和/或提高金銀花產量方面的應用。2.一種利用根內球囊霉降低金銀花鎘積累并提高其產量的方法,其特征在于,是利用根內球囊霉和金銀花共生栽培。3.根據權利要求2所述的方法,其特征在于,所述根內球囊霉是根內球囊霉菌劑,所述根內球囊霉菌劑為包括根內球囊霉宿主植物根段、菌絲、菌根真菌孢子和/或栽培基質的混合物。4.根據權利要求3所述的方法,其特征在于,是先利用宿主植物將根內球囊霉進行擴繁培養后,收獲含有宿主植物根段、真菌菌絲、菌根真菌孢子和栽培土壤的混合物,即為根內球囊霉菌劑;再將根內球囊霉菌劑接種于栽培基質中,進行金銀花的栽培。5.根據權利要求4所述的方法,其特征在于,所述宿主植物為摩西球囊霉的宿主植物。6.根據權利要求4所述的方法,其特征在于,所述利用宿主植物將根內球囊霉進行擴繁培養所用的基質為沙土。7.根據權利要求4所述的方法,其特征在于,所述擴繁時,根內球囊霉的接種量為0.1~20w/w%。8.根據權利要求4所述的方法,其特征在于,所述進行金銀花的栽培時,根內球囊霉菌劑的接種量為0.1~20w/w%。9.根據權利要求4所述的方法,其特征在于,所述根內球囊霉菌劑的制備方法如下:按照0.1~20w/w%的接種量,將根內球囊霉接種劑均勻平鋪在沙土基質上,覆蓋一層滅菌沙土基質,澆水,播種根內球囊霉宿主的種子,再覆蓋一層滅菌沙土基質,培養3~6個月,除去植株地上部分莖葉后,置于溫度和濕度穩定的空間干燥10~15天,然后收獲所有培養物,包括植物根段、菌絲、菌根真菌孢子和栽培基質,剁碎混勻,即得到根內球囊霉菌劑。10.一種適用于鎘污染土壤上種植金銀花的土壤改良劑,其特征在于,包含有根內球囊霉。

說明書

技術領域

本發明屬于重金屬污染修復技術領域。更具體地,涉及一種利用根內球囊霉降低金銀花的鎘積累并提高其產量的方法。

背景技術

由于農田污灌、固體廢棄物施用以及礦山開采與冶煉等人類活動,土壤鎘污染越來越嚴重。鎘在土壤中移動性大、毒性高,是環境中最毒的無機污染物之一。鎘被植物吸收后進入植物體,可通過食物鏈富集進入人體,嚴重威脅著農業生產和人類健康。針對大面積中輕度污染的耕地,目前尚缺乏經濟可行的技術手段徹底清除土壤重金屬。我國人口多與耕地少的矛盾突出,將大面積重金屬污染土地實行休耕會影響農作物生產和國家安全穩定,在我國這是不現實的。因此,必須采取措施降低農作物中重金屬含量以保障農業生產安全。

金銀花(Lonicerajaponica)是忍冬科忍冬屬多年生半常綠藤本植物,廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區,其地上部分為藥用部分,具有很高的藥用和經濟價值。另外,金銀花具有生物量大、生長快、壽命長、根系發達、抗性強、適應性廣、對土壤要求不嚴格等特點。但是,最近研究表明金銀花積累鎘的能力很強(Liu等,2009;劉周莉等,2009;Liu等,2012;Jia等,2013;賈蓮等,2013),這對金銀花的生產和應用帶來十分不良的影響。因此,降低金銀花鎘積累的研究是實現金銀花在鎘污染土地上安全生產的重要環節。向言詞等(2013)采用苔蘚、黑炭土、植物果制吸咐劑和稻草屑作為基質栽培金銀花,這些基質既可為植物生長提供豐富營養,又可吸附固定土壤重金屬,減少重金屬的生物有效性,阻止重金屬從污染土壤傳遞進入金銀花體內,實現在污染土壤中安全栽培與生產金銀花,然而該方法卻不適用于大面積的土壤栽培。

現有技術中,利用生物、物理化學或者農業生態措施可以降低鎘在植物中的積累,是實現在鎘污染土壤中進行安全農業生產的重要措施。其中,施用土壤改良劑是控制土壤鎘污染的有效手段,其目的是降低土壤鎘的生物有效性,達到原位抑制作物吸收鎘的目的。此方法成本低、易于實踐,是在鎘污染土壤上進行安全生產的有效途徑之一。但是,目前常用的鎘污染土壤改良劑,多數存在效果不穩定或對土壤性質、結構造成不利影響等缺陷,直接影響土壤改良劑的實際持續應用。而利用菌根真菌降低植物重金屬吸收量是一種行之有效、環境友好的技術手段。自1981年Bradley等(1981)報道石楠(Callunavulgaris)菌根降低植物對過量銅和鋅的吸收以后,人們對菌根與重金屬污染的研究產生了濃厚的興趣。Amir等(2013)也報道Glomusetunicatum的定殖顯著(p<0.05)降低了其宿主植物Sorghumvulgare根部以及地上部分的Ni濃度而促進了生長。

目前,尚未見有利用菌根真菌降低金銀花中鎘積累的報道。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有技術中降低金銀花鎘積累方法的不足,提供一種利用根內球囊霉(Rhizophagusintraradices)降低金銀花的鎘積累并提高金銀花產量的方法。利用根內球囊霉和金銀花共生,不僅可以改善金銀花的礦質營養狀況,尤其是P素營養,從而促進金銀花生長,增加生物量尤其是地上部生物量;更重要的是,可以阻止鎘自根向地上部分轉移,降低地上部分(莖、葉和花)的鎘濃度,也降低了Cd對金銀花的毒害。

本發明上述目的通過以下技術方案實現:

首先,本發明公開了根內球囊霉在降低金銀花的鎘積累和/或提高金銀花產量方面的應用,該應用均應在本發明的保護范圍之內。

在此基礎上,本發明提供了一種利用根內球囊霉降低金銀花鎘積累并提高其產量的方法,是利用根內球囊霉和金銀花共生栽培。

優選地,所述根內球囊霉是根內球囊霉菌劑。

所述根內球囊霉菌劑可以為常見的根內球囊霉菌劑。

作為一種優選的實施方式,所述根內球囊霉菌劑為包括根內球囊霉宿主植物根段、菌絲、菌根真菌孢子和/或栽培基質的混合物。

更優選地,上述利用根內球囊霉降低金銀花鎘積累并提高其產量的方法具體是:先利用宿主植物將根內球囊霉進行擴繁培養后,收獲含有宿主植物根段、真菌菌絲、菌根真菌孢子和栽培土壤的混合物,即為根內球囊霉菌劑;再將根內球囊霉菌劑接種于栽培基質中,進行金銀花的栽培。

其中,優選地,所述宿主植物為摩西球囊霉的宿主植物。

更優選地,所述摩西球囊霉的宿主植物為玉米、紫云英、高粱、三葉草或蘇丹草等。

優選地,所述根內球囊霉為根內球囊霉BGCAH01。

優選地,所述利用宿主植物將根內球囊霉進行擴繁培養所用的基質為沙土。

更優選地,所述沙土為滅菌的重量比1:1的沙和土混合物。

另外,優選地,上述擴繁培養時,根內球囊霉的接種量為0.1~20w/w%。

更優選地,擴繁培養時,所述根內球囊霉的接種量為1~5w/w%。

最優選地,擴繁培養時,所述根內球囊霉的接種量為3~4w/w%。

優選地,金銀花栽培時,所述根內球囊霉菌劑的接種量為0.1~20w/w%。

更優選地,金銀花栽培時,所述根內球囊霉菌劑的接種量為1~5w/w%。

最優選地,金銀花栽培時,所述根內球囊霉菌劑的接種量為3~4w/w%。

作為一種優選的可實施方案,上述根內球囊霉菌劑的具體制備方法如下:

按照0.1~20w/w%的接種量,將根內球囊霉接種劑均勻平鋪在沙土基質上,覆蓋一層滅菌沙土基質,澆水,播種根內球囊霉宿主的種子,再覆蓋一層滅菌沙土基質,培養3~6個月,除去植株地上部分莖葉后,置于溫度和濕度相對穩定的空間干燥10~15天,然后收獲所有培養物,包括植物根段、菌絲、菌根真菌孢子和栽培基質,剁碎混勻,即得到根內球囊霉菌劑。其中,優選地,所述接種量為1~5w/w%。更優選地,所述接種量為3~4w/w%。優選地,所述沙土基質為滅菌的重量比1:1的沙和土混合物。

另外,上述收獲所有培養物后的操作盡量做到無菌,具體可為:操作桌面先用酒精(如70%酒精)擦拭消毒;桌面上覆蓋若干層(如3層)干凈的紙,將收獲的培養物倒在紙上,用火焰消毒的短柄斧剁碎;用兩張紙卷起剁碎了的培養物,紙筒的一端插入預先準備的能封口的干凈塑料袋中;當所有的培養物都轉移入袋中后,輕輕取出紙,封上袋,任何時候都不要讓手接觸到一點盆栽培養物,再在外面套一個相同的塑料袋,然后放置在4℃冰箱中保藏。

更具體地,所述根內球囊霉菌劑的制備方法如下:

裝滅菌的沙土(按照重量比,沙:土=1:1)培養基至塑料盆的4/5;按照4w/w%的接種量,將根內球囊霉接種劑均勻平鋪在基質上一薄層。再覆滅菌基質2cm,澆水,播種玉米種子10~15粒/盆。覆蓋0.5cm滅菌基質,然后移至溫室培養;

盆栽5個月后進行收獲;收獲時,先剪去植物株地上部分莖葉,將盆置于溫度濕度相對穩定的房間干燥兩周,然后收獲盆中所有培養物(包括植物根系、菌絲、孢子和基質);

操作桌面先用70%酒精擦拭消毒;桌面上覆蓋3層干凈的紙,將盆中培養物倒在紙上,用火焰消毒的短柄斧剁碎;用兩張紙卷起剁碎了的培養物,紙筒的一端插入預先準備的能封口的干凈塑料袋中;當所有的培養物都轉移入袋中后,輕輕取出紙,封上袋,任何時候都不要讓手接觸到一點盆栽培養物,再在外面套一個相同的塑料袋,然后放置在4℃冰箱中保藏。

另外,一種包含有根內球囊霉的適用于鎘污染土壤上種植金銀花的土壤改良劑也應在本發明的保護范圍之內。所述根內球囊霉可為上述的根內球囊霉菌劑。

優選地,所述土壤改良劑中,根內球囊霉菌劑的含量為0.1~20w/w%,所述土壤改良劑的使用量為3.4~668公斤/畝。

更優選地,所述土壤改良劑中,根內球囊霉菌劑的含量為1~5w/w%,所述土壤改良劑的使用量為34~167公斤/畝。

最優選地,所述土壤改良劑中,根內球囊霉菌劑的含量為3~4w/w%,所述土壤改良劑的使用量為100公斤/畝。

另外,還需強調的是,以本發明所公開的根內球囊霉在降低金銀花的鎘積累和/或提高金銀花產量方面的應用為基礎,所衍生、替換、組合出的其他方案,均應在本發明的保護范圍之內。

本發明以金銀花為實驗植物,以根內球囊霉為接種劑,在不同Cd濃度(0、10和20mgCdKg-1)的土壤中,通過盆栽實驗研究接種根內球囊霉降低金銀花積累鎘的潛力,結果表明,接種根內球囊霉(Ri)提高了金銀花吸收P的能力,促進了金銀花生長,生物量大幅度增加;而且,接種Ri可阻止鎘自金銀花根向地上部分轉移,降低了地上部分(莖、葉和花)鎘濃度,實現了在鎘污染土壤上生產金銀花的目的。

本發明具有以下有益效果:

本發明利用根內球囊霉與金銀花共生,不僅可以改善金銀花的礦質營養狀況,尤其是P素營養,從而促進金銀花生長,增加生物量尤其是地上部生物量,提高金銀花的產量;更重要的是,可以阻止鎘自根向地上部分轉移,降低地上部分(莖、葉和花)的鎘濃度,對金銀花的生產及應用具有重要的意義。

另外,本發明還實現了根內球囊霉的一種新應用,為根內球囊霉的開發和應用提供了一個新的思路和方向。

本發明的方法與傳統的化學與農業措施相比,接種根內球囊霉的措施具有效果好、無二次污染、運行成本低等特點。

具體實施方式

以下結合具體實施例來進一步說明本發明,但實施例并不對本發明做任何形式的限定。除非特別說明,本發明采用的試劑、方法和設備為本技術領域常規試劑、方法和設備。

除非特別說明,以下實施例所用試劑和材料均為市購。

實施例1

1、供試菌株擴繁培養和菌劑的制備

根內球囊霉(Rhizophagusintraradices,簡稱Ri)BGCAH01由北京市農林科學院植物營養與資源研究所提供。

利用玉米(Zeamays)作為宿主植物進行盆栽擴繁后,將含有宿主植物根段、真菌菌絲、菌根真菌孢子和盆栽土壤的混合物作為接種菌劑。具體過程如下:

裝滅菌的沙土(按照重量比,沙:土=1:1)培養基至塑料盆的4/5。按照4%的接種量(w:w)將根內球囊霉接種劑均勻平鋪在基質上一薄層。再覆滅菌基質2cm,澆水,播種玉米種子10~15粒/盆。覆蓋0.5cm滅菌基質,然后移至溫室培養。

盆栽5個月后進行收獲。收獲時,先剪去植物株地上部分莖葉,將盆置于溫度濕度相對穩定的房間干燥兩周,然后收獲盆中所有培養物(包括植物根系、菌絲、孢子和基質)。

操作桌面先用70%酒精擦拭消毒。桌面上覆蓋3層干凈的紙,將盆中培養物倒在紙上,用火焰消毒的短柄斧剁碎。用兩張紙卷起剁碎了的培養物,紙筒的一端插入預先準備的能封口的干凈塑料袋中。當所有的培養物都轉移入袋中后,輕輕取出紙,封上袋,任何時候都不要讓手接觸到一點盆栽培養物,再在外面套一個相同的塑料袋,然后放置在4℃冰箱中保藏。

2、供試植物

供試植物為金銀花。

2014年4月,采集二年生金銀花枝條作為插穗。選取長度30cm左右、粗細一致的枝條,枝條上端不留葉,下端削成平滑斜面。砂培扦插培養6周,待到營養葉長出2~3片時,挑選長勢一致的幼苗,經0.3%KMnO4溶液對其根部消毒5s后,用自來水和蒸餾水依次沖洗數次。

3、供試土壤

土壤采自華南師范大學生物園。

土壤的基本理化性質如下:pH6.65,有機物質1.45%,有效磷52mg/kg,總Cd0.14mg/kg,DTPA-Cd0.063mg/kg。

將土壤經自然風干后磨碎,過1mm篩后,121℃高溫高壓蒸汽滅菌2h,分別加入不同濃度的CdCl2使Cd濃度達到10mg/kg和20mg/kg。

為了讓土壤中Cd分布均勻且穩定,加去離子水浸潤一周后風干兩周,循環兩次。

4、根內球囊霉接種金銀花的應用

(1)實驗設計:試驗分為3組:三種土壤重金屬Cd濃度分別為:0mg/kg、10mg/kg、20mg/kg。每組均設計接種和不接種兩種處理。

(2)試驗盆為容量3kg土的塑料花盆,按3w/w%的接種量將根內球囊霉菌劑與土壤均勻混合后裝盆,不接種對照中接入等量的經過兩次滅菌之后的根內球囊霉滅活菌劑,以及菌劑經過濾紙(whatmanNo.1,孔徑:11μm)濾除根內球囊霉之后的菌懸液(補充滅活菌劑中細菌的損失)。每盆移栽3株生長狀況良好并且生長狀況一致的金銀花幼苗,每個處理重復5次。

(3)將盆栽隨機擺放在溫室中進行培養,光照14h,溫度為22℃~28℃,每兩天澆一次無菌水。培養14個月后收獲植物。

5、實驗指標測定

(1)浸染率的測定

用蒸餾水將根洗凈,剪成約1cm長的小段,放入15%的KOH溶液中,90℃恒溫水浴30min,用蒸餾水輕輕漂洗根樣;用10%的H2O2漂白30min,用蒸餾水沖洗;再將根浸入1%的HCl溶液中靜置3min,用蒸餾水洗去HCl溶液后,加入0.05%的Trypanblue染液,90℃水浴下染色30min,染色后,用酸性甘油(乳酸:甘油1:1)洗去根的浮色,隨機挑取50條根段于顯微鏡下觀察侵染情況。參照Giovannetti等(1980)的方法計算根內球囊霉侵染強度。

(2)金銀花生物量的測定

將植物收獲后,用去離子水沖洗干凈,分開植物地上(莖、葉和花)和地下部分,置于80℃烘箱中72h質恒重,稱干重。

(3)金銀花Cd含量的測定

總Cd含量采用HNO3-HClO4-HF消解,用TAS-986火焰型原子吸收儀測定溶液中Cd含量。

(4)土壤有效態Cd含量測定

參照Lindsay和Norvell(1978),用DTPA提取-AAS法測定土壤中有效Cd。

(5)植物體磷含量測定

將植株根莖葉各部分用清水洗干凈,然后放入烘箱內75℃烘48h,直至恒重。分別稱取烘干的根莖葉各部分用硫酸-過氧化氫進行消化,冷卻稀釋后,P含量采用鉬銻抗分光光度法測定。

(6)植物抗氧化指標測定

取植物的葉片0.5g,于液氮中迅速研磨至粉末狀,加6ml預冷的50mmol/LpH7.8的磷酸緩沖液(含質量百分比濃度為4%的PVPP和0.3%的TritonX-100)。并以10000r/min離心20min,上清液即為酶液,4℃保存備用。

SOD活性參照Beyer和Fridovich(1987)的方法測定。以不加酶液同時不加NBT的照光管為對照,以不加酶液同時加NBT的照光管為最大光還原管,以抑止NBT光還原50%所需酶量為一個酶活性單位(U)。

APX活性參照Nakano等(1981)的方法測定。

GR活性參照Carlberg和Mannervik(1985)的方法測定。

CAT活性參照Aebi(1984)的方法測定。

MDA含量參照Heath和Packer(1968)的方法測定。

6、實驗結果

(1)接種Ri對金銀花生物量和P含量的影響,結果如表1所示。結果表明:

1)未接種Ri處理中,金銀花沒有Ri侵染。土壤Cd濃度對Ri的侵染率沒有影響。

2)接種Ri明顯促進了金銀花的生長,地上和地下生物量明顯增加,最大增幅分別為268%和244%。

3)接種Ri顯著提高了金銀花P含量。

表1接種Ri對金銀花生物量和P含量的影響(平均值±標準差,n=5)

表示接種與未接種之間差異顯著(p<0.05)。

(2)接種Ri對金銀花Cd濃度和土壤DTPA-Cd的影響,結果如表2所示。

結果表明:

1)接種Ri明顯降低了金銀花莖、葉和花的Cd濃度,降幅分別為66%、65%、72%(Cd10)和60%、68%、76%(Cd20);

2)接種Ri明顯提高了金銀花根的Cd濃度,增幅分別為62%(Cd10)和28%(Cd20);

3)接種Ri對根際土壤DTPA-Cd濃度沒有顯著影響。

表2接種Ri對金銀花Cd濃度和土壤DTPA-Cd的影響(平均值±標準差,n=5)

*表示接種與未接種之間差異顯著(p<0.05)。

(3)接種Ri對金銀花抗氧化酶和MDA的影響,結果如表3所示。

結果表明:

1)接種Ri顯著提高了金銀花葉片CAT、GR和APX活性,提高了抗氧化能力,從而緩解了鎘對金銀花的毒害作用。

2)接種Ri對金銀花葉片SOD活性沒有顯著影響。

3)接種Ri顯著降低了金銀花葉片MDA含量。

表3Rhizophagusintraradices對金銀花抗氧化酶和MDA的影響(平均值±標準差,n=5)

*表示接種與未接種之間差異顯著(p<0.05)。SOD、CAT、GR、APX和MDA分別為超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽還原酶、抗壞血酸過氧化物酶和丙二醛。

綜上所述,可得出如下結論及分析:

(1)在根內球囊霉-金銀花共生體中,大量延伸到土壤中的根外菌絲擴大了根系的吸收面積,改善金銀花的礦質營養狀況,尤其是P素營養,從而促進金銀花生長,增加生物量尤其是地上部生物量。

(2)根內球囊霉提高金銀花過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)和谷胱甘肽還原酶(GR)等抗氧化保護酶的抗氧化作用,降低MDA含量,從而降低了Cd對金銀花的毒害。

(3)根內球囊霉提高了金銀花根鎘濃度,降低了地上部分(莖、葉和花)鎘濃度,阻止鎘自根向地上部分轉移。

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